Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie związku nieprawidłowego splicingu z profilami oporności na leki w modelach in vitro guzów litych i nowotworów hematologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie farmakologii molekularnej i oporności na chemioterapię, takie jak mechanizm leżący u podstaw oporności na leki na poziomie potranskrypcyjnym? Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona dobrze sprawdzony protokół badań przesiewowych cytotoksyczności z potężną analizą transkryptomiczną opartą na sekwencjonowaniu nowej generacji.

Technika ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw niepowodzenia chemioterapii i usprawni wczesne wykrywanie oporności na leki. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat ogólnogenomowych determinantów oporności na leki w modelach linii komórkowych. Ale może być również stosowany do innych systemów, takich jak pierwotne próbki pacjentów i ksenoprzeszczepy.

Tę procedurę zademonstruje Johan Fomirno, technik z naszego laboratorium w Centrum Onkologii w Amsterdamie. Aby wykonać test MTT dla komórek białaczkowych, przygotuj 96-dołkową płytkę doświadczalną z płaskim dnem. Poświęć studzienki stężeniom leków do kontroli komórek i do pożywki kontrolnej bez komórek.

Przygotować zakres rozcieńczania leku deksametazonu lub deksluksu. Dodać 30 mikrolitrów z każdego rozcieńczenia dex do odpowiedniego dołka na 96-dołkowej płytce. Upewnij się, że każde stężenie jest zawarte w trzech egzemplarzach.

Zbierz wykładniczo rosnące komórki białaczkowe i ponownie je zawiesić w optymalnym stężeniu wysiewu. Dodaj 120 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki zawierającej roztwór leku lub pożywkę wzrostową i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 72 godziny. Po etapie inkubacji dodaj 15 mikrolitrów odczynnika MTT do każdego dołka za pomocą powtarzalnej pipety.

Potrząsaj płytką przez pięć minut za pomocą wytrząsarki do maksymalnej liczby 900 wstrząsów na minutę. Umieść płytki z powrotem w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w inkubatorze do hodowli komórkowych i inkubuj przez kolejne cztery do sześciu godzin. Po inkubacji należy dokładnie zawiesić kryształy formazanu, ponieważ wartości absorbancji zależą od prawidłowej rozpuszczalności związku.

Dodaj 150 mikrolitrów zakwaszonego izopropanolu do każdej studzienki i dobrze wymieszaj pipetą wielokanałową, aby dokładnie zawiesić wszystkie kryształy formazanu. Za pomocą czytnika mikropłytek określ gęstość optyczną lub OD przy 540 i 720 nanometrach, aby zapewnić dokładny pomiar poprzez korektę tła OD.To przeprowadzić test SRB dla komórek raka trzustki, przygotuj 96-dołkową płytkę doświadczalną z płaskim dnem. Wysiewaj komórki raka trzustki rosnące w fazie wykładniczej w trzech egzemplarzach na 96-dołkowych płytkach o płaskim dnie o odpowiedniej gęstości w 100 mikrolitrach pożywki za pomocą pipety wielokanałowej.

Dodaj 100 mikrolitrów pożywki do średnich studzienek i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby zapewnić prawidłowe przyleganie komórek do płytki. Dodać 100 mikrolitrów z każdego rozcieńczenia do odpowiedniego dołka na 96-dołkowej płytce za pomocą pipety wielokanałowej. Upewnij się, że każde stężenie jest w trzech egzemplarzach.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 72 godziny. Następnie dodaj 25 mikrolitrów zimnego roztworu TCA do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytki przez co najmniej 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wytrącić i utrwalić białka na dnie studzienek.

Opróżnij płytkę, usuwając podłoże i krótko wysusz na chusteczce. Umyj pięć razy wodą z kranu przed opróżnieniem talerza i wysuszeniem w temperaturze pokojowej. Dodać 50 mikrolitrów roztworu SRB do dołka za pomocą powtarzalnej pipety i barwić przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie opróżnij płytkę, usuwając plamę z SRB. Po czterokrotnym umyciu płytki 1% kwasem octowym, opróżnij płytkę i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Dodać 150 mikrolitrów roztworu Tris do dołka za pomocą pipety wielokanałowej i mieszać przez trzy minuty na wytrząsarce płytkowej do maksymalnej liczby 900 wstrząsów na minutę.

Odczytaj gęstość optyczną przy 540 nanometrach. Obracać próbki z prędkością 300 g przez trzy minuty. Po usunięciu supernatantu wyekstrahuj całkowite mRNA za pomocą dostępnych na rynku kolumn wirowych z membraną krzemionkową.

Określić stężenie i czystość całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Aby przygotować bibliotekę sekwencjonowania, użyj dwóch mikrogramów całkowitego mRNA na próbkę. Postępuj zgodnie z protokołem przygotowania biblioteki mRNA zgodnie z instrukcjami producenta.

Po połączeniu bibliotek w pojedynczej próbce do końcowego stężenia 10 nanomoli na litr za pomocą bioanalizatora, należy użyć systemu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości z trybem pojedynczego odczytu 100 par zasad. Zaprojektuj wszystkie podkłady zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W przypadku syntezy pierwszej nici cDNA należy skonfigurować odwrotną transkrypcję jednego mikrograma wyizolowanego RNA do cDNA, używając 200 jednostek na mikrolitr odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki mysiej Moloneya w buforze reakcyjnym rozcieńczonym od jednego do pięciu sterylną wodą.

Aby przeprowadzić reakcję RT-PCR, dodaj jeden mikrolitr cDNA do mieszaniny reakcyjnej PCR i umieść probówki w termocyklerze. Uruchom program zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po PCR załaduj próbki do 1% żelu agarozowego i uruchom żel w buforze TBE o napięciu 100 woltów przez około 30 minut w systemie elektroforezy.

Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, podczas wykonywania testu qRT-PCR należy używać końcówek filtrujących. Aby wykonać qRT-PCR, przygotuj mieszaninę reakcyjno-reakcyjną zielonej cyjaniny PCR dla każdego konkretnego wariantu splicingu, który ma zostać wykryty, a także dla genu porządkowego. Załadować mieszankę wzorcową na białą 96-dołkową płytkę i przygotować duplikaty dla każdej próbki.

Dodaj pięć mikrolitrów cDNA rozcieńczonego 10 razy w wodzie do każdej mieszanki przed umieszczeniem płytki w termocyklerze. Przedstawiono tutaj krzywe zahamowania wzrostu określone za pomocą testu MTT dla komórek białaczkowych i testu SRB dla komórek raka trzustki. Krzywe dla komórek opornych na deksametazon i gemcytabinę są przesunięte w prawo, co wskazuje na zahamowanie wzrostu w porównaniu z komórkami wrażliwymi rodziców.

Stężenie i jakość bibliotek cDNA dla wszystkich linii komórkowych określa się za pomocą chipa bioanalizatora DNA. Elektroferogramy wykazują piki fluorescencji na około 300 parach zasad, co wskazuje na dobrą jakość dla późniejszej procedury sekwencjonowania RNA. Krótkie odczyty kandydata genu DDX5 można zwizualizować jako wykresy Sashimi, na których linie łączące reprezentują połączenia łączące.

Transkrypt DDX5 wykazuje zróżnicowane wykorzystanie komórek typu dzikiego eksonu 12 i CEM oraz CEM / R30dm w porównaniu z liniami komórkowymi opornymi na glikokortykosteroidy, CEM-C3 i CEM-R5. Wyniki sekwencjonowania RNA są walidowane poprzez wykonanie RT-PCR na wybranych genach, dla których startery parują się i dają eksony znajdujące się przed i za alternatywnie splicingowanym eksonem. Różnicowy splicing genu DDX5 pokazano tutaj.

Kwantyfikacja różnicowo splicingowanych transkryptów za pomocą testu qRT-PCR przy użyciu specyficznych dla izoformy starterów odwrotnych potwierdza specyficzną regulację w dół wariantu splicingu eksonu delta 12 DDX5 i specyficznych podlinii odpornych na glikokortykosteroidy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech tygodni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przechowywaniu próbek RNA na lodzie, aby uniknąć degradacji.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak ektopowa nadekspresja nowego wariantu splicingu. Pozwoli to odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak funkcjonalny wpływ alternatywnego profilu splicingu na lekooporność. Technika ta może utorować drogę dla badań w dziedzinie farmakologii molekularnej w celu zbadania ogólnogenomowych uwarunkowań oporności na leki.