Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie zmian w alternatywnym splicingu podczas EMT. Osiąga się to poprzez wykorzystanie indukowalnego modelu EMT, w którym ekspresja białka fuzyjnego skręca się. W ludzkich komórkach nabłonka sutka wyzwala komórki do poddania się EMT po leczeniu tamoksyfenem w drugim etapie.

Ekspresja izoform splicingu jest analizowana za pomocą ilościowego R-T-P-C-R przy użyciu zestawów starterów specyficznych dla izoformy, co ujawnia alternatywne zmiany splicingu na poziomie RNA. Następnie liczebność białka odpowiadającego każdej izoformie określa się za pomocą immunoblottingu w celu potwierdzenia ekspresji izoform splicingu na poziomie białka, uzyskuje się wyniki, które pokazują zmiany w alternatywnym splicingu w genach będących przedmiotem zainteresowania podczas EMT, w oparciu o ilościowe analizy R-T-P-C-R i immuno blot, Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu alternatywnego splicingu RN i EMT, takie jak to, w jaki sposób alternatywny splicing jest regulowany podczas EMT i jak ta regulacja wpływa na EMT i procesy patologiczne związane z EMT. Implikacje tej techniki są skierowane do terapii raka, ponieważ EMT odgrywa ważną rolę w promowaniu inwazji guza i przerzutów.