Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie zmian w alternatywnym splicingu podczas EMT. Osiąga się to poprzez wykorzystanie indukowalnego modelu EMT, w którym ekspresja białka fuzyjnego skręca się. W ludzkich komórkach nabłonka sutka wyzwala komórki do poddania się EMT po leczeniu tamoksyfenem w drugim etapie.

Ekspresja izoform splicingu jest analizowana za pomocą ilościowego R-T-P-C-R przy użyciu zestawów starterów specyficznych dla izoformy, co ujawnia alternatywne zmiany splicingu na poziomie RNA. Następnie liczebność białka odpowiadającego każdej izoformie określa się za pomocą immunoblottingu w celu potwierdzenia ekspresji izoform splicingu na poziomie białka, uzyskuje się wyniki, które pokazują zmiany w alternatywnym splicingu w genach będących przedmiotem zainteresowania podczas EMT, w oparciu o ilościowe analizy R-T-P-C-R i immuno blot, Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu alternatywnego splicingu RN i EMT, takie jak to, w jaki sposób alternatywny splicing jest regulowany podczas EMT i jak ta regulacja wpływa na EMT i procesy patologiczne związane z EMT. Implikacje tej techniki są skierowane do terapii raka, ponieważ EMT odgrywa ważną rolę w promowaniu inwazji guza i przerzutów.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w alternatywne łączenie podczas EMT. Metoda wykrywania MRA specyficznego dla izoform może być również stosowana w innych systemach, takich jak badanie alternatywnego splicingu w różnicowaniu neuronów i programowaniu śmierci komórek. Pierwszym krokiem jest płytkowanie komórek wyrażających białko fuzyjne twist ER, zasiewanie komórek w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w dwóch egzemplarzach, następnie przygotowanie i ochrona światłem roztworu tamoksyfenu w celu indukcji nabłonkowego przejścia mezenchymalnego lub EMT traktuje komórki 20 nanomolowymi pożywkami zawierającymi tamoksyfen dla grupy kontrolnej nietraktowanej tamoksyfenem dodaj 0,01% etanolu do dodatkowego zestawu komórek dwa dni po inkubacji.

Rób zdjęcia pod mikroskopem świetlnym przy 10-krotnym powiększeniu, aby zarejestrować wszelkie zmiany morfologiczne. Następnie umyj komórki zimnym PBS. Zeskrobać komórki z jednej połowy płytki do buforu do lizy RNA w celu izolacji RNA, a drugą połowę w 100 mikrolitrach lodowatego buforu ripa do analizy białek, przejść komórki z obu grup, jak pokazano wcześniej, i w sposób ciągły traktować 20 nanomolowym tamoksyfenem lub nośnikiem.

Powtarzaj te czynności co drugi dzień do 14 dnia, kiedy to komórki ER skrętu leczone tamoksyfenem powinny wykazywać mezenchymalną morfologię w kształcie wrzeciona. Natomiast kontrole poddane działaniu podłoża powinny zachować morfologię nabłonka przypominającą bruk. W tym przypadku NNA z czterema eksonami jest używany jako przykład do wykrywania inkluzji eksonów.

Zaprojektuj starter do przodu wewnątrz zmiennego eksonu trzeciego i starter wsteczny wewnątrz pobliskiego konstytutywnego eksonu cztery. Pozwalając na specyficzne wzmocnienie zmiennego eksonu w celu specyficznego wzmocnienia zdarzeń pomijania eksonów. Zaprojektuj startery obejmujące połączenie konstytutywnego eksonu drugiego i eksonu czwartego, które w przeciwnym razie zostałyby zniszczone po uwzględnieniu zmiennego eksonu trzeciego.

Zaprojektuj drugi starter wewnątrz konstytutywnego eksonu czwartego, aby wykryć całkowite transkrypty genu i uniknąć produktów PCR amplifikowanych z genomowego DNA lub starterów prem NA.Design w dwóch konstytutywnych eksonach, gdy są gotowe. Postępuje zgodnie ze standardowymi procedurami ekstrakcji RNA w celu wyizolowania RNA z pobranych wcześniej próbek komórek. Określ stężenie i jakość RNA przez absorpcję UV, aby zsyntetyzować pierwszą nić CD NA, ustawić reakcje odwrotnej transkryptazy w końcowej objętości 20 mikrolitrów.

Przeprowadzaj reakcje RT w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie inkubację w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut. Aby dezaktywować enzym RT w czasie rzeczywistym. PCR ustawił 20 mikrolitrowych reakcji, które składają się z 10 mikrolitrów mieszanki cyber green master, 0,1 do 1,0 mikrolitrów matrycy CD NA oraz pięciu starterów picomole do przodu i do tyłu.

Uruchom PCR w czasie rzeczywistym z 40 cyklami w trzech egzemplarzach. Sprawdź krzywe dysocjacji i upewnij się, że dla każdego zestawu starterów obserwuje się pojedynczy pik. Wartości cyklu kwantyfikacji należy uzyskać, obliczając wartości drugiej pochodnej krzywych amplifikacji.

Obliczyć względną ilość docelowych mRNA w próbkach indukowanych w porównaniu z próbką nieindukowaną przy użyciu metody delta delta CQ, jak pokazano za pomocą tego wzoru. Pozostawić komórki pobrane do analizy białek na lodzie na około 10 minut przed odwirowaniem i zebraniem supernatantu. Po określeniu stężenia białka rozcieńczyć próbki w ładowaniu SDS, buforować i ładować od 20 do 40 mikrogramów białek do 10% żeli stronicowych SDS.

Uruchom żele strony SDS z prędkością 20 miliamperów przez 1,5 godziny. Po tym czasie przenieś białka do membran PVDF w mokrym układzie transferowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny przy napięciu 85 woltów. Dostosuj czas transferu do masy cząsteczkowej docelowych białek.

Następnie zablokuj membranę w 5% beztłuszczowym mleku na 30 minut do jednej godziny. W temperaturze pokojowej inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Przeciwciało pierwszorzędowe rozpoznaje epitop w konstytutywnym regionie otoczki egzonu i jednocześnie wykrywa izoformy warstw na podstawie ich różnych rozmiarów białka.

W tym samym czasie monitoruj EMT za pomocą immunoblottingu. Do markerów EMT. Użyj eec, ahern, gamma kateniny i okludyny jako markerów nabłonkowych oraz fibronektyny n kadheryny i mentonu jako markerów mezenchymalnych.

Następnego dnia przemyj membranę trzykrotnie TBST w odstępach pięciominutowych. Następnie inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w rozcieńczeniu od jednego do 10 000 przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po tym czasie przemyć membranę trzykrotnie TBST w odstępach pięciominutowych.

Na koniec zwizualizuj białka za pomocą systemu detekcji chemiluminescencji i wystaw błonę na film z automatycznej radiografii. EMT wywołane skrętem charakteryzowało się przejściem od fenotypu nabłonkowego przypominającego bruk do wydłużonego fenotypu fibroblastycznego, wykazującego brak markerów nabłonkowych, kadheryny, gamma kateniny i okludyny oraz regulację w górę markerów mezenchymalnych, fibronektyny n kadheryny i wimentyny. Ponadto EMT oceniano na podstawie utraty lokalizacji kadheryny EC w przedstawionych połączeniach komórek komórkowych.

Poniżej przedstawiono projekty starterów do wykrywania izoform splicingu CD 44. Lokalizacje podkładu są oznaczone różnokolorowymi strzałkami. Wyniki analiz Q-R-T-P-C-R wskazują na znaczny spadek mRNA CD 44 V i wzrost mRNA CD 44 s po 14 dniach leczenia TAM.

W przeciwieństwie do tego, całkowity transkrypt CD 44 pozostał niezmieniony podczas EMT zgodnie z wynikami Q-R-T-P-C-R, poziom białka CD 44 V znacznie spadł, podczas gdy ekspresja białka CD 44 s była znacznie zwiększona podczas udziału w tej procedurze. Ważne jest, aby pamiętać, że skuteczna indukcja laryngologii jest bardzo ważna. Dlatego laryngolog musi być dokładnie potwierdzony różnymi metodami, takimi jak wykrywanie zmian w morfologii komórki, ekspresji markerów laryngologicznych i lokalizacji RIN na powierzchni komórki.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak test zarządzania splicing reporter, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób te działające elementy i czynniki transakcyjne wpływają na alternatywną regulację splicingu po jego opracowaniu? Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią RNA, biologią rozwojową i biologią nowotworów do zbadania alternatywnej regulacji splicingu w procesach EMT podczas normalnego rozwoju i przerzutów raka.