Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE
April 10th, 2014
Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ekstrakcja białka z tkanki mózgowej człowieka i myszy do analizy proteomicznej. Osiąga się to poprzez zastosowanie wspólnego buforu do lizy w celu uzyskania tej samej ekstrakcji białka dostosowanej do dwuwymiarowych podejść do elektroforezy. Następnie dwuwymiarowa elektroforeza żelowa różnicy fluorescencji służy do rozdzielania białek w celu identyfikacji za pomocą spektrometrii mas.
Następnie przeprowadza się miniaturową elektroforezę żelową 2D z immunoblottingiem w celu identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych. Wyniki mogą pokazać globalną ekspresję białek. Translacja gospodarza zmienia wszystkie produkty ligamentyzacji i katalityczne w oparciu o różnice w punkcie izoelektrycznym i masie cząsteczkowej.
Połączenie myślnika 2D i monolo 2D może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie neuroproteomiki, jednocześnie dostarczając informacji na temat zmian ekspresji. Modyfikacja pocztowa i katabolizm w produktach Rozpocznij od pobrania i homogenizacji tkanki mózgowej. Przygotuj tkankę o stężeniu wagowym 10% do objętości w buforze ekstrakcyjnym dla ludzkiej tkanki mózgowej.
Homogenizuj tkankę za pomocą szklanego pipetera, jednak użyj homogenizatora teflonowego do tkanki gryzonia, aby rozbić dowolny homogenat. Sonikuj go z częstotliwością 60 Hz za pomocą 30 impulsów półsekundowych. Następnie określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda, używając BSA jako wzorca.
Teraz zbierz roztwory do wytrącania chloroformu metanolu w wiadrze na lód. Zaplanuj pobranie około 125 mikrogramów w przypadku 11-centymetrowych pasków IPG lub około 1,25 miligramów w przypadku 18-centymetrowych pasków IPG. Gdy roztwory osiągną temperaturę czterech stopni Celsjusza, wykonaj wytrącanie całkowicie na lodzie.
Najpierw dodaj trzy objętości metanolu, a następnie jedną chloroformu. Wstrząśnij tą mieszanką. Następnie dodaj trzy objętości zimnej wody.
Wirować, tę mieszaninę przez jedną minutę odwirowywać probówkę z próbką o sile 12 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj trzy objętości wiru metanolu i odwiruj białka w ten sam sposób.
Wysuszyć zebrane granulki białkowe pod gazowym azotem przed DIGE 2D. Ponownie zawiesić białko w buforze 2D w ilości 2,5 miligrama na mililitr. Następnie poddać próbki działaniu sonikacji, tak jak to miało miejsce wcześniej, aż do momentu, gdy zostaną użyte.
Przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed rozpoczęciem tego etapu i po wytrąceniu białka. Konieczne jest ponowne określenie stężenia białka za pomocą testu Bradforda. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, jak pokazano wcześniej, przed etykietowaniem barwnika psy.
W tym celu jakość próbki białka jest weryfikowana na stronie SDS. Rozcieńczyć 15 mikrogramów białka w LDS i rozcieńczyć je do 37 stopni Celsjusza w łaźni grzewczej lub bloku. Następnie uruchom je na żelu z poliakrylamidu, zabarwić żel roztworem Kumasi Blue przez co najmniej godzinę.
Następnie należy zatrzymać żel na noc w 7% roztworze kwasu octowego i 10% etanolu. Po ustaleniu jakości próbki białka, następnego dnia rozpoczyna się procedura znakowania SD. Najpierw zmierz pH lizatu, które powinno być od zasadowego do obojętnego.
Optymalne pH to 8,6 dla kolejnych reakcji. Następnie ustaw reakcje koniugacji barwnika dla każdej próbki białka. Zmieszać 50 mikrogramów z 400 pikomolami barwnika S3 i 50 mikrogramów z 400 pikomolami barwnika S 5.
Zrób to w kwadrupleksie, aby uzyskać w sumie osiem reakcji sprzężenia D na próbkę. Dla każdej badanej próbki należy wykonać uzupełniający zestaw reakcji sprzęgania DI przy użyciu białka z kontroli, np. z chorego mózgu. Następnie dla każdej pary reakcji należy ustawić reakcję kontroli wewnętrznej z 400 pikomolami CY dwa i równą reprezentacją wszystkich białek o łącznej wartości 250 mikrogramów.
Znakowanie SAI uzyskuje się poprzez inkubację wszystkich mieszanin reakcyjnych w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez godzinę. Po inkubacji połącz wszystkie zestawy trzech różnych reakcji cyjanu w objętościach 150 mikrolitrów do każdego zestawu reakcji w 200 mikrolitrach buforu 2D. Następnie przejdź do etapów elektroforezy 2D.
Rozpocząć od przygotowania nieznakowanych roztworów białkowych do żelu preparatywnego, z którego zostaną wycięte plamki białkowe dla każdej próbki i dla kontroli pozytywnej. Podwielokrotność 300 do 350 mikrogramów nieznakowanego białka do buforu 2D i pozwolić im na ponowne uwodnienie w kontakcie z paskiem IPG. Następnie załaduj paski IPG, przenieś znakowane i nieznakowane białko do ponownego nawodnienia.
Cóż, następnie przykryj każdą studzienkę paskiem reakcyjnym IPG. Następnie nałóż olej mineralny i pozwól paskom pasywnie nawodnić się roztworem białkowym przez noc w temperaturze nie wyższej niż 25 stopni Celsjusza. Następnego dnia przeprowadź ogniskowanie izoelektryczne pasków IPG.
Następnie usuń olej i przechowuj paski IPG w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby zrównoważyć paski IPG. Zanurz je w buforze równowagi na 15 minut. Następnie przenieś paski do 4,7% acetamidu IDO w buforze równowagi, bez DTT podczas kąpieli pasków.
Użyj dużego systemu żelowego 2D, aby wlać cztery 12% żele stronicowe SDS na próbkę w szklanych płytkach o niskiej fluorescencji dla znakowanych białek. Wlej również jeden żel 12% SDS Page w standardowych szklanych płytkach o grubości 1,5 milimetra dla każdego z nieznakowanych białek. Są to żele preparatywne.
Gdy żele zostaną schłodzone, przenieś paski na wierzch żeli i pokryj paski 0,5% Aros po schłodzeniu, uruchom żele z mocą 2,5 wata w czterech stopniach Celsjusza przez noc i przeanalizuj je następnego dnia. Wiele reakcji 2D można przeprowadzić z próbkami białek używanymi do żeli preparatywnych. Odmierz mniej niż 100 mikrogramów próbki do 200 mikrolitrów buforu 2D.
Następnie energicznie zwiruj mieszaniny próbek i szybko je zawiruj. Załaduj próbki na 11-centymetrowe paski IPG i pozwól im pasywnie nawodnić się przez noc pokrytych olejem mineralnym następnego dnia. Wykonaj ogniskowanie izoelektryczne.
Następnie przepuścić paski przez trzy kąpiele buforu równoważącego przez 15 minut na kąpiel. Paski są następnie uruchamiane na żelach stronicowych 2D SDS. Ułóż każdy pasek na prefabrykowanym żelu o odpowiedniej masie cząsteczkowej.
Poliakrylamid dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Następnie przenieś żele na membranę NITROCELULOZA PVDF i przeanalizuj je z przeciwciałami w ramach opracowywania tego protokołu. Trzy różne lizy.
Przetestowano. Po pierwsze, wspólny bufor biochemiczny i biologii molekularnej. Tris SDS został przetestowany.
Tris SDS miał słabą rozdzielczość w porównaniu do innego testowanego bufora UTS. Trzeci bufor do de został wykluczony, ponieważ nie można było z nim przygotować próbek nadających się do testowania. Następnie zbadano proteomy mózgu człowieka i myszy.
Porównano próbki ludzkiej kory kontrolnej i próbki kory ad. Białka mózgu myszy z patologią tau podobną do AD oglądano również z próbki ludzkiej. SCI dwa było analizowane niezależnie, podobnie jak S SI trzy i sci pięć dla każdego D. Wysoka rozdzielczość punktowa ułatwiła wyrównanie.
Do zbadania modyfikacji potranslacyjnych zastosowano jakościową mini analizę 2D i stwierdzono, że więzadeł alfa synukleina w tkance ada ma normalny profil, ale także występuje jako dimer oznaczony gwiazdką. Strzałki oznaczały miejsca, w których znaleziono alfa synukleinę. Ubikwitynowane białko prekursorowe amyloidu było również oglądane za pomocą mini 2D.
Sporadyczne reklamy porównano z rodzinną. W rodzinnym ad beta amyloid od jednego do 42 i wariancja ISO są niższe w stężeniu, ponieważ formy liga znaleziono w ośmiu kilodaltonach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać proteom, aby porównywać złożone próbki, mierząc modyfikacje ekspresji białek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na ekstrakcji białek z tkanki mózgu ludzkiego i mysiego przy użyciu wspólnego buforu lizującego do analizy proteomicznej. Metoda umożliwia identyfikację i charakteryzację białek za pomocą zaawansowanych technik elektroforezy.
Kluczowe Elementy Badania
Dział Obszaru Nauki
- Proteomika
- Neuroscience
- Biochemia
Tło
- Ekstrakcja białek jest kluczowa dla zrozumienia funkcji mózgu.
- Techniki dwuwymiarowej elektroforezy zwiększają rozdzielczość białek.
- Modyfikacje posttranslacyjne mogą znacząco wpływać na funkcję białek.
- Niezbędne są wiarygodne metody w celu uzyskania powtarzalnych wyników w biopsjach i modelach.
Cel Badania
- Ekstrakcja białek z tkanki mózgowej do analizy.
- Wykorzystanie dwuwymiarowej elektroforezy różnicowej z fluorescencją.
- Identyfikacja modyfikacji posttranslacyjnych za pomocą western blot.
Wykorzystane Metody
- Ekstrakcja białek za pomocą buforu mocznika/tiourea/SDS.
- Dwuwymiarowa elektroforeza różnicowa z fluorescencją (2D-DIGE).
- Mini 2D elektroforeza do western blot.
- Spektrometria masowa do identyfikacji białek.
Główne Wyniki
- Pomyślna ekstrakcja białek z tkanki mózgu ludzkiego i mysiego.
- Identyfikacja białek za pomocą spektrometrii masowej.
- Charakteryzacja modyfikacji posttranslacyjnych.
- Zwiększona powtarzalność wyników z biopsji i modeli.
Wnioski
- Metoda zapewnia wiarygodne wyniki dla analiz proteomicznych.
- Ułatwia badanie ekspresji i modyfikacji białek.
- Podejście to można zastosować w różnych badaniach neurologicznych.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized protein extraction from limited human post-mortem and murine brain tissue, supporting reproducible proteomic profiling in neurodegenerative disease models. By integrating 2D-DIGE for quantitative expression analysis and mini 2DE immunoblotting for post-translational modification validation, the method strengthens target validation confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates cross-species comparison and biomarker discovery relevant to Alzheimer’s disease and Lewy body dementia pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant brain tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting post-translational modifications such as ubiquitination and dimerization of disease-associated proteins like alpha-synuclein and amyloid precursor protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing qualitative comparison of protein modifications across conditions, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by yielding protein extracts compatible with 2D-DIGE and immunoblotting platforms.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through standardized lysis buffer and chloroform-methanol precipitation, improving consistency across human and murine samples.
- Quantitative Output: Enables reliable compound evaluation via fluorescence difference gel electrophoresis, supporting differential expression screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of molecular pathways in neurodegenerative diseases by enabling analysis of protein aggregates such as amyloid-beta and alpha-synuclein.
- Translational Continuity: Provides continuity from discovery through preclinical validation by allowing side-by-side comparison of human and mouse brain proteomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying disease-associated protein modifications and expression changes in models of tau pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly in neurodegenerative disease programs requiring mechanistic insight and target de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein expression changes and post-translational modifications via isoelectric point and molecular weight separation.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through 2D-DIGE, enabling comparison of protein expression across complex samples.
- Analytics: Generates measurable readouts including spot intensity, migration shifts, and modification patterns that help teams compare conditions and prioritize targets.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of human and murine brain tissue under comparable conditions, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, applicable across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of protein modifications and expression shifts.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via standardized lysis buffer and protein precipitation protocols, minimizing variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insight, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on protein biomarkers and modification states relevant to disease progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, protein biochemistry, and electrophoresis techniques including 2D-DIGE and immunoblotting.
- Depends on instrumentation such as electrophoresis systems, sonicators, centrifuges, and mass spectrometry-compatible platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, protein quantification, and labeling procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, disease models, or sample quantities.
- Includes practical limitations such as the need for careful sample handling to prevent degradation and the dependency on sufficient protein yield from limited tissue inputs.
