Name: Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Poznaj metodę całokomórkowych nagrań klamry krosowej do badania receptorów GABA B w interneuronach hipokampa u szczurów. Technika ta umożliwia precyzyjną identyfikację komórek parwalbuminowych i analizę ich funkcji hamujących.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Inie Wolter za doskonałą pomoc techniczną. Transgeniczne szczury VGAT-Venus zostały wygenerowane przez dr Y. Yanagawę, M. Hirabayashi i Y. Kawaguchi w Narodowym Instytucie Nauk Fizjologicznych w Okazaki, Japonia, przy użyciu pCS2-Venus dostarczonej przez dr A. Miyawaki.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury i utrzymanie zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, niemiecką ustawą o dobrostanie zwierząt, dyrektywą Rady Europejskiej 86/609/EWG dotyczącą ochrony zwierząt oraz wytycznymi władz lokalnych (Berlin, T-0215/11)
1. Przygotowanie plastrów ostrego hipokampa
<ol>
	<li>Weźmy transgenicznego szczura (w wieku od 17 do 24 dni), u którego dochodzi do ekspresji fluorescencyjnego białka Venus / YFP pod promotorem vGAT, który znakuje większość korowych interneuronów hamujących13. Odetnij głowę szczurowi. Szybko rozwarstwić mózg (<40 sekund) na częściowo zamrożony, karbogenny (95% O2/5% CO2) sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy na bazie sacharozy (sacharoza-ACSF, ryc. 1A).</li>
	<li>Oceń wypreparowany mózg szczura pod kątem fluorescencji Wenus/YFP za pomocą lampy LED 505 nm i filtra emisyjnego 515, zamontowanych na goglach.</li>
	<li>Usuń przednią trzecią część kory i móżdżku, a następnie oddziel półkule, wszystko za pomocą skalpela. Usuń grzbietową powierzchnię kory, aby zapewnić płaską powierzchnię do przyklejenia mózgu, jak opisano wcześniej14.</li>
	<li>Wytnij poprzeczne plastry (300 μm) formacji hipokampa na wibratomie, półkule powinny być otoczone częściowo zamrożoną, karbogeniczną sacharozą-ACSF (ryc. 1B)14. Usuń dodatkowe obszary kory rostralnej, śródmózgowia i pnia mózgu. Przenieść każdą cząstkę do zanurzonej komory zawierającej sacharozę-ACSF, która jest karbonogenowana i ogrzewana do 35 °C.</li>
	<li>Pozostaw plastry do odzyskania w temperaturze 35 ºC na 30 minut od momentu, gdy ostatni plasterek wejdzie do ogrzanego ACSF. Zrób to, aby reaktywować procesy metaboliczne i ułatwić ponowne uszczelnienie przeciętych procesów neuronalnych. Następnie przenieś do temperatury pokojowej w celu przechowywania (rysunek 1C).</li>
</ol>
2. Produkcja i napełnianie pipet rejestrujących
<ol>
	<li>Wyciągnij pipety z plastrami ze szklanych kapilar tak, aby po napełnieniu filtrowanym (filtr strzykawkowy, wielkość porów: 0,2 μm) uzyskać rezystancję pipet na poziomie 2-4 MΩ. Roztwór wewnątrzkomórkowy należy przechowywać schłodzony na lodzie, aby zapobiec degradacji jego składników.</li>
	<li>Napełnij pipety z plastrami do identyfikacji prądów postsynaptycznych roztworem zawierającym fizjologicznie istotne niskie stężenie Cl- (ER(Cl-) = -61 mV; patrz lista roztworów).</li>
	<li>W przypadku sparowanych zapisów w celu identyfikacji odpowiedzi za pośrednictwem receptora presynaptycznego, należy napełnić pipety plastrowe roztworem wewnątrzkomórkowym o niskiej pojemności buforowej Ca2+, aby zapobiec zakłóceniom presynaptycznego uwalniania nadajnika, a także 4-krotnie wyższym stężeniu Cl- (ER(Cl-) = -20 mV), aby poprawić stosunek sygnału do szumu obserwowanych IPSC5, umożliwiając dokładną ocenę reakcji farmakologicznej. Należy pamiętać, że zmiana stężenia Cl- może zmienić kinetykę IPSC15.</li>
</ol>
3. Nagrywanie całej komórki z FS-INs
<ol>
	<li>Skarbonować ACSF i wprowadzić go przez system perfuzyjny do komory rejestracyjnej za pomocą pompy perystaltycznej (która również usuwa ACSF z komory rejestracyjnej przez przewód ssący, rysunek 2A). Włącz wszystkie urządzenia w konfiguracji, przygotowując się do nagrywania.</li>
	<li>Przenieś plasterek do komory nagraniowej i przytrzymaj w miejscu za pomocą platynowego pierścienia nawleczonego na pojedyncze włókna jedwabiu. Umieść plasterek tak, aby warstwa piramidalna CA1 przebiegała pionowo przez pole widzenia, umożliwiając dostęp za pomocą 2 pipet do zarówno str. radiatum, jak i str. oriens jednocześnie (ryc. 2C i 4A).</li>
	<li>Umieścić komorę w zestawie i rozpocząć perfuzję karbonogenowanego i ogrzanego (32-34 ºC) rejestrującego ACSF przy natężeniu przepływu 5-10 ml/min.</li>
	<li>Oceń jakość przekroju pod optyką IR-DIC przy 40-krotnym powiększeniu obiektywu i wizualizuj za pomocą kamery CCD wyświetlanej na wyświetlaczu. Załóżmy dobrą jakość wycinka, jeśli duża liczba okrągłych, umiarkowanie kontrastowych komórek piramidalnych CA1 (CA1 PC) jest widoczna w str. pyramidale na głębokości 20-30 μm poniżej gładkiej i lekko pokrytej kraterami powierzchni (Rysunek 2C). Plastry niskiej jakości zawierają dużą liczbę silnie skontrastowanych, skurczonych lub spuchniętych komórek, z nierówną powierzchnią plasterka.</li>
	<li>Zidentyfikuj przypuszczalne interneurony FS w oświetleniu epifluorescencyjnym jako te wyrażające Wenus / YFP (ryc. 2B), z dużymi wielobiegunowymi somatami w lub w pobliżu str. pyramidale. Wybierz komórki odpowiednio głęboko w wycinku (50-100 μm, ryc. 2C), aby lepiej zachować ich integralność morfologiczną.</li>
	<li>Zamontuj elektrodę rejestrującą w uchwycie na pipetę na głowicy, a następnie przyłóż niskie, dodatnie ciśnienie (20-30 mBar) przez przewód rurowy. Opuść pipetę na powierzchnię wycinka, lekko przesuniętą do środka wybranego neuronu.</li>
	<li>Uzyskaj konfigurację zapisu całej komórki, jak opisano wcześniej14,16 i patrz również rysunki 2D i 2E:
	<ol>
		<li>Celowanie w komórkę: Zwiększ ciśnienie do 70-80 mBar i szybko opuść pipetę przez plasterek tuż nad somą wybranej komórki (Rysunek 2D, u góry).</li>
		<li>Zbliż się do komórki: Przyciśnij pipetę do błony komórkowej, aby uzyskać na niej "wgłębienie" (Rysunek 2D, góra). Wykonaj ten krok szybko, aby zapobiec znakowaniu biocytyny w sąsiednich komórkach.</li>
		<li>Stwórz uszczelnienie giga-omowe: Zwolnij ciśnienie i jednocześnie zastosuj polecenie napięcia 20 mV do pipety. Uszczelka giga-omowa (1-50 GΩ; Rysunek 2D, na dole i Rysunek 2E w środku) zwykle rozwija się szybko. Po uszczelnieniu zastosuj oczekiwany potencjał spoczynkowy membrany (zwykle od -70 do -60 mV) jako polecenie napięcia.</li>
		<li>Przebij się przez łatkę: Po uszczelnieniu rozerwij łatkę membrany krótkim impulsem podciśnienia, uzyskując w ten sposób konfigurację całej komórki (rysunek 2E, na dole).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kompensacja pojemności całego ogniwa i rezystancjiszeregowej (RS). Rs wynosi zwykle 5-20 MΩ i jest stabilny do 120 minut. Porzuć komórki, jeśli potencjał błonowy (VM) w momencie przebicia jest bardziej zdepolaryzowany niż -50 mV; RS jest początkowo większe niż 30 MΩ; lub RS zmienia się o więcej niż 20% w trakcie nagrywania.</li>
	<li>Zidentyfikuj FS-IN na podstawie ich odpowiedzi (w trybie cęgów prądowych) na rodzinę hiper- do depolaryzujących impulsów prądowych (od -250 do +250 pA, rysunek 2F, u góry). FS-IN mają stosunkowo zdepolaryzowane VM (zwykle od -50 do -60 mV), krótką stałą czasową membrany (<20 ms) i reagują na wstrzyknięcie prądu depolaryzującego 500 pA ciągiem potencjałów czynnościowych (AP) o częstotliwościach >100 Hz 11 (rysunek 2F, na dole), które znacznie różnią się od tych w komputerach CA1 (rysunek 2F, środek).</li>
</ol>
4. Zewnątrzkomórkowa stymulacja elektryczna wywołująca reakcje za pośrednictwem GABABR
<ol>
	<li>Aby zaobserwować reakcje wywołane synaptowo, należy umieścić elektrodę do stymulacji zewnątrzkomórkowej (pipetę punktową wypełnioną 2 M NaCl; Rezystancja: 0,1-0,3 MΩ) w warstwie na granicy str. radiatum i str. lacunosum-moleculare. Umieść elektrodę 200-300 μm bocznie od somy, aby zapobiec bezpośredniej stymulacji elektrycznej komórki i zminimalizować artefakty stymulacji (rysunek 3A).</li>
	<li>Po umieszczeniu elektrody stymulacyjnej, uzyskaj zapis całej komórki wybranej komórki i oceń fenotyp fizjologiczny w trybie cęgów prądowych, jak w sekcji 3.9 (Rysunek 3B).</li>
	<li>Z neuronem zapisanym w zacisku napięciowym (VM -65 mV), dostarczaj elektryczną stymulację aksonów presynaptycznych przy napięciu 50 V (skuteczny bodziec ~500 μA) co 20 sekund, używając izolowanego stymulatora o stałym napięciu. Użyj pojedynczych bodźców (czas trwania 100 μs, ryc. 3C, u góry), aby obserwować IPSC za pośrednictwem GABABR i przeplataj się z ciągami wielu bodźców (przy 200 Hz), aby uzyskać większe uwolnienie nadajnika.</li>
	<li>Do kąpieli stosuje się jonotropowych antagonistów receptora glutaminianu (receptor AMPA: DNQX [10 μM]; Receptor NMDA: d-AP5 [50 μM]) w celu ujawnienia izolowanego monosynaptycznego IPSC (ryc. 3C, środkowa górna). Dalej izolować IPSC za pośrednictwem GABABR za pomocą blokera GABAAR (gabazyna [10 μM]; Rysunek 3C, środek, dolny).</li>
	<li>Potwierdź, że wynikowy prąd spowolniony na zewnątrz (rysunek 3C niższy, rozszerzony) jest pośredniczony przez GABABR przez późniejsze zastosowanie CGP-55,845 [5 μM] (rysunek 3C niższy, pod szarym spodem)</li>
</ol>
5. Sparowane nagrania synaptycznie sprzężonych komputerów FS-IN i CA1
<ol>
	<li>Oceń presynaptyczną kontrolę hamującej transmisji synaptycznej za pośrednictwem GABABR z jednoczesnymi zapisami, wykonywanymi między synaptycznie sprzężonymi parami IN i PC, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Najpierw ustal zapis całego komórkowego interneuronu presynaptycznego (jak w sekcji 3) i potwierdź fenotyp FS (ryc. 4A).</li>
	<li>Następnie załataj sąsiedni komputer CA1 (odległość 20-100 μm, rysunek 4A) i zastosuj krótkie supraprogowe impulsy prądu depolaryzacyjnego (czas trwania 1 ms, amplituda 1-5 nA) do presynaptycznego IN (utrzymywanego w trybie cęgów prądowych) w celu wywołania AP. Jeśli obecne jest połączenie synaptyczne, AP w IN powodują IPSC w CA1 PC, utrzymywane w zacisku napięciowym (kompensująR S do około 80%).</li>
	<li>W razie potrzeby napełnij nową elektrodę rejestrującą i nagrywaj z kolejnych komputerów CA1, aż zostanie znalezione połączenie.</li>
	<li>Po nawiązaniu połączenia wywołaj pary AP w presynaptycznym FS-IN, aby ocenić zarówno unitarną odpowiedź synaptyczną, jak i dynamiczne zachowanie. Użyj typowego protokołu sparowanych impulsów składającego się z 2 bodźców depolaryzujących w odstępie 50 ms (ryc. 4B).</li>
	<li>Zbieranie śladów kontrolnych w warunkach bazowych. Następnie zastosuj selektywny agonista GABABR baklofen (10 μM) do perfekującego ACSF, aktywując w ten sposób GABABRs, a następnie antagonistę CGP-55,845 (5 μM), aby całkowicie zablokować działanie za pośrednictwem receptora. Zbierz ~50 śladów w stanie stacjonarnym każdego stanu leku (Rysunek 4B i C).</li>
	<li>Po zakończeniu zapisu uszczelnij błonę somatyczną, tworząc łatkę na zewnątrz: Powoli wyjmij pipetę z korpusu komórki w zacisku V-clamp i wraz ze wzrostem RS zmniejsz VM do -40 mV. Zrób to, aby ułatwić tworzenie się łaty na zewnątrz; Następnie wyjmij pipetę z wanny.</li>
</ol>
6. Analiza właściwości elektrofizjologicznych
<ol>
	<li>UWAGA: Dostępnych jest wiele różnych pakietów oprogramowania do pozyskiwania danych elektrofizjologicznych. W tym przypadku używany jest WinWCP, program Windows w darmowym pakiecie Strathclyde Electrophysiology Software, który umożliwia nagrywanie do 16 analogowych kanałów wejściowych i wyprowadzanie 10 sygnałów cyfrowych.</li>
	<li>Filtr dolnoprzepustowy wszystkie dane przy 5-10 kHz i próbka przy 20 kHz.</li>
	<li>Analizuj dane fizjologiczne za pomocą pakietu do analizy off-line. 
	UWAGA: W tym przypadku używany jest Stimfit, pakiet oprogramowania typu open source, który zawiera powłokę Pythona; Jednak zamiast tego można łatwo zastosować inne alternatywy.
	<ol>
		<li>Analizuj pasywne właściwości błony zarejestrowanych neuronów, nabyte w zacisku prądowym, ze spoczynkowego potencjału błonowego.</li>
		<li>Zmierz średni spoczynkowy potencjał błony od linii podstawowej zarejestrowanych odpowiedzi od początku zapisu.</li>
		<li>Oblicz rezystancję wejściową, korzystając z prawa Ohma, od odpowiedzi napięciowej na najmniejsze impulsy prądu hiperpolaryzacyjnego (≤ -50 pA). Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, uśrednij wiele ścieżek. Uwaga: nasze przykłady to zazwyczaj średnie z 10-50 pojedynczych przeciągnięć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oszacuj pozorną stałą czasową błony, dopasowując krzywą monowykładniczą do zaniku odpowiedzi na najmniejsze impulsy prądu hiperpolaryzacyjnego.</li>
	<li>Przeanalizuj przebieg potencjału czynnościowego, aby określić próg, amplitudę (od progu do szczytu) i czas trwania (szerokość mierzoną w połowie wysokości) wywołane przez impulsy prądu depolaryzującego na poziomie progowym.</li>
	<li>Analizuj IPSC za pośrednictwem GABAIRz nagrań cęgów napięciowych. Przefiltruj ślady off-line przy 500 Hz (filtr Gaussa) i oceń szczytową amplitudę i opóźnienie odpowiedzi za pośrednictwem GABABR (średnio co najmniej 10 śladów).</li>
	<li>Wykryj wpływ GABABRs na hamującą produkcję IN jako zmianę amplitudy piku IPSC za pośrednictwem GABAAR, mierzoną między szczytem a poprzednią linią wyjściową. Obliczyć średnią amplitudę ze śladów ≥50 dla okresu kontrolnego i stanu ustalonego wszystkich epok farmakologicznych.</li>
</ol>
7. Wizualizacja i immunocytochemia FS-Ins
<ol>
	<li>Po nagraniach utrwalić plastry przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie z 0,1 M buforem fosforanowym (PB, pH = 7,35) O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W razie potrzeby plastry można przenieść do PB i przechowywać do ~1 tygodnia przed przetworzeniem.</li>
	<li>Plastry myć obficie w świeżym PB, a następnie w 0,025 M PB z 0,9% NaCl (PBS, pH = 7,35).</li>
	<li>Aby zmniejszyć nieswoiste wiązanie przeciwciał, należy zablokować plastry na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w roztworze zawierającym 10% normalnej surowicy koziej (NGS), 0,3% Triton-X100 (detergent do przepuszczalności błon) i 0,05% NaN3, uzupełnione w PBS.</li>
	<li>Aby oznaczyć ekspresję PV, należy użyć mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-PV rozcieńczonego w roztworze zawierającym 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN3 w PBS. Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe przez 2-3 dni w temperaturze 4 °C12. Dokładnie opłucz plastry w PBS.</li>
	<li>Zastosować fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe przeciwko myszom (np. Alexafluor-546) wraz z białkiem wiążącym biotynę streptawidyną, sprzężonym z fluorochromem (np. Alexafluor-647); i inkubować w roztworze zawierającym 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN3, rozcieńczony w PBS i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Obficie opłucz plastry 2-3x PBS, a następnie 2-3 płukania w PB. Zamontuj plastry na szkiełkach podstawowych. Użyj przekładki agarowej 300 μm, aby zapobiec zapadaniu się plasterka. Plastry szkiełka nakrywkowego z fluorescencyjnym medium montażowym i uszczelnić lakierem do paznokci.</li>
</ol>
8. Obrazowanie i rekonstrukcja wizualizowanych FS-Ins
<ol>
	<li>Wizualizacja wycinków za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego, z reporterem fluorochomowym wzbudzonym odpowiednią linią laserową (laser diodowy 635 nm dla Alexafluor-647; Hel-neon 543 nm dla znakowania Alexafluor-546 dla PV i Argon 488 lub 515 nm dla Wenus/YFP).</li>
	<li>Rób zdjęcia w odpowiedniej rozdzielczości Z (zwykle co 0,5-1 μm, używając obiektywu 20X), aby utworzyć stos Z całej komórki. Do zobrazowania całej komórki zwykle wymaganych jest wiele stosów, które można cyfrowo zszyć w trybie off-line za pomocą oprogramowania FIJI/ImageJ (rysunek 5A).</li>
	<li>Zrekonstruuj komórkę ze zszytego stosu obrazów za pomocą półautomatycznej metody śledzenia (wtyczka Simple Neurite Tracer w pakiecie oprogramowania FIJI/ImageJ17, rysunek C).</li>
	<li>Na koniec oceń immunoreaktywność PV interneuronu za pomocą soczewki obiektywowej o wysokiej aperturze numerycznej (60-krotne zanurzenie w krzemie, NDA = 1,3). Wykonaj obrazy somy, dendrytów proksymalnych i aksonu proksymalnego lub alternatywnie zakończeń aksonów, jeśli wymywanie somatyczne PV jest zbyt silne. Komórki uważa się za immunoreaktywne dla PV, jeśli zaobserwowano, że znakowanie immunologiczne jest zgodne ze strukturami znakowanymi biocytyną (Figura 5B).</li>
</ol>

<ol><li>Freund, T. F., Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Interneurons of the hippocampus.</a> Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).</li>
<li>Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+labeling+of+parvalbumin-positive+interneurons+and+analysis+of+electrical+coupling+in+identified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons.</a> Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).</li>
<li>Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unitary+IPSPs+evoked+by+interneurons+at+the+stratum+radiatum-stratum+lacunosum-moleculare+border+in+the+CA1+area+of+the+rat+hippocampus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiolology%22%5BJournal%5D)">Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro.</a> Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).</li>
<li>Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+cleft+at+GABA+synapses+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bridging the cleft at GABA synapses in the brain.</a> Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).</li>
<li>Bartos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+inhibition+promotes+synchronized+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks.</a> PNAS. 99, 13222-13227 (2002).</li>
<li>Cobb, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+effects+of+identified+interneurons+innervating+both+interneurons+and+pyramidal+cells+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).</li>
<li>Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+mechanisms+of+synchronized+gamma+oscillations+in+inhibitory+interneuron+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks.</a> Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).</li>
<li>Ascoli, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Petilla+terminology+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).</li>
<li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+properties+of+anatomically+identified+basket+and+bistratified+cells+in+the+CA1+areas+of+the+rat+hippocampus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro.</a> Hippocampus. 6, 294-305 (1996).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+spiking+cells+in+rat+hippocampus+%28CA1+region%29+contain+the+calcium-+binding+protein+parvalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin.</a> Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).</li>
<li>Booker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+GABAB-Receptor-Mediated+Effects+in+Perisomatic-+and+Dendrite-Targeting+Parvalbumin+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).</li>
<li>Uematsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+composition+of+cortical+GABAergic+neurons+revealed+in+transgenic+Venus-expressing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats.</a> Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).</li>
<li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li>
<li>Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Chloride+Ions+Regulate+the+Time+Course+of+GABA-Mediated+Inhibitory+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission.</a> Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Geiger, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+in+brain+slices+with+improved+slicer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archives%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology.</a> Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li>
<li>Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shunting+inhibition+improves+robustness+of+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks+by+homogenizing+firing+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates.</a> Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).</li>
<li>Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+origin+of+CB1-dependent+tonic+inhibition+of+GABA+release+at+cholecystokinin-positive+basket+cell+to+pyramidal+cell+synapses+in+the+CA1+region+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).</li>
<li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit%2C+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic%2C+basket%2C+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisujemy metodę, która łączy techniki elektrofizjologiczne i neuroanatomiczne w celu funkcjonalnego scharakteryzowania morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych neuronów in vitro; w szczególności różne rodzaje korowych inhibitorów IN. Kluczowe aspekty procedury to: (1) wstępna selekcja potencjalnych IN; (2) zapis wewnątrzkomórkowy i wizualizacja neuronów; i wreszcie (3) analiza morfologiczna i immunocytochemiczna zarejestrowanych IN. Chociaż badanie to dotyczyło w szczególności PV-IN, opisany protokół może być ...

Obwody neuronalne hipokampa od dawna są przedmiotem intensywnych badań, zarówno w odniesieniu do anatomii, jak i fizjologii, ze względu na ich istotną rolę w uczeniu się i pamięci, a także nawigacji przestrzennej zarówno u ludzi, jak i gryzoni. Podobnie, wyraźna, ale prosta organizacja laminarna hipokampa sprawia, że region ten jest ulubionym przedmiotem badań dotyczących strukturalnych i funkcjonalnych właściwości sieci korowych.
Obwody hipokampa składają się z głównych komórek pobudzających (>80%) i mniejszej (10-20%), ale bardzo zróżnicowanej kohorty interneuronów hamujących>1-3. Interneurony uwalniają kwas γ-aminomasłowy (GABA) ze swoich zakończeń aksonów, który działa na szybkie jonotropowe receptoryA, A, (GABA, A, RS) i powolne metabotropowe receptory GABAB (GABAB, RS)4. Te mechanizmy hamujące równoważą pobudzenie i regulują pobudliwość głównych komórek, a tym samym ich czas i wzorzec wyładowania. Jednak GABA uwalniany z interneuronów działa nie tylko na główne komórki, ale także na same interneurony5,6. Receptory pre- i postsynaptyczne pośredniczą w regulacji sprzężenia zwrotnego i hamujących wzajemnych interakcjach między różnymi typami interneuronów. Uważa się, że te mechanizmy hamujące w sieciach interneuronowych mają kluczowe znaczenie dla generowania i kształtowania wzorców aktywności populacji, w szczególności oscylacji o różnych częstotliwościach7.
Zapis na całej komórce jest dobrze znaną metodą badania wewnętrznych właściwości i interakcji synaptycznych neuronów. Jednak ze względu na dużą różnorodność typów interneuronów, badanie interneuronów hamujących wymaga rygorystycznej identyfikacji zarejestrowanych komórek. Ponieważ typy interneuronów hipokampa charakteryzują się odrębnymi cechami morfologicznymi i ekspresją markerów neurochemicznych, połączone badanie anatomiczne i immunocytochemiczne może zapewnić sposób na określenie precyzyjnej tożsamości interneuronów6,8,9.
W niniejszym artykule opisujemy eksperymentalne podejście, w którym zapisy całokomórkowych kropek z pojedynczych neuronów lub par sprzężonych synaptycznie są łączone z wewnątrzkomórkowym znakowaniem, a następnie analizą morfologiczną i immunocytochemiczną post hoc, co pozwala na scharakteryzowanie powolnego GABAB Efekty hamujące za pośrednictwem receptorów w zidentyfikowanych interneuronach. Jako przykład skupiamy się na jednym głównym typie interneuronu, podzbiorze tak zwanych "komórek koszyczkowych" (BC), który unerwia somę i proksymalne dendryty swoich celów postsynaptycznych i charakteryzuje się "szybkim wyładowaniem" (FS), aksonem gęsto pokrywającym warstwę ciała komórki i ekspresją białka wiążącego wapń parwalbuminy (PV)10,11. Te interneurony wykazują duże postsynaptyczne prądy hamujące, a także wyraźną presynaptyczną modulację ich synaptycznego wyjścia w odpowiedzi na aktywację GABABR12. Opisana tutaj kombinacja technik może być równie dobrze zastosowana do badania wewnętrznych lub synaptycznych mechanizmów w wielu innych zidentyfikowanych typach neuronów.

<table><tbody><tr><td>Transgeniczne szczury vGAT-venus</td><td></td><td></td><td>patrz Uematsu , &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2008</td></tr><tr><td>Gogle Venus (515 nm)</td><td>BLS Ltd., Węgry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do sekcji</td><td>&lt;em&gt;np.&lt;/em&gt; FST</td><td></td><td>Do usuwania mózgu</td></tr><tr><td>Wibratom</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>Lub inny wibratom wysokiej klasy z minimalnymi oscylacjami pionowymi</td></tr><tr><td>Komory do utrzymywania skrawków</td><td></td><td></td><td>Wykonane na zamówienie w laboratorium</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy IR-DIC</td><td>Olympus, Japonia</td><td>BX50WI</td><td>Z systemem mikromanipulatorów; &lt;em&gt;np.&lt;/em&gt; Luigs and Neumann, Kleindiek &lt;em&gt;itp.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Till Photonics</td><td>VX55</td><td></td></tr><tr><td>System LED 505 nm</td><td>Cairn Research</td><td>OptiLED system</td><td>Lub lampa rtęciowa lub inny system LED, &lt;em&gt;np.&lt;/em&gt; CooLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Alternatywnie 2x wzmacniacze Axopatch 200B&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie akwizycyjne WinWCP</td><td>John Dempster, Strathclyde University</td><td></td><td>Można użyć dowolnego wysokiej jakości oprogramowania akwizycyjnego, &lt;em&gt;np.&lt;/em&gt; EPHUS, pClamp, Igor itp.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Wytciągacz elektrod</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>Stosowany z włóknem w pudełku (box-filament)</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemowe do pipet</td><td>Hilgenberg, Niemcy</td><td>1405020</td><td>Średnica zewnętrzna 2 mm, wewnętrzna 1 mm, bez włókna</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>Minipuls</td><td>Zamiast niej można użyć innych pomp lub zasilania grawitacyjnego</td></tr><tr><td>Termometr cyfrowy</td><td></td><td></td><td>Wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>Manometr cyfrowy</td><td>Supertech, Węgry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/&quot; target=&quot;_blank">Izolowany stymulator stałego napięcia&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds2a-isolated-constant-voltage-stimulatorstimulus-isolator/&quot; target=&quot;_blank">DS-2A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Biocytyna</td><td>Invitrogen</td><td>B1592</td><td>Znana również jako &amp;epsilon;-Biotinoyl-L-Lysine&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sól sodowa DL-AP5(V)</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120271</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa DNQX</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120169</td><td>Alternatywnie NBQX lub CNQX</td></tr><tr><td>Gabazyna (SR95531)</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120042</td><td>Alternatywnie metjodydek bikukulinowy</td></tr><tr><td>R-Baklofen</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120325</td><td></td></tr><tr><td>Wodorochlorek CGP-55,845</td><td>Tocris</td><td>1248</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>mysi monoklonalne przeciwciało anty-PV</td><td>Swant, Szwajcaria</td><td>235</td><td>Stężenie robocze 1:5,000-1:10,000</td></tr><tr><td>przeciwciało wtórne anty-mysie&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>W przypadku stosowania Venus lub GFP u gryzoni zaleca się użycie kanału czerwonego (&lt;em&gt;np.&lt;/em&gt; 546 nm).</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Lamelki mikroskopowe</td><td></td><td></td><td>Dowolna wysokiej jakości marka</td></tr><tr><td>Szklane nakrywki</td><td></td><td></td><td>Zazwyczaj 22 x 22 mm</td></tr><tr><td>Przestrzenie agarowe</td><td></td><td></td><td>Blok agaru, wycinany na wibratomie do 300 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Skanujący konfokalny mikroskop laserowy</td><td>Olympus, Japonia</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Lub inny porównywalny system</td></tr><tr><td>Fiji (Fiji to po prostu ImageJ)</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td>Patrz Schindelin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2012</td></tr></tbody></table>

nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Interneurony hamujące GABAergiczne odgrywają centralną rolę w obwodach neuronalnych mózgu. Interneurony stanowią niewielki podzbiór populacji neuronów (10-20%), ale wykazują wysoki poziom heterogeniczności fizjologicznej, morfologicznej i neurochemicznej, co odzwierciedla ich różnorodne funkcje. Dlatego badanie interneuronów dostarcza ważnych informacji na temat zasad organizacji i funkcji obwodów neuronalnych. Wymaga to jednak zintegrowanego podejścia fizjologicznego i neuroanatomicznego do selekcji i identyfikacji poszczególnych typów interneuronów. Zapis całokomórkowy patch-clamp z ostrych wycinków mózgu zwierząt transgenicznych, eksprymujących białka fluorescencyjne pod promotorami markerów specyficznych dla interneuronów, zapewnia skuteczną metodę celowania i elektrofizjologicznego charakteryzowania wewnętrznych i synaptycznych właściwości określonych typów interneuronów. W połączeniu z wewnątrzkomórkowym znakowaniem barwników, podejście to można rozszerzyć o analizę morfologiczną i immunocytochemiczną post hoc, umożliwiając systematyczną identyfikację zarejestrowanych neuronów. Metody te można dostosować do szerokiego zakresu pytań naukowych dotyczących właściwości funkcjonalnych różnych typów neuronów korowych.

Pod warunkiem, że jakość skrawka jest odpowiednio wysoka, rejestrację z komórek piramidowych (PCs) obszaru CA1 oraz szybkich interneuronów (FS-INs) można przeprowadzić z minimalnymi trudnościami. Transgeniczna linia szczurów wykazująca ekspresję Venus / YFP pod promotorem vGAT13 nie identyfikuje jednoznacznie FS-INs, ani komórek koszyczkowych (BCs). Jednak rejestracje z interneuronów (INs) w obrębie i wokół str. pyramidale, gdzie gęstość FS-INs jest zazwyczaj wysoka1, dają duże prawdopodobi...

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka efektów pośredniczonych przez receptory GABA B w zidentyfikowanych interneuronach hipokampa wykazujących ekspresję parwalbuminy. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności wysokiej jakości ostrych przekrojów hipokampa. Drugim krokiem jest wykorzystanie mikroskopu wideo do wyboru neuronów na podstawie ekspresji YFP oraz znanych cech neuronów wykazujących ekspresję parwalbuminy.Następnie przeprowadza się rejestracje metodą patch clamp w konfiguracji whole cell, wykorzystując stymulację zewnątrzkomórkową lub rejestracje sparowane w celu zbadania efektów pośredniczonych przez receptory GABA B. Ostatnim krokiem jest wizualizacja neuronów i potwierdzenie, że rejestrowane neurony są rzeczywiście paralbuminowe oraz stanowią inhibitoryczne neurony parasomatyczne lub dendrytyczne. Ostatecznie metoda ta umożliwia charakteryzację hamujących efektów pośredniczonych przez receptory GABA B i pozwala na jednoznaczną klasyfikację rejestrowanych interneuronów.Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronów interneuronów. Na przykład: w jaki sposób interneurony komunikują się ze so

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestrowanie całego zacięcia komórkowego z identyfikowanych morfologicznie i neurochemicznie interneuronów hipokampu

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Ten film demonstruje technikę nagrywania za pomocą zacisku krosowego z powierzchni membrany dendrytycznej. Pomaga to bezpośrednio badać właściwości elektryczne dendrytów i leżących u ich podstaw kanałów jonowych bramkowanych napięciem w neuronach dopaminergicznych.

Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Film demonstruje protokół do badania interakcji synaptycznych i odpowiedzi neuronalnych w transfekowanym wycinku mózgu hipokampa myszy. Polega na oświetlaniu neuronów czuciowych dalekiego zasięgu w celu wyzwolenia potencjałów czynnościowych i rejestrowaniu powstałych pobudzających potencjałów postsynaptycznych w zarejestrowanym neuronie za pomocą techniki patch-clamp dla całej komórki.

Fotostymulacja i zapisy klamer całokomórkowych neuronów w wycinkach hipokampa myszy

Ten film demonstruje procedurę wykonywania zapisów elektrofizjologicznych w neuronach istoty żelowej (SG) wycinków rdzenia kręgowego, przy użyciu technik całokomórkowych kropek do analizy wzorców uruchamiania neuronów. Metoda ta pozwala na badanie reakcji neuronalnych na bodźce w neuronach SG rdzenia kręgowego.

Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Ten film demonstruje procedurę mapowania połączeń synaptycznych poprzez zabezpieczenie wycinka mózgu, ustawienie pipet w celu uzyskania konfiguracji całych komórek i stymulowanie neuronów presynaptycznych do rejestrowania odpowiedzi postsynaptycznych, wyjaśniając w ten sposób łączność neuronalną.

Zapis sparowanych połączeń neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Nagrania par to równoczesne nagrania klamrów całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów, umożliwiające precyzyjną elektrofizjologiczną i farmakologiczną charakterystykę synaps między poszczególnymi neuronami. Poniżej opisujemy szczegółową metodologię i wymagania dotyczące ustalenia tej techniki w organotypowych kulturach plastrów hipokampa w dowolnym laboratorium wyposażonym do elektrofizjologii.

Sparowane nagrania całych komórek w organotypowych wycinkach hipokampa

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Subcellular patch-clamp recordings dają możliwość zbadania funkcjonalnych właściwości dendrytów. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne ze względu na ich małą średnicę. Opisany tutaj protokół ma na celu ułatwienie zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminowych w wycinkach in vitro.

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Obecny protokół opisuje, jak izolować i oczyszczać pierwotny mikroglej hipokampa od dorosłych myszy, a następnie instrukcje dotyczące przeprowadzania zapisów całokomórkowych na tych ostro izolowanych komórkach.

Izolacja i zapis całokomórkowy mikrogleju hipokampa od dorosłych myszy

Poznaj metodę całokomórkowych nagrań klamry krosowej do badania receptorów GABA B w interneuronach hipokampa u szczurów. Technika ta umożliwia precyzyjną identyfikację komórek parwalbuminowych i analizę ich funkcji hamujących.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Przeglądaj więcej filmów