Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie wpływu receptora GABA B na zidentyfikowane neurony inter neuronowe parwalbuminy w hipokampie. Osiąga się to poprzez wyprodukowanie najpierw wysokiej jakości ostrych plastrów hipokampa. Drugim krokiem jest użycie mikroskopu wideo do wyselekcjonowania neuronów na podstawie żylnej ekspresji YFP i znanych cech neuronów dodatnich do albuminy paraalnej.

Następnie uzyskuje się zapisy klamry całych komórek i wykorzystuje się stymulację zewnątrzkomórkową lub sparowane nagrania do zbadania działania za pośrednictwem receptora GABA B. Ostatnim krokiem jest wizualizacja neuronów i potwierdzenie, że zarejestrowane neurony są w rzeczywistości par albuminowo-dodatnie i są albo parasomatycznymi, albo dendrytycznymi neuronami hamującymi. Ostatecznie metoda ta umożliwia scharakteryzowanie efektów hamujących za pośrednictwem receptora GABA B i pozwala na jednoznaczną klasyfikację zarejestrowanych neuronów międzyneuronowych.

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie międzyneuronowej. Na przykład, jak komunikują się ze sobą neurony, jak ich pobudliwość, ich wyjście synaptyczne jest kontrolowane przez systemy neuromodulacyjne. Chociaż ta metoda zapewnia wgląd w GABA-ergiczną, kontrolę hipokampa w neuronach, może być również stosowana do innych regionów mózgu, systemów neuromodulacyjnych lub typów komórek.

Weź mózg transgenicznego szczura w wieku od 17 do 24 dni z ekspresją fluorescencyjnego żylnego YFP trzymanego w półmrożonej karbogenu sacharozy, płynu mózgowo-rdzeniowego A za pomocą skalpela, usuń przednią trzecią część kory, móżdżek i oddziel półkule. Usuń grzbietową powierzchnię kory, aby zapewnić płaską powierzchnię do przyklejenia mózgu do cięcia. Przyklej półkule do etapu viome za pomocą kąpieli viome wypełnionej natywną sacharozą rozen carbogen

Płyn mózgowo-rdzeniowy wyciął 300-mikrometrowe poprzeczne wycinki formacji hipokampa. Przenieś każdą plasterkę do zanurzonej komory trzymającej zawierającej sacharozę karbogenową, płyn mózgowo-rdzeniowy A w temperaturze 35 stopni Celsjusza. 30 minut Po umieszczeniu ostatniego plasterka w podgrzanej sacharozy, płyn mózgowo-rdzeniowy przenosi plastry do temperatury pokojowej w celu przechowywania.

Wyciągnij pipety krosowe ze szklanych kapilar tak, aby uzyskać rezystancję pipety od dwóch do czterech megaomów. Po napełnieniu przenieś plaster hipokampa do komory nagrywającej, przytrzymując go na miejscu platynowym pierścieniem nawleczonym na pojedyncze włókna jedwabiu. Umieść komorę w zestawie do nagrywania i rozpocznij perfuzję z podgrzewanym karbogenem zapisem A CSF przy natężeniu przepływu od pięciu do 10 mililitrów na minutę.

Użyj kamery wideo, aby ocenić jakość przekroju pod optyką I-R-D-I-C przy 40-krotnym powiększeniu obiektywu. Załóżmy, że plasterek jest dobrej jakości. Jeśli duża liczba okrągłych, umiarkowanie skontrastowanych komórek parametalicznych można zobaczyć w parametrze warstwy na głębokości od 20 do 30 mikrometrów poniżej gładkiej i lekko pokrytej kraterami powierzchni.

Korzystając z oświetlenia epifluorescencyjnego, zidentyfikuj przypuszczalne szybko wystrzeliwujące neurony międzyneuronowe jako te wyrażające żylny YFP z dużym wielobiegunowym somatycznym w warstwie paramy lub w jej pobliżu. Następnie napełnij pipety z plastrem roztworem zawierającym niskie i fizjologicznie istotne stężenie chlorków w celu identyfikacji prądów postsynaptycznych i umieść je w uchwycie na pipetę na głowicy. Następnie zastosuj niskie nadciśnienie przez przewód rurowy.

Opuść pipetę na powierzchnię wycinka, lekko przesuniętą do środka wybranego neuronu. Zwiększ ciśnienie do 70 do 80 milibarów i szybko opuść pipetę przez plasterek tuż nad somą wybranej komórki. Dociśnij pipetę do błony komórkowej, aby uzyskać na niej wgłębienie.

Wykonaj ten krok szybko. Aby zapobiec znakowaniu biotyną sąsiednich komórek, należy utworzyć uszczelnienie gigaomowe, zwalniając ciśnienie i jednocześnie przykładając do pipety polecenie napięcia ujemnego 20 miliwoltów. Po rozpoczęciu uszczelniania zmniejsz napięcie do oczekiwanego potencjału spoczynkowego membrany, zwykle od minus 70 do minus 60 miliwoltów.

Teraz zastosuj krótki impuls podciśnienia, aby rozerwać łatę błony, uzyskując w ten sposób całą konfigurację komórki. Korzystając z trybu cęgów prądu, zidentyfikuj szybko rosnące neurony pośrednie na podstawie ich odpowiedzi na rodzinę impulsów prądu hiperpolaryzującego do depolaryzującego. Aby zaobserwować odpowiedzi wywołane synaptycznie, umieść elektrodę stymulacji zewnątrzkomórkowej w wycinku na granicy zapisu molekularnego warstwy radu i warstwy laun oum.

W trybie cęgów napięcia użyj izolowanego stymulatora o stałym napięciu, aby co 20 sekund dostarczać pojedyncze lub 200 hercowe ciągi pięciu 50-woltowych bodźców elektrycznych do aksonów presynaptycznych. Następnie nałóż do kąpieli jonotropowych antagonistów receptora glutaminianu w celu odsłonięcia wyizolowanych monosów. Synaptyczne IPSC.

Dalej izolować IPSC za pośrednictwem receptora GABA B z zastosowaniem antagonisty receptora GABA a. Aby rozpocząć sparowane nagrania. Po pierwsze, ustal zapis całej komórki presynaptycznego neuronu inter, jak poprzednio, i potwierdź szybko rosnący fenotyp.

Następnie załataj CA jedną komórkę parametaliczną w odległości od 20 do 100 mikrometrów od neuronu pośredniego zawierającego presynaptyczny neuron międzyneuronowy. W bieżącym trybie cęgowym. Zastosuj krótkie impulsy prądu depolaryzującego próg, aby wywołać potencjały czynnościowe w neuronach wewnętrznych.

Jeśli obecne jest połączenie synaptyczne, potencjały czynnościowe w neuronach wewnętrznych powodują powstawanie IPC w napięciu zaciśniętym w jednej komórce parametalicznej. Po nawiązaniu połączenia wywołaj pary potencjałów czynnościowych w presynaptycznym szybkim neuronie interneuronowym z typowym sparowanym protokołem impulsowym dwóch depolaryzujących bodźców w odstępie 50 milisekund. Po zebraniu śladów kontrolnych należy zastosować selektywny agonista receptora GABA B baklofen do perfującego A płynu mózgowo-rdzeniowego, aktywując w ten sposób receptory GABA B.

Następnie zastosuj antagonistę CGP 55 8 45, aby całkowicie zablokować działanie za pośrednictwem receptora. Po zakończeniu zapisu powoli wyjmij pipetę z korpusu kuwety w objętości clamp. Wraz ze wzrostem rezystancji mierzonej szeregowo zmniejsz napięcie membrany do minus 40 miliwoltów, aby uszczelnić membranę somatyczną poprzez utworzenie łaty na zewnątrz.

Po nagraniach utrwalić plastry przez zanurzenie w 4% para formaldehydzie z 0,1 molowym buforem fosforanowym przez noc w buforze fosforanowym do płukania o czterech stopniach Celsjusza, a następnie w buforze fosforanowym soli fizjologicznej i blokować 10% normalną surowicą kozią 0,03% TRITTON X 100 i 0,05% azydkiem sodu na jedną godzinę w temperaturze pokojowej w celu oznaczenia ekspresji albuminy par, użyć mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciw parwalbuminie, rozcieńczonego w roztworze zawierającym 5% normalnej surowicy koziej, 0,3% TRITTON X 100 i 0,05% azydku sodu w PBS, inkubować przeciwciała pierwszorzędowe przez dwa do trzech dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji dokładnie opłucz plastry w PBS, nałóż fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe anty-US wraz z paskiem białkowym wiążącym biotynę sprzężoną z fluorochromem i inkubuj w roztworze zawierającym 3% normalnej surowicy koziej, 0,1% tritton X 100 i 0,05% sodu rozcieńczonego w PBS inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia obficie opłucz plastry dwa do trzech razy PBS, a następnie dwa do trzech płukań w buforze fosforanowym.

Zamontuj plastry na szkiełkach podstawowych i użyj przekładki agarowej o grubości 300 mikrometrów, aby zapobiec zapadaniu się plastra. Następnie nakryj plastry fluorescencyjnym medium montażowym i uszczelnij lakierem do paznokci. Oceń immunoreaktywność albuminy par neuronu wewnętrznego przy dużym powiększeniu i aperturze numerycznej.

Obiektywne komórki soczewki są uważane za immunoreaktywne dla albuminy par. Jeśli zauważasz, że znakowanie immunologiczne jest wyrównane ze strukturami znakowanymi biotyną, wykonaj serię obrazów w osi Z za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, obrazując fluorescencyjny Aden w celu identyfikacji morfologicznej i rekonstrukcji trójwymiarowej. Następnie zrekonstruuj obraz w neuron w trzech wymiarach, włączając arboryzację dendrytyczną i aksonalną

Pokazano tutaj złożoną odpowiedź synaptyczną szybko wystrzeliwującego neuronu wewnętrznego w odpowiedzi na pojedynczy bodziec zewnątrzkomórkowy. Zastosowanie jonotropowych antagonistów receptora glutaminianu, izolatów DNQX i A PV, monosynaptycznego prądu hamującego postsynaptycznego lub IPSC antagonisty receptora gabaa. Gazin zniósł szybki komponent IPSC.

Ciąg pięciu bodźców ujawnił powolny IPSC za pośrednictwem receptora GABA B, który został zablokowany przez późniejsze zastosowanie CGP. Ślady te pokazują potencjały czynnościowe w presynaptycznych, szybko wystrzeliwujących neuronach międzyneuronowych i unitarnych I PSC o krótkim opóźnieniu w komórkach parametalicznych CA w warunkach kontrolnych po kąpieli, zastosowaniu baklofenu i późniejszym zastosowaniu CGP. Należy zauważyć, że baklofen zmniejsza amplitudę IPSC o około 50%, podczas gdy antagonista receptora B GABA spowodował prawie pełne odzyskanie amplitudy IPSC.

Wykres przebiegu w czasie amplitudy IPSC pokazuje wpływ baklofenu i CGPA szybko wybijającego się neuronu międzyneuronowego pokazanego w 20-krotnym powiększeniu, miał somatę znajdującą się na granicy warstwy radu i parama lalki obszaru ca jeden obszar z dendrytami biegnącymi pionowo i obejmującymi wszystkie warstwy. Podczas gdy większość aksonu znajduje się w warstwie ciała komórki i wokół niej, co jest typowe dla komórek koszowych, obraz w powiększeniu 60 razy pokazuje typowe kosze aksonów tworzące się wokół przypuszczalnego około jednego salata parametalu, które są oznaczone pomarańczową gwiazdką. Pokazano tutaj trójwymiarową rekonstrukcję tego samego neuronu wewnętrznego z somą i dendrytami w kolorze czarnym oraz aksonem w kolorze czerwonym.

Warstwy ca one są oznaczone kolorem niebieskim Po opanowaniu. Technikę tę można wykonać w ciągu jednego dnia z podoktorską analizą morfologiczną wykonywaną na kilku wycinkach jednocześnie po jej opracowaniu. To połączone podejście utorowało drogę badaczom mikroobwodów hipokampa i kory mózgowej do zbadania morfologicznej różnorodności fizjologicznej, a także wzajemnych powiązań funkcji strukturalnych między typami neuronów.