Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka efektów pośredniczonych przez receptory GABA B w zidentyfikowanych interneuronach hipokampa wykazujących ekspresję parwalbuminy. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności wysokiej jakości ostrych przekrojów hipokampa. Drugim krokiem jest wykorzystanie mikroskopu wideo do wyboru neuronów na podstawie ekspresji YFP oraz znanych cech neuronów wykazujących ekspresję parwalbuminy.

Następnie przeprowadza się rejestracje metodą patch clamp w konfiguracji whole cell, wykorzystując stymulację zewnątrzkomórkową lub rejestracje sparowane w celu zbadania efektów pośredniczonych przez receptory GABA B. Ostatnim krokiem jest wizualizacja neuronów i potwierdzenie, że rejestrowane neurony są rzeczywiście paralbuminowe oraz stanowią inhibitoryczne neurony parasomatyczne lub dendrytyczne. Ostatecznie metoda ta umożliwia charakteryzację hamujących efektów pośredniczonych przez receptory GABA B i pozwala na jednoznaczną klasyfikację rejestrowanych interneuronów.

Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronów interneuronów. Na przykład: w jaki sposób interneurony komunikują się ze sobą oraz jak ich pobudliwość i wyjście synaptyczne są kontrolowane przez systemy neuromodulacyjne. Chociaż metoda ta dostarcza wiedzy na temat GABAergicznej kontroli interneuronów hipokampa, można ją również zastosować do innych obszarów mózgu, systemów neuromodulacyjnych lub typów komórek.

Pobrać mózg od transgenicznej szczura w wieku od 17 do 24 dni, wykazującego fluorescencyjne żyłkowanie YFP, utrzymywanego w półzamrożonym roztworze sacharozy w karbogenie, A CSF. Za pomocą skalpela usunąć przednią jedną trzecią kory, móżdżek oraz rozdzielić półkule. Usunąć powierzchnię grzbietową kory, aby uzyskać płaską powierzchnię umożliwiającą przyklejenie mózgu do sekcjonowania. Przykleić półkule do stolika viome, przy czym kąpiel viome powinna być wypełniona zamrożoną natywną sacharozą w karbogenie.

Wyciąć poprzeczne plastry formacji hipokampa o grubości 300 µm w roztworze ACSF. Każdy plaster przenieść do zanurzonej komory holdingowej zawierającej sacharozę w ACSF z karbogenem w temperaturze 35 °C. 30 minut po umieszczeniu ostatniego plastra w ogrzanej sacharozie w ACSF przenieść plastry do temperatury pokojowej w celu przechowywania.

Wyciągnij pipety do patch-clampu z kapilar szklanych tak, aby uzyskać oporność pipety od dwóch do czterech megaomów. Po napełnieniu przenieś skibę hipokampa do komory rejestracyjnej, stabilizując ją za pomocą pierścienia platynowego z naciągniętymi pojedynczymi jedwabnymi włóknami. Umieść komorę w układzie rejestracyjnym i rozpocznij perfuzję ogrzanym karbogenem z płynem CSF typu A do rejestracji z przepływem od 5 do 10 mililitrów na minutę.

Użyj kamery wideo, aby ocenić jakość skrawka przy zastosowaniu optyki I-R-D-I-C i 40-krotnym powiększeniu obiektywu. Przyjmij, że skrawek jest dobrej jakości. Jeśli w warstwie paramarginalnej, na głębokości od 20 do 30 micrometers poniżej gładkiej i lekko kraterowatej powierzchni, widoczna jest duża liczba okrągłych, umiarkowanie kontrastowych komórek paramarginalnych.

Wykorzystując oświetlenie epifluorescencyjne, zidentyfikuj potencjalne interneurony szybkotstrzelające (fast-spiking) jako komórki wykazujące ekspresję YFP z dużymi, wielobiegunowymi somami znajdującymi się w stratum pyramidale lub w jego sąsiedztwie. Następnie napełnij pipety do patch-clampu roztworem o niskim, fizjologicznie istotnym stężeniu chlorków w celu identyfikacji prądów postsynaptycznych i umieść pipetę w uchwycie na głowicy mikromanipulatora. Następnie przyłóż niskie ciśnienie dodatnie poprzez linię rurek.

Obniż pipetę do powierzchni skrawka, przesuwając ją lekko w stronę centrum wybranego neuronu. Zwiększ ciśnienie do 70–80 millibarów i szybko wprowadź pipetę przez skrawek, aż znajdzie się tuż nad somą wybranej komórki. Przyciśnij pipetę do błony komórkowej, aby wytworzyć w niej wgłębienie.

Wykonaj ten krok sprawnie. Aby zapobiec znakowaniu biotyną sąsiednich komórek, utwórz uszczelnienie gigaomowe poprzez zwolnienie ciśnienia i jednoczesne przyłożenie do pipety napięcia sterującego o wartości -20 mV. Po rozpoczęciu uszczelniania zmniejsz napięcie sterujące do spodziewanego potencjału spoczynkowego błony, który zazwyczaj wynosi od -70 mV do -60 mV.

Następnie zastosuj krótki impuls podciśnienia, aby przerwać płatek błony, osiągając tym samym konfigurację whole-cell. Korzystając z trybu clamp prądowy, zidentyfikuj szybkie interneurony pobudliwe na podstawie ich odpowiedzi na zestaw impulsów prądowych od hiperpolaryzujących do depolaryzujących. Aby zaobserwować odpowiedzi wywołane synaptycznie, umieść zewnątrzkomórkową elektrodę stymulującą w skrawku na granicy stratum radiatum i stratum lacunosum moleculare.

W trybie clampowania napięcia (voltage clamp) należy użyć izolowanego stymulatora stałego napięcia, aby dostarczać do aksonów presynaptycznych pojedyncze bodźce lub serie 200 Hz po pięć impulsów elektrycznych o napięciu 50 V co 20 sekund. Następnie do kąpieli należy dodać antagonistów jonotropowych receptorów glutaminianu, aby wyizolować monosynaptyczne IPSC.

Dalszą izolację IPSC pośredniczonych przez receptor GABA B przeprowadź poprzez zastosowanie antagonisty receptora GABA a. Aby rozpocząć rejestrację parzystą, najpierw wykonaj rejestrację z całej komórki (whole-cell) presynaptycznego neuronu pośredniczącego, analogicznie jak wcześniej, i potwierdź fenotyp szybkiego wyładowywania (fast spiking).

Następnie należy wykonać patch jednej komórki piramidalnej CA1 w odległości od 20 do 100 µm od neuronu pośredniczącego utrzymującego presynaptyczny neuron pośredniczący. W trybie clamp prądowy należy przyłożyć krótkie impulsy prądu depolaryzującego o wartości progowej SRA, aby wywołać potencjały czynnościowe w neuronie pośredniczącym.

Jeśli połączenie synaptyczne istnieje, potencjały czynnościowe w neuronie pośredniczącym wywołują IPC w komórce parametalnej ca one poddanej clampowaniu napięcia. Po ustanowieniu połączenia wywołaj pary potencjałów czynnościowych w presynaptycznym szybko wyładowującym się neuronie pośredniczącym, stosując typowy protokół podwójnego impulsu składający się z dwóch bodźców depolaryzujących w odstępie 50 millisecond. Po zebraniu śladów kontrolnych dodaj do perfuzji A CSF selektywny agonista receptora GABA B baklofen, aktywując w ten sposób receptory GABA B.

Następnie należy zastosować antagonistę CGP 55 8 45, aby całkowicie zablokować efekty pośredniczone przez receptory. Po zakończeniu rejestracji powoli wycofać pipetę z ciała komórki w trybie voltage clamp. W miarę wzrostu mierzonej rezystancji szeregowej należy obniżyć napięcie błony do -40 mV, aby uszczelnić błonę somatyczną poprzez utworzenie patcha typu outside-out.

Po zakończeniu rejestracji utrwalić skrawki poprzez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie z 0,1 M buforem fosforanowym przez noc w temperaturze 4 °C, przemyć buforem fosforanowym, a następnie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i zablokować za pomocą 10% normalnej surowicy koziej, 0,03% TRITON X 100 i 0,05% azotku sodu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Aby znakować ekspresję paralbuminy, należy użyć mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko paralbuminie, rozcieńczonego w roztworie zawierającym 5% normalnej surowicy koziej, 0,3% TRITON X 100 i 0,05% azotku sodu w PBS; inkubować przeciwciała pierwotne od dwóch do trzech dni w temperaturze 4 °C. Po inkubacji dokładnie wypłukać skrawki w PBS, nanieść fluorescencyjne przeciwciała wtórne anty-mysie wraz z białkiem wiążącym biotynę sprzężonym z fluorochromem i inkubować w roztworze zawierającym 3% normalnej surowicy koziej, 0,1% TRITON X 100 i 0,05% azotku sodu rozcieńczonego w PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia obficie przemyć skrawki dwa do trzech razy PBS, a następnie dwa do trzech razy buforem fosforanowym.

Przenieś skrawki na szkiełka przedmiotowe, stosując agarowy dystans o grubości 300 µm, aby zapobiec zapadnięciu się tkanki. Następnie przykryj skrawki szkiełkami nakrywkowymi, stosując fluorescencyjne medium montażowe, i zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci. Oceń immunoreaktywność paralbuminy w neuronach pośredniczących przy użyciu dużego powiększenia i wysokiej apertury numerycznej.

Komórki soczewki uznaje się za immunoreaktywne w odniesieniu do paralbuminy. Jeśli stwierdzono, że znakowanie immunologiczne pokrywa się ze strukturami znakowanymi biotyną, należy wykonać serię obrazów w osi Z za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego, obrazując fluorescencyjną adenę w celu identyfikacji morfologicznej i rekonstrukcji trójwymiarowej. Następnie należy zrekonstruować obraz neuronu w trzech wymiarach, uwzględniając arboryzację dendrytów i aksonów.

Przedstawiono tutaj złożoną odpowiedź synaptyczną szybko wyładowującego neuronu interneuronalnego w odpowiedzi na pojedynczy bodziec zewnątrzkomórkowy. Zastosowanie antagonistów jonotropowych receptorów glutaminianu, DNQX i APV, izoluje monosynaptyczny hamujący prąd postsynaptyczny lub IPSC; zastosowanie antagonisty receptorów GABA$_A$, gazin, zniosło szybką komponentę IPSC.

Seria pięciu bodźców ujawniła wolny prąd postsynaptyczny hamujący (IPSC) pośredniczony przez receptor GABA B, który został zablokowany przez następujące podanie CGP. Przebiegi te przedstawiają potencjały czynnościowe w presynaptycznym, szybko wyładowującym interneuronie oraz jednostkowe IPSC o krótkim czasie utajenia w komórkach paramedyalnych pola CA1 w warunkach kontrolnych, po aplikacji baklofenu do kąpieli oraz po następującym podaniu CGP. Należy zauważyć, że baklofen redukuje amplitudę IPSC o około 50%, podczas gdy antagonista receptorów GABA B doprowadził do niemal pełnego powrotu amplitudy IPSC.

Wykres przebiegu czasowego amplitudy IPSC pokazuje efekt działania baklofeny i CGPA. Szybko odpalający interneuron, przedstawiony przy 20-krotnym powiększeniu, posiadał somata zlokalizowane na granicy stratum radiatum i parama doll obszaru CA1, z dendrytami przebiegającymi pionowo i obejmującymi wszystkie warstwy. Podczas gdy większość aksonu znajduje się w warstwie ciał komórkowych i wokół niej, co jest typowe dla komórek koszyczkowych, obraz przy 60-krotnym powiększeniu pokazuje typowe koszyczki aksonów formujące się wokół domniemanych CA1 parametal salata, które zostały oznaczone pomarańczową gwiazdką. Tutaj przedstawiono trójwymiarową rekonstrukcję tego samego interneuronu, w której soma i dendryty są koloru czarnego, a akson koloru czerwonego.

Warstwy kory są zaznaczone na niebiesko. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu jednego dnia, wykonując analizę morfologiczną postdoc na kilku przekrojach jednocześnie po jej opracowaniu. To zintegrowane podejście utorowało drogę badaczom mikroukładów hipokampa i kory do badania różnorodności morfologiczno-fizjologicznej, a także zależności między strukturą a funkcją różnych typów interneuronów.