Name: Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę hodowli współkulturowej ludzkich astrocytów i komórek śródbłonkowych mózgu na porowatej membranie. Ta technika umożliwia dokładniejsze symulowanie bariery krew-mózg w celu badania jej przepuszczalności i testowania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z grantów przyznanych R.L.M. przez National Health and Medical Research Council of Australia (grant # 606658).

1. Hodowla komórkowa (3-7 dni przed montażem BBB)
1.1. Pierwotne komórki śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu (BECs)
BECs zostały uzyskane komercyjnie. Komórki zostały wytworzone w wyniku dysocjacji normalnej tkanki ludzkiej kory mózgowej i zostały zamrożone w pasażu 3 (<12 podwojenia populacji).
<ol>
	<li>Podłoże: Pokryj naczynia do hodowli tkankowej "Czynnikiem przywiązania" zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Utrzymanie komórek: Utrzymuj BEC w kompletnym pożywce zawierającej surowicę. W celach eksperymentalnych posaz BEC w kompletnym pożywce wolnej od surowicy. Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze 5%CO2, 21%O2 w temperaturze 37 °C 
	Uwaga: Jako alternatywa dla specjalistycznych odczynników, 0,1% (w/v) roztwór żelatyny może służyć jako odczynnik powlekający, podczas gdy DMEM/F-12 uzupełniony 15 mM HEPES, 10% (v/v) płodową surowicę cielęcą (FCS), 2 mM L-glutaminy, 50 μg/ml gentamycyny, 20 μg/ml heparyny i 20 μg/ml suplementu wzrostu komórek śródbłonka może być stosowany do utrzymania BEC.</li>
	<li>Podkultura do eksperymentów: Podziel zlewające się BEC w stosunku 1:3 do 1:6, w zależności od zamierzonego czasu na następne użycie (3-7 dni). Zmieniaj podłoże konserwacyjne co 3 dni. Używaj BEC do 15 fragmentów.</li>
</ol>
1.2. SVG Ludzka linia komórkowa astrogleju płodu
SVG ludzkie płodowe komórki astroglejowe22 pierwotnie pochodziły z pierwotnych kultur ludzkiego mózgu płodu przekształconego za pomocą małpiego wirusa z niedoborem replikacji 40.
<ol>
	<li>Utrzymanie: Hodowla komórek SVG w minimalnej ilości niezbędnej pożywki ze zrównoważonym roztworem soli Earle'a uzupełnionym 20% (v/v) FCS (ten sam procent surowicy, który jest używany do utrzymania ich rodzicielskich komórek pierwotnych 22), 2 mM L-glutaminy, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny. Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze 5% CO2 i 21% O2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Podkultura do eksperymentów: Podziel zlewające się SVG w stosunku 1:5 do 1:10, w zależności od zamierzonego czasu na następne użycie (3-7 dni). Usunięcie trypsyny nie jest wymagane ze względu na dużą zawartość surowicy w pożywce. Zmieniaj podłoże co 3 dni. Używaj plików SVG do 20 fragmentów.</li>
</ol>
2. Montaż i hodowla ludzkiego modelu BBB in vitro (Dzień 0)
Komentarz: Model ludzkiego kontaktu z BBB in vitro jest przygotowany zgodnie z opublikowanymi protokołami 13,23, z modyfikacjami.
2.1. Powlekanie wkładek
<ol>
	<li>Umieść wkładki do hodowli tkankowych (o średnicy 6,5 mm z porowatą membraną poliestrową, wielkość porów 3 μm) w dołkach dostarczonej płytki 24-dołkowej. Powierzchnię świecącą wkładek<s> </s>pokryć przez noc w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C kolagenem szczurzym I (20 μg/cm2; 50 μl 132 μg/ml kolagenu I w 0,02% kwasie octowym w wodzie Milli-Q (MQH2O)). Umyj wkładki raz (zarówno od strony abluminalnej, jak i luminalnej) za pomocą MQH2O, aby usunąć resztki kwasu. 
	nuta: Błona podstawna naczyń włosowatych mózgu nie zawiera kolagenu I, ale głównie lamininy, izoformy kolagenu typu IV, nidogeny i proteoglikany siarczanu heparanu9. Z tego powodu niektórzy badacze stosują środki powlekające, takie jak kolagen IV, fibronektyna13 lub Matrigel (BD biosciences)16, aby uzyskać bardziej autentyczne modelowanie BBB.</li>
</ol>
2.2. Wysiewanie SVG na spodniej (abluminalnej) powierzchni membrany
<ol>
	<li>Odwróć wkładkę i delikatnie dopasuj do krawędzi porowatej membrany krótki kawałek elastycznej rurki silikonowej ("rurka zewnętrzna"; ~10 mm długości, 8 mm średnicy wewnętrznej, 1,6 mm ścianki), tworząc zasadniczo nową studnię nad powierzchnią abluminalną (rysunek 2A).</li>
	<li>Spód wkładki musi być uszczelniony, aby uniknąć wycieku mediów. Najpierw przygotuj korek (Rysunek 2A i 2B) wykonany z rurki silikonowej (określanej jako "rurka wewnętrzna"; ~8 mm długości, 3,2 mm średnicy wewnętrznej, 1,6 mm ścianki; Rysunek 2B), zapieczętowany na jednym end with plastic sealing cane (~3mm długości; przygotowany przez przecięcie dna probówki z 0,2 ml polimerazy chain reaction (PCR); Rysunek 2B). Stożek ten nie tylko uszczelnia wewnętrzny prześwit rurki, ale także poszerza jego krawędź, aby zapewnić ściślejsze dopasowanie do wkładu. Następnie, za pomocą sterylnych kleszczyków, włóż silikonową zatyczkę do wnęki luminalnej i przesuwaj ją, aż dotrze do ~1-2 mm od membrany (Rysunek 2A).</li>
	<li>Następnie wysiewaj 4 x 104 komórki SVG w 200 μl pożywki konserwacyjnej SVG (sekcja 1.2.2 powyżej) bezpośrednio do silikonu znacznie powyżej powierzchni membrany abluminalnej (rysunek 2A). Pozwól plikom SVG przylegać w inkubatorze przez co najmniej 4 godziny. 
	nuta: Aby zachować sterylność, należy transportować zmontowane wkładki pomiędzy dwiema płytkami 6-dołkowymi (jedna płytka odwrócona nad drugą; Rysunek 2C) aby zminimalizować narażenie na niefiltrowane powietrze podczas zabiegu. Silikonowe rurki i zatyczki są myte w etanolu i sterylizowane w autoklawie do późniejszego użycia. 
	nuta: Zatyczki (sekcja 2.2.2) należy stosować tylko w przypadku wkładek, których wielkość porów membrany jest większa niż 1 μm. Membrany o średnicy porów ≤1 μm rzadko przeciekają i wymagają jedynie zamontowania zewnętrznej rurki silikonowej (sekcja 2.2.1). Ponadto niektóre środki powlekające inne niż kolagen I (patrz uwaga do sekcji 2.1) mogą zapobiegać nieszczelności nawet przez pory o wielkości 3 μm. Określ to empirycznie.</li>
	<li>Aby monitorować stan przylegania astrocytów, wysiewaj równolegle do standardowej 96-dołkowej identyczną objętość zawiesiny komórek astrocytów. Studzienka ta ma taką samą powierzchnię jak wkładka 6,5 mm (0,33cm2) i umożliwia łatwiejszą wizualizację komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym niż membrana wkładu. Kiedy zaobserwujesz wystarczające przyleganie astrocytu w 96-dołku kontrolnym, astrocyty odpowiednio przylegają również do błony wstawki.</li>
	<li>Gdy astrocyty wystarczająco przylegają do 96-dołkowej grupy kontrolnej, przenieś zespoły wkładek do kaptura do hodowli tkankowej (patrz uwaga powyżej) i delikatnie wyjmij zewnętrzne silikonowe rurki i zatyczki. Włożyć wkładki do normalnej (tj. pionowej) orientacji do dostarczonych studzienek zawierających 800 μl/studzienkę pożywki konserwacyjnej BEC (sekcja 1.1.2 powyżej).</li>
</ol>
2.3. Wprowadzanie BEC do Komory Luminalnej nad Astrocytami
Wysiej 2x104 BEC w 200 μl na pokrytą kolagenem powierzchnię luminalną i włóż wkładki do inkubatora.
2.4. Hodowla
Kokultura osadzona w SVG/BEC wstawia się przez 3 dni w pożywce BEC bez zmiany podłoża przed eksperymentem.
3. Eksperymenty z ludzkim modelem BBB (Dzień 3)
<ol>
	<li>Aby stymulować BBB in vitro, najpierw przepłucz komórki, zastępując pożywkę abluminalną i luminalną odpowiednio 600 μl i 100 μl pożywki BECs bez surowicy.</li>
	<li>Ponownie odessać pożywkę luminalną i zastąpić 100 μl pożywki bez surowicy ze środkami stymulującymi. 
	nuta: Jeśli wymagana jest stymulacja komory abluminalnej (w celu aktywacji BBB in vitro z przedziału astrocytowego), należy odessać pożywkę abluminalną i zastąpić 600 ul wolnej pożywki surowicy środkami stymulującymi.</li>
	<li>Przetestuj każdą grupę eksperymentalną w trzech egzemplarzach (stąd, jeśli przeprowadzana jest stymulacja światłem, która wymaga 3 x 100 μl, zalecamy rozcieńczenie odczynników do ich końcowych stężeń w 350 μl pożywki wolnej od surowicy na grupę, aby zminimalizować błędy pipetowania między studzienkami).</li>
	<li>Wykonaj standardowe testy przepuszczalności parakomórkowej i/lub transkomórkowej znakowanych znaczników 16,24 (w przypadku tych ostatnich używamy albuminy sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)) i/lub pomiar TEER 13,16,25, jak opisano wcześniej.</li>
</ol>
Aby uwzględnić wahania w podstawowej przepuszczalności między eksperymentami, przeanalizuj zmiany przepuszczalności w stosunku do powlekanej wkładki bez komórek (która służy jako odniesienie dla maksymalnej przepuszczalności) i do grupy traktowanej nośnikiem, używając wzoru: przepuszczalność (% maks.) = (wartość przepuszczalności wkładki eksperymentalnej - średnia wartość przepuszczalności grupy nośników) / (wartość przepuszczalności ślepej wkładki - średnia wartość przepuszczalności grupy nośników) X 100. 
4. Wizualizacja komórek na porowatych błonach
Komentarz: Niebarwione komórki na błonach wstawianych są trudne do zaobserwowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego lub kontrastu interferencji różnicowej (DIC), ponieważ membrana jest dość nieprzezroczysta i zakłóca transmisję światła. Aby poradzić sobie z tym problemem, opracowaliśmy różne procedury barwienia komórek na wkładkach, które znacznie poprawiają wygląd komórek na błonie. Ogólnie rzecz biorąc, membrany wkładek należy zabarwić, gdy są nadal przymocowane do wkładu, w studzienkach. Membrany należy usunąć dopiero po zakończeniu procedury barwienia w celach montażowych.
4.1. Barwienie hematoksyliny
<ol>
	<li>Utrwalić wkładki lodowatym 4% (w/v) paraformaldehydem (PFA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS; 130 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2PO4, pH 7,2) przez 20 min. Umyć raz w PBS.</li>
	<li>Zanurz wkładkę w 0,1% roztworze hematoksyliny Mayera na 2 minuty.</li>
	<li>Delikatnie umyć wkład wodą z kranu (zanurzając go w zlewce z wodą z kranu i delikatnie odpipetując nadmiar wody). Przenieś wkładkę do roztworu wody z kranu Scotta (2 g/L NaHCO3, 20 g/L MgSO4) na ~20 sekund, aż pojawi się pożądany niebieski kolor. Ponownie umyć wkładkę wodą z kranu (rozdział 4.1.3). Opcjonalnie można tutaj wprowadzić barwnik eozyny, zanurzając wkładkę w 1% roztworze eozyny na 10 sekund, a następnie myjąc ją wodą z kranu.</li>
	<li>Wysuszyć membranę wkładu na powietrzu. Za pomocą skalpela (nacinając wokół krawędzi membrany) usuń membranę i zamontuj ją na szkiełku podstawowym do obrazowania w jasnym polu 
	nuta: Jeśli stosowane jest medium montażowe di-N-butyloftalaninksylenu (DPX), przed zdjęciem i montażem membrany należy umyć wkładkę 100% etanolem, a następnie ksylenem.</li>
</ol>
4.2. Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)
<ol>
	<li>Utrwal wkładki lodowatym 4% (w/v) PFA w PBS przez 20 minut. Umyj trzy razy w PBS.</li>
	<li>Utrwal membrany przez 30 minut w 1% (w/v) tetratlenku osmu w MQH2O.</li>
	<li>Umyć wkładki w wodzie (sekcja 4.1.3) i odwodnić w rosnącym gradiencie etanolu (50%, 70%, 90% przez 5 minut każde, a następnie 3x ze 100% etanolem przez 10 minut na interwał).</li>
	<li>Odwodnione wkładki należy traktować mieszaniną heksametylodylazanu: etanolu (1:2, a następnie 2:1 przez 5 minut).</li>
	<li>Wkładki należy traktować 100% HMDS przez 5 minut, wysuszyć na powietrzu i przechowywać w suchych warunkach.</li>
	<li>Usuń membranę za pomocą skalpela (nacinając wokół krawędzi membrany). Zbadaj membrany za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.</li>
</ol>
4.3. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Utrwalić wkładki lodowatym 4% (w/v) PFA w PBS przez 20 minut, przemyć raz w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS; 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 μm przefiltrowane).</li>
	<li>Wykonaj barwienie immunologiczne komórek na błonie wstawki, jak opisano wcześniej26.</li>
	<li>Usuń membranę za pomocą skalpela (nacinając wokół krawędzi membrany) i zamontuj ją na szkiełku podstawowym z fluorescencyjnym medium montażowym. Zbadaj membranę za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>

<ol><li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%2Fneurovascular+unit+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.</a> Neuron. 57, 178-201 (2008).</li>
<li>Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+plasminogen+activator+on+the+neurovascular+unit%3A+from+clinical+data+to+experimental+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).</li>
<li>Stewart, P. A., Wiley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+nervous+tissue+induces+formation+of+blood-brain+barrier+characteristics+in+invading+endothelial+cells%3A+a+study+using+quail--chick+transplantation+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras.</a> Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).</li>
<li>Janzer, R. C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+induce+blood-brain+barrier+properties+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells.</a> Nature. 325, 253-257 (1987).</li>
<li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li>
<li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).</li>
<li>Girouard, H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+coupling+in+the+normal+brain+and+in+hypertension%2C+stroke%2C+and+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease.</a> J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).</li>
<li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).</li>
<li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+%28muBBB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB).</a> Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).</li>
<li>Gaillard, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+functional+characterization+of+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier%2C+comprising+a+co-culture+of+brain+capillary+endothelial+cells+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes.</a> Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).</li>
<li>Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+astrocytes+induce+the+expression+of+blood-brain+barrier+specific+proteins+by+autologous+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells.</a> Brain Res. 625, 238-243 (1993).</li>
<li>Demeuse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+coculture+of+rat+brain+endothelial+cells+and+astrocytes%3A+a+syngenic+model+to+study+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier.</a> J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).</li>
<li>Coisne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+syngenic+in+vitro+blood-brain+barrier+model%3A+a+new+tool+to+examine+inflammatory+events+in+cerebral+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium.</a> Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).</li>
<li>Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+gap+between+the+in+vivo+and+in+vitro+blood-brain+barrier+tightness%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness.</a> Brain Res. 1284, 12-21 (2009).</li>
<li>Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+blood-brain+barrier+by+glucocorticoids+and+the+cells+of+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).</li>
<li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling%3A+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+endothelial+and+astrocyte+cocultures%3A+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+delivery+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).</li>
<li>Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+In+Vitro+Models+of+Ischaemic+Stroke%3A+a+Test+Bed+for+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation.</a> Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).</li>
<li>Major, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+line+of+human+fetal+glial+cells+that+supports+JC+virus+multiplication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).</li>
<li>Eugenin, E. A., Berman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-dependent+mechanisms+of+leukocyte+trafficking+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier.</a> Methods. 29, 351-361 (2003).</li>
<li>Dehouck, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transfer+across+the+blood-brain+barrier%3A+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models.</a> J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).</li>
<li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li>
<li>Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin-induced+activation+of+astrocytes+in+mixed+rat+hippocampal+cultures+is+inhibited+by+soluble+thrombomodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin.</a> Brain Res. 1381, 38-51 (2011).</li>
<li>Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endothelial+and+astrocyte+co-culture+model+of+the+blood-brain+barrier+utilizing+an+ultra-thin%2C+nanofabricated+silicon+nitride+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane.</a> Lab Chip. 5, 74-85 (2005).</li>
<li>Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((t-PA-specific+modulation+of+a+human+BBB+model+involves+plasmin-mediated+activation+of+the+Rho-kinase+pathway+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes.</a> Blood. , (2012).</li>
<li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%2CN-diethyl-2-%5B4-%28phenylmethyl%29phenoxy%5Dethanamine+increases+the+permeability+of+primary+mouse+cerebral+endothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers.</a> Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).</li>
<li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nat. Med. 14, 731-737 (2008).</li>
<li>Yepes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-type+plasminogen+activator+induces+opening+of+the+blood-brain+barrier+via+the+LDL+receptor-related+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein.</a> J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li>
<li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li>
<li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li>
<li>Acheampong, P., Ford, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+of+alteplase+in+the+treatment+of+ischaemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Metab.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).</li>
<li>Derex, L., Nighoghossian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+haemorrhage+after+thrombolysis+for+acute+ischaemic+stroke%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Neurosurg.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li>
<li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li>
<li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+Stroke+in+the+2010s%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li>
<li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li>
<li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania medyczne nad patologiami mózgu napotykają na wiele trudności translacyjnych. Na przykład w dziedzinie ostrego udaru niedokrwiennego mózgu wiele leków, które okazały się bardzo obiecujące w modelach zwierzęcych, zawiodło w klinice38,39. Przyczyny tych rozczarowujących wyników są różne i obejmują niewierność przedklinicznych systemów testowych scenariuszowi udaru mózgu u ludzi oraz zawyżenie wyników uzyskanych w badaniach na zwierzętach21. Jedną ze strategii mających na celu poprawę wartości p...

BBB to wyspecjalizowany interfejs między obwodowym krążeniem krwi a ośrodkowym układem nerwowym, odpowiedzialny za utrzymanie hemostazy mózgu. Składa się z odrębnych komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BEC), na które funkcjonalnie wpływa kilka składników komórkowych i bezkomórkowych (poniżej), tworząc ciasną i dynamiczną bramę do mózgu. W warunkach fizjologicznych bariera krew-mózg ogranicza przepływ komórek krwi, składników osocza i substancji szkodliwych, potencjalnie neurotoksycznych, do mózgu. Równolegle BBB selektywnie wymienia kluczowe jony i składniki odżywcze (glukozę i aminokwasy) oraz produkty przemiany materii między mózgiem a krążeniem, aby precyzyjnie utrzymać środowisko mózgowe1,2. W ostatnich latach staje się oczywiste, że niewydolność bariery krew-mózg występuje w różnych przewlekłych patologiach mózgu, takich jak choroby neurodegeneracyjne lub związane ze stanami zapalnymi (np. odpowiednio choroba Alzheimera i stwardnienie rozsiane)3, a także w stanach ostrych, takich jak udar niedokrwienny4.
Unikalne właściwości BBB komórek śródbłonka mózgu (BEC) są w dużej mierze indukowane przez ich środowisko mózgowe5, a w szczególności przez astrocyty6,7. Coraz powszechniejsze staje się zrozumienie, że inne typy komórek, takie jak perycyty8, neurony i mikroglej1,3, a także błona podstawna9, wspierają BEC i tworzą razem jednostkę funkcjonalną zwaną "jednostką nerwowo-naczyniową" (NVU), która jednocześnie łączy neuronalne zapotrzebowanie metaboliczne z ich naczyniami włosowatymi10.
Udział BBB w sytuacjach patologicznych leży u podstaw licznych prób opracowania in vitro modeli BBB, które mają pomóc w badaniach związanych z BBB11,12. Modele te mają na celu jak najwierniejsze naśladowanie charakterystyki BBB in vivo zgodnie z zasadą NVU. Metody in vitro Modele BBB na ogół opierają się na monowarstwie BEC tworzących ścisłe połączenia (głównie pochodzące od bydła13, człowieka14, szczura15, myszy16 i świni17,18), hodowanych na porowatej błonie wraz z podporowymi astrocytami (szeroko analizowane przez Deli i in. 200511).
Astrocyty mogą być hodowane w warunkach bezkontaktowych na dnie dobrze hodowanej tkanki, oddzielone od BEC (hodowanych na górnej powierzchni błony) przez pożywkę hodowlaną, ale komunikujące się z BEC za pomocą rozpuszczalnych czynników16. W bardziej zaawansowanych modelach, które lepiej przypominają strukturę anatomiczną BBB in vivo, astrocyty są utrzymywane w warunkach kontaktowych i hodowane bezpośrednio po przeciwnej stronie błony w bliskiej odległości od BECs13,15,17 (ryc. 1). Ta konfiguracja umożliwia fizyczny kontakt między BEC a astrocytami, nawiązywany, gdy astrocyty projektują swoje procesy przez porowatą błonę. Co ważne, aby doszło do prawdziwego kontaktu, pory powinny mieć średnicę ≥1 μm, ponieważ astrocyty nie mogą przechodzić przez pory o mniejszych rozmiarach (tj. 0,4 μm)14,15. Warto zauważyć, że w niektórych badaniach wykazano, że kontaktowe systemy BBB są lepsze od ich bezkontaktowych odpowiedników pod względem wartości trans-śródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i przepuszczalności śródbłonka różnych znaczników13,17,18. Dodatkowy wymiar przepływu pożywki został niedawno dodany w wielu modelach BBB in vitro w celu przyłożenia sił ścinających do śródbłonka w celu dokładniejszej symulacji układu naczyniowego mózgu12,19.
Jedną z przeszkód technicznych do pokonania podczas generowania kontaktowego modelu BBB jest umieszczanie astrocytów wbrew grawitacji na powierzchni abluminalnej porowatej błony. Poprzednie protokoły13,20, w których astrocyty były po prostu wysiewane w kropli pożywki na wierzchu odwróconej wkładki, pozwalały tylko na krótkie czasy wysiewu (tj. 10 min13 lub 2 godz.20), które w naszych rękach okazały się niewystarczające do prawidłowego przyłączenia komórek. Stosując tę podstawową metodę, dłuższy okres przyłączania astrocytów wymaga stałego monitorowania wkładek poprzez częste otwieranie inkubatora (powodując wahania temperatury, pH i wilgotności), a także jest podatny na nierównomierne wysiewanie komórek z powodu wycieku pożywki przez pory, zwłaszcza jeśli stosowane są pory większe niż 1 μm.
Tutaj opisujemy ogólny protokół przygotowania kontaktowego modelu BBB. Nasza procedura obejmuje alternatywną metodę wysiewu komórek na odwróconych wkładach, która rozwiązuje wyżej wymienione ograniczenia. Metoda ta pozwala na niezakłócone przyleganie astrocytów do powierzchni błony brzusznej w inkubatorze w równowadze przez dłuższy czas. W rezultacie uzyskuje się równomierne wysiewanie astrocytów, co zwiększa jakość bariery i minimalizuje różnice w przepuszczalności podstawy między insertami.
Ponieważ wykorzystanie ludzkich komórek jest ważne dla badań istotnych dla ludzi21, dodatkowo pokazujemy w tym artykule konkretne zastosowanie nowej kombinacji pierwotnych ludzkich BEC i unieśmiertelnionych ludzkich astrocytów do stworzenia kontaktowego modelu ludzkiej bariery krew-mózg o wysokiej przepustowości badań przesiewowych. Ponieważ oglądanie komórek na porowatych błonach może być trudne, szczegółowo opisujemy również techniki barwienia, które mogą pomóc w określeniu konfluencji i morfologii komórek na porowatych błonach. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób nasz ludzki model BBB może być wykorzystany do zbadania wpływu tkankowego aktywatora plazminogenu (t-PA) - enzymu rozbijającego skrzepy, który służy jako jedyna opcja leczenia ostrego udaru niedokrwiennego - na BBB.

<table><tbody><tr><td>Czynnik przyłączenia</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-210</td><td></td></tr><tr><td>Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu (BEC), pierwotne, ludzkie</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>Kompletne podłoże</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-500</td><td>Uzupełnione CSC JetFuel</td></tr><tr><td>Kompletne podłoże bez surowicy</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>SF-4Z0-500</td><td>Uzupełniony o CSC RocketFue</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 z 15 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka (pochodzenia bydlęcego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Zewnętrzna rurka silikonowa</td><td>Watson-Marlow</td><td>913.A080.016</td><td>Marka Pumpsil, średnica wewnętrzna 8 mm, ścianka 1,6 mm</td></tr><tr><td>Surowica dla cieląt płodowych</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Pfizer</td><td></td><td>1,000 U/ml</td></tr><tr><td>Heksametylodilazan (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4875</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>Wewnętrzna rurka</td><td>silikonowa Watson-Marlow</td><td>913.A032.016</td><td>Marka Pumpsil, średnica wewnętrzna 3,2 mm, ścianka 1,6 mm</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s roztwór hematoksyliny</td><td>Amber Scientific</td><td>MH</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna niezbędna pożywka z Earle' s zrównoważony roztwór soli</td><td>HyClone Laboratories</td><td>SH30244.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen szczurzy I</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Marka Cultrex</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli tkankowych</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3472</td><td>Marka Transwell, o średnicy 6,5 mm, z porowatą membraną poliestrową, 3 i mikro; m Wielkość porów</td></tr></tbody></table>

ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Bariera krew-mózg (BBB) składa się z nieprzepuszczalnych, ale elastycznych naczyń włosowatych mózgu, które ściśle kontrolują środowisko mózgu. Niepowodzenie bariery krew-mózg zostało zasugerowane w etiologii wielu patologii mózgu, co stwarza potrzebę opracowania ludzkich modeli BBB in vitro, aby pomóc w klinicznie istotnych badaniach. Wśród licznych opisanych do tej pory modeli BBB, statyczny (bez przepływu), kontaktowy model BBB, w którym astrocyty i komórki śródbłonka mózgu (BEC) są hodowane po przeciwnych stronach porowatej błony, wyłonił się jako uproszczony, ale autentyczny system symulujący barierę krew-mózg z wysoką przepustowością badań przesiewowych. Niemniej jednak wygenerowanie takiego modelu wiąże się z niewielkimi wyzwaniami technicznymi. W tym miejscu opisujemy protokół przygotowania kontaktowego modelu ludzkiego BBB wykorzystującego nowatorską kombinację pierwotnych ludzkich BEC i unieśmiertelnionych ludzkich astrocytów. W szczególności szczegółowo opisujemy innowacyjną metodę wysiewu komórek na odwróconych wkładkach, a także określamy techniki barwienia wkładek i pokazujemy, w jaki sposób wykorzystujemy nasz model do badań związanych z BBB.

Aby stworzyć ludzki kontaktowy model BBB, musieliśmy hodować SVGs i BECs na membranach porowatych o rozmiarze porów 3 µm, co według badań umożliwia przejście stopek astrocytów w celu nawiązania kontaktu z komórkami śródbłonka14,15,27,28. Schematyczna reprezentacja pełnego modelu kontaktowego została przedstawiona na Rysunku 1 (ilustracja po lewej). Głównym wyzwaniem technicznym w systemie kontaktowym jest konieczność wysiewania astrocytów przeciwko grawitacji na powierzchni abluminalnej membra...

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Celem niniejszej procedury jest symulacja bariery krew-mózg in vitro poprzez kokulturę astrocytów i komórek śródbłonka po przeciwnych stronach porowatej membrany. W pierwszej kolejności należy pokryć powierzchnię luminalną porowatej membrany macierzą zewnątrzkomórkową. Białka takie jak kolagen pasują do odwróconego insertu z zewnętrzną rurką silikonową i wewnętrznym korkiem silikonowym, co pozwala na stworzenie wyjmowalnego dołka nad powierzchnią abluminalną membrany.Następnie wysiej komórki astrocytów na odwróconym wkładzie, aby przylgnęły one do powierzchni abluminalnej. Po tym usuń rurkę i umieść wkład w jego normalnej orientacji w studzience wypełnionej pożywką. W kolejnym kroku wysiej komórki endotelialne do komory luminalnej wkładu i przeprowadź kokulturę z przeciwległymi astrocytami.Ostatecznie, do pomiaru zmian przepuszczalności in vitro BBB w odpowiedzi na różne czynniki stymulujące wykorzystuje się przejście znaczników fluorescencyjnych lub pomiar oporu elektrycznego śródbłonkowego. Procedurę tę zaprezentuje pan Barry Nigo, postdoc w moim laboratorium, który podczas studiów doktoranckich opracował zmodyfikowany protokół wysiewu, którego używamy do symulowania bariery krew-mózg. Pomysł na tę procedurę pojawił się po przetestowaniu prostszych metod wysiewu i napotkaniu wielu trudności związanych z przeciekaniem medium przez pory, a także z niewielkimi objętościami medium.Powodowało to krótki i niewystarczający czas osadzania się astrocytów, co staramy się rozwiązać w naszej procedurze. Umieść inserty do hodowli tkankowej w dołkach płytki 24-dołkowej. Następnie dodaj 50 µL kolagenu szczurczego typu I w stężeniu 132 µg/mL, aby pokryć powierzchnię luminalną insertów, inkubuj przez noc w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C w celu usunięcia resztkowe kwasu, a następnie przemyj obie strony insertów – abluminalną i luminalną – wodą dwukrotnie destylowaną.Następnie odwrócić wkłady i delikatnie dopasować krótki odcinek elastycznej rurki silikonowej wokół krawędzi porowatej membrany. Tworzy to w zasadzie nową studzienkę nad powierzchnią abluminalną. Aby uszczelnić stronę dolną.Przygotuj korek z rurki silikonowej, której jeden koniec został uszczelniony odciętą końcówką probówki PCR o objętości 0,2 mililitra. Następnie, używając sterylnej pęsety, wprowadź silikonowy korek do światła jamistego i przesuń go, aż znajdzie się w odległości około jednego do dwóch milimetrów od błony. Następnie zasiać 40 000 astrocytów w 200 µL ich pożywki hodowlanej bezpośrednio do otworu silikonowego nad powierzchnią abluminalną błony.Aby monitorować stan adhezji astrocytów, należy użyć standardowej płytki 96-dołkowej, ponieważ posiada ona taką samą powierzchnię jak wkładka 6,5 mm i umożliwia łatwiejszą wizualizację komórek za pomocą mikroskopii kontrastowej. Do płytki 96-dołkowej należy wysiać taką samą objętość zawiesiny komórek astrocytów. Będzie ona monitorowana w czasie, aby określić, kiedy astrocyty w dołku płytki, a tym samym w membranie wkładki, wystarczająco przywarły, aby zachować sterylność.Przenieś zmontowane wkładki, umieszczając je pomiędzy dwiema płytkami 6-dołkowymi, aby zminimalizować ekspozycję na nieprzefiltrowane powietrze. Umieść komórki w inkubatorze, aby umożliwić przyleganie astrocytów. W tym samym czasie umieść w inkubatorze kontrolną płytkę 96-dołkową.Po około czterech godzinach należy sprawdzić kontrolną studzienkę 96-dołkową, aby ocenić, czy astrocyty przywarły do podłoża. Jeśli tak, należy przenieść cały zestaw z wkładką z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Ostrożnie usuń zewnętrzne rurki silikonowe oraz korki.Następnie umieść inserty w normalnej, pionowej orientacji w dołkach zawierających 800 µL na dołek medium do utrzymania komórek śródbłonka. Nanieś 20 000 komórek śródbłonka mózgu w 200 µL na luminalną powierzchnię pokrytą kolagenem i inkubuj w kokulturze przez trzy dni w medium BEC bez wymiany pożywki przed rozpoczęciem eksperymentu.Przed autoklawowaniem do późniejszego użycia należy przemyć rurki i korki silikonowe etanolem. Aby pobudzić barierę krew-mózg in vitro, należy najpierw zastąpić podłoża abluminalne i luminalne odpowiednio 600 µL i 100 µL bezzbiórkowego podłoża becs. Odessać płukaninę luminalną i zastąpić ją 100 µL bezzbiórkowego podłoża zawierającego czynniki stymulujące.W przypadku indukowania bariery krew-mózg (BBB) in vitro z przedziału astrocytarnego, należy odessać medium abluminalne i zastąpić je 600 µL medium bezsurowiczego. Medium zawierające czynniki stymulujące należy stosować dalej, przeprowadzając standardowe testy przepuszczalności parakomórkowej lub transkomórkowej z użyciem znaczników w celu ustanowienia modelu ludzkiej kontaktowej bariery krew-mózg. Uniezmiertelnione ludzkie astrocyty i komórki śródbłonka mózgu są hodowane na membranach o porach o wielkości trzech mikronów, które umożliwiają przenikanie stopek astrocytów w celu nawiązania kontaktu z komórkami śródbłonka.Metoda ta zapewniła optymalny, nieprzerwany okres wysiewu astrocytów i komórek BEC, które z kolei silnie przylegają do porowatej powierzchni przy minimalnej utracie komórek i osiągają konfluencję w ciągu trzech dni po wysiewie. Oba typy komórek zachowują swoje specyficzne markery na membranach porowatych, co potwierdzają wzorce ekspresji białka kwaśnego włókienka gliałego GFAP w SVG oraz czynnika von Willegranda VWF w NEC.Zgodnie z najbardziej podstawową cechą modelu kontaktowej bariery krew-mózg (BBB), astrocyty NFE mogą przenikać przez trzymikronowe pory do przedziału luminalnego. W związku z tym istnieje potencjalna możliwość kontaktu między SVG a BES osadzonymi na porach o takim wymiarze. Co więcej, obrazy SEM wskazują, że SVG i BBC były zdolne do wzrostu bezpośrednio nad porami błony, co jest zjawiskiem sztucznie przyczyniającym się do funkcji fizycznej bariery w modelach kontaktowych BBB in vitro.W niniejszym badaniu wykorzystano ludzki model bariery krew-mózg (BBB) w kontakcie w celu zbadania wpływu środka fibrynolitycznego TPA na BBB. Badania in vitro potwierdzają, że TPA rzeczywiście zwiększył przepuszczalność nienaruszonej BBB w sposób zależny od stężenia i czasu, przy czym oba parametry mieściły się w zakresie istotnym farmakologicznie. Na porowatych membranach po ekspozycji na TPA widoczne są gwałtowne zmiany morfologiczne astrocytów SVG, co sugeruje, że odpowiedź astrocytów na TPA leży u podstaw indukowanego przez TPA otwarcia BBB.Metoda ta odegrała kluczową rolę w naszych badaniach, których celem było sprawdzenie, w jaki sposób bariera krew-mózg reaguje na lek trombolityczny TPAA, stosowany u pacjentów z udarem w celu rozpuszczenia skrzepów krwi. Jest to pierwsza opisana w literaturze demonstracja tej metody i mamy nadzieję, że inni badacze zaadaptują ją do własnych celów.

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Udoskonaloną metodę przygotowania ludzkiego kontaktowego modelu bariery krew-mózg opartego na komórkach

Ten film pokazuje współhodowlę komórek ludzkiego mózgu perycytów, astrocytów i śródbłonka. Każda warstwa komórkowa jest tworzona oddzielnie, a następnie hodowana razem, tworząc trójwarstwowy system, który naśladuje układ komórkowy bariery...

Opracowanie modelu potrójnej hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg

Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CP) tworzą barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (BCSFB). Model in vitro BCSFB wykorzystuje ludzkie komórki brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP). W artykule opisano hodowlę i infekcję podstawno-boczną komórek HIBCPP przy użyciu systemu wkładek filtrujących do hodowli komórkowych.

Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Izolowane naczynia włosowate mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej mogą być użyte jako model przedkliniczny do badania funkcji bariery w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący ustawienie systemu hodowli z porowatej membrany poliestrowej BBB (bariera krew-mózg) w celulonowym systemie hodowli w celu oceny transportu biomolekuł lub czynników zakaźnych przez ludzki BBB i ich fizjologicznego wpływu na sąsiednie komórki mózgowe.

Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki oraz ich interakcji z mózgiem

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

Tutaj opisujemy metodę tworzenia modelu potrójnej hodowli komórkowej bariery krew-mózg na podstawie pierwotnych komórek śródbłonka mikronaczyniowego, astrocytów i perycytów ludzkiego mózgu. Ten wielokomórkowy model nadaje się do badań dysfunkcji jednostek nerwowo-naczyniowych podczas udaru niedokrwiennego in vitro lub do badań przesiewowych kandydatów na leki.

Potrójny pierwotny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Bariera krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilnego i zdrowego środowiska mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi. Opracowaliśmy trójwymiarowy model bariery krew-mózg pochodzący z komórek macierzystych, aby zbadać patologię naczyń mózgowych, integralność bariery krew-mózg oraz sposób, w jaki bariera krew-mózg jest zmieniona przez genetykę i chorobę.

Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

Poznaj ulepszoną metodę hodowli współkulturowej ludzkich astrocytów i komórek śródbłonkowych mózgu na porowatej membranie. Ta technika umożliwia dokładniejsze symulowanie bariery krew-mózg w celu badania jej przepuszczalności i testowania leków.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Przeglądaj więcej filmów