Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Opisujemy optymalną technikę wewnątrzczaszkowego wstrzykiwania komórek glejaka pochodzących z GEM do immunokompetentnego mózgu myszy, w wyniku czego powstają guzy, które podsumowują kluczowe cechy ludzkiego glejaka. Ta technika ortotopowego wstrzykiwania komórek TRP pochodzących z GEM daje wysoce powtarzalne, skalowalne i spójne wyniki dla guzów, które pochodzą z kory mózgowej, ale zachowują inwazyjność guzów GEM. Guzy mózgu glejaka myszy wykazują agresywny wzrost i atakują otaczający miąższ mózgu.

Dlatego może być stosowany do oceny środków terapeutycznych, które mogą hamować naciek i migrację guza u pacjentów. Protokół ten można dostosować do innych modeli guzów mózgu, wirusów, środków terapeutycznych lub zaadaptować do wstrzykiwania do różnych obszarów mózgu z dostosowaniem współrzędnych stereotaktycznych. Procedurę zademonstruje Devon Atkinson, pracownik naukowy z mojego laboratorium.

Na początek umieść ochraniacze powierzchni pod aparatem stereotaktycznym i na powierzchni roboczej. Podłącz rurkę winylową z aparatu anestezjologicznego do portu wejściowego platformy znieczulenia gazowego aparatu stereotaktycznego, a drugą rurkę do jego portu wyjściowego. Podłącz wyświetlacz cyfrowy do źródła zasilania i urządzenia.

Następnie podłącz mikropompę do ramienia manipulatora aparatu po podłączeniu sterownika mikropompy do źródła zasilania. Ustaw mikropompę na 5,6 nanolitra na sekundę. Podłącz podkładkę grzewczą myszy do regulatora temperatury i do źródła zasilania.

Załaduj z powrotem precyzyjną strzykawkę o rozmiarze 30 z mieszaniną komórek metylometylocelulozy, unikając pęcherzyków. Po włożeniu tłoka założyć igłę i wciskać tłok, aż załadowana mieszanina komórek wpadnie przez igłę. Wyczyść igłę wacikiem nasączonym 70% alkoholem.

Po przymocowaniu precyzyjnej strzykawki do mikropompy, przed umieszczeniem myszy obróć ramię manipulatora od stolika, aby zapobiec przemieszczeniu igły strzykawki. Przenieś znieczuloną mysz do instrumentu stereotaktycznego i przymocuj ją do stożka nosowego, umieszczając górne zęby na wsporniku stożka nosowego. Po zaciśnięciu stożka nosowego za pomocą pokrętła, uszczypnij palec u nogi, aby sprawdzić odruchy, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie.

Następnie włóż nauszniki i dokręć pokrętło, aby zabezpieczyć głowę. Nałóż maść do oczu, aby nawilżyć oczy w znieczulonych warunkach. Wstrzyknąć podskórnie lek przeciwbólowy buprenorfiny SR i umieścić sondę doodbytniczą myszy w celu monitorowania temperatury wewnętrznej.

Wysterylizuj pole operacyjne za pomocą zewnętrznych kółek, trzykrotnie na przemian z peelingiem chirurgicznym i etanolem. Pociągnij napiętą skórę kleszczami i za pomocą ostrza skalpela wykonaj około 1-centymetrowe nacięcie między oczami. W celu wstrzyknięcia komórek należy włożyć ramię manipulatora ze strzykawką dołączoną do myszy.

Po dokręceniu pokręteł przesunąć strzykawkę za pomocą pokręteł X i Y w płaszczyźnie poziomej i zamontować ją nad bregmą. Opuść wskazówkę za pomocą pokrętła Z, aby potwierdzić pozycję bregma i ustaw konsolę odczytu cyfrowego na zero. Następnie przesuń igłę do żądanej pozycji, zgodnie z opisem w rękopisie, za pomocą pokręteł X i Y oraz odpowiedniego odczytu cyfrowego, a następnie użyj pokrętła Z, aby przesunąć igłę na powierzchnię czaszki.

Nakłuć otwór w czaszce za pomocą 1-mililitrowej strzykawki z dołączoną igłą o rozmiarze 25. Ostrożnie obróć ramię manipulatora na bok, jednocześnie kierując skos igły w kierunku precyzyjnej strzykawki o rozmiarze 30. Gdy ramię manipulatora z załadowaną precyzyjną igłą strzykawki zostanie umieszczone nad otworem, wyrównaj końcówkę igły z otworem i użyj pokrętła Z, aby opuścić igłę do opony twardej mózgu.

Po ustawieniu cyfrowej konsoli odczytu na zero opuść wskazówkę o 1 milimetr za pomocą pokrętła Z i odczekaj minutę. Po osiągnięciu głębokości 2 milimetrów zatrzymaj mikropompę i upewnij się, że pompa zatrzyma się po wstrzyknięciu 2 mikrolitrów zawiesiny komórek. Aby usunąć igłę z czaszki, podnieś ją o jeden milimetr i odczekaj minutę.

Do zamknięcia rany, używając drewnianej końcówki aplikatora z bawełnianą końcówką, weź kawałek wosku kostnego i uformuj z niego stożek. Po umieszczeniu wosku w otworze w czaszce wepchnij go do otworu. Użyj wysterylizowanych koralików, aby stopić pozostały wosk na czaszce.

Gdy stanie się gładka, dodaj dwie krople znieczulającego roztworu bupiwakainy do nacięcia i ściągnij krawędzie skóry do siebie za pomocą kleszczy. Po naciągnięciu skóry, za pomocą jednego lub dwóch klipsów do ran, zamknij skórę, umieść mysz w czystej klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej w miejscu wolnym od przeciągów i uważnie obserwuj mysz. Cotygodniowe skany MRI wykazały rosnące obciążenie guzem w mózgu i pomiary objętości guza.

Pomiar objętości guza MRI wykazał brak zahamowania wzrostu guza nawet po radioterapii, a przeżycie leczonych myszy nie uległo zwiększeniu. Guzy GBM w modelach syngenicznych wydawały się być agresywnie rosnące i naruszyły czaszkę do końcowego punktu końcowego. Jeśli w obrazowaniu po implantacji komórek obserwuje się wzrost pozaczaszkowy, oznacza to wyciek komórek podczas procesu wstrzykiwania i należy zachować większą ostrożność podczas wyjmowania igły do wstrzykiwań.

Histopatologia ortotopowych guzów TRP GBM potwierdziła obecność gwiaździaka stopnia 4, w tym rekapitulację charakterystycznych cech nowotworów, takich jak pseudopalisada i martwica. Zachowaj precyzję podczas ustawiania punktu zerowego w bregmie, aby zapewnić prawidłowe współrzędne wstrzykiwania komórek. Opuszczanie i podnoszenie igły w mózgu musi być powolne, aby zapobiec urazowi i cofaniu się.

Po wstrzyknięciu komórek nowotworowych cotygodniowe skany MRI mogą być wykorzystywane do określenia wyjściowej wielkości guza przed rozpoczęciem leczenia i do wizualizacji zmieniającego się obciążenia guzem w mózgu.