Name: Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj metodę wykrywania alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego w ludzkich komórkach gruczołu mlekowego. Technika ta umożliwia badanie regulacji ekspresji genów związanej z progresją nowotworową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Wensheng Liu za nieocenioną pomoc w obrazowaniu komórek. Praca ta była wspierana przez granty z amerykańskich National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation i A Sister's Hope Foundation.

1. Hodowla komórkowa z indukcją EMT
Uwaga: EMT można indukować poprzez traktowanie TGFβ lub ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych Twist, Snail lub Zeb1/2 w komórkach nabłonkowych. W niniejszym protokole opisano indukowalny system EMT poprzez ekspresję białka fuzyjnego Twist-ER w unieśmiertelnionych ludzkich komórkach nabłonkowych gruczołu mlekowego (HMLE/Twist-ER, dar od dr. J. Yanga, UCSD)9,11,29. Po traktowaniu 4-hydroksytamoksyfenem (TAM) białko fuzyjne Twist-ER przemieszcza się do jądra komórkowego, aby stymulować transkrypcję, co prowadzi do pełnego przejścia EMT w ciągu 12-14 dni9,11,29. Dodatkowe indukowalne systemy EMT, takie jak HMLE/Snail-ER, HMLE/TGFβ oraz MCF10A/TGFβ, można znaleźć w naszych poprzednich publikacjach11,30.
<ol>
	<li>Hodować komórki HMLE/Twist-ER w bezsurowiczym medium do wzrostu komórek nabłonka piersi (MEGM) w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Prowadzić pasażowanie komórek co 2-3 dni po osiągnięciu przez nie 80% konfluencji. Inkubować komórki z 0,15% trypsyną w temperaturze 37 °C przez 5-10 min, a następnie inaktywować trypsynę za pomocą 5% surowicy cielęcej/DMEM. Odwirować komórki i resuspenderować je w MEGM. Wysiać komórki do nowej szalki hodowlanej w stosunku 1 do 4.</li>
	<li>Rozpuścić TAM w etanolu w celu przygotowania roztworu o stężeniu 200 μM. Chronić TAM przed światłem i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem dodać świeżo TAM do medium MEGM w rozcieńczeniu 1:10 000, aby uzyskać końcowe stężenie 20 nM TAM.</li>
	<li>W celu indukcji EMT wysiać 1,6 x 106 komórek HMLE/Twist-ER do 10 cm szalki hodowlanej w dwóch powtórzeniach. Hodować komórki w medium MEGM zawierającym 20 nM TAM.</li>
	<li>Wysiać 1,6 x 106 komórek HMLE/Twist-ER do 10 cm szalki w dwóch powtórzeniach i traktować komórki 0,01% etanolem jako kontrolę niepoddaną działaniu TAM.</li>
	<li>Po dwóch dniach inkubacji wykonać zdjęcia pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 10X, aby zarejestrować zmiany morfologiczne komórek.</li>
	<li>Odssać medium z jednej szalki z komórkami kontrolnymi lub traktowanymi TAM. Przemyć komórki zimnym PBS i zebrać komórki poprzez zeskrobanie połowy powierzchni szalki do buforu lizującego RNA w celu izolacji RNA oraz drugiej połowy do buforu RIPA w celu analizy białek.</li>
	<li>Przeprowadzić pasażowanie komórek z szalek kontrolnych lub traktowanych TAM poprzez ponowne wysianie 1,6 x 106 komórek do 10 cm szalki w dwóch powtórzeniach. Kontynuować traktowanie komórek 20 nM TAM lub nośnikiem.</li>
	<li>Powtarzać kroki od 5 do 7 co drugi dzień aż do 14. dnia, kiedy komórki Twist-ER traktowane TAM wykazują wrzecionowatą morfologię mezenchymalną, podczas gdy komórki kontrolne traktowane nośnikiem zachowują brukową morfologię nabłonkową.</li>
</ol>
2. Charakterystyka EMT
Uwaga: O zakończeniu procesu EMT świadczą: (1) zmiany morfologiczne komórek z nabłonkowej morfologii przypominającej brukową na wrzecionowaty wygląd fibroblastopodobny; (2) utrata lokalizacji E-kadheryny w połączeniach międzykomórkowych; oraz (3) zmiana ekspresji markerów EMT, definiowana przez utratę markerów nabłonkowych i pojawienie się markerów mezenchymalnych.
Zmiany morfologiczne komórek są rejestrowane za pomocą mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 10X w trakcie przebiegu indukcji EMT, opisanej w Sekcji 1. Detekcja immunofluorescencyjna E-kadheryny w połączeniach komórkowych jest opisana w niniejszej sekcji. Ekspresję markerów EMT wykrywa się za pomocą immunoblotingu. Typowe markery nabłonkowe to E-kadheryna, γ-katenina i okludyna, natomiast markery mezenchymalne obejmują fibronektynę, N-kadherynę i wimentynę. Ogólne procedury immunoblotingu opisano w Sekcji 4.
<ol>
	<li>W 12. dniu leczenia TAM wysiać 1 x 105 komórki na szklanym okładce o średnicy 12 mm umieszczonej w studzience płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>48 h po wysianiu odessać pożywkę i przemyć komórki uprzednio ogrzanym PBS.</li>
	<li>Utrwal komórki w uprzednio ogrzanym 4% paraformaldehydzie przez 15 min.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie buforem PBS.</li>
	<li>Inkubować komórki z 0,2% Triton X-100 w PBS przez 15 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie buforem PBS.</li>
	<li>Inkubować komórki w 5% BSA/PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznego wiązania.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko E-kadherynie w rozcieńczeniu 1:50 w 1% BSA/PBS w komorze wilgotnościowej przez noc w temperaturze 4 °CUWAGA: Zakres rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego wynosi zazwyczaj od 1:50 do 1:200, a optymalne rozcieńczenie dla każdego przeciwciała należy ustalić doświadczalnie.</li>
	<li>Odlać przeciwciało pierwszorzędowe i trzykrotnie przemyć komórki buforem PBS.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałem wtórnym znakowanym fluorescencyjnie w rozcieńczeniu 1:500 przez 1 h w temperaturze pokojowej. Od tego momentu chronić komórki przed światłem.</li>
	<li>Odlać przeciwciało wtórne i przemyć trzy razy buforem PBS.</li>
	<li>Barwić komórki DAPI lub Hoechst w stężeniu 0,1-1 g/ml przez 10 min.</li>
	<li>Przepłucz komórki buforem PBS trzy razy.</li>
	<li>Przymocuj szkiełka nakrywkowe za pomocą kropli medium montażowego, a następnie uszczelnij je lakierem do paznokci.</li>
	<li>Obserwować komórki i wykonywać zdjęcia pod mikroskopem fluorescencyjnym z obiektywem 63X.</li>
</ol>
W celu potwierdzenia fenotypu EMT można przeprowadzić barwienie z dodatkowymi przeciwciałami. Na przykład, w celu wykazania fenotypu mezenchymalnego można przeprowadzić barwienie na N-cadherin oraz α-smooth muscle actin29,31,32. Reorganizację struktury cytoszkieletu można monitorować poprzez barwienie komórek faloidyną na F-actin11. Dodatkowo, w celu zbadania właściwości EMT można przeprowadzić testy mobilności komórek oraz odporności na śmierć komórkową11.
3. Wykrywanie izoform splicingu za pomocą testów qRT-PCR
<ol>
	<li>Projektowanie starterów 
	UWAGA: Pary starterów powinny zostać starannie zaprojektowane w celu amplifikacji odrębnych izoform splicingowych. Pominięcie eksonu, będące najczęściej obserwowanym zdarzeniem alternatywnego splicingu, przedstawiono tutaj jako przykład w celu zilustrowania strategii projektowania starterów. Rycina 1A przedstawia pre-mRNA składający się z czterech eksonów, w którym trzeci ekson jest eksonem zmiennym. Włączenie eksonu 3 skutkuje produkcją dłuższej izoformy splicingowej, natomiast pominięcie eksonu 3 generuje krótszą izoformę splicingową. Startery muszą zostać zaprojektowane tak, aby odróżnić izoformę z włączonym eksonem 3 od izoformy z pominiętym eksonem 3 oraz aby wykryć całkowity transkrypty tego mRNA.
	<ol>
		<li>W celu detekcji włączenia eksonu starannie zaprojektuj starter forward w obrębie zmiennego eksonu 3 oraz starter reverse w obrębie pobliskiego eksonu konstytutywnego 4, co pozwoli na specyficzną amplifikację izoformy z włączonym eksonem zmiennym. Należy upewnić się, że zarówno starter forward, jak i reverse nie znajdują się w obrębie tego samego eksonu zmiennego, aby uniknąć amplifikacji produktów PCR z DNA genomowego lub pre-mRNA.</li>
		<li>Aby specyficznie amplifikować zdarzenia pominięcia eksonu, zaprojektuj jeden ze starterów tak, aby obejmował on złącze eksonu konstytutywnego 2 i eksonu 4, które w przeciwnym razie zostałoby zniszczone przy włączeniu zmiennego eksonu 3. Drugi starter zaprojektuj w obrębie eksonu konstytutywnego 4. W ten sposób produkty PCR są generowane tylko wtedy, gdy zmienny ekson 3 jest wykluczony, a ekson konstytutywny 2 i ekson 4 zostają następnie połączone.</li>
		<li>W celu detekcji całkowitych transkryptów genu zaprojektuj startery w obrębie dwóch eksonów konstytutywnych 1 i 2. Dzięki temu produkty PCR są amplifikowane ze wszystkich izoform.</li>
		<li>Upewnij się, że temperatura topnienia (Tm) dla wszystkich starterów wynosi około 55 °C, długość każdego startera wynosi około 18-22 nukleotydów, a wielkość produktów PCR mieści się w przedziale od 80 do 150 par zasad.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja RNA: Ekstrakt RNA za pomocą zestawu do izolacji całkowitego RNA (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Zbierz komórki w 350 μl buforu do lizy RNA.</li>
		<li>Dodaj 350 μl 70% etanolu do lizatu i dokładnie wymieszaj.</li>
		<li>Przenieś próbkę do kolumny do oczyszczania RNA.</li>
		<li>Wiruj przy 10,000 x g przez 1 min i odrzuć filtrat.</li>
		<li>Przemyj kolumnę raz 500 μl buforu do przemywania RNA I oraz dwukrotnie buforu do przemywania RNA II.</li>
		<li>Usuń resztki buforu do przemywania RNA II z kolumny poprzez wirowanie z maksymalną prędkością przez 2 min.</li>
		<li>Przenieś kolumnę do nowej probówki 1,5 ml, dodaj 50 μl wody wolnej od nukleaz do centrum macierzy kolumny i elueuj RNA poprzez wirowanie z maksymalną prędkością.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza pierwszej nici cDNA
	<ol>
		<li>Określ stężenie i jakość RNA za pomocą pomiaru absorbancji UV. UWAGA: RNA dobrej jakości powinno mieć stosunek absorbancji 260 nm / 280 nm wynoszący około 2,0.</li>
		<li>Przygotuj reakcje odwrotnej transkrypcji (RT) zawierające 250 ng całkowitego RNA, 0,05 μg starterów randomowych heksamerów, 50 pmol MgCl2, 10 pmol dNTP, 2 μl 5× buforu GoScript oraz 1 μl enzymu RT w końcowej objętości 20 μl.</li>
		<li>Przeprowadź reakcje RT w 42 °C przez 1 h, a następnie inkubuj w 70 °C przez 5 min w celu inaktywacji enzymu RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Real-time PCR
	<ol>
		<li>Przygotuj reakcje o objętości 20 μl, składające się z 10 μl SYBR green master mix, 0,1-1,0 μl matrycy cDNA oraz 5 pmol starterów forward i reverse.</li>
		<li>Przeprowadź real-time PCR z 40 cyklami następujących etapów: denaturacja w 95 °C przez 10 s, przyłączanie w 58 °C przez 10 s oraz elongacja w 60 °C przez 30 s. Reakcje PCR przeprowadź w trzech powtórzeniach.</li>
		<li>Sprawdź krzywe dysocjacji i upewnij się, że dla każdego zestawu starterów obserwowany jest pojedynczy pik.</li>
		<li>Wyznacz wartości cyklu kwantyfikacji (Cq) poprzez obliczenie wartości drugiej pochodnej krzywych amplifikacji.</li>
		<li>Oblicz względną ilość (RQ) docelowych mRNA w próbkach indukowanych w porównaniu z próbką nieindukowaną, korzystając z metody „delta delta Cq (ΔΔCq)” zgodnie z poniższym wzorem. Jako referencję wykorzystaj geny gospodarza (housekeeping genes), takie jak GAPDH lub TBP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Równania ilościowego PCR; wzory ΔCq, ΔΔCq, RQ; metoda analizy ekspresji genów." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
W celu dokładniejszego obliczenia wartości względnych izoform splicingowych należy rozważyć zastosowanie wielu genów referencyjnych. Wyniki można przeanalizować za pomocą zmodyfikowanej metody ilościowego oznaczania wartości bezwzględnych opisanej przez Pfaffla et al33,34.
4. Analiza izoform splicingu na poziomie białka
<ol>
	<li>Zebrać komórki w 100 μl schłodzonego do temperatury lodowej buforu RIPA.</li>
	<li>Pozostawić lizaty na lodzie przez około 10 min.</li>
	<li>Wirować przy 14,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C, a następnie zebrać nadsącz.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białek metodą Bradforda.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki białek w buforze do ładowania SDS i nanieść 20-40 μg białek na żele 10% SDS-PAGE.</li>
	<li>Prowadzić elektroforezę SDS-PAGE przy natężeniu 20 mA przez 1,5 hr.</li>
	<li>Przenieść białka na membrany PVDF w systemie transferu mokrego w temperaturze 4 °C przez 3 hr przy napięciu 85 V. Dostosować czas transferu do masy cząsteczkowej białek docelowych.</li>
	<li>Zablokować membranę w 5% beztłuszczowym mleku przez 30 min do 1 hr w temperaturze RT.</li>
	<li>Inkubować membranę z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C O/N. Zakres rozcieńczeń przeciwciał pierwszorzędowych mieści się zazwyczaj między 1:200 a 1:5,000; optymalne rozcieńczenie dla każdego przeciwciała należy wyznaczyć doświadczalnie. Rozcieńczenia przeciwciał użytych w tym protokole znajdują się w „Tabeli specyficznych odczynników i sprzętu”.
	<ol>
		<li>W celu wykrycia izoform splicingowych należy użyć specyficznych przeciwciał rozpoznających konkretną izoformę. Alternatywnie można zastosować przeciwciało rozpoznające epitop w regionie kodującym egzon konstytutywny i wykryć izoformy splicingowe jednocześnie na podstawie ich różnych rozmiarów białek.</li>
		<li>Jednocześnie monitorować proces EMT za pomocą immunoblottingu w kierunku markerów EMT. Jako markery nabłonkowe stosować E-cadherin, γ-catenin oraz occludin, a jako markery mezenchymalne fibronectin, N-cadherin i vimentin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć membranę trzy razy buforem TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) w odstępach 5-minutowych.</li>
	<li>Inkubować membranę z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP w rozcieńczeniu 1:10,000 przez 1 hr w temperaturze RT.</li>
	<li>Przemyć membranę trzy razy buforem TBS-T w odstępach 5-minutowych.</li>
	<li>Wizualizować białka za pomocą systemu detekcji chemiluminescencyjnej i naświetlić membranę na filmie autoradiograficznym.</li>
</ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Sleeman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+networks+orchestrate+epithelial-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).</li>
<li>Yang, J., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev Cell. 14, 818-829 (2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+master+regulator+of+morphogenesis%2C+plays+an+essential+role+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis.</a> Cell. 117, 927-939 (2004).</li>
<li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).</li>
<li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).</li>
<li>Comijn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-handed+E+box+binding+zinc+finger+protein+SIP1+downregulates+E-cadherin+and+induces+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion.</a> Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).</li>
<li>Bolos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Slug+represses+E-cadherin+expression+and+induces+epithelial+to+mesenchymal+transitions%3A+a+comparison+with+Snail+and+E47+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.</a> J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).</li>
<li>Eger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeltaEF1+is+a+transcriptional+repressor+of+E-cadherin+and+regulates+epithelial+plasticity+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).</li>
<li>Shapiro, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-driven+alternative+splicing+program+occurs+in+human+breast+cancer+and+modulates+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype.</a> PLoS Genet. 7, e1002218(2011).</li>
<li>Warzecha, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ESRP-regulated+splicing+programme+is+abrogated+during+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition.</a> EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).</li>
<li>Brown, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+splice+isoform+switching+in+human+and+mouse+epithelium+is+essential+for+epithelial-mesenchymal+transition+and+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Liu, S., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+RNA+splicing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Alternative RNA splicing and cancer.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).</li>
<li>Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+RNAs+transcribed+from+the+human+abl+gene+and+from+the+bcr-abl+fused+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene.</a> Cell. 47, 277-284 (1986).</li>
<li>Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+HLA-A+and+-B+antigens+via+an+alternative+RNA+splicing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway.</a> J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).</li>
<li>Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+Qa%2FTla+class+I+major+histocompatibility+antigen+gene+is+a+general+feature+of+oncogenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse.</a> Nature. 306, 756-760 (1983).</li>
<li>Barbaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+splice-site+mutations+in+WT1+are+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome.</a> Nat Genet. 17, 467-470 (1997).</li>
<li>Charlet, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+muscle-specific+chloride+channel+in+type+1+myotonic+dystrophy+due+to+misregulated+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing.</a> Mol Cell. 10, 45-53 (2002).</li>
<li>Hutton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+missense+and+5%27-splice-site+mutations+in+tau+with+the+inherited+dementia+FTDP-17%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17.</a> Nature. 393, 702-705 (1998).</li>
<li>Kohsaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+9+mutations+in+the+WT1+gene%2C+without+influencing+KTS+splice+isoforms%2C+are+also+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome.</a> Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).</li>
<li>Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+splicing+regulated+by+a+CUG-binding+protein+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy.</a> Science. 280, 737-741 (1998).</li>
<li>Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+regulation+of+insulin+receptor+alternative+splicing+is+associated+with+insulin+resistance+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy.</a> Nat Genet. 29, 40-47 (2001).</li>
<li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+tau+gene+in+familial+multiple+system+tauopathy+with+presenile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotonic+dystrophy+evidence+for+a+possible+dominant-negative+RNA+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation.</a> Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).</li>
<li>Graubert, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+the+U2AF1+splicing+factor+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 44, 53-57 (2012).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+SF3B1+mutation+in+myelodysplasia+with+ring+sideroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts.</a> N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).</li>
<li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+pathway+mutations+of+splicing+machinery+in+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia.</a> Nature. 478, 64-69 (2011).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133, 704-715 (2008).</li>
<li>Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail+represses+the+splicing+regulator+epithelial+splicing+regulatory+protein+1+to+promote+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition.</a> J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).</li>
<li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).</li>
<li>Zavadil, J., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+epithelial-to-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions.</a> Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45(2001).</li>
<li>Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qBase+relative+quantification+framework+and+software+for+management+and+automated+analysis+of+real-time+quantitative+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.</a> Genome Biol. 8, R19(2007).</li>
<li>Boutz, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+post-transcriptional+regulatory+switch+in+polypyrimidine+tract-binding+proteins+reprograms+alternative+splicing+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons.</a> Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).</li>
<li>Salomonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+regulates+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).</li>
<li>Calarco, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vertebrate+nervous+system+alternative+splicing+and+development+by+an+SR-related+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein.</a> Cell. 138, 898-910 (2009).</li>
<li>Grabowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+takes+shape+during+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing takes shape during neuronal development.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).</li>
<li>Seol, D. W., Billiar, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-9+variant+missing+the+catalytic+site+is+an+endogenous+inhibitor+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis.</a> J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).</li>
<li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+endogenous+dominant-negative+short+isoform+of+caspase-9+that+can+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis.</a> Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).</li>
<li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Bcl-2-related+genes+functional+consequences+and+potential+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37, 331-340 (2005).</li>
<li>Cheng, C., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD44+alternative+splicing+by+SRm160+and+its+potential+role+in+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj procedura umożliwia wykrycie alternatywnego splicingu w indukowalnym modelu EMT. W związku z tym dynamiczne zmiany ekspresji izoformy splicingu mogą być uchwycone w całym przebiegu czasu EMT. Metoda ta ma przewagę nad stosowaniem różnych linii komórkowych reprezentujących nabłonek lub mezenchymal do porównania alternatywnego splicingu, ponieważ odrębne tła genetyczne z niespokrewnionych linii komórkowych mogą nadmiernie wpływać na alternatywne splicing. Jednak udana indukcja EMT musi zostać dokładnie potwie...

Przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) to program rozwojowy, który napędza morfogenezę narządów i przebudowę tkanek podczas embriogenezy. W przypadku nieprawidłowej aktywacji EMT sprzyja przerzutom guza i zwłóknieniu narządów1,2. Przekonujące badania opisały znaczenie regulacji transkrypcji podczas procesu EMT, zdefiniowanego przez kilka czynników transkrypcyjnych, takich jak Twist, Snail i ZEB, które hamują ekspresję białka połączenia adherens E-kadheryny, powodując utratę morfologii nabłonka przypominającą bruk i uzyskanie wrzecionowatego fenotypu mezenchymalnego3-8. Niedawne badania przeprowadzone przez analizę całego genomu RNA ujawniły, że istnieje grupa genów, których wzorce splicingu są związane z fenotypami nabłonkowymi lub mezenchymalnymi9,10. Pracuj z naszego laboratorium, funkcjonalnie połączone alternatywne łączenie i EMT. Badając cząsteczkę adhezyjną CD44 na powierzchni komórki, wykazaliśmy, że alternatywny splicing CD44 jest ściśle regulowany podczas EMT, a co ważniejsze, że przełączanie izoform splicingu CD44 przyczynowo przyczynia się do EMT11.
Alternatywny splicing reprezentuje szeroko rozpowszechniony i konserwatywny model regulacji genów, ponieważ do 95% ludzkich genów wieloeksonowych jest alternatywnie splicingowanych12-14. Generując wiele produktów białkowych z jednego genu, alternatywny splicing stanowi niezbędny mechanizm dla różnorodności białek, dodając kolejną warstwę złożoności do ludzkiego genomu. W związku z tym rozregulowanie alternatywnego splicingu może potencjalnie prowadzić do głębokich skutków biologicznych powodujących choroby u ludzi. Rzeczywiście, nieprawidłowy alternatywny splicing w chorobach jest dokumentowany od ponad dekady15-25, w tym niedawne odkrycia, że mutacje w genach kodujących maszynerię spliceosomów są powszechnie spotykane w zespołach mielodysplastycznych26-28. Dlatego opracowanie wiarygodnych metod wykrywania alternatywnie splicowanych izoform ma ogromne znaczenie w badaniu różnych procesów biologicznych, w tym EMT.
Tutaj udostępniamy protokół do wykrywania zmian w alternatywnym splicingu za pomocą indukowalnego modelu EMT. Metody projektowania starterów PCR i wykrywania izoform splicingu są odpowiednie nie tylko do badania alternatywnego splicingu podczas EMT, ale także do badania alternatywnego splicingu w innych procesach biologicznych. Badanie alternatywnego splicingu podczas EMT jest konieczne, aby lepiej zrozumieć mechanizmy EMT i przerzutów nowotworowych, ułatwiając w ten sposób opracowanie skutecznych strategii leczenia przerzutów raka.

<table><tbody><tr><td>4-hydroksytamoksyfen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Przygotować roztwór podstawowy, rozpuszczając 4-hydroksytamoksyfen w etanolu do 200 &#956;M. Utrzymywać roztwór na poziomie -20 &#176; C chroniony przed światłem.</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Zestaw do izolacji całkowitego RNA</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>Zestaw do izolacji całkowitego RNA</td></tr><tr><td>System odwrotnej transkrypcji GoScript</td> Odczynnik <td>Promega</td><td>A5001</td><td>do testu qRT-PCR</td></tr><tr><td>Odczynnik GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>do testu qRT-PCR</td></tr><tr><td>System LightCycler 480 do PCR w czasie rzeczywistym</td><td></td> Sprzęt Roche <td></td><td>do testu qRT-PCR</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD44</td><td>R& D Systems</td><td>BBA10</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało E-kadheryny</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4065</td><td>Rozcieńczenie 1:2,500 do immunoblottingu; Rozcieńczenie 1:50 dla immunofluorescencji</td></tr><tr><td>&gamma;-kateniny</td><td>przeciwciało Cell Signaling Technology</td><td>2309</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało okludyny</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>przeciwciało fibronektyny</td><td>Laboratoria Transdukcji BD 610077</td><td></td><td>rozcieńczenie 1:5,000</td></tr><tr><td>przeciwciało N-kadheryny</td><td>Laboratoria transdukcji BD</td><td>610920</td><td>1:2,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało wimentyny</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>1:500 przeciwciało</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>rozcieńczenie 1:10 000</td></tr><tr><td>Odczynnik do wykrywania blottingu Amasham ECL Western System</td><td>chemiluminescencji</td> <td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td></tr></tbody></table>

wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternatywny splicing odgrywa kluczową rolę w przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT), niezbędnym programie komórkowym, który występuje w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy strategię wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT przy użyciu indukowalnego modelu EMT poprzez ekspresję represora transkrypcji Twist. EMT jest monitorowany przez zmiany w morfologii komórek, utratę lokalizacji E-kadheryny na połączeniach komórka-komórka oraz przełączoną ekspresję markerów EMT, takich jak utrata markerów nabłonkowych E-kadheryny i γ-kateniny oraz przyrost markerów mezenchymalnych N-kadheryny i wimentyny. Korzystając z zestawów starterów specyficznych dla izoformy, alternatywne składanie zainteresowanych mRNA jest analizowane za pomocą ilościowego RT-PCR. Produkcja odpowiednich izoform białek jest walidowana za pomocą testów immunoblottingowych. Opisana tutaj metoda wykrywania izoform splicingu nadaje się również do badania alternatywnego splicingu w innych procesach biologicznych.

Opisane powyżej procedury stanowią solidną metodę wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT. Reprezentatywne wyniki przełączania izoform splicingowych CD44 podczas indukowanego przez Twist procesu EMT przedstawiono poniżej jako przykład.
EMT indukowany przez Twist w komórkach HMLE/Twist-ER charakteryzował się przejściem z nabłonkowego fenotypu przypominającego brukowaną kostkę do wydłużonego fenotypu fibroblastycznego (Rysunek 2A), brakiem markerów nabłonkowych E-cadheri...

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie zmian w alternatywnym splicingu podczas EMT. Osiąga się to poprzez wykorzystanie indukowalnego modelu EMT, w którym ekspresja białka fuzyjnego skręca się. W ludzkich komórkach nabłonka sutka wyzwala komórki do poddania się EMT po leczeniu tamoksyfenem w drugim etapie.Ekspresja izoform splicingu jest analizowana za pomocą ilościowego R-T-P-C-R przy użyciu zestawów starterów specyficznych dla izoformy, co ujawnia alternatywne zmiany splicingu na poziomie RNA. Następnie liczebność białka odpowiadającego każdej izoformie określa się za pomocą immunoblottingu w celu potwierdzenia ekspresji izoform splicingu na poziomie białka, uzyskuje się wyniki, które pokazują zmiany w alternatywnym splicingu w genach będących przedmiotem zainteresowania podczas EMT, w oparciu o ilościowe analizy R-T-P-C-R i immuno blot, Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu alternatywnego splicingu RN i EMT, takie jak to, w jaki sposób alternatywny splicing jest regulowany podczas EMT i jak ta regulacja wpływa na EMT i procesy patologiczne związane z EMT. Implikacje tej techniki są skierowane do terapii raka, ponieważ EMT odgrywa ważną rolę

detection-alternative-splicing-during-epithelial-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisana jest prosta metoda indukcji przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT) w różnych typach komórek.  Uwzględniono metody analizy komórek w stanach EMT za pomocą immunocytochemii.

Indukcja i analiza przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Ten raport opisuje metodę bioinżynierii do projektowania i konstruowania nowych sztucznych czynników splicingu (ASF), które specyficznie modulują splicing docelowych genów w komórkach ssaków. Metoda ta może być dalej rozszerzana w celu inżynierii różnych sztucznych czynników w celu manipulowania innymi aspektami metabolizmu RNA.

Inżynieria sztucznych czynników w celu specyficznego manipulowania alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich

Prezentujemy tutaj metodę hodowli komórkowej do indukowania przemian mezenchymalno-nabłonkowych (MET) w komórkach mięsaka opartą na połączonej ektopowej ekspresji członków rodziny mikroRNA-200 i ziarnistej głowy 2 (GRHL2). Metoda ta jest odpowiednia do lepszego zrozumienia biologicznego wpływu plastyczności fenotypowej na agresywność raka i leczenie.

Indukcja przejść mezenchymalno-nabłonkowych w komórkach mięsaka

Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

Opisujemy systematyczny proces badania sygnalizacji TGF-β i EMT indukowanego przez TGF-β, badając ekspresję białek i genów zaangażowanych w ten szlak sygnałowy. Metody obejmują Western blotting, test reporterowy lucyferazy, qPCR i barwienie immunofluorescencyjne.

Badanie sygnalizacji TGF-β i indukowanego przez TGF-β przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego w raku piersi i prawidłowych komórkach

Ten protokół przedstawia szybkie i użyteczne narzędzie do oceny roli białka o niescharakteryzowanej funkcji w alternatywnej regulacji splicingu po leczeniu chemioterapeutycznym.

Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA

Alternatywny splicing (AS) i alternatywna poliadenylacja (APA) rozszerzają różnorodność izoform transkryptu i ich produktów. W tym miejscu opisujemy protokoły bioinformatyczne do analizy masowych testów sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania końca 3' w celu wykrycia i wizualizacji AS i APA różniących się w różnych warunkach eksperymentalnych.

Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

Światło / ciemność testu transformacji jest jednym z najczęściej stosowanych testów do pomiaru lęku zachowań w myszy. Poniżej prezentujemy film, który pokazuje szczegółowe procedury, w jaki sposób przeprowadzenia testu.

Światło / ciemność test przejścia dla Myszy

Poznaj metodę wykrywania alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego w ludzkich komórkach gruczołu mlekowego. Technika ta umożliwia badanie regulacji ekspresji genów związanej z progresją nowotworową.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Przeglądaj więcej filmów