Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy
12 sierpnia 2014
Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie genetycznie zmodyfikowanych modeli gwiaździaka z określonych typów komórek w celu charakterystyki fenotypowej in vitro i in vivo. Osiąga się to poprzez zbieranie komórek pierwotnych typu dzikiego od noworodków, warunkowo modyfikowanych genetycznie myszy z ekspresją Cree do hodowli in vitro. W drugim etapie komórki pierwotne są zakażane wektorem adenowirusowym kodującym rekombinację Cree w celu wywołania rekombinacji genetycznej alleli flox F in vitro.
Następnie zrekombinowane komórki są hodowane seryjnie w celu ich charakterystyki fenotypowej. Ostatecznie to, czy zdefiniowane mutacje sprzyjają agenezji glejowej w określonych typach komórek nerwowych, zależy od charakterystyki fenotypów istotnych dla nowotworów in vitro i in vivo. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania neuroonkologiczne, takie jak: Jakie są fenotypowe konsekwencje mutacji związanych z gwiaździakiem?
Implikacje tej techniki rozciągają się na przedkliniczne opracowywanie leków na gwiaździaki, ponieważ te genetycznie zdefiniowane komórki mogą być stosowane in vitro i in vivo, u myszy syngenetycznych kompetentnych immunologicznie. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy pobierania komórek i iniekcji ortotopowej są technicznie trudne i wymagają dokładnej identyfikacji struktur anatomicznych. Procedurę zademonstruje Ryan Bash, technik z mojego laboratorium, który pobierze tkankę mózgową.
Zacznij od użycia wysterylizowanych etanolem nożyczek preparacyjnych, aby wykonać strzałkowe nacięcie skóry nad czaszką jedno- lub trzydniowej, uśpionej, genetycznie zmodyfikowanej myszy noworodkowej, od rdzenia kręgowego do nosa. Następnie wykonaj nacięcie w czaszce wzdłuż szwu strzałkowego, zaczynając od rdzenia kręgowego i rozciągając się obok opuszków węchowych. Następnie użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie oderwać każdą półkulę czaszki bocznie od mózgu za pomocą prostych mikrokleszczy.
Następnie delikatnie uszczypnij grzbietową część każdej półkuli korowej, uważając, aby ominąć móżdżek i opuszkę węchową i umieść tkankę mózgową w naczyniu do hodowli tkanek zawierającym H-B-S-S-N. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj dwóch par mikrokleszczyków, aby delikatnie usunąć opony mózgowe z każdej półkuli korowej i umieść naczynie do hodowli tkankowej z powrotem na lodzie, aby homogenizować tkankę mózgową. Najpierw użyj czystej żyletki, aby w końcu pokroić półkule korowe w kostkę.
Następnie przenieś płytkę do kaptura do hodowli tkankowych i przenieś kawałki tkanki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Opłucz płytkę jednym mililitrem lodowatego HBSS i przenieś pranie również do tubki. Po usunięciu nadmiaru HBSS w temperaturze pokojowej o dwóch mililitrach należy przeprowadzić tripin z EDTA do probówki i powiązać fragmenty tkanki dalej, pipetując w górę iw dół około 10 razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.
Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Ostrożnie mieszając roztwór komórkowy przez inwersję co pięć minut po inkubacji, wymieszaj trzy mililitry kompletnej pożywki z zawiesiną komórkową, aby zahamować trypsynę, pipetując w górę iw dół 10 razy, jak właśnie pokazano. Następnie odkręć zdysocjowane astrocyty.
Ostrożnie usuń kroplę za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i ponownie zawieś granulkę w czterech mililitrach o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kompletne nośniki. Następnie przenieś zawiesinę astrocytów do kolby do hodowli tkankowych T 75 i utrzymuj astrocyty korowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla około 16 godzin po zbiorach.
Umyć kolbę czterema mililitrami HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj cztery mililitry kompletnej pożywki i utrzymuj astrocyty korowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Gdy kultura osiągnie około 95% konfluencji, potrząśnij kulturą przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.
Następnie wyjmij pożywkę zawierającą oderwane komórki i umyj płytkę czterema kolejnymi mililitrami HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj cztery mililitry świeżej, kompletnej pożywki i ponownie inkubuj komórki 24 godziny po wzbogaceniu kultury astrocytów korowych. Odśwież kulturę za pomocą dwóch mililitrów kompletnego podłoża.
Następnie inkubować komórki z jednym mililitrem kompletnej pożywki zawierającej jeden mikrolitr co najmniej jeden razy 10 z 10 pfu na mililitr interesującego adenowirusa w temperaturze 32 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla w wieku pięciu stopni. Zakażenie Gfab CRE powoduje przewagę proliferacyjną w rekombinowanych astrocytach gfab, zwiększając czystość astrocytów z 59% do ponad 90% po pięciu do dziewięciu pasażach w hodowli. Po sześciu godzinach usuń pożywkę zawierającą wirusa i ponownie inkubuj kulturę w świeżych, kompletnych pożywkach.
Po zebraniu astrocytów korowych w około 90% zbiegu, a odpowiednia liczba komórek jest ponownie zawieszona w lodowatej 5% metylocelulozie. Umieść szklaną strzykawkę o pojemności 250 mikrolitrów w powtarzalnym dozowniku antygenu, a następnie przymocuj igłę o rozmiarze 18 do strzykawki. Użyj igły o rozmiarze 18, aby zassać astrocyty korowe do strzykawki i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
Następnie wyrzucić igłę o rozmiarze 18 i założyć igłę o rozmiarze 27 na strzykawkę. Naciśnij przycisk na dozowniku antygenu, aż płyn zostanie usunięty z nowej igły, aby wszczepić astrocyty. Następnie zabezpiecz trzy- do sześciomiesięcznego immunokompetentnego biorcę w ramie stereotaktycznej i wykonaj nacięcie nad szwem strzałkowym o długości około 0,5 centymetra między uszami a oczami.
Zlokalizuj przecięcie szwów koronalnych i strzałkowych lub BRE MA, a także przecięcie lambdoidu w szwach strzałkowych lub Lambda. Po upewnieniu się, że BMA i lambda znajdują się w tej samej płaszczyźnie poziomej, przymocuj strzykawkę i dozownik powtarzającego się antygenu do ramy stereotaktycznej nad głową zwierzęcia i doprowadź końcówkę igły do kontaktu z bgma. Podnieś igłę lekko z powierzchni czaszki i przesuń dwa milimetry w bok i jeden milimetr rostral od bgma.
Następnie ostrożnie opuść igłę przez czaszkę do miejsca docelowego. Cztery milimetry brzusznie od breg MA i aktywować powtarzający się dozownik antygenu. Jednorazowo wstrzyknąć pięć mikrolitrów zawiesiny komórek.
Pozostawić igłę na miejscu na dwie minuty, aby ciśnienie śródczaszkowe się zrównoważyło, a następnie powoli wyjmować igłę przez okres 30 sekund, używając bawełnianej zamiany, aby wywrzeć nacisk na krwawienie, które może wystąpić. Na koniec użyj kleju tkankowego, aby przybliżyć krawędzie rany i zamknąć nacięcie, a następnie umieść zwierzę w czystej, ciepłej klatce, aby mogło dojść do siebie. Ksenoprzeszczepy ustalonych ludzkich linii komórkowych wymagają gospodarzy z niedoborem odporności i na ogół nie uzupełniają histopatologii ludzkich gwiaździaków.
Na przykład ksenoprzeszczepy ortotopowe U 87 MG tworzą ograniczone guzy, które nie atakują normalnego mózgu. W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie astrocytów zerowych T RRP do mózgów myszy syngenicznych kompetentnych immunologicznie daje guzy, które podsumowują cechy histologiczne ich ludzkich odpowiedników, w szczególności inwazję normalnej tkanki mózgowej. Aby monitorować wzrost alloprzeszczepu zerowego TRP, myszy uśmierano co pięć dni po wstrzyknięciu komórek, a obciążenie guza określano poprzez ilościowe określenie obszaru guza na wybarwionych h i e odcinkach mózgu.
Stwierdzono, że obszar guza zwiększa się wykładniczo w czasie, a ortotopowe wstrzyknięcie jednego razy 10 do jednej piątej astrocytów TP nll do mózgu biorcy doprowadziło do zachorowalności neurologicznej. Z medianą przeżycia wynoszącą 22 dni. Obrazowanie podłużne in vivo zostało wykorzystane do zdefiniowania kinetyki wzrostu guza.
Dlatego w tym eksperymencie astrocyty karne TR i zaprojektowane do ekspresji lucyferazy zostały wstrzyknięte do mózgów kompetentnych immunologicznie syngeneicznych. Liczbę rodzeństwa z miotu i wzrost guza określono za pomocą seryjnego obrazowania bioluminescencyjnego. W ciągu 16 dni zaobserwowano 15-krotny wzrost bioluminescencji
.Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić testy leków in vitro i in vivo w celu określenia skuteczności i przetestowania nowych kombinacji leków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać astrocyty korowe od warunkowo modyfikowanych myszy genetycznie modyfikowanych bez ekspresji crea, jak indukować rekombinację genetyczną in vitro i jak modelować nowotwór za pomocą ortotopowych przeszczepów alloskopowych u myszy kompetentnych immunologicznie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na generowaniu genetycznie zmodyfikowanych modeli astrocytoma z astrocytów typu dzikiego oraz komórek macierzystych neuronów pobranych od warunkowo zmodyfikowanych genetycznie myszy. Modele te są charakteryzowane in vitro i in vivo w celu zrozumienia fenotypowych konsekwencji mutacji związanych z astrocytoma.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuroonkologia
- Biologia komórki
- Inżynieria genetyczna
Wstęp
- Astrocytoma to rodzaj guza mózgu wywodzącego się z astrocytów.
- Zrozumienie podstaw genetycznych astrocytoma może pomóc w opracowaniu strategii leczenia.
- Warunkowa inżynieria genetyczna umożliwia ukierunkowane badania nad konkretnymi mutacjami.
- Modelowanie astrocytoma in vitro i in vivo jest kluczowe dla charakterystyki fenotypowej.
Cel badania
- W celu wygenerowania modeli astrocytoma do charakteryzacji fenotypowej.
- W celu zbadania wpływu specyficznych mutacji na gliogenezę.
- W celu udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuroonkologii dotyczące mutacji w astrocytoma.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie pierwotnych komórek typu dzikiego z myszy modyfikowanych genetycznie.
- Zakażanie komórek pierwotnych wektorem adenowirusowym w celu rekombinacji genetycznej.
- Kultura seryjna rekombinowanych komórek do analizy fenotypowej.
- Charakteryzacja fenotypów istotnych dla tumorigeniczności in vitro oraz in vivo.
Główne wyniki
- Skuteczne wytworzenie modeli astrocytomy z określonych typów komórek.
- Charakterystyka zmian fenotypowych związanych z mutacjami.
- Wgląd w rolę specyficznych mutacji w rozwoju astrocytomy.
- Potencjalne implikacje dla zrozumienia i leczenia astrocytom.
Wnioski
- Badanie dostarcza ram dla modelowania patogenezy astrocytomi.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mutacji związanych z astrocytomią.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych modelach w celu zbadania opcji terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia badaniom i rozwojowi w sektorze biofarmaceutycznym modelowanie patogenezy astrocytoma z wykorzystaniem genetycznie zdefiniowanych astrocytów korowych lub komórek macierzystych neuronów z kondycjonalnych modeli GEM, zapewniając syngeniczny, immunokompetentny system, który odtwarza ludzkie cechy histopatologiczne, w tym rozsianą inwazję mózgu. Wspiera ona redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie konkretnych mutacji onkogennych z efektami fenotypowymi in vitro i in vivo, co zwiększa pewność walidacji celu terapeutycznego. Ortotopowy model allograftu ułatwia przedkliniczne testowanie leków w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku, zwiększając ciągłość translacyjną w procesach rozwoju leków w neuroonkologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez określenie skutków fenotypowych konkretnych mutacji onkogennych w odpowiednich typach komórek mózgu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system funkcjonalnej walidacji celów poprzez rekombinację zależną od adenowiralnej Cre w komórkach pierwotnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie mutacji z fenotypami transformacji, proliferacji oraz odpowiedzi na leki.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje zwalidowane systemy biologiczne odpowiednie do późniejszego przesiewania związków po fenotypowej charakterystyce in vitro.
- Wyniki ilościowe: Umożliwia pomiar proliferacji, transformacji i odpowiedzi na leki jako zestandaryzowanych punktów końcowych dla rozwoju testów.
- Skalowalność: Seryjna hodowla rekombinowanych komórek umożliwia skalowalne przygotowanie transformowanych astrocytów dla powtarzalnych kampanii przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Ortotopowe allografty u immunokompetentnych myszy syngenicznych odzwierciedlają cechy histopatologiczne ludzkich astrocytomów, w tym glejaków wielopostaciowych oraz rozlaną inwazję miąższową.
- Ciągłość translacyjna: Obrazowanie bioluminescencyjne allograftów wykazujących ekspresję lucyferazy umożliwia podłużne monitorowanie wzrostu guza in vivo na potrzeby badań farmakokinetycznych i farmakodynamicznych.
- Użyteczność przedkliniczna: Ułatwia testowanie skuteczności leków in vitro i in vivo z wykorzystaniem tego samego, genetycznie zdefiniowanego systemu komórkowego, co wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając genetycznie zdefiniowany, immunokompetentny model systemowy astrocytoma.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie kontrolowanej rekombinacji floxowanych alleli onkogennych w astrocytach korowych lub NSC.
- Przesiewanie: Dostarcza przekształcone komórki gotowe do analizy z mierzalnymi fenotypami (proliferacja, transformacja, odpowiedź na lek), co pozwala na wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych (pole powierzchni guza w badaniu histopatologicznym, sygnał bioluminescencyjny), co umożliwia porównania między grupami oraz modelowanie kinetyki wzrostu.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z tumorigenezą in vivo poprzez ortotopowe allografty, które odzwierciedlają histopatologię ludzkiego astrocytoma.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania wielu kombinacji onkogennych w różnych typach komórek, co zmniejsza zależność od modeli ksenograftów wymagających immunosupresji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki zastosowaniu izogenicznego modelowania specyficznego dla typu komórek.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym wejściom genetycznym oraz syngenicznym systemom gospodarza.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka związanego z celami za pomocą modelu, który zapobiega niepowodzeniom na późnych etapach wynikającym z niskiej wierności histopatologicznej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, dostarczając danych na temat potencjału tumorigennego i odpowiedzi na leki w kontekście klinicznie istotnym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pozyskiwaniu pierwotnych komórek nerwowych, transdukcji adenowirusowej oraz stereotaktycznego wstrzykiwania ortotopowego.
- Zależy od dostępu do warunkowych myszy modyfikowanych genetycznie z floxowanymi allelami onkogennymi oraz zaplecza do hodowli komórkowych w celu ekspansji komórek pierwotnych.
- Konieczna jest standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia spójnej wydajności rekombinacji Cre oraz powtarzalnych współrzędnych implantacji allograftu.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy rozszerzaniu modelu na neuralne komórki macierzyste lub inne kombinacje onkogenne poza astrocytami.
- Ograniczenia praktyczne obejmują trudności techniczne związane z sekcją mózgu noworodka i wstrzykiwaniem wewnątrzczaszkowym, co wymaga specjalistycznego przeszkolenia w celu zapewnienia żywotności i powtarzalności.
