Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ekstrakcja białek z tkanki mózgowej człowieka i myszy do analiz proteomicznych. Zostaje to osiągnięte poprzez zastosowanie wspólnego buforu lizującego w celu uzyskania identycznej ekstrakcji białek, dostosowanej do metod elektroforezy dwuwymiarowej. Następnie wykorzystuje się dwuwymiarową fluorescencyjną elektroforezę różnicową (DIGE) do rozdzielenia białek w celu ich identyfikacji za pomocą spektrometrii mas.

Następnie przeprowadzono miniaturową elektroforezę w żelu 2D z immunoblottingiem w celu identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych. Wyniki mogą wykazać globalną ekspresję białek. Zmiany translacyjne gospodarza obejmują wszystkie produkty ligamentyzacji i produkty katalityczne, w oparciu o różnice w punkcie izoelektrycznym i masie cząsteczkowej.

Połączenie 2D dash i 2D monolo może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuroproteomiki poprzez jednoczesne dostarczenie informacji o zmianach w ekspresji, modyfikacjach posttranslacyjnych i katabolizmie produktów. Rozpocznij od pobrania i homogenizacji tkanki mózgowej. Przygotuj tkankę w stężeniu 10% w stosunku masy do objętości w buforze ekstrakcyjnym dla ludzkiej tkanki mózgowej.

Zhomogenizuj tkankę za pomocą szklanej pipety, jednak w przypadku tkanki gryzoni użyj homogenizatora teflonowego, aby rozbić homogenat. Poddaj go sonikacji przy częstotliwości 60 hertz, stosując 30 pulsów trwających po pół sekundy. Następnie wyznacz stężenie białka za pomocą metody Bradforda, używając BSA jako wzorca.

Następnie przygotuj roztwory do wytrącania chloroformowo-metanolowego w wiaderku z lodem. Należy zaplanować pobranie około 125 µg dla pasków IPG o długości 11 cm lub około 1,25 mg dla pasków IPG o długości 18 cm. Gdy roztwory osiągną temperaturę 4 °C, przeprowadź proces wytrącania całkowicie w lodzie.

Najpierw należy dodać trzy objętości metanolu, a następnie jedną objętość chloroformu. Mieszaninę należy wstrząsnąć. Następnie dodaje się trzy objętości zimnej wody.

Wymieszać tę mieszaninę za pomocą wirówki vortex przez jedną minutę, a następnie odwirować probówkę z próbką z prędkością 12 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać i usunąć nadsącz. Następnie dodać trzy objętości metanolu, wymieszać za pomocą wirówki vortex i wytrącić białka w ten sam sposób.

Osusz zebrany osad białkowy w strumieniu azotu przed analizą 2D DIGE. Ponownie zawieś białko w buforze do 2D w stężeniu 2,5 mg/mL. Następnie poddaj próbki sonikacji, zgodnie z poprzednią procedurą, aż do momentu ich wykorzystania.

Przechowywać je w temperaturze -80°C przed rozpoczęciem tego etapu oraz po wytrącaniu białek. Konieczne jest ponowne oznaczenie stężenia białka za pomocą metody Bradforda, postępując zgodnie z procedurą opisaną wcześniej, przed znakowaniem barwnikiem psy.

W tym celu jakość próbki białka weryfikuje się za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. 15 µg białka rozcieńczono w buforze LDS i inkubowano w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej lub bloku grzejnym. Następnie próbki poddano elektroforezie na żelu poliakryloamidowym, a żel barwiono roztworem błękitu Coomassie przez co najmniej godzinę.

Następnie pozostaw żel na noc w roztworze 7% kwasu octowego i 10% etanolu. Po ustaleniu jakości próbki białka, następnego dnia rozpoczyna się procedurę znakowania SD. Najpierw zmierz pH lizatu, które powinno być zasadowe lub neutralne.

Optymalne pH dla kolejnych reakcji wynosi 8.6. Następnie przygotuj reakcje sprzęgania barwnika dla każdej próbki białka. Wymieszaj 50 µg z 400 pmol barwnika S3 oraz 50 µg z 400 pmol barwnika S5.

Przeprowadź tę procedurę w czterech powtórzeniach, co da łącznie osiem reakcji sprzęgania D dla każdej próbki. Dla każdej badanej próbki przygotuj uzupełniający zestaw reakcji sprzęgania DI, wykorzystując białka z kontroli, na przykład z mózgu chorego. Następnie dla każdej pary reakcji przygotuj reakcję kontroli wewnętrznej z 400 picomoli CY two oraz reprezentatywną mieszaniną wszystkich białek o łącznej masie 250 mikrogramów.

Znakowanie SAI przeprowadza się poprzez inkubację wszystkich mieszanin reakcyjnych w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez godzinę. Po inkubacji wszystkie zestawy trzech różnych reakcji z cyjaninem łączy się do objętości 150 µL, a następnie do każdego zestawu reakcji dodaje się 200 µL buforu 2D. Następnie należy przystąpić do etapów elektroforezy 2D.

Rozpocznij od przygotowania nieznakowanych roztworów białek do żelu preparatywnego, z którego będą wycinane plamki białek dla każdej próbki oraz dla kontroli pozytywnej. Odmierz 300 do 350 µg nieznakowanego białka do buforu 2D i pozwól im na rehydratację w kontakcie z paskiem IPG. Następnie załaduj paski IPG i przenieś znakowane oraz nieznakowane białka do rehydratacji.

Następnie należy przykryć każdą studzienkę paskiem reakcyjnym IPG. Po tym kroku nałożyć warstwę oleju mineralnego i pozostawić paski do pasywnej rehydratacji w roztworze białek przez noc w temperaturze nieprzekraczającej 25 °C. Następnego dnia przeprowadzić izoelektryczne ogniskowanie pasków IPG.

Następnie usunąć olej i przechowywać paski IPG w temperaturze -20 °C w celu ich ekwilibracji. Zanurzyć paski w buforze do ekwilibracji na 15 minut. Następnie przenieść paski do 4,7% acetamidu IDO w buforze do ekwilibracji bez dodatku DTT, pozostawiając paski w roztworze.

Używając dużego systemu do elektroforezy 2D, przygotuj cztery żele SDS-PAGE 12% na próbkę w szklanych płytkach o niskiej fluorescencji dla białek znakowanych. Przygotuj również jeden żel SDS-PAGE 12% w standardowych szklanych płytkach o grubości 1,5 mm dla każdego z białek nieznakowanych. Są to żele preparatywne.

Po ochłodzeniu żeli przenieś paski na ich górną powierzchnię i pokryj je 0,5% Aros. Po ostygnięciu prowadź elektroforezę w żelach przy mocy 2,5 W w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie przeanalizuj je następnego dnia. Wiele reakcji 2D można przeprowadzić z wykorzystaniem próbek białek użytych do żeli preparatywnych. Odmierz mniej niż 100 µg próbki do 200 µL buforu 2D.

Następnie intensywnie wymieszać mieszaniny próbek w wortexie i krótko odwirować. Nanieść próbki na 11 centymetrowe paski IPG i pozostawić do pasywnej rehydratacji przez noc, przykrywając je olejem mineralnym, a następnego dnia przeprowadzić ogniskowanie izoelektryczne.

Następnie przenieś paski do trzech kąpieli z buforem równoważącym na 15 minut w każdej z nich. Paski są następnie poddawane elektroforezie na żelach 2D SDS-PAGE. Nałóż każdy pasek na gotowy żel o odpowiedniej masie cząsteczkowej.

Poliakrylamid dla białka docelowego. Następnie przenieś żele na membranę NITROCELLULOSE PVDF i przeanalizuj je za pomocą przeciwciał zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Trzy różne rodzaje lizy.

Przeprowadzono testy buforów. W pierwszej kolejności przetestowano powszechnie stosowany w biochemii i biologii molekularnej bufor Tris SDS.

Bufor Tris SDS wykazał słabą rozdzielczość w porównaniu z innym przetestowanym buforem UTS. Trzeci bufor został odrzucony, ponieważ nie można było z jego użyciem przygotować próbek do analizy. Następnie zbadano proteomy mózgu człowieka i myszy.

Porównano próbki kory kontrolnej człowieka oraz próbki kory w chorobie Alzheimera (AD). Białka mózgu myszy z patologią tau przypominającą AD analizowano również w odniesieniu do próbek ludzkich. Próbki SCI two, S SI three oraz sci five analizowano niezależnie dla każdego przypadku D. Wysoka rozdzielczość plamek ułatwiła dopasowanie.

W celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych wykorzystano jakościową mini analizę 2D, w której stwierdzono, że ligandyzowana alfa-synukleina w tkance tłuszczowej wykazuje prawidłowy profil, lecz występuje również w formie dimeru oznaczonego gwiazdką. Strzałki wskazują miejsca obecności alfa-synukleiny. Za pomocą mini 2D analizowano również ubikwitynowane białko prekursor amyloidowy.

Sporadyczną postać choroby Alzheimera porównano z postacią rodzinną. W rodzinnej postaci choroby Alzheimera stężenia beta-amyloidu 1-42 oraz wariancji ISO są niższe, ponieważ formy liganda stwierdzono przy masie 8 kDa. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat badania proteomu w celu porównania złożonych próbek poprzez pomiar modyfikacji ekspresji białek.