Name: Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj technikę wstrzyknięcia komórek glejaka pochodzących z GEM do mózgu myszy immunokompetentnej. Model ten odwzorowuje kluczowe cechy ludzkiego glejaka wielopostaciowego i umożliwia ocenę terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Panu Alanowi E. Kulaga za doskonałą pomoc techniczną oraz Pani Michelle L. Gumprecht za udoskonalenie technik chirurgicznych. Dziękujemy dr Philipowi L. Martinowi za analizę patologiczną oraz pani Lilii Ileva i dr Josephowi Kalenowi z Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program za skany MRI.
Ten projekt został sfinansowany w całości lub w części z funduszy federalnych z National Cancer Institute, National Institutes of Health, na podstawie umowy nr. HHSN261201500003I. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, a wzmianka o nazwach handlowych, produktach komercyjnych lub organizacjach nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

Opisany tutaj protokół badania został zatwierdzony przez NCI przy Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick jest akredytowany przez AAALAC International i przestrzega Polityki Publicznej Służby Zdrowia w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych. Opieka nad zwierzętami była prowadzona zgodnie z procedurami określonymi w "Przewodniku opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" (Krajowa Rada ds. Badań Naukowych, 2011; The National Academies Press, Waszyngton, D.C.).
1. Przygotowanie komórek do iniekcji
UWAGA: Pierwotne komórki guza mózgu myszy (MBR) użyte w tym modelu zostały pierwotnie wyizolowane z myszy TRP GEM indukowanych tamoksyfenem, jak opisano w El Meskini et al.5. Szczegółowe informacje na temat przygotowania komórek można znaleźć w tym odnośniku.
<ol>
	<li>Wykonaj następujące kroki przy użyciu sterylnej techniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Hoduj pierwotne komórki guza mózgu in vitro, aż osiągną fazę wzrostu wykładniczego.</li>
	<li>Zbierz komórki w 0,25% trypsyny, a po ich odłączeniu rozcieńcz je pożywką wzrostową, aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Komórki otoczić przez odwirowanie przy 400 x g i przemyć pożywką bez surowicy. Powtórz raz przed liczeniem.</li>
	<li>Policz komórki ręcznie lub za pomocą automatycznego licznika komórek. Zawiesić komórki w 5% sterylnej metylocelulozie w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w żądanym stężeniu, w oparciu o końcową objętość wstrzyknięcia wynoszącą 2 μl. Pożądane stężenie komórek może się różnić w zależności od linii komórkowej i modelu guza mózgu. W przypadku komórek GBM GEM TRP wstrzykujemy 2 μl roztworu 25 x 106 komórek/ml lub 50 000 komórek.</li>
</ol>
2. Szczep myszy
<ol>
	<li>Wyhoduj lub kup odpowiednią odmianę myszy, która pasuje do tła szczepu komórek guza mózgu. W przypadku komórek TRP użyj 9-tygodniowych myszy B6D2F1 / J (ze skrzyżowania samic C57BL / 6J [B6] i samców DBA / 2J [D2]) jako biorców komórek nowotworowych.</li>
</ol>
3. Ustawianie pola operacyjnego
UWAGA: Wszystkie etapy chirurgiczne są przeprowadzane przy użyciu techniki aseptycznej w czystym, odkażonym środowisku. Chirurg powinien nosić fartuchy i środki ochrony osobistej, w tym maskę. Narzędzia chirurgiczne muszą być wysterylizowane termicznie przed użyciem.
<ol>
	<li>Umieść ochraniacze powierzchni pod aparatem stereotaktycznym i na powierzchni roboczej.</li>
	<li>Podłącz rurkę winylową z aparatu do znieczulenia do portu IN platformy znieczulenia gazowego aparatu stereotaktycznego, a drugą rurkę do portu OUT.</li>
	<li>Podłącz wyświetlacz cyfrowy do źródła zasilania i do urządzenia.</li>
	<li>Podłącz sterownik mikropompy (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) do źródła zasilania i podłącz mikropompę (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) do ramienia manipulatora urządzenia (patrz również instrukcja producenta).</li>
	<li>Ustaw mikropompę na 5,6 nL/s dla wtrysku objętościowego 2,000 nL.</li>
	<li>Włącz sterylizator gorących kulek.</li>
	<li>Podłącz podkładkę grzewczą myszy do regulatora temperatury i podłącz do źródła zasilania. Umieść talerz na platformie sceny. Ustaw temperaturę płyty na 37 °C.</li>
	<li>Ponownie załadować precyzyjną strzykawkę 30 G, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków. Włożyć tłok i założyć igłę. Upewnij się, że chwytasz igłę tylko za piastę. Naciskać tłok do momentu, aż kropla mieszaniny komórek metylocelulozy zostanie dozowana przez igłę. Wyczyść igłę wacikiem nasączonym 70% alkoholem, ostrożnie wycierając boki igły lub umieszczając sterylny gazik na powierzchni roboczej i osuszając go. Należy uważać, aby nie zgiąć ani nie złamać igły.</li>
	<li>Przymocuj precyzyjną strzykawkę do mikropompy i obróć ramię manipulatora od stolika, aby zapobiec przemieszczeniu się igły strzykawki przed umieszczeniem myszy na stoliku.</li>
</ol>
4. Przygotowanie myszy do operacji
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy należy umieszczając ją w komorze indukcyjnej z parownikiem izofluranowym ustawionym na 2,5% lub zgodnie z wytycznymi instytucji. Włączyć przepływ izofluranu do stożka.</li>
	<li>Przenieś mysz do aparatu stereotaktycznego i przymocuj do stożka nosa, tak aby górne zęby umieszczone były na wsporniku nosa (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, 9). Dokręć pokrętło na stożku nosowym, aby zabezpieczyć (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Zapewnij odpowiedni poziom znieczulenia, wykonując szczypanie palca u nogi, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu.
	<ol>
		<li>Monitoruj uszy, stopy i błony śluzowe pod kątem koloru (różowy), aby zapewnić odpowiednie natlenienie. Należy również monitorować częstość oddechów (wzrost lub spadek może wskazywać na potrzebę dostosowania poziomu izofluranu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włóż nauszniki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) do obu uszu i dokręć pokrętło, aby zabezpieczyć głowę.</li>
	<li>Nałóż maść do oczu, aby nawilżyć oczy, gdy mysz jest pod narkozą.</li>
	<li>Użyj zakrzywionych kleszczy, aby wyrwać włosy na głowie myszy do obszaru o około 150% większego niż planowane nacięcie, aby zapewnić odpowiednie warunki aseptyki.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 0,5-1 mg/kg steroidu przeciwbólowego buprenorfiny SR lub użyć innego zatwierdzonego w protokole środka przeciwbólowego.</li>
	<li>Ustaw sondę doodbytniczą myszy, aby monitorować temperaturę wewnętrzną i zapobiegać hipotermii spowodowanej znieczuleniem. Utrzymuj temperaturę ciała myszy w zakresie od 36.5 do 38.5 °C.</li>
	<li>Zdezynfekuj pole operacyjne za pomocą zewnętrznych kółek, na przemian z peelingiem chirurgicznym i etanolem trzy razy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy naciągnij skórę, wykonaj nacięcie o długości około 1 cm ostrzem skalpela, zaczynając między oczami. Bregma powinna być widoczna przez nacięcie. 
	UWAGA: Aby zapewnić prawidłową technikę sterylną, dotykaj pola operacyjnego tylko końcówkami wysterylizowanych narzędzi i umieszczaj końcówki narzędzi wyłącznie na sterylnej powierzchni (takiej jak wnętrze autoklawowanego zestawu narzędzi).</li>
	<li>Użyj drewnianego końca aplikatora z bawełnianą końcówką, aby zeskrobać nadmiar tkanki łącznej, a następnie bawełnianego końca innego aplikatora do wyschnięcia.</li>
</ol>
5. Wstrzyknięcie komórek
<ol>
	<li>Umieść ramię manipulatora z nasadką strzykawki na myszy, dokręcając pokrętło, aby zabezpieczyć. Użyj pokręteł X i Y w płaszczyźnie poziomej, aby przesunąć mocowanie strzykawki nad bregmą. Opuść igłę za pomocą pokrętła Z, aby potwierdzić pozycję bregma. Ustaw konsolę odczytu cyfrowego na zero.</li>
	<li>Użyj pokręteł X i Y oraz odpowiedniego odczytu cyfrowego, aby przesunąć igłę do żądanej pozycji. Dla lokalizacji kory korowej odpowiednie współrzędne to 3 mm z tyłu, 2 mm z boku po prawej stronie do bregmy i 2 mm głębokości od opony twardej. Użyj pokrętła Z, aby przesunąć igłę na powierzchnię czaszki.</li>
	<li>Nakłuć otwór w czaszce za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z dołączoną igłą 25 G. Ustawić skos igły w kierunku precyzyjnej strzykawki i igły 30 G i ostrożnie obrócić ramię manipulatora na bok. Używając kciuka i palca, powoli obracaj imigrację w przód iw tył, delikatnie naciskając, aż końcówka igły przebije nasadkę czaszki.</li>
	<li>Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć krew z otworu na igłę. Ustaw ramię manipulatora w odpowiedniej pozycji z załadowaną igłą precyzyjnej strzykawki nad otworem. Dopasuj końcówkę igły do otworu, używając pokrętła Z, aby opuścić igłę w dół do opony twardej mózgu i ustaw cyfrową konsolę odczytu na zero.</li>
	<li>Za pomocą pokrętła Z opuść igłę o 1 mm, a następnie odczekaj 1 min. Powtarzaj, aż do osiągnięcia żądanej głębokości (2 mm zgodnie ze wskazaniami). 
	UWAGA: Igła jest powoli opuszczana, aby zapobiec dodatkowemu uszkodzeniu otaczającej tkanki mózgowej i cofaniu się roztworu komórkowego.</li>
	<li>Uruchomić mikropompę, a następnie monitorować, aby upewnić się, że pompa zatrzymuje się po wstrzyknięciu 2 μl. Proces ten powinien zająć około 6 minut przy wskazanej prędkości. Następnie należy odczekać 1 minutę przed przesunięciem igły.</li>
</ol>
6. Usunięcie igły i zamknięcie rany
<ol>
	<li>Podnieś igłę o 1 mm, a następnie odczekaj 1 minutę. Powtarzaj tę czynność, aż igła całkowicie oderwie się od czaszki.</li>
	<li>W razie potrzeby należy użyć aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć krew z miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Używając drewnianej końcówki aplikatora z bawełnianą końcówką, weź mały kawałek wosku kostnego (~1 mm) i uformuj z niego stożek. Umieść go w otworze w czaszce, wpychając wosk do otworu.</li>
	<li>Podgrzej kleszcze za pomocą sterylizatora koralików i użyj ich do stopienia pozostałego wosku na czaszce i wygładzenia jej.</li>
	<li>Umieść mniej więcej dwie krople roztworu bupiwakainy (środka znieczulającego) w nacięciu i użyj kleszczy, aby ściągnąć krawędzie skóry do siebie.</li>
	<li>Napnij skórę i umieść jeden lub dwa klipsy do rany, aby zamknąć skórę.</li>
	<li>Umieść mysz w czystej klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej w miejscu wolnym od przeciągów i uważnie obserwuj mysz. Pozwól myszy całkowicie obudzić się ze znieczulenia, wznawiając normalną aktywność, zanim wrócisz do zwykłego mieszkania.</li>
	<li>Sprawdzaj mysz codziennie po zabiegu chirurgicznym i stosuj leczenie bólu, zgodnie z wytycznymi instytucji.
	<ol>
		<li>Jeśli do znieczulenia stosuje się buprenorfinę SR (krok 4.6), preparat o przedłużonym uwalnianiu utrzymuje się przez 72 godziny. Powtórzyć wstrzyknięcie tylko wtedy, gdy po 72 godzinach wystąpi widoczny ból lub dyskomfort. Przy prawidłowym wykonaniu myszy dobrze regenerują się po wstrzyknięciach wewnątrzczaszkowych i dodatkowe znieczulenie nie jest potrzebne.</li>
		<li>Usuń zszywki 7-10 dni po zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitoruj wzrost guza za pomocą obrazowania żywych zwierząt (MRI).
	<ol>
		<li>Poddaj myszy eutanazji, gdy zostaną osiągnięte humanitarne punkty końcowe (tj. jeśli zwierzę straci 20% masy ciała lub stanie się hipotermiczne).</li>
		<li>Ze względu na inwazyjny charakter tych guzów mózgu, obserwuj myszy pod kątem objawów neurologicznych, takich jak nierówny chód, częściowy paraliż, wirowanie lub przechylanie głowy. Poddaj mysz eutanazji, jeśli zaobserwuje się którykolwiek z tych klinicznych objawów zaawansowanego wzrostu guza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTamimi%2C+AF+%22Glioblastoma%22">Glioblastoma</a>. , (2017).</li>
<li>Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+and+tools+to+tackle+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Experimental models and tools to tackle glioblastoma.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).</li>
<li>Wen, P. Y., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+gliomas+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Malignant gliomas in adults.</a> The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).</li>
<li>Haddad, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+glioblastoma+for+the+evaluation+of+novel+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies.</a> Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).</li>
<li>El Meskini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+orthotopic+model+for+glioblastoma+recapitulates+key+features+of+human+tumors+and+demonstrates+sensitivity+to+a+combination+of+MEK+and+PI3K+pathway+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+etiology+of+high-grade+astrocytomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+characterization+defines+human+glioblastoma+genes+and+core+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways.</a> Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).</li>
<li>Motomura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis-based+proteomic+subclassification+of+newly+diagnosed+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas.</a> Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).</li>
<li>Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tumor+imaging+with+dynamic+contrast-enhanced+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).</li>
<li>Raza, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+necrosis-associated+genes+in+glioblastoma+by+cDNA+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis.</a> Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).</li>
<li>Raza, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrosis+and+glioblastoma%3A+a+friend+or+a+foe%3F+A+review+and+a+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis.</a> Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%3A+defining+tumor+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma: defining tumor niches.</a> Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).</li>
<li>Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKijima%2C+N+%22Mouse+Models+of+Glioblastoma%22">Mouse Models of Glioblastoma</a>. , Exon Publications. (2017).</li>
<li>Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+needle+insertion+speed+on+tissue+injury%2C+stress%2C+and+backflow+distribution+for+convection-enhanced+delivery+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain.</a> PloS One. 9 (4), 94919(2014).</li>
<li>Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Experimental+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gliomas%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Experimental Glioblastoma.</a> Gliomas. , Exon Publications. (2021).</li>
<li>Zalles, M., Towner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-Clinical+Models+and+Potential+Novel+Therapies+for+Glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Gliomas%22%5BJournal%5D)">Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas.</a> Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).</li>
<li>Wierzbicki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+therapeutic+monitoring+of+H3K27M-mutant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma.</a> Current Oncology Reports. 22 (2), 19(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Modele przedkliniczne są niezbędne do oceny nowych celów terapeutycznych i nowatorskich strategii leczenia GBM. Genetycznie modyfikowane mysie modele GBM mają tę zaletę, że guz występuje w miejscu autochtonicznym, ale często z długim opóźnieniem i nieprzewidywalnym wzrostem guza13. Guzy modelu GEM wykazują opóźnienie wynoszące 4-5 miesięcy, a idealne okno czasowe do obrazowania, rekrutacji i leczenia jest zmienne u poszczególnych myszy. Model ortotopowy ma dobrze ugruntowany i możliwy do opanowani...

Glejak wielopostaciowy (GBM; glejak IV stopnia) jest najczęstszym i najbardziej złośliwym nowotworem mózgu, a obecne terapie są nieskuteczne, co skutkuje medianą przeżycia 15 miesięcy1. Wiarygodne i dokładne modele przedkliniczne, które reprezentują złożone szlaki sygnałowe zaangażowane we wzrost i patogenezę guza mózgu, są niezbędne do przyspieszenia postępu w ocenie nowych schematów terapeutycznych GBM. Modele mysie, w których linie komórkowe ludzkiego guza mózgu są wszczepiane podskórnie myszom z obniżoną odpornością, nie odzwierciedlają natywnego środowiska immunologicznego guzów mózgu, ani nie mogą być wykorzystane do oceny zdolności terapii do przekraczania bariery krew-mózg2. Idealnie byłoby, gdyby przedkliniczne modele mysie dokładnie odwzorowywały histopatologię ludzkiego GBM, w tym wysoki poziom inwazyjności w otaczającym miąższu3. Chociaż genetycznie modyfikowane modele myszy (GEM) rozwijają nowotwory w kontekście nienaruszonego układu odpornościowego, często wymagane są skomplikowane schematy hodowlane, a nowotwory mogą rozwijać się powoli i niekonsekwentnie4. Modele przeszczepów allogenicznych pochodzące z GEM lepiej nadają się do przedklinicznych badań terapeutycznych, w których potrzebne są duże kohorty myszy z guzem w krótszym czasie.
W poprzednim raporcie opisaliśmy ortotopowy model myszy GBM wywodzący się bezpośrednio z guzów GEM. Nowotworzenie w GEM jest inicjowane przez zdarzenia genetyczne w populacjach komórek (głównie astrocytach) wykazujących ekspresję kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP), które prowadzą do progresji do GBM. Te GEM-y TRP zawierają transgen TgGZT121 (T), który ulega ekspresji T121 po ekspozycji na rekombinazę Cre napędzaną przez GFAP. Ekspresja białka T121 powoduje supresję aktywności białka Rb (Rb1, p107 i p103). Koekspresja transgenu Cre sterowanego przez GFAP (GFAP-CreERT2) jest ukierunkowana na ekspresję dorosłych astrocytów po indukcji tamoksyfenem. Myszy TRP są również nosicielami zależnego od Cre mutanta Kras (KrasG12D; Allel R), reprezentujący aktywację szlaku receptorowej kinazy tyrozynowej i są heterozygotyczne pod względem utraty Pten (P)5,6. Równoczesne aberracje genowe w receptorowej kinazie tyrozynowej (RTK), PI3K i sieciach RB są zaangażowane w 74% patogenezy GBM7. W związku z tym pierwotne szlaki sygnałowe zmienione w ludzkim GBM są reprezentowane przez zmodyfikowane mutacje u myszy TRP, w szczególności guzy GBM, w których aktywowane są wspólne dalsze cele RTK5.
Syngeniczny model ortotopowy pochodzący z GEM został zweryfikowany jako model, który podsumowuje cechy ludzkich guzów mózgu, w tym inwazyjność i obecność biomarkerów podtypu, do wykorzystania jako platforma do oceny terapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na nieprawidłowe szlaki w GBM. Komórki hodowano z guzów pobranych z mózgów TRP i ponownie wszczepiono do mózgu myszy dopasowanych do szczepów, używając sprzętu stereotaktycznego do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego do kory mózgowej. Ten przedkliniczny ortotopowy model myszy rozwinął guzy GBM, które były wysoce komórkowe, inwazyjne, pleomorficzne z wysokim wskaźnikiem mitozy i wykazywały liniowe ogniska martwicy komórek nowotworowych i gęste unaczynienie, jak obserwowano u ludzkiego GBM. Objętość i wzrost guza mierzono za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo (MRI).
W tym raporcie opisujemy optymalną technikę wewnątrzczaszkowego wstrzykiwania pierwotnych komórek GBM lub linii komórkowych do mózgu myszy typu dzikiego, używając jako przykładu guzów TRP. Ten sam protokół może być dostosowany dla myszy z obniżoną odpornością i innych linii komórkowych GBM. Podano kluczowe wskazówki dotyczące unikania typowych pułapek, takich jak nieoptymalne przygotowanie komórek lub nieszczelność komórek w miejscu wstrzyknięcia, a także prawidłowe korzystanie ze sprzętu stereotaktycznego w celu zapewnienia powtarzalności i niezawodności modelu. Do celów translacyjnych walidujemy model za pomocą wykrywania MRI wzrostu guza mózgu u żywych zwierząt, charakterystyki histologicznej i przedstawiamy przykład leczenia u myszy z guzem.

<table><tbody><tr><td>5% metylocelulozy w 1X PBS, autoklawizowana</td><td>Millipore Sigma</td><td>M7027</td><td></td></tr><tr><td>1mL Strzykawka tuberkulinowa, końcówka poślizgowa</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>6-calowe aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Regulowana platforma sceniczna</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 901</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki bariery aerozolowej</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-33</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki nasączone alkoholem Sterylne, duże - 2,5 x 3 cale</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>B6D2&nbsp; szczep myszy (C57Bl/6J x DBA/2J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Jax #10006</td><td></td></tr><tr><td>Wosk kostny</td><td>Specjalizacje chirurgiczne</td><td>901</td><td></td></tr><tr><td>Bupiwakaina 0,25%</td><td>Henry Schein</td><td>6023287</td><td></td></tr><tr><td>BuprenorfinaSR</td><td>ZooPharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta rurka winylowa 1/8ID X 3/16OD</td><td>UDP</td><td>T10004001</td><td></td></tr><tr><td>CVS Lubrykant Maść do oczu</td><td>CVS Apteka</td><td>247881</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe skalpele, ostrze #10</td><td>Skalpel Miltex</td><td>16-63810</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do znieczulania gazem z podłączeniem tlenu i skrzynką anestezjologiczną</td><td>Somni Scientific</td><td>n/a</td><td>Badacz może korzystać z obiektu standardowego wyposażenia</td></tr><tr><td>Gaz platforma anestezjologiczna dla myszy</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 923-B</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Graphpad</td><td>Prism&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 9&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; wersja 9.4.1</td><td></td></tr><tr><td>Igła Hamilton 30 g, &frac12; ", mała piasta, punkt pst 3</td><td>Hamilton</td><td>na specjalne zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna strzykawka mikrolitrowa Hamilton, 1701 RN, bez igły 10 i mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator gorących kulek z koralikami</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess 3 Automatyczny licznik komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki przygotowawcze z alkoholem izopropylowym</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>ITK_SNAP (wersja 36.X, 2011- obecna)</td> <td>Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) na Uniwersytecie Pensylwanii oraz Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) na Uniwersytecie Utah</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOPF Stereotaktyczny instrument dla małych zwierząt z cyfrową konsolą odczytu</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, PVDF, prosta, reduktor z zadziorami węża, 1/4" ID x 1/8" ID</td><td>Masterflex</td><td>HV-30616-16</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza myszy</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Sonda doodbytnicza</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH RET-3-ISO</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Super Versi-Dry Ochrona powierzchni</td><td>Pipeta ThermoFisher Scientific</td><td>74000-00</td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Jodowy peeling chirurgiczny</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator do spinania ran Reflex 9 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Ściągacz do spinek do ran</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td></td></tr><tr><td>Spinki do ran Reflex 9 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Semken, zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa z igłą 25 g, końcówka wsuta</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump 3 z kontrolerem Micro2T</td><td>World Precision Instruments</td><td>Model UMP3T</td><td></td></tr></tbody></table>

translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEM) dla ludzkiego glejaka wielopostaciowego (GBM) są kluczowe dla zrozumienia rozwoju i progresji guzów mózgu. W przeciwieństwie do guzów ksenoprzeszczepów, w GEM guzy powstają w natywnym mikrośrodowisku u myszy immunokompetentnej. Jednak zastosowanie GBM GEM w badaniach przedklinicznych nad leczeniem jest wyzwaniem ze względu na długie opóźnienia guza, niejednorodność częstości występowania nowotworów oraz czas rozwoju guza o zaawansowanym stopniu złośliwości. Myszy indukowane za pomocą wewnątrzczaszkowego wstrzyknięcia ortotopowego są bardziej podatne na badania przedkliniczne i zachowują cechy guzów GEM. Stworzyliśmy ortotopowy model guza mózgu pochodzący z modelu GEM z aberracjami Rb, Kras i p53 (TRP), w którym rozwijają się guzy GBM wykazujące liniowe ogniska martwicy komórek nowotworowych i gęste unaczynienie analogiczne do ludzkiego GBM. Komórki pochodzące z guzów GEM GBM są wstrzykiwane wewnątrzczaszkowo do myszy biorców typu dzikiego, dopasowanych do szczepów i rozmnażają guzy IV stopnia, omijając w ten sposób długi okres utajenia guza u myszy GEM i umożliwiając tworzenie dużych i powtarzalnych kohort do badań przedklinicznych. Wysoce proliferacyjne, inwazyjne i naczyniowe cechy modelu TRP GEM dla GBM są rekapitulowane w guzach ortotopowych, a markery histopatologiczne odzwierciedlają ludzkie podgrupy GBM. Wzrost guza jest monitorowany za pomocą seryjnych skanów MRI. Ze względu na inwazyjny charakter guzów wewnątrzczaszkowych w modelach immunokompetentnych, uważne przestrzeganie opisanej tutaj procedury wstrzykiwania jest niezbędne, aby zapobiec wzrostowi guza pozaczaszkowego.

Myszy, którym wstrzyknięto komórki guza mózgu, powinny być codziennie monitorowane pod kątem oznak wzrostu guza, takich jak drgawki, ataksja lub utrata wagi. Wzrost guza mózgu może być również monitorowany za pomocą rezonansu magnetycznego w regularnych odstępach czasu. Cotygodniowe skany MRI pozwalają na wizualizację rosnącego obciążenia guzem w mózgu i pomiary objętości guza (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). W szczególności guzy TRP wykazują agresywny wzrost, a objętość guza 3D można zmierzyć za pomocą rezonansu magnet...

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Opisujemy optymalną technikę wewnątrzczaszkowego wstrzykiwania komórek glejaka pochodzących z GEM do immunokompetentnego mózgu myszy, w wyniku czego powstają guzy, które podsumowują kluczowe cechy ludzkiego glejaka. Ta technika ortotopowego wstrzykiwania komórek TRP pochodzących z GEM daje wysoce powtarzalne, skalowalne i spójne wyniki dla guzów, które pochodzą z kory mózgowej, ale zachowują inwazyjność guzów GEM. Guzy mózgu glejaka myszy wykazują agresywny wzrost i atakują otaczający miąższ mózgu.Dlatego może być stosowany do oceny środków terapeutycznych, które mogą hamować naciek i migrację guza u pacjentów. Protokół ten można dostosować do innych modeli guzów mózgu, wirusów, środków terapeutycznych lub zaadaptować do wstrzykiwania do różnych obszarów mózgu z dostosowaniem współrzędnych stereotaktycznych. Procedurę zademonstruje Devon Atkinson, pracownik naukowy z mojego laboratorium.Na początek umieść ochraniacze powierzchni pod aparatem stereotaktycznym i na powierzchni roboczej. Podłącz rurkę winylową z aparatu anestezjologicznego do portu wejściowego platformy znieczulenia gazowego aparatu stereotaktycznego, a drugą rurkę do jego portu wyjściowego. Podłącz wyświetlacz cyfrowy do źródła zasilania i urządzenia.Następnie podłącz mikropompę do ramienia manipulatora aparatu po podłączeniu sterownika mikropompy do źródła zasilania. Ustaw mikropompę na 5,6 nanolitra na sekundę. Podłącz podkładkę grzewczą myszy do regulatora temperatury i do źródła zasilania.Załaduj z powrotem precyzyjną strzykawkę o rozmiarze 30 z mieszaniną komórek metylometylocelulozy, unikając pęcherzyków. Po włożeniu tłoka założyć igłę i wciskać tłok, aż załadowana mieszanina komórek wpadnie przez igłę. Wyczyść igłę wacikiem nasączonym 70% alkoholem.Po przymocowaniu precyzyjnej strzykawki do mikropompy, przed umieszczeniem myszy obróć ramię manipulatora od stolika, aby zapobiec przemieszczeniu igły strzykawki. Przenieś znieczuloną mysz do instrumentu stereotaktycznego i przymocuj ją do stożka nosowego, umieszczając górne zęby na wsporniku stożka nosowego. Po zaciśnięciu stożka nosowego za pomocą pokrętła, uszczypnij palec u nogi, aby sprawdzić odruchy, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie.Następnie włóż nauszniki i dokręć pokrętło, aby zabezpieczyć głowę. Nałóż maść do oczu, aby nawilżyć oczy w znieczulonych warunkach. Wstrzyknąć podskórnie lek przeciwbólowy buprenorfiny SR i umieścić sondę doodbytniczą myszy w celu monitorowania temperatury wewnętrznej.Wysterylizuj pole operacyjne za pomocą zewnętrznych kółek, trzykrotnie na przemian z peelingiem chirurgicznym i etanolem. Pociągnij napiętą skórę kleszczami i za pomocą ostrza skalpela wykonaj około 1-centymetrowe nacięcie między oczami. W celu wstrzyknięcia komórek należy włożyć ramię manipulatora ze strzykawką dołączoną do myszy.Po dokręceniu pokręteł przesunąć strzykawkę za pomocą pokręteł X i Y w płaszczyźnie poziomej i zamontować ją nad bregmą. Opuść wskazówkę za pomocą pokrętła Z, aby potwierdzić pozycję bregma i ustaw konsolę odczytu cyfrowego na zero. Następnie przesuń igłę do żądanej pozycji, zgodnie z opisem w rękopisie, za pomocą pokręteł X i Y oraz odpowiedniego odczytu cyfrowego, a następnie użyj pokrętła Z, aby przesunąć igłę na powierzchnię czaszki.Nakłuć otwór w czaszce za pomocą 1-mililitrowej strzykawki z dołączoną igłą o rozmiarze 25. Ostrożnie obróć ramię manipulatora na bok, jednocześnie kierując skos igły w kierunku precyzyjnej strzykawki o rozmiarze 30. Gdy ramię manipulatora z załadowaną precyzyjną igłą strzykawki zostanie umieszczone nad otworem, wyrównaj końcówkę igły z otworem i użyj pokrętła Z, aby opuścić igłę do opony twardej mózgu.Po ustawieniu cyfrowej konsoli odczytu na zero opuść wskazówkę o 1 milimetr za pomocą pokrętła Z i odczekaj minutę. Po osiągnięciu głębokości 2 milimetrów zatrzymaj mikropompę i upewnij się, że pompa zatrzyma się po wstrzyknięciu 2 mikrolitrów zawiesiny komórek. Aby usunąć igłę z czaszki, podnieś ją o jeden milimetr i odczekaj minutę.Do zamknięcia rany, używając drewnianej końcówki aplikatora z bawełnianą końcówką, weź kawałek wosku kostnego i uformuj z niego stożek. Po umieszczeniu wosku w otworze w czaszce wepchnij go do otworu. Użyj wysterylizowanych koralików, aby stopić pozostały wosk na czaszce.Gdy stanie się gładka, dodaj dwie krople znieczulającego roztworu bupiwakainy do nacięcia i ściągnij krawędzie skóry do siebie za pomocą kleszczy. Po naciągnięciu skóry, za pomocą jednego lub dwóch klipsów do ran, zamknij skórę, umieść mysz w czystej klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej w miejscu wolnym od przeciągów i uważnie obserwuj mysz. Cotygodniowe skany MRI wykazały rosnące obciążenie guzem w mózgu i pomiary objętości guza.Pomiar objętości guza MRI wykazał brak zahamowania wzrostu guza nawet po radioterapii, a przeżycie leczonych myszy nie uległo zwiększeniu. Guzy GBM w modelach syngenicznych wydawały się być agresywnie rosnące i naruszyły czaszkę do końcowego punktu końcowego. Jeśli w obrazowaniu po implantacji komórek obserwuje się wzrost pozaczaszkowy, oznacza to wyciek komórek podczas procesu wstrzykiwania i należy zachować większą ostrożność podczas wyjmowania igły do wstrzykiwań.Histopatologia ortotopowych guzów TRP GBM potwierdziła obecność gwiaździaka stopnia 4, w tym rekapitulację charakterystycznych cech nowotworów, takich jak pseudopalisada i martwica. Zachowaj precyzję podczas ustawiania punktu zerowego w bregmie, aby zapewnić prawidłowe współrzędne wstrzykiwania komórek. Opuszczanie i podnoszenie igły w mózgu musi być powolne, aby zapobiec urazowi i cofaniu się.Po wstrzyknięciu komórek nowotworowych cotygodniowe skany MRI mogą być wykorzystywane do określenia wyjściowej wielkości guza przed rozpoczęciem leczenia i do wizualizacji zmieniającego się obciążenia guzem w mózgu.

translational-orthotopic-models-of-glioblastoma-multiforme

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Celem niniejszego artykułu jest opis zastosowania ortotopowego modelu glejaka wielopostaciowego w badaniach nad chemoradioterapią. Artykuł ten obejmuje procesy przetwarzania komórek, implantację oraz radioterapię myszy z wykorzystaniem modelu wewnątrzczaszkowego.

Radioterapia skojarzona w ortotopowym modelu guza mózgu u myszy

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Złośliwe glejaki stanowią niejednorodną grupę wysoce naciekających nowotworów glejowych o wyraźnych cechach klinicznych i molekularnych. Pierwszorzędowe ksenoprzeszczepy ortotopowe podsumowują histopopatologiczne i molekularne cechy podtypów glejaka złośliwego w przedklinicznych modelach zwierzęcych.

Pierwotne ksenoprzeszczepy glejaka ortotopowego podsumowują wzrost naciekowy i mutację dehydrogenazy izocytrynianowej I

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Tutaj opisujemy skuteczny i wszechstronny protokół do indukcji, monitorowania i analizy nowych glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o histopatologicznej charakterystyce ludzkiego GBM.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Poznaj technikę wstrzyknięcia komórek glejaka pochodzących z GEM do mózgu myszy immunokompetentnej. Model ten odwzorowuje kluczowe cechy ludzkiego glejaka wielopostaciowego i umożliwia ocenę terapii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Przeglądaj więcej filmów