Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie genetycznie zmodyfikowanych modeli gwiaździaka z określonych typów komórek w celu charakterystyki fenotypowej in vitro i in vivo. Osiąga się to poprzez zbieranie komórek pierwotnych typu dzikiego od noworodków, warunkowo modyfikowanych genetycznie myszy z ekspresją Cree do hodowli in vitro. W drugim etapie komórki pierwotne są zakażane wektorem adenowirusowym kodującym rekombinację Cree w celu wywołania rekombinacji genetycznej alleli flox F in vitro.

Następnie zrekombinowane komórki są hodowane seryjnie w celu ich charakterystyki fenotypowej. Ostatecznie to, czy zdefiniowane mutacje sprzyjają agenezji glejowej w określonych typach komórek nerwowych, zależy od charakterystyki fenotypów istotnych dla nowotworów in vitro i in vivo. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania neuroonkologiczne, takie jak: Jakie są fenotypowe konsekwencje mutacji związanych z gwiaździakiem?

Implikacje tej techniki rozciągają się na przedkliniczne opracowywanie leków na gwiaździaki, ponieważ te genetycznie zdefiniowane komórki mogą być stosowane in vitro i in vivo, u myszy syngenetycznych kompetentnych immunologicznie. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy pobierania komórek i iniekcji ortotopowej są technicznie trudne i wymagają dokładnej identyfikacji struktur anatomicznych. Procedurę zademonstruje Ryan Bash, technik z mojego laboratorium, który pobierze tkankę mózgową.

Zacznij od użycia wysterylizowanych etanolem nożyczek preparacyjnych, aby wykonać strzałkowe nacięcie skóry nad czaszką jedno- lub trzydniowej, uśpionej, genetycznie zmodyfikowanej myszy noworodkowej, od rdzenia kręgowego do nosa. Następnie wykonaj nacięcie w czaszce wzdłuż szwu strzałkowego, zaczynając od rdzenia kręgowego i rozciągając się obok opuszków węchowych. Następnie użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie oderwać każdą półkulę czaszki bocznie od mózgu za pomocą prostych mikrokleszczy.

Następnie delikatnie uszczypnij grzbietową część każdej półkuli korowej, uważając, aby ominąć móżdżek i opuszkę węchową i umieść tkankę mózgową w naczyniu do hodowli tkanek zawierającym H-B-S-S-N. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj dwóch par mikrokleszczyków, aby delikatnie usunąć opony mózgowe z każdej półkuli korowej i umieść naczynie do hodowli tkankowej z powrotem na lodzie, aby homogenizować tkankę mózgową. Najpierw użyj czystej żyletki, aby w końcu pokroić półkule korowe w kostkę.

Następnie przenieś płytkę do kaptura do hodowli tkankowych i przenieś kawałki tkanki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Opłucz płytkę jednym mililitrem lodowatego HBSS i przenieś pranie również do tubki. Po usunięciu nadmiaru HBSS w temperaturze pokojowej o dwóch mililitrach należy przeprowadzić tripin z EDTA do probówki i powiązać fragmenty tkanki dalej, pipetując w górę iw dół około 10 razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.

Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Ostrożnie mieszając roztwór komórkowy przez inwersję co pięć minut po inkubacji, wymieszaj trzy mililitry kompletnej pożywki z zawiesiną komórkową, aby zahamować trypsynę, pipetując w górę iw dół 10 razy, jak właśnie pokazano. Następnie odkręć zdysocjowane astrocyty.

Ostrożnie usuń kroplę za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i ponownie zawieś granulkę w czterech mililitrach o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kompletne nośniki. Następnie przenieś zawiesinę astrocytów do kolby do hodowli tkankowych T 75 i utrzymuj astrocyty korowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla około 16 godzin po zbiorach.

Umyć kolbę czterema mililitrami HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj cztery mililitry kompletnej pożywki i utrzymuj astrocyty korowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Gdy kultura osiągnie około 95% konfluencji, potrząśnij kulturą przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Następnie wyjmij pożywkę zawierającą oderwane komórki i umyj płytkę czterema kolejnymi mililitrami HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj cztery mililitry świeżej, kompletnej pożywki i ponownie inkubuj komórki 24 godziny po wzbogaceniu kultury astrocytów korowych. Odśwież kulturę za pomocą dwóch mililitrów kompletnego podłoża.

Następnie inkubować komórki z jednym mililitrem kompletnej pożywki zawierającej jeden mikrolitr co najmniej jeden razy 10 z 10 pfu na mililitr interesującego adenowirusa w temperaturze 32 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla w wieku pięciu stopni. Zakażenie Gfab CRE powoduje przewagę proliferacyjną w rekombinowanych astrocytach gfab, zwiększając czystość astrocytów z 59% do ponad 90% po pięciu do dziewięciu pasażach w hodowli. Po sześciu godzinach usuń pożywkę zawierającą wirusa i ponownie inkubuj kulturę w świeżych, kompletnych pożywkach.

Po zebraniu astrocytów korowych w około 90% zbiegu, a odpowiednia liczba komórek jest ponownie zawieszona w lodowatej 5% metylocelulozie. Umieść szklaną strzykawkę o pojemności 250 mikrolitrów w powtarzalnym dozowniku antygenu, a następnie przymocuj igłę o rozmiarze 18 do strzykawki. Użyj igły o rozmiarze 18, aby zassać astrocyty korowe do strzykawki i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Następnie wyrzucić igłę o rozmiarze 18 i założyć igłę o rozmiarze 27 na strzykawkę. Naciśnij przycisk na dozowniku antygenu, aż płyn zostanie usunięty z nowej igły, aby wszczepić astrocyty. Następnie zabezpiecz trzy- do sześciomiesięcznego immunokompetentnego biorcę w ramie stereotaktycznej i wykonaj nacięcie nad szwem strzałkowym o długości około 0,5 centymetra między uszami a oczami.

Zlokalizuj przecięcie szwów koronalnych i strzałkowych lub BRE MA, a także przecięcie lambdoidu w szwach strzałkowych lub Lambda. Po upewnieniu się, że BMA i lambda znajdują się w tej samej płaszczyźnie poziomej, przymocuj strzykawkę i dozownik powtarzającego się antygenu do ramy stereotaktycznej nad głową zwierzęcia i doprowadź końcówkę igły do kontaktu z bgma. Podnieś igłę lekko z powierzchni czaszki i przesuń dwa milimetry w bok i jeden milimetr rostral od bgma.

Następnie ostrożnie opuść igłę przez czaszkę do miejsca docelowego. Cztery milimetry brzusznie od breg MA i aktywować powtarzający się dozownik antygenu. Jednorazowo wstrzyknąć pięć mikrolitrów zawiesiny komórek.

Pozostawić igłę na miejscu na dwie minuty, aby ciśnienie śródczaszkowe się zrównoważyło, a następnie powoli wyjmować igłę przez okres 30 sekund, używając bawełnianej zamiany, aby wywrzeć nacisk na krwawienie, które może wystąpić. Na koniec użyj kleju tkankowego, aby przybliżyć krawędzie rany i zamknąć nacięcie, a następnie umieść zwierzę w czystej, ciepłej klatce, aby mogło dojść do siebie. Ksenoprzeszczepy ustalonych ludzkich linii komórkowych wymagają gospodarzy z niedoborem odporności i na ogół nie uzupełniają histopatologii ludzkich gwiaździaków.

Na przykład ksenoprzeszczepy ortotopowe U 87 MG tworzą ograniczone guzy, które nie atakują normalnego mózgu. W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie astrocytów zerowych T RRP do mózgów myszy syngenicznych kompetentnych immunologicznie daje guzy, które podsumowują cechy histologiczne ich ludzkich odpowiedników, w szczególności inwazję normalnej tkanki mózgowej. Aby monitorować wzrost alloprzeszczepu zerowego TRP, myszy uśmierano co pięć dni po wstrzyknięciu komórek, a obciążenie guza określano poprzez ilościowe określenie obszaru guza na wybarwionych h i e odcinkach mózgu.

Stwierdzono, że obszar guza zwiększa się wykładniczo w czasie, a ortotopowe wstrzyknięcie jednego razy 10 do jednej piątej astrocytów TP nll do mózgu biorcy doprowadziło do zachorowalności neurologicznej. Z medianą przeżycia wynoszącą 22 dni. Obrazowanie podłużne in vivo zostało wykorzystane do zdefiniowania kinetyki wzrostu guza.

Dlatego w tym eksperymencie astrocyty karne TR i zaprojektowane do ekspresji lucyferazy zostały wstrzyknięte do mózgów kompetentnych immunologicznie syngeneicznych. Liczbę rodzeństwa z miotu i wzrost guza określono za pomocą seryjnego obrazowania bioluminescencyjnego. W ciągu 16 dni zaobserwowano 15-krotny wzrost bioluminescencji

Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić testy leków in vitro i in vivo w celu określenia skuteczności i przetestowania nowych kombinacji leków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać astrocyty korowe od warunkowo modyfikowanych myszy genetycznie modyfikowanych bez ekspresji crea, jak indukować rekombinację genetyczną in vitro i jak modelować nowotwór za pomocą ortotopowych przeszczepów alloskopowych u myszy kompetentnych immunologicznie.