Name: Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów od genetycznie modyfikowanych myszy. Ta metoda umożliwia badanie fenotypowych konsekwencji mutacji związanych z nowotworami mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CRM jest badaczem klinicznym Damon Runyon-Genentech. Praca ta była częściowo wspierana przez granty dla CRM z Fundacji Badań nad Rakiem Damona Runyona (CI-45-09), Departamentu Obrony (W81XWH-09-2-0042) i Funduszu Badań nad Rakiem Uniwersytetu Karoliny Północnej (UCRF). Autorzy pragną podziękować Danielowi Rothowi za pomoc w hodowli myszy. Autorzy pragną również podziękować Hannah Chae, Carterowi McCormickowi, Demi Canoutas, Stephanie Gillette i Susannah Krom za pomoc w hodowli tkanek i immunofluorescencji.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytycznymi krokami w celu zapewnienia prawidłowego zbioru i hodowli astrocytów korowych są: 1) wycięcie kory bez pobierania tkanki poniżej ciała modzelowatego, 2) usunięcie opon mózgowych, 3) dokładna dysocjacja komórek i 4) wzbogacenie astrocytów GFAP+ . Chociaż zastosowaliśmy metody mechaniczne (wstrząsanie) i genetyczne (ograniczenie rekombinacji genetycznej za pomocą wektora Ad5GFAPCre lub wykorzystanie dominującego transgenu transformującego (TgGZT121) pod kontrol...

Gwiaździaki są najczęstszym pierwotnym guzem mózgu, a glejak (GBM), gwiaździak IV stopnia, jest najczęstszym i najbardziej agresywnym podtypem z medianą przeżycia 12-15 miesięcy1,2. Inwazja rozlanych gwiaździaków, zwłaszcza GBM, wyklucza całkowitą resekcję chirurgiczną, ogranicza skuteczność terapii adjuwantowych i nieuchronnie prowadzi do nawrotu po leczeniu3. U pacjentów początkowo występuje albo gwiaździak de novo (pierwotny), albo gwiaździak o niższym stopniu złośliwości, który nieuchronnie postępuje do (wtórnego) GBM4. GBM jest genomowo heterogeniczny i charakteryzuje się wzajemnie wykluczającymi się i współwystępującymi mutacjami w genach, które rządzą trzema podstawowymi szlakami sygnałowymi: punktem kontrolnym cyklu komórkowego G1 / S (Rb), receptorową kinazą tyrozynową (RTK) i szlakami TP53 5-7. GBM składa się z czterech podtypów genomowych o odrębnych profilach ekspresji, które przypominają różne typy komórek mózgowych, co sugeruje, że na podtyp GBM wpływa komórka, z której pochodzi6,8,9. Potrzebne są lepsze modele gwiaździaków, aby określić rolę określonych kombinacji mutacji w określonych typach komórek podczas patogenezy gwiaździaka. Wykorzystanie tych modeli do bardziej efektywnego przedklinicznego opracowywania leków ostatecznie przyczyni się do poprawy wyników leczenia pacjentów. Obecne modele gwiaździaków obejmują ustalone linie komórek ludzkich, ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX), genetycznie zmodyfikowane normalne ludzkie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste (NSC) oraz genetycznie zmodyfikowane myszy (GEM)10-14. Opracowaliśmy alternatywny, niezarodkowy model GEM (nGEM)15 wykorzystujący pierwotne komórki mózgowe – astrocyty korowe i NSC – pobrane z GEM zawierające różne kombinacje floksowanych alleli onkogennych. Celem było wygenerowanie modeli gwiaździaków z genetycznie zdefiniowanymi komórkami, które można by scharakteryzować fenotypowo zarówno in vitro, jak i in vivo, i potencjalnie wykorzystać do przedklinicznego opracowania leków u myszy kompetentnych immunologicznie.
Uznane linie komórek ludzkich są najczęściej używanym modelem patogenezy gwiaździaka i odpowiedzi na leki in vitro i in vivo. Są one technicznie proste, szeroko dostępne i mają zdefiniowaną kinetykę i rakotwórczość po ortotopowym ksenoprzeszczepie u myszy z niedoborem odporności10,11,16-18. Ich wady obejmują niezdolność do generowania ustalonych linii komórkowych z gwiaździaków o niskim stopniu złośliwości, ograniczając badanie tylko do gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości; brak zdefiniowanej komórki pochodzenia; obecność złożonych nieprawidłowości genomowych, często z profilami genomowymi, które znacznie różnią się od oryginalnej próbki pobranej od pacjenta; oraz podatność na dryf fenotypowy i genotypowy podczas hodowli seryjnej w surowicy11,17,19-22. Fenotypowe konsekwencje poszczególnych mutacji onkogennych w ustalonych ludzkich liniach komórkowych GBM mogą być maskowane przez mnogość nieprawidłowości, które są faktycznie obecne, co często uniemożliwia wyjaśnienie bezpośrednich konsekwencji genotypowo-fenotypowych.
PDX są generowane przez podskórne przechodzenie izolowanych przez pacjenta komórek gwiaździaka u myszy z niedoborem odporności lub poprzez ich hodowlę jako nieprzylegające sferoidy w określonym, wolnym od surowicy pożywce przed wstrzyknięciem ortotopowym do mózgów myszy z niedoborem odporności12,23. PDX dokładniej utrzymuje krajobraz genomiczny ludzkich gwiaździaków, ale podobnie jak w przypadku ustalonych ludzkich linii komórkowych, fenotypowy efekt poszczególnych mutacji onkogennych może być maskowany ze względu na ich złożoność genomową19,24. Aby określić fenotypowe konsekwencje określonych mutacji onkogennych, szczególnie w odpowiedzi na nowe terapie, często wykorzystuje się panele ustalonych ludzkich linii komórkowych lub PDX w celu ustalenia korelacji genotyp-fenotyp, wykazania możliwości uogólnienia i zminimalizowania prawdopodobieństwa wystąpienia efektów specyficznych dla linii komórkowej. Podczas gdy PDX dokładnie podsumowuje histopatologiczne cechy charakterystyczne gwiaździaków u ludzi, w tym inwazję, ksenoprzeszczepy ortotopowe ustalonych linii komórek ludzkich na ogół nie21,23,25. Dodatkowo, normalne ludzkie astrocyty i NSC zostały genetycznie zmodyfikowane ze zdefiniowanymi mutacjami onkogennymi w celu modelowania nowotworzenia gwiaździaka in vitro i in vivo13,14,26. Komórki te nie mają złożoności genomowej ustalonych ludzkich linii komórkowych i PDX i dokładnie podsumowują histopatologię ludzkiego gwiaździaka, ale wymagają ksenoprzeszczepu u gryzoni z niedoborem odporności in vivo. Ponieważ wszystkie modele komórek ludzkich wymagają gospodarzy gryzoni z niedoborem odporności, aby zapobiec odrzuceniu ksenoprzeszczepu za pośrednictwem układu odpornościowego, modele te nie są w stanie odtworzyć natywnych interakcji guz-zrąb w systemie syngenicznym i nie mają nienaruszonego układu odpornościowego, co ogranicza badania przedkliniczne terapii ukierunkowanych na zrąb i immunomodulujących10,11.
GEM pozwala na badanie fenotypowych konsekwencji z góry określonych kombinacji mutacji onkogennych in vivo podczas nowotworzenia in situ. Podczas gdy bezwarunkowy GEM ma mutacje we wszystkich tkankach podczas rozwoju, warunkowy GEM ma floksowane allele onkogenne, które umożliwiają celowanie w mutacje poprzez ograniczenie rekombinacji za pośrednictwem Cre do określonych typów komórek poprzez zastosowanie promotorów specyficznych dla typu komórki10,11,15,18. Gwiaździak warunkowy GEM został wykorzystany do wyjaśnienia funkcjonalnych ról mutacji onkogennych w różnych typach komórek w nienaruszonym mózgu11. Przedkliniczna użyteczność glejakogenezy in situ przy użyciu warunkowego GEM jest ograniczona przez szereg czynników, w tym: 1) brak korelatu in vitro, 2) trudności w generowaniu dużych kohort myszy o złożonych genotypach, 3) długie opóźnienie rozwoju guza in situ, 4) i stochastyczna progresja guza. Ponieważ nowotworzenie in situ nie ma odpowiadającego mu modelu in vitro, testy narkotykowe in vitro nie mogą być przeprowadzane przy użyciu konwencjonalnych warunkowych modeli GEM. W przeciwieństwie do innych nowotworów, warunkowe modele gwiaździaków GEM rzadko są indukowane przez pojedyncze mutacje onkogenne11. W związku z tym do wygenerowania warunkowego GEM z wieloma mutacjami onkogennymi potrzebne są złożone schematy hodowlane. Co więcej, inicjacja gwiaździaka następuje ze zmienną penetracją po długim okresie utajenia w tych modelach, podczas gdy progresja do gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości zwykle zachodzi w niejednolity, stochastyczny sposób i ostatecznie prowadzi do powstania guzów o złożonych krajobrazach genomowych i kinetyce szybkiego wzrostu27,28. Zmienna penetracja i stochastyczny charakter progresji nowotworu złośliwego w warunkowych modelach GEM wymaga, aby poszczególne myszy były badane przesiewowo za pomocą obrazowania radiograficznego w celu wykrycia obecności i lokalizacji gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości przed włączeniem ich do przedklinicznych badań klinicznych. Podsumowując, ograniczenia te utrudniają generowanie i testowanie dużych kohort warunkowych GEM wymaganych do przedklinicznych testów leków.
System RCAS-tva GEM, który wykorzystuje ptasie wektory retrowirusowe (RCAS) do infekowania GEM zaprojektowanego do ekspresji receptora wirusowego (tva) na określonych typach komórek nerwowych, był szeroko stosowany do modelowania nowotworów gwiaździaków11. W przeciwieństwie do warunkowego GEM, ten model umożliwia wprowadzanie wielu mutacji onkogennych w określonych typach komórek bez konieczności stosowania skomplikowanych schematów hodowlanych. Jest jednak ograniczony przez zmienną penetrację, wymóg aktywnego podziału komórek w celu osiągnięcia integracji wirusa oraz losowe wprowadzanie transgenów do genomu gospodarza29.
Modele GEM bez linii zarodkowej (nGEM), które wykorzystują komórki zebrane z GEM, stają się coraz ważniejsze, ponieważ pokonują wiele ograniczeń innych systemów modelowych15. Rola inicjowania typu komórki i współwystępujących mutacji w patogenezie gwiaździaka jest trudna do określenia przy użyciu ustalonych ludzkich linii komórkowych GBM lub PDX, ponieważ pochodzą one z guzów w końcowym stadium, które zgromadziły rozległe mutacje genetyczne w nieokreślonych typach komórek w trakcie progresji nowotworu. W przeciwieństwie do tego, wszystkie stopnie gwiaździaków mogą być modelowane za pomocą nGEM poprzez indukowanie określonych mutacji genetycznych w określonych oczyszczonych typach komórek mózgowych11,30. W ten sposób wpływ określonych mutacji genetycznych i typu komórki na fenotypy komórkowe i molekularne można określić in vitro i in vivo. Podobnie jak w przypadku ustalonych ludzkich linii komórkowych GBM, wstępne testy leków in vitro z wykorzystaniem nGEM mogą być wykorzystane do ustalenia priorytetów leków do testów in vivo z wykorzystaniem tych samych komórek. Nowotworzenie in vivo można następnie określić poprzez ortotopowe przeszczepy allograficzne komórek nGEM do mózgów kompetentnych immunologicznie syngenicznych rodzeństwa z miotu30. Te ortotopowe modele przeszczepów allogenowych umożliwiają zatem testowanie in vivo nie tylko konwencjonalnych terapii cytotoksycznych i celowanych, ale także terapii immunomodulacyjnych i ukierunkowanych na zręb. Wreszcie, rolę mikrośrodowiska w inicjacji i progresji guza można określić, porównując wyniki między nGEM a konwencjonalnymi modelami GEM wykorzystującymi te same mutacje w tych samych typach komórek.
My i inni opracowaliśmy gwiaździaka nGEM przy użyciu komórek pierwotnych - astrocytów, NSC lub komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) - pobranych z GEM30-34. Przesłanką do opracowania gwiaździaka nGEM było stworzenie modelu do określenia fenotypowych konsekwencji mutacji onkogennych w określonych typach komórek, który mógłby potencjalnie zostać wykorzystany do przedklinicznych testów leków in vitro i in vivo u zwierząt kompetentnych immunologicznie. Pobraliśmy fenotypowo astrocyty korowe WT i NSC z nieeksprymującego Cre, warunkowego GEM utrzymywanego na tle >94% C57 / Bl6 z floksowanym szlakiem RB - Rb1loxP / loxP lub TgGZT121 - i floxowanym szlakiem RTK / RAS / PI3K - Nf1loxP / loxP, KrasG12D, PtenloxP / loxP - geny w różnych kombinacjach35-39. Przeprowadziliśmy indukcję genetyczną in vitro za pomocą wektorów adenowirusowych kodujących rekombinazę Cre. Ponieważ zbiory astrocytów korowych zawierają mieszaninę typów komórek, użyliśmy wektorów Ad5GFAPCre lub dominujących transgenów onkogennych, takich jak TgGZT121 napędzanych przez ludzki promotor GFAP, aby wzbogacić astrocyty korowe GFAP + w tych kulturach. Określiliśmy fenotypowe konsekwencje mutacji szlaku G1 / S (Rb), MAPK i PI3K w astrocytach korowych i NSC in vitro i in vivo. Aktywowane szlakiem MAPK i PI3K astrocyty z defektem G1 / S naśladowały molekularnie ludzki proneuronalny GBM i po wstrzyknięciu ortotopowym tworzyły guzy w określonej lokalizacji o jednolitej kinetyce wzrostu, krótkich opóźnieniach i histopatologicznych cechach charakterystycznych ludzkiego GBM30. Podłużne monitorowanie wzrostu guza in vivo wspomaga przedkliniczne testowanie leków poprzez normalizację kohort leczenia i ilościową analizę wzrostu guza w odpowiedzi na leczenie40. Określiliśmy kinetykę wzrostu guza za pomocą podłużnego obrazowania bioluminescencyjnego myszy, którym wstrzyknięto astrocyty korowe z ekspresją lucyferazy. W związku z tym astrocyty korowe i NSC pochodzące z warunkowego GEM stanowią wykonalny system modelowy do definiowania funkcjonalnych konsekwencji mutacji związanych z gwiaździakiem oraz potencjalny system modelowy do przedklinicznego opracowywania leków.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td>DMEM można również kupić od innych dostawców, w tym GIBCOSigma i Cellgro</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, Regular</td><td>Cellgro</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Ostre nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-395</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do chrząstek kciuka, zakrzywione</td><td>Fisher Scientific</td><td>1631</td><td></td></tr><tr><td>Miltex 17-301 Style 1 Kleszcze jubilerskie, drobne, 4</td><td>Miltex</td><td>17-301</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 dowodów)</td><td>Decon Labs</td><td>2710</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (1x), płyn</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), Czerwień fenolowa</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td>Inne roztwory trypsyny są również odpowiednie do hodowli astrocytów korowych i naczyń</td></tr><tr><td>hodowlanych, 60 x 15 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>9380H77</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml BD</td><td>Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Zapas adenowirusa</td><td>Transfer genów Vector Core, U. Iowa</td><td>Ad5CMVCre</td><td>Sklep w 5 & mikro; l podwielokrotności przy -80 &deg;C. Niebezpieczne. Stosować środki ostrożności Bsl2</td></tr><tr><td>Siarczan sodu (Na2SO4)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan potasu (K2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221325</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td></td><td>Sól</td> potasowa Sigma-Aldrich 746495 <td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)- Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy (0,22 i mikro; m wielkość porów)</td><td>Millipore</td><td>SLGP033NS</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do proliferacji Neurocult, mysz</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5702</td><td>Ten zestaw zawiera NeuroCult NSC Basal Medium i suplement NeuroCult NSC potrzebny do hodowli</td></tr><tr><td>NSC 0,2% roztwór heparyny</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>EGF&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>bFGF&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td>Zrób 10 mM zapasów DMSO, przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (40 &mikro; m wielkość porów)</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dysocjacji komórek macierzystych</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5707</td><td>Alternatywnie użyj delikatnych roztworów enzymatycznych, takich jak Accutase</td></tr><tr><td>Metyloceluloza 15 cP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle's Media firmy Dulbecco 2x</td><td>Milipore</td><td>SLM-202-B</td><td>Do sporządzania 5% roztworu metylocelulozy</td></tr><tr><td>1,7 ml Snap Cap Rurka do mikrowirówki</td><td>Corning</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton, 250 i mikro; l LT bez igły</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-92</td><td></td></tr><tr><td>PB600-1 Dozownik antygenu</td><td>Hamilton</td><td>&nbsp; 83700</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe igły 18 G</td><td>Fisher Scientific NC9015638</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 ga 1/2" Igła z końcówką luer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoetanol (Avertin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Maść okulistyczna</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>NC9689910</tr><tr><td>Model 900 Rama stereotaktyczna</td><td>Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VETBOND</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9259532&nbsp;</td><td>Klej do tkanek&nbsp;</td></tr><tr><td>Lidokaina&nbsp;</td><td>ShopMedVet</td><td>RXLIDO-EPI</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2</td><td>Millipore</td><td>AB5603</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne królicze białko kwasowe przeciwglejowe fibrylarne (GFAP)</td><td>Dako</td><td>Z0334&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Kinetic</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>D-Lucyferyna - Sól K+ Podłoże bioluminescencyjne</td><td>PerkinElmer</td><td>122796</td><td>Do obrazowania bioluminescencyjnego in vivo</td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania EdU Invitrogen</td><td></td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>MSCV Lucyferazy PGK-hygro</td><td>Addgene</td><td>18782</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Obecne modele gwiaździaków mają ograniczoną zdolność do definiowania ról mutacji onkogennych w określonych typach komórek mózgowych podczas patogenezy choroby i ich użyteczność dla przedklinicznego rozwoju leków. W celu zaprojektowania lepszego systemu modelowego dla tych zastosowań, fenotypowo dzikie astrocyty korowe i nerwowe komórki macierzyste (NSC) od warunkowych, genetycznie modyfikowanych myszy (GEM), które zawierają różne kombinacje floksowanych alleli onkogennych, zostały zebrane i wyhodowane w hodowli. Rekombinację genetyczną indukowano in vitro za pomocą rekombinacji za pośrednictwem adenowirusa Cre, w wyniku której prowadzono do ekspresji zmutowanych onkogenów i delecji genów supresorowych nowotworów. Fenotypowe konsekwencje tych mutacji zostały zdefiniowane poprzez pomiar proliferacji, transformacji i odpowiedzi na leki in vitro. Ortotopowe modele alloprzeszczepów, w których przekształcone komórki są stereotaktycznie wstrzykiwane do mózgów immunokompetentnych, syngenicznych rodzeństwa z miotu, zostały opracowane w celu określenia roli mutacji onkogennych i typu komórki w nowotworzeniu in vivo. W przeciwieństwie do większości uznanych ksenoprzeszczepów linii komórkowej glejaka ludzkiego, wstrzyknięcie przekształconych astrocytów korowych pochodzących z GEM do mózgów kompetentnych immunologicznie rodzeństwa z miotu spowodowało powstanie gwiaździaków, w tym najbardziej agresywnego podtypu, glejaka, który rekapitulował histopatologiczne cechy charakterystyczne ludzkich gwiaździaków, w tym rozlaną inwazję normalnego miąższu mózgu. Obrazowanie bioluminescencyjne ortotopowych alloprzeszczepów z przekształconych astrocytów zmodyfikowanych do ekspresji lucyferazy wykorzystano do monitorowania wzrostu guza in vivo w czasie. W związku z tym modele gwiaździaków wykorzystujące astrocyty i NSC zebrane z GEM z warunkowymi allelami onkogennymi zapewniają zintegrowany system do badania genetyki i biologii komórki patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo i mogą być przydatne w przedklinicznym opracowywaniu leków na te wyniszczające choroby.

Opracowaliśmy model nGEM z wykorzystaniem astrocytów korowych i NSC pozyskanych z noworodkowych GEM posiadających floksowane warunkowe allele onkogenne, które mogą być charakteryzowane fenotypowo in vitro oraz in vivo (Rycina 1). Aby zbadać konsekwencje mutacji onkogennych specyficznie w astrocytach korowych in vitro, kluczowe jest najpierw wzbogacenie populacji astrocytów. Materiał z astrocytów korowych zawiera mieszaninę mikrogleju, astrocytów, oligodendrocytów, OPC i neuronó...

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie genetycznie zmodyfikowanych modeli gwiaździaka z określonych typów komórek w celu charakterystyki fenotypowej in vitro i in vivo. Osiąga się to poprzez zbieranie komórek pierwotnych typu dzikiego od noworodków, warunkowo modyfikowanych genetycznie myszy z ekspresją Cree do hodowli in vitro. W drugim etapie komórki pierwotne są zakażane wektorem adenowirusowym kodującym rekombinację Cree w celu wywołania rekombinacji genetycznej alleli flox F in vitro.Następnie zrekombinowane komórki są hodowane seryjnie w celu ich charakterystyki fenotypowej. Ostatecznie to, czy zdefiniowane mutacje sprzyjają agenezji glejowej w określonych typach komórek nerwowych, zależy od charakterystyki fenotypów istotnych dla nowotworów in vitro i in vivo. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania neuroonkologiczne, takie jak: Jakie są fenotypowe konsekwencje mutacji związanych z gwiaździakiem?Implikacje tej techniki rozciągają się na przedkliniczne opracowywanie leków na gwiaździaki, ponieważ te genetycznie zdefiniowane komórki mogą być stosowane in vitro i in vivo, u myszy syngenetycznych kompetentnych immunologicznie. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy pobierania komórek i iniekcji ortotopowej są technicznie trudne i wymagają dokładnej identyfikacji struktur anatomicznych. Procedurę zademonstruje Ryan Bash, technik z mojego laboratorium, który pobierze tkankę mózgową.Zacznij od użycia wysterylizowanych etanolem nożyczek preparacyjnych, aby wykonać strzałkowe nacięcie skóry nad czaszką jedno- lub trzydniowej, uśpionej, genetycznie zmodyfikowanej myszy noworodkowej, od rdzenia kręgowego do nosa. Następnie wykonaj nacięcie w czaszce wzdłuż szwu strzałkowego, zaczynając od rdzenia kręgowego i rozciągając się obok opuszków węchowych. Następnie użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie oderwać każdą półkulę czaszki bocznie od mózgu za pomocą prostych mikrokleszczy.Następnie delikatnie uszczypnij grzbietową część każdej półkuli korowej, uważając, aby ominąć móżdżek i opuszkę węchową i umieść tkankę mózgową w naczyniu do hodowli tkanek zawierającym H-B-S-S-N. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj dwóch par mikrokleszczyków, aby delikatnie usunąć opony mózgowe z każdej półkuli korowej i umieść naczynie do hodowli tkankowej z powrotem na lodzie, aby homogenizować tkankę mózgową. Najpierw użyj czystej żyletki, aby w końcu pokroić półkule korowe w kostkę.Następnie przenieś płytkę do kaptura do hodowli tkankowych i przenieś kawałki tkanki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Opłucz płytkę jednym mililitrem lodowatego HBSS i przenieś pranie również do tubki. Po usunięciu nadmiaru HBSS w temperaturze pokojowej o dwóch mililitrach należy przeprowadzić tripin z EDTA do probówki i powiązać fragmenty tkanki dalej, pipetując w górę iw dół około 10 razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Ostrożnie mieszając roztwór komórkowy przez inwersję co pięć minut po inkubacji, wymieszaj trzy mililitry kompletnej pożywki z zawiesiną komórkową, aby zahamować trypsynę, pipetując w górę iw dół 10 razy, jak właśnie pokazano. Następnie odkręć zdysocjowane astrocyty.Ostrożnie usuń kroplę za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i ponownie zawieś granulkę w czterech mililitrach o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kompletne nośniki. Następnie przenieś zawiesinę astrocytów do kolby do hodowli tkankowych T 75 i utrzymuj astrocyty korowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla około 16 godzin po zbiorach.Umyć kolbę czterema mililitrami HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj cztery mililitry kompletnej pożywki i utrzymuj astrocyty korowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Gdy kultura osiągnie około 95% konfluencji, potrząśnij kulturą przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.Następnie wyjmij pożywkę zawierającą oderwane komórki i umyj płytkę czterema kolejnymi mililitrami HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj cztery mililitry świeżej, kompletnej pożywki i ponownie inkubuj komórki 24 godziny po wzbogaceniu kultury astrocytów korowych. Odśwież kulturę za pomocą dwóch mililitrów kompletnego podłoża.Następnie inkubować komórki z jednym mililitrem kompletnej pożywki zawierającej jeden mikrolitr co najmniej jeden razy 10 z 10 pfu na mililitr interesującego adenowirusa w temperaturze 32 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla w wieku pięciu stopni. Zakażenie Gfab CRE powoduje przewagę proliferacyjną w rekombinowanych astrocytach gfab, zwiększając czystość astrocytów z 59% do ponad 90% po pięciu do dziewięciu pasażach w hodowli. Po sześciu godzinach usuń pożywkę zawierającą wirusa i ponownie inkubuj kulturę w świeżych, kompletnych pożywkach.Po zebraniu astrocytów korowych w około 90% zbiegu, a odpowiednia liczba komórek jest ponownie zawieszona w lodowatej 5% metylocelulozie. Umieść szklaną strzykawkę o pojemności 250 mikrolitrów w powtarzalnym dozowniku antygenu, a następnie przymocuj igłę o rozmiarze 18 do strzykawki. Użyj igły o rozmiarze 18, aby zassać astrocyty korowe do strzykawki i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Następnie wyrzucić igłę o rozmiarze 18 i założyć igłę o rozmiarze 27 na strzykawkę. Naciśnij przycisk na dozowniku antygenu, aż płyn zostanie usunięty z nowej igły, aby wszczepić astrocyty. Następnie zabezpiecz trzy- do sześciomiesięcznego immunokompetentnego biorcę w ramie stereotaktycznej i wykonaj nacięcie nad szwem strzałkowym o długości około 0,5 centymetra między uszami a oczami.Zlokalizuj przecięcie szwów koronalnych i strzałkowych lub BRE MA, a także przecięcie lambdoidu w szwach strzałkowych lub Lambda. Po upewnieniu się, że BMA i lambda znajdują się w tej samej płaszczyźnie poziomej, przymocuj strzykawkę i dozownik powtarzającego się antygenu do ramy stereotaktycznej nad głową zwierzęcia i doprowadź końcówkę igły do kontaktu z bgma. Podnieś igłę lekko z powierzchni czaszki i przesuń dwa milimetry w bok i jeden milimetr rostral od bgma.Następnie ostrożnie opuść igłę przez czaszkę do miejsca docelowego. Cztery milimetry brzusznie od breg MA i aktywować powtarzający się dozownik antygenu. Jednorazowo wstrzyknąć pięć mikrolitrów zawiesiny komórek.Pozostawić igłę na miejscu na dwie minuty, aby ciśnienie śródczaszkowe się zrównoważyło, a następnie powoli wyjmować igłę przez okres 30 sekund, używając bawełnianej zamiany, aby wywrzeć nacisk na krwawienie, które może wystąpić. Na koniec użyj kleju tkankowego, aby przybliżyć krawędzie rany i zamknąć nacięcie, a następnie umieść zwierzę w czystej, ciepłej klatce, aby mogło dojść do siebie. Ksenoprzeszczepy ustalonych ludzkich linii komórkowych wymagają gospodarzy z niedoborem odporności i na ogół nie uzupełniają histopatologii ludzkich gwiaździaków.Na przykład ksenoprzeszczepy ortotopowe U 87 MG tworzą ograniczone guzy, które nie atakują normalnego mózgu. W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie astrocytów zerowych T RRP do mózgów myszy syngenicznych kompetentnych immunologicznie daje guzy, które podsumowują cechy histologiczne ich ludzkich odpowiedników, w szczególności inwazję normalnej tkanki mózgowej. Aby monitorować wzrost alloprzeszczepu zerowego TRP, myszy uśmierano co pięć dni po wstrzyknięciu komórek, a obciążenie guza określano poprzez ilościowe określenie obszaru guza na wybarwionych h i e odcinkach mózgu.Stwierdzono, że obszar guza zwiększa się wykładniczo w czasie, a ortotopowe wstrzyknięcie jednego razy 10 do jednej piątej astrocytów TP nll do mózgu biorcy doprowadziło do zachorowalności neurologicznej. Z medianą przeżycia wynoszącą 22 dni. Obrazowanie podłużne in vivo zostało wykorzystane do zdefiniowania kinetyki wzrostu guza.Dlatego w tym eksperymencie astrocyty karne TR i zaprojektowane do ekspresji lucyferazy zostały wstrzyknięte do mózgów kompetentnych immunologicznie syngeneicznych. Liczbę rodzeństwa z miotu i wzrost guza określono za pomocą seryjnego obrazowania bioluminescencyjnego. W ciągu 16 dni zaobserwowano 15-krotny wzrost bioluminescencji.Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić testy leków in vitro i in vivo w celu określenia skuteczności i przetestowania nowych kombinacji leków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać astrocyty korowe od warunkowo modyfikowanych myszy genetycznie modyfikowanych bez ekspresji crea, jak indukować rekombinację genetyczną in vitro i jak modelować nowotwór za pomocą ortotopowych przeszczepów alloskopowych u myszy kompetentnych immunologicznie.

modeling-astrocytoma-pathogenesis-vitro-vivo-using-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Astrocyty jednolicie układają korę mózgową, co utrudnia analizę ich złożonej morfologii na poziomie komórkowym. Dostarczony tutaj protokół wykorzystuje wielokolorowe znakowanie oparte na elektroporacji in utero w celu wyodrębnienia astrocytów korowych i przeanalizowania ich objętości i morfologii za pomocą przyjaznego dla użytkownika potoku analizy obrazu.

Elektroporacja in utero wieloadresowalnych markerów kolorystycznych integrujących genom (MAGIC) w celu indywidualizacji astrocytów korowych myszy

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Tutaj przedstawiamy metodę biodruku 3D mysich astrocytów korowych do biofabrykacji tkanek podobnych do neuronów w celu zbadania funkcjonalności astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym i mechanizmów obejmujących komórki glejowe w chorobach neurologicznych i leczeniu.

Biodrukowanie 3D mysich astrocytów korowych do inżynierii tkanki neuronalnej

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Migrena i jej przemiana w przewlekłą migrenę to ogromne obciążenie zdrowotne, które wymaga poprawy metod leczenia.  Staramy się określić, w jaki sposób neuronalna sygnalizacja immunologiczna moduluje podatność na migrenę, modelując in vitro przy użyciu rozprzestrzeniającej się depresji w kulturach warstw hipokampa, jako sposób na opracowanie nowych celów terapeutycznych.

Modelowanie neuronalnej sygnalizacji immunologicznej epizodycznej i przewlekłej migreny za pomocą rozprzestrzeniającej się depresji in vitro

Poznaj modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów od genetycznie modyfikowanych myszy. Ta metoda umożliwia badanie fenotypowych konsekwencji mutacji związanych z nowotworami mózgu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Przeglądaj więcej filmów