Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Procedura ta ma na celu symulację in vitro bariery krew-mózg poprzez kohodowlę astrocytów i komórek śródbłonka po przeciwnych stronach porowatej błony. Najpierw pokryj powierzchnię świetlną porowatej błony macierzą zewnątrzkomórkową. Białko takie jak kolagen pasuje do odwróconej wkładki z zewnętrzną silikonową rurką i wewnętrzną silikonową zatyczką, aby stworzyć wyjmowaną studnię nad abluminalną powierzchnią membrany.

Teraz zasiej komórki astrocytów na odwróconej wkładce, tak aby przylegały do powierzchni abluminalnej. Następnie wyjmij rurkę i umieść wkładkę w normalnej orientacji w dobrze wypełnionej pożywce. Następnie zasiej komórki śródbłonka w przedziale luminalnym wkładki i współhoduj z przeciwstawnymi astrocytami.

Ostatecznie przejście znaczników fluorescencyjnych lub rejestracja oporu elektrycznego śródbłonka trans jest wykorzystywana do pomiaru zmian przepuszczalności w BBB in vitro w odpowiedzi na różne czynniki stymulujące. Tę procedurę zademonstruje pan Barry Nigo, doktor habilitowany w moim laboratorium, który w trakcie swojego doktoratu opracował zmodyfikowany protokół wysiewu, który wykorzystaliśmy do symulacji bariery krew-mózg. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej procedury po przetestowaniu bardziej prymitywnych metod osadzania i dużej frustracji z powodu wycieku medium przez pauzę, a także małych średnich objętości.

Podyktowało to krótkie i niewystarczające okresy siedzenia astrocytów, z czym staramy się rozwiązać w naszej procedurze. Umieść wkładki do hodowli tkankowych w dołkach 24-dołkowej płytki. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 132 mikrogramów na mililitr kolagenu szczura, jeden do pokrycia powierzchni świetlnej wkładek, inkubuj przez noc w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu usunięcia pozostałości kwasu, umyj zarówno abluminalną, jak i luminalną stronę wkładek podwójnie destylowaną wodą.

Następnie odwróć wkładki i delikatnie dopasuj krótki kawałek elastycznej silikonowej rurki wokół krawędzi porowatej membrany. Zasadniczo tworzy nową studnię nad powierzchnią abluminalną. Aby uszczelnić spód.

Przygotuj zatyczkę wykonaną z silikonowej rurki uszczelnionej z jednej strony naciętą końcówką 0,2 mililitrowej probówki do PCR. Teraz za pomocą sterylnego kleszcza włóż silikonową zatyczkę do wnęki luminalnej i przesuwaj ją, aż dotrze do około jednego do dwóch milimetrów od membrany. Następnie wysiew, 40 000 astrocytów w 200 mikrolitrach ich pożywki podtrzymującej bezpośrednio do silikonu znacznie powyżej powierzchni błony abluminalnej.

Aby monitorować stan przylegania astrocytów, użyj standardowej płytki 96-dołkowej, ponieważ ma ona taką samą powierzchnię jak wkładka 6,5 milimetra i pozwala. Łatwiejsza wizualizacja komórek za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, ziarna identycznej objętości zawiesiny komórek astrocytów do ósmej płytki 96-dołkowej. Będzie to monitorowane w czasie, aby określić, kiedy astrocyty w studzience 96, a co za tym idzie w błonie wkładki, wystarczająco przylegają, aby zachować sterylność.

Zmontowane wkładki należy transportować pomiędzy dwiema płytkami sześciodołkowymi, aby zminimalizować narażenie na niefiltrowane powietrze. Umieść komórki w inkubatorze, aby astrocyty mogły przylegać. W tym czasie należy również umieścić w inkubatorze płytkę kontrolną 96 studzienki.

Po około czterech godzinach dobrze sprawdź kontrolę 96, aby zobaczyć, czy astrocyty przylegały. Jeśli tak, przenieś zespół wkładki z powrotem do kaptura do hodowli tkankowych. Delikatnie wyjmij zewnętrzną silikonową rurkę i zatyczki.

Następnie przywróć wkładki do normalnej orientacji pionowej do studzienek zawierających 800 mikrolitrów na studzienkę pożywki do konserwacji komórek śródbłonka. Zobacz 20 000 komórek śródbłonka mózgu w 200 mikrolitrach na pokrytej kolagenem kokulturze powierzchni luminalnej przez trzy dni w pożywce BEC bez żadnej zmiany pożywki. Przed eksperymentowaniem.

Umyj silikonowe rurki i korki w etanolu przed autoklawowaniem do późniejszego użycia. Aby stymulować barierę mózgową krwi in vitro, najpierw zastąp pożywkę abluminalną i luminalną odpowiednio 600 mikrolitrami i 100 mikrolitrami pożywki wolnej od surowicy. Odessać płyn do płukania luminalu i zastąpić 100 mikrolitrami surowicy wolnej od pożywki zawierającej środki stymulujące.

W przypadku indukcji BBB in vitro z przedziału astrocytowego, należy odessać podłoże abluminalne i zastąpić 600 mikrolitrami surowicy wolnej. Pożywki zawierające środki stymulujące kontynuują standardowe testy przepuszczalności parakomórkowej lub transkomórkowej znaczników etykiety w celu ustanowienia modelu bariery krew-mózg w kontakcie z człowiekiem. Ludzkie unieśmiertelnione astrocyty i komórki śródbłonka mózgu są hodowane na trzech mikronowych porowatych błonach, które umożliwiają przejście astrocytów i stóp w celu kontaktu z komórkami śródbłonka.

Metoda ta pozwoliła na optymalny, nieprzerwany okres wysiewu astrocytów i beków, które z kolei silnie przylegają do porowatej powierzchni przy minimalnej utracie komórek i osiągają płynność w ciągu trzech dni. Po wysiewie. Oba typy komórek utrzymują swoje specyficzne dla komórek markery na porowatych błonach, na co wskazują wzorce ekspresji kwaśnego białka fibrylarnego gleju GFAP w SVG i czynniku von Vinda VWF NEC.

Zgodnie z najbardziej podstawową cechą kontaktowego modelu BBB, astrocytarny NFE może przechodzić przez trzy pory mikronowe do przedziału luminalnego. W związku z tym potencjalnie może istnieć kontakt między SVG i BES osadzonymi na porach tego wymiaru. Co więcej, obrazowanie SEM wskazuje, że SVG i BBC były zdolne do wzrostu bezpośrednio nad porami błony, co jest zjawiskiem, które sztucznie przyczynia się do funkcji bariery fizycznej w modelach kontaktowych BBB in vitro.

W tym badaniu model BBB kontaktu z człowiekiem jest wykorzystywany do zbadania wpływu czynnika fibrynolitycznego TPAA na barierę krew-mózg. Te badania in vitro potwierdzają, że TPA rzeczywiście zwiększał przepuszczalność nienaruszonej bariery krew-mózg w sposób zależny od stężenia i czasu, które mieściły się w odpowiednim zakresie farmakologicznym. Dramatyczne zmiany morfologiczne astrocytów SVG są widoczne na porowatych błonach po ekspozycji na TPA, co sugeruje, że odpowiedź astrocytowa na TPA leży u podstaw indukowanego przez TPA otwarcia BBB.

Metoda ta odegrała kluczową rolę w naszych badaniach, które miały na celu zbadanie, w jaki sposób bariera krew-mózg reaguje na lek trombolityczny TPAA stosowany u pacjentów po udarze mózgu w celu rozpuszczenia skrzepów krwi. Jest to pierwsza demonstracja tej metody w literaturze i mamy nadzieję, że inni badacze będą mogli zastosować ją do własnych celów.