Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Celem niniejszej procedury jest symulacja bariery krew-mózg in vitro poprzez kokulturę astrocytów i komórek śródbłonka po przeciwnych stronach porowatej membrany. W pierwszej kolejności należy pokryć powierzchnię luminalną porowatej membrany macierzą zewnątrzkomórkową. Białka takie jak kolagen pasują do odwróconego insertu z zewnętrzną rurką silikonową i wewnętrznym korkiem silikonowym, co pozwala na stworzenie wyjmowalnego dołka nad powierzchnią abluminalną membrany.

Następnie wysiej komórki astrocytów na odwróconym wkładzie, aby przylgnęły one do powierzchni abluminalnej. Po tym usuń rurkę i umieść wkład w jego normalnej orientacji w studzience wypełnionej pożywką. W kolejnym kroku wysiej komórki endotelialne do komory luminalnej wkładu i przeprowadź kokulturę z przeciwległymi astrocytami.

Ostatecznie, do pomiaru zmian przepuszczalności in vitro BBB w odpowiedzi na różne czynniki stymulujące wykorzystuje się przejście znaczników fluorescencyjnych lub pomiar oporu elektrycznego śródbłonkowego. Procedurę tę zaprezentuje pan Barry Nigo, postdoc w moim laboratorium, który podczas studiów doktoranckich opracował zmodyfikowany protokół wysiewu, którego używamy do symulowania bariery krew-mózg. Pomysł na tę procedurę pojawił się po przetestowaniu prostszych metod wysiewu i napotkaniu wielu trudności związanych z przeciekaniem medium przez pory, a także z niewielkimi objętościami medium.

Powodowało to krótki i niewystarczający czas osadzania się astrocytów, co staramy się rozwiązać w naszej procedurze. Umieść inserty do hodowli tkankowej w dołkach płytki 24-dołkowej. Następnie dodaj 50 µL kolagenu szczurczego typu I w stężeniu 132 µg/mL, aby pokryć powierzchnię luminalną insertów, inkubuj przez noc w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C w celu usunięcia resztkowe kwasu, a następnie przemyj obie strony insertów – abluminalną i luminalną – wodą dwukrotnie destylowaną.

Następnie odwrócić wkłady i delikatnie dopasować krótki odcinek elastycznej rurki silikonowej wokół krawędzi porowatej membrany. Tworzy to w zasadzie nową studzienkę nad powierzchnią abluminalną. Aby uszczelnić stronę dolną.

Przygotuj korek z rurki silikonowej, której jeden koniec został uszczelniony odciętą końcówką probówki PCR o objętości 0,2 mililitra. Następnie, używając sterylnej pęsety, wprowadź silikonowy korek do światła jamistego i przesuń go, aż znajdzie się w odległości około jednego do dwóch milimetrów od błony. Następnie zasiać 40 000 astrocytów w 200 µL ich pożywki hodowlanej bezpośrednio do otworu silikonowego nad powierzchnią abluminalną błony.

Aby monitorować stan adhezji astrocytów, należy użyć standardowej płytki 96-dołkowej, ponieważ posiada ona taką samą powierzchnię jak wkładka 6,5 mm i umożliwia łatwiejszą wizualizację komórek za pomocą mikroskopii kontrastowej. Do płytki 96-dołkowej należy wysiać taką samą objętość zawiesiny komórek astrocytów. Będzie ona monitorowana w czasie, aby określić, kiedy astrocyty w dołku płytki, a tym samym w membranie wkładki, wystarczająco przywarły, aby zachować sterylność.

Przenieś zmontowane wkładki, umieszczając je pomiędzy dwiema płytkami 6-dołkowymi, aby zminimalizować ekspozycję na nieprzefiltrowane powietrze. Umieść komórki w inkubatorze, aby umożliwić przyleganie astrocytów. W tym samym czasie umieść w inkubatorze kontrolną płytkę 96-dołkową.

Po około czterech godzinach należy sprawdzić kontrolną studzienkę 96-dołkową, aby ocenić, czy astrocyty przywarły do podłoża. Jeśli tak, należy przenieść cały zestaw z wkładką z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Ostrożnie usuń zewnętrzne rurki silikonowe oraz korki.

Następnie umieść inserty w normalnej, pionowej orientacji w dołkach zawierających 800 µL na dołek medium do utrzymania komórek śródbłonka. Nanieś 20 000 komórek śródbłonka mózgu w 200 µL na luminalną powierzchnię pokrytą kolagenem i inkubuj w kokulturze przez trzy dni w medium BEC bez wymiany pożywki przed rozpoczęciem eksperymentu.

Przed autoklawowaniem do późniejszego użycia należy przemyć rurki i korki silikonowe etanolem. Aby pobudzić barierę krew-mózg in vitro, należy najpierw zastąpić podłoża abluminalne i luminalne odpowiednio 600 µL i 100 µL bezzbiórkowego podłoża becs. Odessać płukaninę luminalną i zastąpić ją 100 µL bezzbiórkowego podłoża zawierającego czynniki stymulujące.

W przypadku indukowania bariery krew-mózg (BBB) in vitro z przedziału astrocytarnego, należy odessać medium abluminalne i zastąpić je 600 µL medium bezsurowiczego. Medium zawierające czynniki stymulujące należy stosować dalej, przeprowadzając standardowe testy przepuszczalności parakomórkowej lub transkomórkowej z użyciem znaczników w celu ustanowienia modelu ludzkiej kontaktowej bariery krew-mózg. Uniezmiertelnione ludzkie astrocyty i komórki śródbłonka mózgu są hodowane na membranach o porach o wielkości trzech mikronów, które umożliwiają przenikanie stopek astrocytów w celu nawiązania kontaktu z komórkami śródbłonka.

Metoda ta zapewniła optymalny, nieprzerwany okres wysiewu astrocytów i komórek BEC, które z kolei silnie przylegają do porowatej powierzchni przy minimalnej utracie komórek i osiągają konfluencję w ciągu trzech dni po wysiewie. Oba typy komórek zachowują swoje specyficzne markery na membranach porowatych, co potwierdzają wzorce ekspresji białka kwaśnego włókienka gliałego GFAP w SVG oraz czynnika von Willegranda VWF w NEC.

Zgodnie z najbardziej podstawową cechą modelu kontaktowej bariery krew-mózg (BBB), astrocyty NFE mogą przenikać przez trzymikronowe pory do przedziału luminalnego. W związku z tym istnieje potencjalna możliwość kontaktu między SVG a BES osadzonymi na porach o takim wymiarze. Co więcej, obrazy SEM wskazują, że SVG i BBC były zdolne do wzrostu bezpośrednio nad porami błony, co jest zjawiskiem sztucznie przyczyniającym się do funkcji fizycznej bariery w modelach kontaktowych BBB in vitro.

W niniejszym badaniu wykorzystano ludzki model bariery krew-mózg (BBB) w kontakcie w celu zbadania wpływu środka fibrynolitycznego TPA na BBB. Badania in vitro potwierdzają, że TPA rzeczywiście zwiększył przepuszczalność nienaruszonej BBB w sposób zależny od stężenia i czasu, przy czym oba parametry mieściły się w zakresie istotnym farmakologicznie. Na porowatych membranach po ekspozycji na TPA widoczne są gwałtowne zmiany morfologiczne astrocytów SVG, co sugeruje, że odpowiedź astrocytów na TPA leży u podstaw indukowanego przez TPA otwarcia BBB.

Metoda ta odegrała kluczową rolę w naszych badaniach, których celem było sprawdzenie, w jaki sposób bariera krew-mózg reaguje na lek trombolityczny TPAA, stosowany u pacjentów z udarem w celu rozpuszczenia skrzepów krwi. Jest to pierwsza opisana w literaturze demonstracja tej metody i mamy nadzieję, że inni badacze zaadaptują ją do własnych celów.