Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Protokół ten może być wykorzystany do odpowiedzi na ważne pytania w badaniach podstawowych i klinicznych poprzez przyjrzenie się ekspresji białek w różnych tkankach i punktach czasowych. Aby przeprowadzić wiarygodne ilościowe badanie Western blot, łączymy fluorescencyjne barwienie białka całkowitego z wewnętrzną kontrolą obciążenia. W ten sposób przezwycięża się ograniczenia, które pojawiają się podczas porównywania różnych tkanek w różnych warunkach eksperymentalnych.

Aby wyekstrahować białka z zamrożonych próbek komórek lub tkanek, należy rozmrozić próbki o temperaturze minus 80 stopni na lodzie przed umyciem próbek, zgodnie z tabelą. Za pomocą ręcznego homogenizatora elektrycznego z tłuczkiem polipropylenowym homogenizować umyte próbki, płucząc tłuczek w wodzie podwójnie destylowanej i susząc czystą chusteczką między próbkami. Pozostawić próbki na lodzie na 10 minut, a następnie odwirować.

Następnie przenieść supernatant zawierający próbkę białka do nowej probówki na lodzie, nie naruszając osadu. W celu ilościowego określenia stężenia białka należy ustalić wzorce albuminy surowicy bydlęcej przy rosnących stężeniach w trzech powtórzeniach i dodać jeden mikrolitr każdej próbki białka w dwóch egzemplarzach do odpowiednich studzienek 96-dołkowej płytki optycznej. Inkubować białko w bloku grzewczym o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut lub dłużej, jeśli oczekuje się, że stężenie białka będzie niskie, i zmierzyć absorpcję przy 560 nanometrach na czytniku płytkowym.

Eksportuj pomiary czytnika płytek i oblicz stężenie białka, porównując średnie wartości absorbancji każdej próbki z krzywą wzorcową uzyskaną przy użyciu wzorca białka. Aby znormalizować ilość białka, przygotuj rozcieńczenia próbek białka w buforze próbki i ultraczystej wodzie i inkubuj próbki w bloku grzewczym o temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie umieść próbki na lodzie przed wirowaniem i krótkim odwirowaniem.

Do elektroforezy należy ustawić prefabrykowany żel gradientowy Bis-Tris o stężeniu od czterech do 12% w systemie komory do elektroforezy żelowej i załadować do studni 3,5 mikrolitra wzorca białkowego. W przypadku stosowania wzorca wewnętrznego do normalizacji między błonami, należy załadować ilość równą pozostałym próbkom do pierwszych trzech dołków obok drabinki białkowej i załadować 30 mikrogramów każdej próbki do pozostałych studzienek. Następnie przepuść próbki przez żel do układania w stos pod napięciem 80 V przez 10 minut, a następnie 150 V przez dodatkowe 45 do 60 minut.

Pod koniec elektroforezy, aby zmontować stos transferowy, umieść żel białkowy na dolnym stosie zawierającym membranę z polifluorku winylidenu, a następnie na bibule filtracyjnej. Użyj wałka do bibuły, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i umieść górny stos na wierzchu bibuły filtracyjnej przed ponownym zwinięciem stosu, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przenieś cały stos do urządzenia transferowego za pomocą elektrody po lewej stronie urządzenia i umieść gąbkę żelową na wierzchu stosu tak, aby gąbka była wyrównana z odpowiednimi stykami elektrycznymi na urządzeniu.

Po zamknięciu pokrywy wybierz i uruchom odpowiedni program. Pod koniec programu przytnij membranę do rozmiaru żelu i szybko umyj przeciętą membranę wodą podwójnie destylowaną, a następnie kontynuuj barwienie całkowitym białkiem. Aby uzyskać całkowite barwienie białka, zwiń membranę do 50-mililitrowej probówki stroną z białkiem skierowaną do wewnątrz i oznacz membranę pięcioma mililitrami roztworu barwienia białkowego na wałku przez pięć minut w temperaturze pokojowej w dygestorium.

Pod koniec inkubacji szybko przemyć membranę pięcioma mililitrami roztworu do mycia, zwracając rurkę na krótko do wałka między praniami, a następnie krótko spłukać ultraczystą wodą. Dodaj trzy mililitry buforu blokującego do membrany i zwróć membranę do rolki na 30 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp bufor blokujący pierwszorzędowym przeciwciałem o odpowiednim zoptymalizowanym stężeniu i inkubuj błonę na walce przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia umyj membranę sześć razy przez pięć minut pięcioma mililitrami świeżego PBS na pranie na wałku w temperaturze pokojowej. Po ostatnim płukaniu inkubować membranę z odpowiednim roztworem przeciwciał wtórnych na wałku przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie trzy płukania przez 30 minut na pranie. Po ostatnim praniu wysusz membranę i użyj folii aluminiowej, aby chronić membranę przed światłem.

Aby uzyskać obraz, umieść membranę na skanerze stroną z białkiem skierowaną w dół i wybierz obszar skanowania w oprogramowaniu. Następnie należy pozyskać obrazy w obu kanałach i wyeksportować je do odpowiedniego programu do analizy obrazów. Wyświetl kanał 700-nanometrowy, aby pokazać całkowity wynik barwienia białek i wybierz Analiza i Narysuj prostokąt, aby zdefiniować obszar zainteresowania do normalizacji.

Następnie skopiuj i wklej pierwszy obszar prostokąta do każdej pojedynczej próbki, aby upewnić się, że zdefiniowany obszar ma ten sam rozmiar dla wszystkich analizowanych pasów. Aby określić ilościowo stężenie białka na każdym pasie, skopiuj wyniki zarówno całkowitego barwienia białka, jak i białka będącego przedmiotem zainteresowania do programu arkusza kalkulacyjnego i określ najwyższy całkowity sygnał barwienia białka. Następnie podziel każdą całkowitą wartość sygnału barwienia białka przez tę wartość, aby uzyskać znormalizowaną wartość obciążenia białka i podziel wartość sygnału 800-nanometrowej z każdej pojedynczej próbki przez odpowiadającą jej znormalizowaną wartość białka, aby obliczyć względny stosunek ekspresji białka w różnych próbkach.

W tych reprezentatywnych zachodnich plamach białka wyekstrahowane z tkanek uzyskanych od myszy w piątej dobie po urodzeniu są porównywane z białkami wyekstrahowanymi od 10-tygodniowych dorosłych myszy. Kwantyfikację intensywności fluorescencji całkowitego barwienia białka uzyskano poprzez pomiar intensywności fluorescencji wewnątrz prostokątnego pudełka na każdym pasie. Gdy analizowane są całe pasy, intensywność fluorescencji pozostaje stosunkowo podobna we wszystkich próbkach, co wskazuje, że użycie całkowitego barwienia białka do normalizacji jest odpowiednie do tego celu.

Fluorescencyjne całkowite barwienie białka może być również wykorzystane do porównania poziomów białka w różnych punktach rozwojowych. Na przykład, chociaż poziomy białek neuronu ruchowego przeżycia wyraźnie spadają wraz z wiekiem u myszy, całkowita kwantyfikacja wybarwionego białka pozostaje stała. Zastosowanie wewnętrznych standardów, normalizacji opartej na fluorescencji i odpowiednich statystyk zwiększa niezawodność złożonej analizy ekspresji białek w różnych warunkach.

Protokół ten uzupełnia tradycyjne techniki Western blot, pokonując problemy związane z odpowiednimi kontrolami obciążenia i porównaniami między partiami eksperymentalnymi oraz zapewniając elastyczność w analizie ekspresji białek. Podejście to można rozszerzyć o porównywanie ekspresji białek w innych warunkach eksperymentalnych.