Name: Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj standaryzowane ilościowe Western blotting do porównywania poziomów białka w różnych tkankach i etapach rozwojowych. Ta metoda łączy fluorescencyjne barwienie białek z wewnętrznymi kontrolami ładunku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.J.N.G. jest wspierany przez Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Inne fundusze zostały zapewnione przez SMA Trust (SMA UK Consortium; T.H.G. & Y-T.H.), SMA Europe (T.H.G, D.v.d.h. & E.J.N.G.), University of Edinburgh DTP in Precision Medicine (T.H.G., L.L. & A.M.M.) oraz Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research (T.H.G.).

Tkanki do tej procedury zostały uzyskane z badań na zwierzętach, które zostały zatwierdzone przez wewnętrzną komisję etyki na Uniwersytecie w Edynburgu i zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i brytyjskim Home Office, na podstawie odpowiednich licencji osobistych i projektowych.
UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany przy użyciu standardowych, dostępnych na rynku zestawów i odczynników w celu zwiększenia odtwarzalności (zobacz Tabelę Materiałów).
1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Ekstrakcja białek 
	<ol>
		<li>Przenieść zamrożone próbki komórek lub tkanek z temperatury -80 °C na suchy lód, rozmrozić na lodzie i przemyć w razie potrzeby lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (szczegółowe informacje na temat tkanek i płukania PBS znajdują się w tabeli 1). Unikaj niepotrzebnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ wpłynie to na jakość białka.</li>
		<li>Dodać bufor do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% deoksycholan sodu, 0,1% SDS) zawierający 1x inhibitor proteazy do każdej próbki, stosując optymalną ilość na masę tkanki (zalecenia znajdują się w Tabeli 1). 
		UWAGA: W zależności od zastosowania, rodzaj i ilość bufora homogenizacyjnego może wymagać dalszej optymalizacji.</li>
		<li>Do homogenizacji próbek tkanek należy użyć ręcznego homogenizatora elektrycznego z tłuczkiem polipropylenowym. Pomiędzy każdą próbką umyj tłuczek w wodzie podwójnie destylowanej i osusz czystą chusteczką. Zmieniaj tłuczek między różnymi warunkami eksperymentalnymi i tkankami.</li>
		<li>Pozostawić próbki na lodzie na 10 minut po homogenizacji. Odwirować próbki w temperaturze >10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki na lodzie, nie naruszając osadu. Supernatantem jest próbka białka. Wyekstrahowane białko należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przystąpić do pomiaru stężenia białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja i normalizacja stężenia białka 
	<ol>
		<li>Zmierz stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA). Przygotować mieszaninę do oznaczania BCA zgodnie z instrukcjami producenta w 96-dołkowej płytce optycznej, używając 200 μl mieszanki BCA na basenik. 
		UWAGA: Inne metody kwantyfikacji, takie jak testy Lowry'ego i Bradforda, mogą być również stosowane do określania stężenia białka, o ile stężenie białka jest konsekwentnie określane ilościowo we wszystkich eksperymentach.</li>
		<li>Przygotować wzorce albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w rosnących stężeniach w trzech egzemplarzach i dodać 1 μl każdej próbki białka w dwóch egzemplarzach. Inkubować 96-dołkową płytkę w podgrzanym bloku grzewczym w temperaturze 60 °C przez 10 minut lub dłużej, jeżeli przewiduje się, że stężenie białka będzie niskie.</li>
		<li>Po inkubacji zmierzyć absorpcję przy długości fali 560 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
		<li>Eksportuj pomiary czytnika płytek i oblicz stężenie białka, porównując średnie wartości absorbancji każdej próbki z krzywą wzorcową uzyskaną przy użyciu wzorca białka. Wartość R-kwadrat dla krzywej wzorcowej powinna być większa lub równa 0,98, aby dokładnie oszacować stężenie białka w próbce.</li>
		<li>Normalizować ilość białka, przygotowując rozcieńczenia próbek białek w buforze próbki i wodzie ultraczystej. Całkowitą objętość można regulować w zależności od rodzaju użytego żelu. Zaleca się załadowanie 30 μg białka na linię jako ilość początkową. W razie potrzeby dodać do każdej próbki środek redukujący, taki jak ditiotreitol (DTT; stężenie końcowe 5 mM) lub beta-merkaptoetanol (stężenie końcowe 200 mM). Odpipetować nierozcieńczony beta-merkaptoetanol w dygestorium.</li>
		<li>Próbki inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Umieścić próbki na lodzie, zagłuszyć i krótko odwirować w celu zebrania. Trzymaj na lodzie do momentu załadowania żelu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Elektroforeza żelowa próbek białek
<ol>
	<li>Konfiguracja urządzenia i żelu
	<ol>
		<li>Ustawić prefabrykowany żel gradientowy Bis-Tris o sile 4–12% (patrz tabela materiałów) w systemie komory do elektroforezy żelowej. Przed użyciem spłucz żele wodą podwójnie destylowaną. 
		UWAGA: W zależności od wielkości, interakcji i obfitości białka będącego przedmiotem zainteresowania, można stosować żele o różnym gradiencie, środku buforującym lub wielkości i liczbie studzienek.</li>
		<li>Dodaj 500 ml 1x buforu do biegania MES SDS rozcieńczonego w podwójnie destylowanej wodzie na zbiornik. Ostrożnie wyjmij grzebień z żeli po dodaniu bufora do biegania, nie naruszając dołków w żelu do układania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie białka
	<ol>
		<li>Załaduj 3,5 μl wzorca białka do studzienki. W zależności od układu próbki, załadowanie drabinki białkowej po obu stronach żelu może pomóc w dokładniejszym oszacowaniu wielkości białka. Użyj końcówek do ładowania żelu z cienką końcówką, aby uzyskać dokładniejsze ładowanie próbki.</li>
		<li>W przypadku stosowania wewnętrznego wzorca do normalizacji między błonami (patrz krok 5 poniżej i dyskusja), załaduj ilość równą innym próbkom do pierwszych 3 dołków obok drabinki białkowej.</li>
		<li>Załadować 30 μg każdej próbki do pozostałych studzienek. Dodaj 1x bufor próbki do wszystkich pustych studzienek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforezy
	<ol>
		<li>Zmontuj zbiornik żelu po załadowaniu próbek. Przepuścić próbki przez żel do układania w stos pod napięciem 80 V przez 10 minut, a następnie pod napięciem 150 V przez dodatkowe 45-60 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Transfer białka
UWAGA: Transfer białka w tym protokole odbywa się za pomocą dostępnego na rynku systemu półsuchego blottingu (patrz Tabela Materiałów) w celu uzyskania szybkich i spójnych wyników.
<ol>
	<li>Przygotuj transfer białka, mocząc wstępnie bibułę filtracyjną w wodzie podwójnie destylowanej i upewniając się, że nóż do żelu, plastikowa pipeta Pasteura, wałek do bibułki i kleszcze są gotowe do użycia.</li>
	<li>Otwórz stos transferowy, ostrożnie usuwając całą folię do pakowania. Zdejmij górę z dolnego stosu i odłóż go na bok. Szybko zwilż membranę na dolnym stosie kilkoma kroplami buforu do elektroforezy (2-3 ml). Po otwarciu stosu transferowego ważne jest, aby zapobiec wysychaniu membrany PVDF.</li>
	<li>Po zatrzymaniu elektroforezy otwórz wstępnie obrobiony żel za pomocą noża do żelu i odetnij żel do układania w stosy. Przetnij żel wokół jego krawędzi, aby uwolnić go od plastikowego odlewu. Nóż do żelu powinien być mokry, aby zapobiec uszkodzeniu żelu.</li>
	<li>Zmontuj stos transferowy od dołu do góry: dolny stos (zawierający membranę PVDF), żel białkowy, bibuła filtracyjna. Użyj wałka do bibuły, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Umieść górny stos na bibule filtracyjnej i ponownie zwiń stos, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Nie należy naciskać zbyt mocno, ponieważ może to spowodować odkształcenie żelu podczas przenoszenia białka.</li>
	<li>Przenieś cały stos do urządzenia transferowego za pomocą elektrody po lewej stronie urządzenia i umieść gąbkę żelową na wierzchu stosu tak, aby była wyrównana z odpowiednimi stykami elektrycznymi na urządzeniu. Zamknij pokrywę, wybierz i uruchom odpowiedni program (zalecany punkt wyjścia to 20 V przez 7 minut).</li>
	<li>Po zakończeniu pozostaw pokrywę zamkniętą na 2 minuty, aby komin ostygł i zapobiec wysychaniu membrany. Usuń stos transferowy i przytnij membranę do rozmiaru żelu. Szybko umyj przeciętą membranę wodą podwójnie destylowaną, zanim przejdziesz do całkowitego barwienia białka.</li>
</ol>
4. Barwienie białka ogółem
UWAGA: Korzystanie z detekcji fluorescencyjnej daje znaczną przewagę nad bardziej tradycyjnymi metodami (np. wykrywaniem ECL), ponieważ zakres liniowy i czułość mogą być znacznie lepiej kontrolowane4. Dlatego w krokach 4 i 5 stosuje się fluorescencyjny TPS i fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe (patrz tabela materiałów).
<ol>
	<li>Zwiń membranę do probówki o pojemności 50 ml stroną z białkiem skierowaną do wewnątrz. Ze względu na światłoczułość fluorescencyjnego TPS i przeciwciał drugorzędowych, wszystkie kolejne etapy są przeprowadzane w ciemności.</li>
	<li>Dodać 5 ml roztworu barwienia białkowego (patrz tabela materiałów) i inkubować na wałku przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponieważ TPS i bufor płuczący zawierają metanol, należy wykonać te czynności w dygestorium.</li>
	<li>Wyrzucić roztwór barwiący i szybko przemyć dwukrotnie 5 ml roztworu myjącego (6,3% kwasu octowego w 30% metanolu). Umieść rurkę na krótko z powrotem na wałku między etapami mycia. Przed kontynuowaniem krótko spłucz membranę ultraczystą wodą.</li>
</ol>
5. Blokowanie, inkubacja i wykrywanie przeciwciał
<ol>
	<li>Blokowanie membrany: Dodać 3 ml buforu blokującego (patrz Tabela materiałów) do probówki o pojemności 50 ml zawierającej membranę. Inkubować błonę na wałku przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W zależności od wyboru przeciwciała, rodzaj zastosowanego buforu blokującego może wymagać optymalizacji.</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych
	<ol>
		<li>Odrzuć bufor blokujący i zastąp go przeciwciałem pierwszorzędowym o odpowiednim, zoptymalizowanym stężeniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2: mysi anty-SMN, w stosunku 1:1,000, rozcieńczony w buforze blokującym). 
		UWAGA: Odpowiednia optymalizacja przeciwciał pierwszorzędowych powinna obejmować potwierdzenie, że przeciwciało wykrywa produkt białkowy o odpowiedniej wielkości, wykazując brak lub minimalne wiązanie z innymi, niespecyficznymi produktami białkowymi. Jeśli to możliwe, przetestuj i porównaj wiele przeciwciał przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Inkubować błonę na wałku przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała i przemyj 6 razy przez 5 minut 1x PBS na wałku w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Przygotować swoiste przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:5 000 przeciwko gospodarzowi przeciwciała pierwszorzędowego w 5 ml buforze blokującym. Inne przeciwciała drugorzędowe mogą wymagać innych rozcieńczeń lub użycia alternatywnych blokujących.</li>
		<li>Inkubować błonę z roztworem przeciwciał drugorzędowych na wałku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyć membranę trzy razy po 30 minut 1x PBS na wałku.</li>
		<li>Wysuszyć membranę i chronić ją przed światłem za pomocą folii aluminiowej do momentu wykrycia. Membrany mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu
	<ol>
		<li>Zaloguj się do komputera podłączonego do skanera. Umieść membranę na skanerze stroną z białkiem skierowaną w dół i wybierz obszar skanowania w oprogramowaniu.</li>
		<li>Zoptymalizuj intensywność lasera dla obu kanałów (700 nm i 800 nm), upewniając się, że nie występuje nasycenie. Uzyskaj obrazy w obu kanałach i wyeksportuj je do dalszej analizy (krok 6).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza i kwantyfikacja Western blot
UWAGA: Te zalecenia są oparte na darmo dostępnym oprogramowaniu Image Studio. Jednak porównywalne analizy można również przeprowadzić za pomocą innych pakietów oprogramowania, takich jak ImageJ.
<ol>
	<li>Zaimportuj plik: Utwórz lokalny obszar roboczy na komputerze używanym do analizy. W ten sposób generowana jest baza danych plików graficznych dla pozyskanych zachodnich plam. Zaimportuj pliki uzyskane na skanerze i wybierz obraz do analizy.</li>
	<li>Analiza TPS
	<ol>
		<li>Wyświetl kanał 700 nm, aby pokazać całkowity wynik barwienia białka. Przykład obrazu TPS znajduje się w Rysunek 1, w którym bezpośrednio porównano różne tkanki noworodków (P5) (Figura 1A-B) i 10-tygodniowych myszy (Figura 1C-D). Podobnie, Rysunek 2 pokazuje przykład bezpośredniego porównania tkanki mózgowej myszy w różnym wieku.</li>
		<li>Wybierz zakładkę Analiza w prawym górnym rogu i wybierz Dodaj prostokąt, aby zdefiniować obszar zainteresowania do normalizacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B, D). Skopiuj i wklej pierwszy obszar prostokąta do każdej pojedynczej próbki, aby upewnić się, że zdefiniowany obszar ma ten sam rozmiar dla wszystkich analizowanych pasów.</li>
		<li>Skopiuj wynik z zakładki Kształty w lewym dolnym rogu oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja 
	UWAGA: Optymalne podejście do ilościowego oznaczania próbek zależy od projektu eksperymentu. W tym miejscu przedstawimy ilustracyjny przykład wykrywania białka neuronu ruchowego przeżycia (Smn; kluczowego białka zaangażowanego w chorobę nerwowo-mięśniową rdzeniowego zaniku mięśni20,21), o którym wiadomo, że zmniejsza się z czasem19 i jak normalizacja intensywności sygnału Smn do TPS zapewnia wiarygodne szacunki rozwoju ekspresji białka.
	<ol>
		<li>Rysunek 2 pokazuje spadek ekspresji Smn wraz z wiekiem zwierzęcia z TPS jako kontrolą obciążenia białka. Powtórz kroki 6.2.1-6.2.3, aby określić ilościowo obciążenie białkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Powtórz kroki 6.2.1-6.2.3 w kanale 800 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A), aby przeanalizować interesujące Cię białko.</li>
		<li>Skopiuj wyniki zarówno z TPS, jak i białka będącego przedmiotem zainteresowania do programu arkusza kalkulacyjnego. W arkuszu kalkulacyjnym najpierw znormalizuj obciążenie białkami, określając najwyższy sygnał TPS i dzieląc każdą wartość sygnału TPS przez tę wartość, aby uzyskać znormalizowaną wartość ładowania białka.</li>
		<li>Podziel wartość sygnału 800 nm z każdej pojedynczej próbki przez odpowiadającą jej znormalizowaną wartość białka, aby obliczyć względny stosunek ekspresji białka w różnych próbkach.</li>
		<li>Po pierwszej normalizacji porównaj różne punkty czasowe lub tkanki ze średnią wartością wzorca wewnętrznego, aby umożliwić bezpośrednie porównania między różnymi błonami i eksperymentami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Statystyki
<ol>
	<li>Aby określić jakiekolwiek statystycznie istotne różnice w ekspresji białek w złożonych i dużych grupach próbek, wymagana jest odpowiednia metodologia statystyczna. Chociaż szczegółowe omówienie tła statystycznego wykracza poza zakres tego artykułu, chcemy zwrócić uwagę na kilka kwestii i szczegółowo opisać skuteczne podejście, które zastosowaliśmy wcześniej19.</li>
	<li>Podobnie jak w przypadku wielu eksperymentów, pomiary kwantyfikacji białek nie stanowią całkowicie niezależnych danych. Tutaj, na przykład, wiele tkanek jest zwykle pozyskiwanych od pojedynczych zwierząt w celu określenia poziomów białka w wielu narządach w jednym eksperymentalnym punkcie czasowym. W związku z tym użyliśmy modeli efektów mieszanych do analizy różnic w ekspresji białek w czasie i między tkankami. Ogólnie rzecz biorąc, modele efektów mieszanych zapewniają skuteczny sposób radzenia sobie z brakiem niezależności, a tym samym unikania pseudo-replikacji22,23. W tym przypadku modele efektów mieszanych zwiększają moc statystyczną poprzez uwzględnienie powtarzających się pomiarów między tkankami, w obrębie poszczególnych osób. Do przeprowadzania tych analiz używamy pakietu oprogramowania statystycznego R, ponieważ jest on ogólnodostępny i wszechstronny. Jednak inne dostępne na rynku pakiety mogą być w stanie przeprowadzić podobne analizy.  </li>
	<li>Obecny projekt eksperymentalny obejmuje projekt "podzielonej działki", ponieważ każda mysz należała tylko do jednej grupy wiekowej. W związku z tym modelowaliśmy poszczególne myszy (identyfikator myszy) jako losowy efekt z unikalnym identyfikatorem; Uwzględniliśmy również tkankę, wiek i ich interakcję jako stałe efekty. Dane modelowaliśmy za pomocą funkcji lmer w bibliotece R, lme4. W ramach kontroli jakości zwizualizowaliśmy resztki, aby ocenić założenia o równej wariancji i rozkładzie normalnym, a następnie przekształciliśmy dane tam, gdzie było to konieczne, aby spełnić te założenia. Aby przetestować istotną interakcję między tkanką a wiekiem, dopasowaliśmy identyczny model, w którym brakowało tej interakcji, i porównaliśmy modele za pomocą parametrycznego bootstrappingu (funkcja R PBmodcomp w bibliotece, pbkrtest). Tam, gdzie pojawiły się znaczące interakcje, użyliśmy funkcji emmeans (w bibliotece emmeans R), aby określić przyczynę interakcji. Na przykład: Porównaliśmy średnią ekspresję między klasami wiekowymi w każdej tkance; Istotna interakcja może wystąpić między wiekiem a tkanką, jeśli, powiedzmy, dwie dane klasy wiekowe różnią się znacząco dla jednej tkanki, ale nie dla innej. Podsumowując, podejścia te umożliwiają rozszerzenie wiarygodności wniosków z eksperymentów Western blot poprzez zapewnienie statystycznego wsparcia dla tych wyników.</li>
</ol>

<ol><li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li>
<li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457(2013).</li>
<li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li>
<li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archives+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li>
<li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archives+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li>
<li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).</li>
<li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+%28SMN%29+protein+levels%3A+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li>
<li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparency+Is+the+Key+to+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li>
<li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li>
<li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+pitfalls+of+internal+controls%3A+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028(2012).</li>
<li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li>
<li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506(2015).</li>
<li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li>
<li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+or+Not+Tubulin%3A+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li>
<li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li>
<li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+survival+motor+neuron+protein+%28SMN%29+in+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li>
<li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neurology%22%5BJournal%5D)">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li>
<li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFitzmaurice%2C+GM+%22Applied+longitudinal+analysis%22">Applied longitudinal analysis</a>. , Wiley-Interscience. (2004).</li>
<li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+sampling+affects+pseudoreplication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054(2018).</li>
<li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+%28FMRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Dzięki odpowiedniemu projektowi eksperymentalnemu, środkom kontrolnym i analizie statystycznej, western blot może być stosowany do dokonywania wiarygodnych ilościowych szacunków ekspresji białek w obrębie i pomiędzy różnymi próbkami biologicznymi. Protokół, który opisujemy w niniejszym manuskrypcie, ma służyć jako wskazówka dla badaczy, którzy chcą wykorzystać Western blotting do przeprowadzenia analizy ilościowej na większych i bardziej złożonych grupach próbek, przy użyciu kombinacji metod wykrywania opartych na fluore...

Western blotting to technika, która jest powszechnie używana do wykrywania i ilościowego określania ekspresji białek, w tym w homogenatach tkanek lub ekstraktach. Z biegiem lat technika ta doprowadziła do wielu postępów zarówno w badaniach podstawowych, jak i klinicznych, gdzie może być używana jako narzędzie diagnostyczne do identyfikacji obecności choroby1,2. Western blotting został po raz pierwszy opisany w 1979 roku jako metoda przenoszenia białek z żeli poliakrylamidowych na arkusze nitrocelulozy, a następnie wizualizacji białek za pomocą przeciwciał drugorzędowych, które były albo znakowane radioaktywnie, albo sprzężone z fluoresceiną lub peroksydazą3. Dzięki rozwojowi dostępnych na rynku zestawów i urządzeń, zachodnie metody blottingu były z biegiem lat coraz bardziej standaryzowane i upraszczane. Rzeczywiście, technika ta jest obecnie chętnie stosowana przez naukowców o różnym pochodzeniu i poziomie doświadczenia. Jednak, podobnie jak w przypadku wielu podobnych technik eksperymentalnych, na wynik analiz Western blot łatwo wpływają wybory dokonane podczas projektowania i realizacji eksperymentu. Dlatego ważne jest, aby dostępność ustandaryzowanych metod Western blot nie przesłaniała potrzeby starannego planowania i projektowania eksperymentów. Rozważania eksperymentalne obejmują między innymi przygotowanie i obsługę próbek, wybór i walidację przeciwciał do wykrywania białek oraz efektywność transferu żel-błona szczególnie małych lub dużych (<10 lub >140 kDa) białek4,5,6,7,8,9. Jakość białka w oryginalnej próbce odgrywa znaczącą rolę w określaniu wyniku późniejszej analizy Western blot. Ponieważ białko można ekstrahować z wielu różnych próbek i źródeł, w tym z linii komórkowych, tkanek z modeli zwierzęcych i pośmiertnych tkanek ludzkich, w celu uzyskania powtarzalnych wyników wymagana jest konsekwencja w obchodzeniu się i przetwarzaniu. Na przykład, gdy wymagane jest długotrwałe przechowywanie próbek do ekstrakcji białka, ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że chociaż białko jest ogólnie stabilne w temperaturze -80 °C, odnotowano różnice w stabilności białka między wyekstrahowanymi białkami a nienaruszonymi tkankami w temperaturze -80 °C10. Ponadto, aby uzyskać powtarzalne szacunki ilości białka, kluczowa jest konsekwentna homogenizacja próbek. Optymalizacja różnych do lizy i metod homogenizacji (np. homogenizacja ręczna w porównaniu z metodami automatycznymi) może być wymagana przed rozpoczęciem eksperymentu ilościowego na dużą skalę.
Strategie normalizacji korygujące obciążenie białkami i zmienność kwantyfikacyjną są niezbędne do uzyskania solidnych, ilościowych wyników ekspresji białek. Białka porządkowe, takie jak β-aktyna, α-tubulina, β-tubulina i dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa (GAPDH) były tradycyjnie stosowane do normalizacji poziomu białka w celu oceny ilościowej. Jednak w ciągu ostatnich kilku lat coraz częściej krytykowano normalizację do określonych białek porządkowych w celu oceny ilościowej11,12. Na przykład ekspresja białek porządkowych może się zmieniać na różnych etapach rozwoju13,14, w tkankach tego samego zwierzęcia4 i w różnych stanach chorobowych4,15,16,17. W związku z tym stosowanie specyficznych białek porządkowych ogranicza możliwości dokonywania bardziej złożonych porównań między ekspresją białek z różnych tkanek, w różnych punktach czasowych i w różnych warunkach eksperymentalnych. Alternatywą dla białek porządkowych w celu kontrolowania zmienności obciążenia białkami jest użycie całkowitego barwienia białka (TPS), które znakuje i wizualizuje wszystkie białka obecne w próbce. TPS umożliwia normalizację sygnału w oparciu o całkowite obciążenie białkiem, a nie poziomy jednego konkretnego białka, a zatem kwantyfikacja sygnału TPS powinna być porównywalna i odtwarzalna niezależnie od warunków eksperymentalnych, typu próbki lub punktu czasowego rozwoju. Przykłady barwienia białka całkowitego obejmują Ponceau S, żele bez barwników, Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black i Cy5 (przegląd w odnośniku 18). Każda z tych metod ma określone zalety i ograniczenia, a wybór metody zależy od dostępnego czasu i narzędzi, a także konfiguracji eksperymentalnej4,18.
Oprócz używania TPS do korygowania obciążenia wewnątrz błony i zmienności ilościowej, może być konieczne porównywanie próbek między różnymi membranami, szczególnie podczas przeprowadzania analizy ekspresji białek na dużą skalę. Jednak zmienność czynników, takich jak skuteczność wiązania przeciwciał i całkowita intensywność barwienia białek, może wprowadzać dalszą zmienność między próbkami białek, które są analizowane na oddzielnych żelach i błonach. W celu uzyskania solidnej oceny ilościowej w tej sytuacji konieczne jest zatem wprowadzenie kolejnego etapu normalizacji w celu uwzględnienia zmienności między błonami. Można to osiągnąć poprzez włączenie wewnętrznego wzorca obciążenia na każdej z oddzielnie analizowanych membran, który jest utrzymywany na stałym poziomie we wszystkich eksperymentach. Wzorzec ten może mieć postać dowolnego lizatu białkowego, który można uzyskać w ilościach wystarczających do wykorzystania na wszystkich błonach objętych eksperymentem. Tutaj używamy lizatu mózgu myszy (uzyskanego od 5-dniowych myszy kontrolnych), ponieważ mózg łatwo się homogenizuje, a uzyskany lizat białkowy zawiera znaczną ilość białka w wysokim stężeniu. Umieszczenie wzorca wewnętrznego w trzech egzemplarzach umożliwia normalizację i bezpośrednie porównanie próbek na oddzielnych membranach.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół, który opracowaliśmy, aby umożliwić nam przeprowadzenie kompleksowych porównań zmienności ekspresji białek w różnych tkankach, modelach mysich (w tym modelach chorób) i punktach czasowych rozwoju19. Łącząc fluorescencyjny TPS z wykorzystaniem wewnętrznego wzorca obciążenia, byliśmy w stanie przezwyciężyć istniejące ograniczenia w liczbie próbek i warunkach eksperymentalnych, które można porównać w ramach jednego eksperymentu. Podejście to rozszerza zastosowanie tradycyjnych technik Western blot, umożliwiając w ten sposób naukowcom lepsze badanie ekspresji białek w różnych tkankach i próbkach.

<table><tbody><tr><td>Końcówki ładujące żel z cienką końcówką</td><td>Alpha Laboratories</td><td>GL20057SNTL</td><td></td></tr><tr><td>Halt Koktajl inhibitorów proteazy, bez EDTA 100x 5mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny homogenizator&nbsp;</td><td>VWR Collection</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Żelowe urządzenie transferowe</td> Stos <td></td> transferowy iBlot <td>ThermoFisher Scientific</td> IB21001<td></td></tr><tr><td>, PVDF, rozmiar regularny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>IB401031</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio Lite</td><td>Licor</td><td>N/A Bezpłatne</td><td>pobieranie z https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td></tr> <tr><td>IRDye 800CW przeciwciała wtórne</td><td>Licor</td> <td>-</td> <td>Wybierz odpowiednie przeciwciało drugorzędowe, które jest specyficzne przeciwko gospodarzowi przeciwciała pierwszorzędowego.</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Micro BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Novex Sharp Wstępnie barwione białko Standard</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15-dołkowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor do próbek (4X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Bufor (20X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer</td><td>Licor</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone mysie przeciwciało monoklonalne anty-SMN (przeżycie neuronu ruchowego)</td><td>Laboratoria Transdukcji BD 610646</td><td></td><td>Jest szeroko stosowany w literaturze SMN/SMA i daje spójne wyniki niezależnie od numeru partii</td></tr><tr><td>REVERT Całkowite barwienie białka, 250 ml&nbsp;</td><td>Licor</td><td>926-11021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>REVERT Roztwór do mycia&nbsp;</td><td>Licor</td><td>926-11012&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Bufor do lizy i ekstrakcji</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego western blotting

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting to technika, która jest powszechnie używana do wykrywania i ilościowego określania ekspresji białek. Z biegiem lat technika ta doprowadziła do wielu postępów zarówno w badaniach podstawowych, jak i klinicznych. Jednak, podobnie jak w przypadku wielu podobnych technik eksperymentalnych, na wynik analiz Western blot łatwo wpływają wybory dokonane podczas projektowania i realizacji eksperymentu. Specyficzne białka porządkowe były tradycyjnie używane do normalizacji poziomu białka w celu oceny ilościowej, jednak mają one szereg ograniczeń i dlatego są coraz częściej krytykowane w ciągu ostatnich kilku lat. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół, który opracowaliśmy, aby umożliwić nam przeprowadzenie złożonych porównań zmienności ekspresji białek w różnych tkankach, modelach mysich (w tym modelach chorób) i punktach czasowych rozwoju. Dzięki zastosowaniu fluorescencyjnego barwienia białka całkowitego i wprowadzeniu wzorca obciążenia wewnętrznego, możliwe jest przezwyciężenie istniejących ograniczeń w liczbie próbek, które można porównać w ramach eksperymentów i systematyczne porównywanie poziomów białka w różnych warunkach eksperymentalnych. Podejście to rozszerza zastosowanie tradycyjnych technik western blot, umożliwiając w ten sposób naukowcom lepsze badanie ekspresji białek w różnych tkankach i próbkach.

Przedstawiamy przykłady zastosowania TPS oraz standardu wewnętrznego w celu ułatwienia porównywania poziomów białek w różnych tkankach i punktach czasowych. Rysunek 1 przedstawia wyniki Western blottingu białek wyekstrahowanych z tkanek pobranych od myszy noworodkowych (5. dzień postnatalny) w porównaniu z myszami dorosłymi (10-tygodniowymi). Immunoblottng TPS i Smn pokazano na Rysunku 1A, C. Ilościowe oznaczenie...

Ta metoda opisuje solidne i powtarzalne podejście do porównywania poziomów białek w różnych tkankach i w różnych punktach czasowych rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego podejścia western blotting.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Protokół ten może być wykorzystany do odpowiedzi na ważne pytania w badaniach podstawowych i klinicznych poprzez przyjrzenie się ekspresji białek w różnych tkankach i punktach czasowych. Aby przeprowadzić wiarygodne ilościowe badanie Western blot, łączymy fluorescencyjne barwienie białka całkowitego z wewnętrzną kontrolą obciążenia. W ten sposób przezwycięża się ograniczenia, które pojawiają się podczas porównywania różnych tkanek w różnych warunkach eksperymentalnych.Aby wyekstrahować białka z zamrożonych próbek komórek lub tkanek, należy rozmrozić próbki o temperaturze minus 80 stopni na lodzie przed umyciem próbek, zgodnie z tabelą. Za pomocą ręcznego homogenizatora elektrycznego z tłuczkiem polipropylenowym homogenizować umyte próbki, płucząc tłuczek w wodzie podwójnie destylowanej i susząc czystą chusteczką między próbkami. Pozostawić próbki na lodzie na 10 minut, a następnie odwirować.Następnie przenieść supernatant zawierający próbkę białka do nowej probówki na lodzie, nie naruszając osadu. W celu ilościowego określenia stężenia białka należy ustalić wzorce albuminy surowicy bydlęcej przy rosnących stężeniach w trzech powtórzeniach i dodać jeden mikrolitr każdej próbki białka w dwóch egzemplarzach do odpowiednich studzienek 96-dołkowej płytki optycznej. Inkubować białko w bloku grzewczym o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut lub dłużej, jeśli oczekuje się, że stężenie białka będzie niskie, i zmierzyć absorpcję przy 560 nanometrach na czytniku płytkowym.Eksportuj pomiary czytnika płytek i oblicz stężenie białka, porównując średnie wartości absorbancji każdej próbki z krzywą wzorcową uzyskaną przy użyciu wzorca białka. Aby znormalizować ilość białka, przygotuj rozcieńczenia próbek białka w buforze próbki i ultraczystej wodzie i inkubuj próbki w bloku grzewczym o temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie umieść próbki na lodzie przed wirowaniem i krótkim odwirowaniem.Do elektroforezy należy ustawić prefabrykowany żel gradientowy Bis-Tris o stężeniu od czterech do 12% w systemie komory do elektroforezy żelowej i załadować do studni 3,5 mikrolitra wzorca białkowego. W przypadku stosowania wzorca wewnętrznego do normalizacji między błonami, należy załadować ilość równą pozostałym próbkom do pierwszych trzech dołków obok drabinki białkowej i załadować 30 mikrogramów każdej próbki do pozostałych studzienek. Następnie przepuść próbki przez żel do układania w stos pod napięciem 80 V przez 10 minut, a następnie 150 V przez dodatkowe 45 do 60 minut.Pod koniec elektroforezy, aby zmontować stos transferowy, umieść żel białkowy na dolnym stosie zawierającym membranę z polifluorku winylidenu, a następnie na bibule filtracyjnej. Użyj wałka do bibuły, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i umieść górny stos na wierzchu bibuły filtracyjnej przed ponownym zwinięciem stosu, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przenieś cały stos do urządzenia transferowego za pomocą elektrody po lewej stronie urządzenia i umieść gąbkę żelową na wierzchu stosu tak, aby gąbka była wyrównana z odpowiednimi stykami elektrycznymi na urządzeniu.Po zamknięciu pokrywy wybierz i uruchom odpowiedni program. Pod koniec programu przytnij membranę do rozmiaru żelu i szybko umyj przeciętą membranę wodą podwójnie destylowaną, a następnie kontynuuj barwienie całkowitym białkiem. Aby uzyskać całkowite barwienie białka, zwiń membranę do 50-mililitrowej probówki stroną z białkiem skierowaną do wewnątrz i oznacz membranę pięcioma mililitrami roztworu barwienia białkowego na wałku przez pięć minut w temperaturze pokojowej w dygestorium.Pod koniec inkubacji szybko przemyć membranę pięcioma mililitrami roztworu do mycia, zwracając rurkę na krótko do wałka między praniami, a następnie krótko spłukać ultraczystą wodą. Dodaj trzy mililitry buforu blokującego do membrany i zwróć membranę do rolki na 30 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp bufor blokujący pierwszorzędowym przeciwciałem o odpowiednim zoptymalizowanym stężeniu i inkubuj błonę na walce przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia umyj membranę sześć razy przez pięć minut pięcioma mililitrami świeżego PBS na pranie na wałku w temperaturze pokojowej. Po ostatnim płukaniu inkubować membranę z odpowiednim roztworem przeciwciał wtórnych na wałku przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie trzy płukania przez 30 minut na pranie. Po ostatnim praniu wysusz membranę i użyj folii aluminiowej, aby chronić membranę przed światłem.Aby uzyskać obraz, umieść membranę na skanerze stroną z białkiem skierowaną w dół i wybierz obszar skanowania w oprogramowaniu. Następnie należy pozyskać obrazy w obu kanałach i wyeksportować je do odpowiedniego programu do analizy obrazów. Wyświetl kanał 700-nanometrowy, aby pokazać całkowity wynik barwienia białek i wybierz Analiza i Narysuj prostokąt, aby zdefiniować obszar zainteresowania do normalizacji.Następnie skopiuj i wklej pierwszy obszar prostokąta do każdej pojedynczej próbki, aby upewnić się, że zdefiniowany obszar ma ten sam rozmiar dla wszystkich analizowanych pasów. Aby określić ilościowo stężenie białka na każdym pasie, skopiuj wyniki zarówno całkowitego barwienia białka, jak i białka będącego przedmiotem zainteresowania do programu arkusza kalkulacyjnego i określ najwyższy całkowity sygnał barwienia białka. Następnie podziel każdą całkowitą wartość sygnału barwienia białka przez tę wartość, aby uzyskać znormalizowaną wartość obciążenia białka i podziel wartość sygnału 800-nanometrowej z każdej pojedynczej próbki przez odpowiadającą jej znormalizowaną wartość białka, aby obliczyć względny stosunek ekspresji białka w różnych próbkach.W tych reprezentatywnych zachodnich plamach białka wyekstrahowane z tkanek uzyskanych od myszy w piątej dobie po urodzeniu są porównywane z białkami wyekstrahowanymi od 10-tygodniowych dorosłych myszy. Kwantyfikację intensywności fluorescencji całkowitego barwienia białka uzyskano poprzez pomiar intensywności fluorescencji wewnątrz prostokątnego pudełka na każdym pasie. Gdy analizowane są całe pasy, intensywność fluorescencji pozostaje stosunkowo podobna we wszystkich próbkach, co wskazuje, że użycie całkowitego barwienia białka do normalizacji jest odpowiednie do tego celu.Fluorescencyjne całkowite barwienie białka może być również wykorzystane do porównania poziomów białka w różnych punktach rozwojowych. Na przykład, chociaż poziomy białek neuronu ruchowego przeżycia wyraźnie spadają wraz z wiekiem u myszy, całkowita kwantyfikacja wybarwionego białka pozostaje stała. Zastosowanie wewnętrznych standardów, normalizacji opartej na fluorescencji i odpowiednich statystyk zwiększa niezawodność złożonej analizy ekspresji białek w różnych warunkach.Protokół ten uzupełnia tradycyjne techniki Western blot, pokonując problemy związane z odpowiednimi kontrolami obciążenia i porównaniami między partiami eksperymentalnymi oraz zapewniając elastyczność w analizie ekspresji białek. Podejście to można rozszerzyć o porównywanie ekspresji białek w innych warunkach eksperymentalnych.

robust-comparison-protein-levels-across-tissues-throughout

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Film demonstruje technikę western blottingu opartą na normalizacji całkowitego białka do ilościowego określania docelowej ekspresji białka w próbce. Wykorzystując całkowite barwienie białka w próbce, przeprowadza się analizę ratiometryczną w celu określenia względnego poziomu ekspresji białka docelowego.

Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

V3 to procedura western blot z użyciem żeli bez plam. Technologia bezbarwna pozwala naukowcom na wizualizację jakości separacji białek, weryfikację wydajności transferu, a co najważniejsze, walidację zmiany w białku będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu całkowitej kwantyfikacji białka jako niezawodnej kontroli obciążenia.

V3 Bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w Western blotting

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Postęp western blottingu za pomocą fluorescencji pozwolił na wykrycie subtelnych zmian w ekspresji białek, umożliwiając analizy ilościowe. W tym miejscu opisujemy solidną metodologię wykrywania szeregu białek w różnych gatunkach i typach tkanek. Zapewniona jest również strategia przezwyciężania typowych problemów technicznych.

Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Standardowy protokół Western blotting został zoptymalizowany do analizy zaledwie 500 hematopoetycznych komórek macierzystych lub progenitorowych. Optymalizacja polega na ostrożnym obchodzeniu się z próbką komórki, ograniczaniu transferów między probówkami i bezpośredniej lizie komórek w buforze próbki Laemmli.

Protokół Western Blotting dla małej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych

Tutaj demonstrujemy szczegółowy proces ilościowej analizy punktowej (QDB) poprzez określenie bezwzględnej zawartości docelowego białka, białka aktynowego capping, gelsolin-like (CAPG), w trzech różnych tkankach myszy. Demonstrujemy wysokoprzepustową, wygodną, ilościową technikę immunoblot do walidacji biomarkerów na poziomie komórkowym i tkankowym.

Wysoka przepustowość, bezwzględne oznaczanie zawartości wybranego białka na poziomie tkankowym za pomocą ilościowej analizy igłowej (QDB)

Opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu do walidacji histologii immunofluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu jako sposobu ilościowego oznaczania interesującego białka w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Nasze wyniki wskazują na przydatność histologii immunofluorescencyjnej do ustalania względnej ilości białek biomarkerowych w rutynowych próbkach biopsji.

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Ten artykuł opisuje protokół analizy białek z oocytów i zarodków Xenopus za pomocą immunoblottingu. Opisane są etapy pobierania, po których następują kroki odpowiadające przetwarzaniu próbek, SDS-PAGE, transferowi, barwieniu przeciwciał oraz obrazowaniu. Protokół kładzie nacisk na badanie translacyjnych kompleksów białek regulacyjnych z endogennymi przeciwciałami oraz przeciwciał przeciwko znacznikom powinowactwa białkowego.

Optymalizacja analizy białek z oocytów i zarodków Xenopus przez immunoblotting

Poznaj standaryzowane ilościowe Western blotting do porównywania poziomów białka w różnych tkankach i etapach rozwojowych. Ta metoda łączy fluorescencyjne barwienie białek z wewnętrznymi kontrolami ładunku.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting (Wideo) | JoVE Journal

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Przeglądaj więcej filmów