Name: Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj metodę minigenu E1A2 do oceny globalnych zmian splicingu mRNA w komórkach HEK 293 po leczeniu chemioterapią. To szybkie i ekonomiczne narzędzie pozwala badać funkcję białek w regulacji alternatywnego splicingu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, poprzez Grant Temático 2017/03489-1 dla JK i stypendium dla FLB 2018/05350-3) oraz Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) za finansowanie tych badań. Chcielibyśmy podziękować dr Adrianowi Krainerowi za dostarczenie plazmidu pMTE1A oraz Zerlerowi i współpracownikom za ich pracę nad klonowaniem E1A. Dziękujemy również prof. dr Patrícii Moriel, prof. dr Wandzie Pereirze Almeidzie, prof. dr Marcelo Lancellottiemu i prof. dr Karinie Kogo Cogo Müller za umożliwienie nam korzystania z ich przestrzeni laboratoryjnej i sprzętu.

1. Komórki poszycia
UWAGA: W tym opisanym protokole użyto stabilnych linii komórkowych HEK293, wcześniej wygenerowanych dla stabilnej indukowalnej ekspresji Nek421, jednak ten sam protokół jest odpowiedni dla wielu innych linii komórkowych, takich jak HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. Wzorzec ekspresji izoform minigenu E1A w warunkach podstawowych różni się w zależności od tych komórek i powinien być scharakteryzowany dla każdego stanu. Protokół ten nie ogranicza się do stabilnych linii komórkowych. Najpowszechniejszym podejściem do oceny białka kandydującego jest przejściowa kotransfekcja polegająca na zwiększaniu jego ilości przy ustalonej ilości minigenu. Ten sam protokół jest odpowiedni dla ogniw nokautujących.
<ol>
	<li>Komórki tabliczkowe z uwzględnieniem kontroli nośnika, nietransfekowanej i GFP.</li>
	<li>Hodowla komórek HEK293 ze stabilną ekspresją interesującego genu w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 4,5 g/l glukozy, 4 mM L-glutaminy i utrzymywana w 100 μg/ml higromycyny B, na płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wilgotnej atmosferze.</li>
	<li>Podziel komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA. Płytka 3 x 105 komórek na płytkach 6-dołkowych i inkubować je przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2, 
	UWAGA: W przypadku transfekcji komórki muszą być zlewane w 70-80%, aby zmniejszyć śmierć komórki po transfekcji.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórkowa
UWAGA: użyto tutaj 1-2 μg plazmidu minigenu pMTE1A, jednak ilość DNA, jak również czas ekspresji, muszą być utrzymywane na minimalnym poziomie, aby uniknąć toksyczności. Na przykład wysoką toksyczność zaobserwowano w komórkach HeLa po 30 godzinach transfekcji 1 μg DNA pMTE1A. Do opisanej tutaj transfekcji użyto odczynnika do transfekcji na bazie lipidów
<ol>
	<li>Sprawdź konfluencję komórek 24 godziny po posiewie i transfekuj stabilne komórki HEK293 tylko wtedy, gdy 70-80% zlewania się.</li>
	<li>Ostrożnie usuń pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą pipety, zamiast używać systemu pompy próżniowej. Następnie ostrożnie dodać 2 ml kompletnej pożywki DMEM bez antybiotyków i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Przygotować probówkę z buforem do transfekcji (200 μl/studzienkę), dodać 2 μg DNA pMTE1A, przetrząsnąć, a następnie dodać 2 μl odczynnika do transfekcji. Ponownie wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjąć płytki z inkubatora i ostrożnie dodawać kroplami mieszaninę transfekcji.</li>
	<li>Do stabilnych komórek HEK293 dodać tetracyklinę (0,5 μg/ml) w celu indukcji ekspresji Nek4 6 godzin po transfekcji. Zmiana medium nie jest konieczna. 
	UWAGA: Objętości/ilości opisane w tej sekcji dotyczą jednego dołka. Przygotuj mieszaninę dla wszystkich studzienek użytych w eksperymencie w tej samej probówce.</li>
	<li>Przygotuj jeden dobrze do transfekcji EGFP lub innego plazmidu wyrażającego fluorofor, aby oszacować skuteczność transfekcji. Lepsze wyniki można zaobserwować przy skuteczności transfekcji wynoszącej co najmniej 40%, ale wcześniej obserwowano dobre wyniki przy niższej wydajności transfekcji.</li>
	<li>Podczas korzystania z kotransfekcji (białko odsetek i minigen) należy dobrze współpracować z komórkami nietransfekowanymi, aby uniknąć uzyskania wyników z endogennego mRNA. W przypadku E1A komórki HEK293 już wyrażają gen E1A30.</li>
</ol>
3. Przygotowanie leków
UWAGA: Czas i koncentracja leczenia zostały wybrane na podstawie wyników literatury, które wskazują na zmiany w alternatywnym splicingu dla niektórych genów.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem testu należy wykonać krzywą dawka-odpowiedź, aby określić minimalne stężenie alternatywnej indukcji splicingu bez wpływu na żywotność komórek.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy paklitakselu w etanolu o stężeniu 5 mM. Końcowe stężenie wynosi 1 μM. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyć 0,02% etanolu jako kontroli pojazdu.</li>
	<li>Przygotować roztwór cisplatyny, rozcieńczając w 0,9% NaCl w stężeniu około 0,5 mg/ml (1,66 mM). Chronić przed światłem, wirować i inkubować w łaźni termalnej w temperaturze 37 °C przez 30 min. Końcowe stężenie wynosi 30 μM. Przygotować świeże lub przechowywać w temperaturze 2-10 °C przez okres do jednego miesiąca. 
	UWAGA: Wszystkie leki muszą być chronione przed światłem.</li>
</ol>
4. Leczenie i pobieranie komórek
UWAGA: Stabilne komórki HEK293 zostały pobrane 48 godzin po transfekcji i w tym celu zostały poddane leczeniu 24 godziny po transfekcji, ponieważ najwyższy poziom ekspresji Nek4 osiągany jest w ciągu 48 godzin. Jednak w tym czasie zaobserwowano wysoki poziom ekspresji izoformy 13S (do 90%). Aby zmniejszyć udział izoformy 13S, spróbuj poddać leczeniu i zebrać komórki 30 godzin po maksymalnej transfekcji.
<ol>
	<li>Używaj końcówek i probówek wolnych od RNA/DNaz. Przeprowadzić ekstrakcję całkowitego RNA odczynnikiem fenolowo-chloroformowym zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>24 godziny po transfekcji sprawdzić morfologię komórek i skuteczność transfekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Usuń pożywkę do hodowli komórkowych, najlepiej za pomocą pipety zamiast systemu pompy próżniowej. Następnie dodać pożywkę do hodowli komórkowych z chemioterapeutykami w opisanym wcześniej stężeniu końcowym.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 18 - 24 godziny.</li>
	<li>Zebrać RNA, wyrzucając pożywkę do hodowli komórkowych do pojemnika i dodając 0,5 - 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA bezpośrednio do studzienki. Jeśli studzienki są bardzo zlewające, użyj 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA, aby poprawić jakość RNA.</li>
	<li>Homogenizować pipetą i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. W tym momencie protokół można wstrzymać, przechowując próbki w temperaturze -80 °C lub natychmiast przejść do ekstrakcji RNA. 
	UWAGA: Odczynnik do ekstrakcji RNA na bazie fenolu jest toksyczny i wszystkie procedury należy wykonywać w dygestoriach chemicznych, a pozostałości należy odpowiednio zutylizować.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja RNA i synteza cDNA
<ol>
	<li>W dygestorii rozmrozić próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 0,1 -0,2 ml chloroformu i energicznie wymieszać.</li>
	<li>Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać górną fazę wodną i przenieść do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zbierz około 60% całkowitej objętości; jednak nie pobieraj DNA ani fazy organicznej (dolnej).</li>
	<li>Dodać 0,25 - 0,5 ml izopropanolu i mieszać przez odwrócenie 4 razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć osad RNA dwukrotnie etanolem (75% w wodzie uzdatnionej dietylowęglanem (DEPC)). Wirować przy 7 500 x g przez 5 minut i wyrzucić etanol.</li>
	<li>Usuń nadmiar etanolu, odwracając rurkę na ręczniku papierowym, a następnie pozostaw rurkę otwartą w dygestorium, aby częściowo wysuszyć granulkę przez 5 - 10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad RNA w 15 μl wody uzdatnionej DEPC.</li>
	<li>Określ ilościowo całkowite RNA za pomocą absorbancji przy 230 nm, 260 nm i 280 nm w celu sprawdzenia jakości RNA.</li>
	<li>Aby zweryfikować całkowitą jakość RNA, uruchom 1% żel agarozowy wstępnie potraktowany 1,2% (v/v) 2,5% roztworu podchlorynu sodu przez 30 min31.</li>
	<li>Przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu 1-2 μg całkowitego RNA.
	<ol>
		<li>Odpipetować RNA, 1 μl oligo-dT (50 μM), 1 μl dNTP (10 mM) i uzupełnić objętość do 12 μl wodą wolną od nukleaz. Inkubować w termocyklerze przez 5 minut w temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Wyjąć próbki z termocyklera do ochłodzenia i przygotować mieszaninę reakcyjną: 4 μl buforu odwrotnej transkryptazy, 2 μl ditiotreitolu (DTT) i 1 μl inhibitora rybonukleazy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.</li>
		<li>Dodać 1 μl termostabilnej odwrotnej transkryptazy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut i inaktywować enzym w temperaturze 70 °C przez 15 minut 
		UWAGA: cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni. Przeprowadzić kontrolę bez odwrotnej transkryptazy (NRT) pod kątem zanieczyszczenia genomu spowodowanego dyskryminacją przypuszczalnych zdarzeń retencji intronacyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. PCR minigenu pMTE1A
<ol>
	<li>Wykonaj PCR ze składem reakcji (1,5 mM MgCl2, 0,3 mM mieszaniny dNTP, 0,5 μM każdego startera, 2,5 U polimerazy Taq na gorąco i 150 ng cDNA) w następujących warunkach: 
	94 °C przez 2 min, 29 cykli: 94 °C przez 1 min, 50 °C przez 2 min, 72 °C przez 2 min, 72 °C przez 10 min.</li>
	<li>Załaduj 20-25 μl produktu PCR do 3% żelu agarozowego zawierającego barwnik kwasem nukleinowym i pracuj pod napięciem 100 V przez około 1 godzinę.</li>
</ol>
7. Analiza żelu za pomocą oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazu32
<ol>
	<li>Po serii sfotografuj żel (za pomocą systemu akwizycji obrazu żelu), unikając nasycenia pasm i określ ilościowo prążki za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
	<li>W celu kwantyfikacji rozważ pasma na ~631 pz, ~493 pz i ~156 pz, które odpowiadają odpowiednio izoformom 13S, 12S i 9S.</li>
	<li>Z menu Plik oprogramowania otwórz plik obrazu uzyskany z systemu akwizycji obrazu. Przekonwertuj na skalę szarości, dostosuj jasność i kontrast oraz usuń szumy odstające, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Narysuj prostokąt wokół pierwszego pasa ruchu za pomocą narzędzia Zaznaczanie prostokąta i zaznacz go za pomocą przycisku Analizuj | Żele | Wybierz polecenie Pierwszy pas lub naciskając skrót klawiaturowy.</li>
	<li>Użyj myszy, aby kliknąć i przytrzymać środek prostokąta na pierwszym pasie ruchu i przeciągnij go na następny pas. Przejdź do punktu Analiza | Żele | Wybierz opcję Next Lane (Następny pas) lub naciśnij dostępny skrót. Powtórz ten krok dla wszystkich pozostałych pasów ruchu.</li>
	<li>Po podświetleniu i ponumerowaniu wszystkich pasów ruchu przejdź do punktu menu Analizuj | Żele | Narysuj pasy ruchu, aby narysować wykres profilu każdego pasa ruchu.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia Zaznaczanie linii prostej narysuj linię w poprzek podstawy każdego szczytu odpowiadającego każdemu pasmu, pomijając szum tła. Po zamknięciu wszystkich szczytów z każdej alei wybierz narzędzie Różdżka i kliknij wewnątrz każdego szczytu. Dla każdego wyróżnionego piku pomiary powinny pojawić się w wyświetlonym oknie Wyniki.</li>
	<li>Zsumować natężenie ze wszystkich 3 pasm dla każdej próbki i obliczyć wartość procentową dla każdej izoformy w stosunku do całości.</li>
	<li>Wykreślić zawartość procentową każdej izoformy lub różnice w zawartości procentowej w stosunku do próbek niepoddanych działaniu substancji. 
	UWAGA: Upewnij się, że suma trzech wariantów E1A musi być równa 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+Regulatory+Networks%3A+Functions%2C+Mechanisms%2C+and+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li>
<li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li>
<li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing%3A+a+new+dimension+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li>
<li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing%3A+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li>
<li>Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li>
<li>Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li>
<li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li>
<li>Anufrieva, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-induced+stress+response+is+associated+with+downregulation+of+pre-mRNA+splicing+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells.</a> Genome Medicine. 10 (1), 49(2018).</li>
<li>Shultz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li>
<li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li>
<li>Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li>
<li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).</li>
<li>Zerler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E1A+coding+sequences+that+enable+ras+and+pmt+oncogenes+to+transform+cultured+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).</li>
<li>Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+splicing+of+adenovirus+E1A+transcripts%3A+characterization+of+novel+reactions+and+of+multiple+branch+points+abnormally+far+from+the+3%27+splice+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site.</a> Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).</li>
<li>Stephens, C., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+splicing+yields+novel+adenovirus+5+E1A+mRNAs+that+encode+30+kd+and+35+kd+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).</li>
<li>Ulfendahl, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li>
<li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li>
<li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li>
<li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11(2015).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li>
<li>Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li>
<li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li>
<li>Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092(2013).</li>
<li>Jarnæss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+Factor+Arginine%2FSerine-rich+17A+%28SFRS17A%29+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li>
<li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+association+of+human+Ki-1%2F57+with+pre-mRNA+splicing+events%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li>
<li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980(2013).</li>
<li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+3%27+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF%2FSF2+and+hnRNP+A1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li>
<li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT%2FCGRP+precursor+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Minigeny są ważnymi narzędziami do określania skutków globalnego alternatywnego splicingu in vivo. Minigen adenowirusowy E1A jest z powodzeniem stosowany od dziesięcioleci do oceny roli białek poprzez zwiększenie ich ilości w komórce13,14. W tym miejscu proponujemy zastosowanie minigenu E1A do oceny alternatywnego splicingu po ekspozycji na chemioterapeutyk. Zastosowano stabilną linię komórkową eksprymującą izoformę Nek4 1, unikając artefaktów nadekspresji spowod...

Splicing jest jednym z najważniejszych etapów przetwarzania eukariotycznego mRNA, który następuje jednocześnie z cappingiem 5'mRNA i poliadenylacją 3'mRNA, składającą się z usunięcia intronów, a następnie połączenia eksonowego. Rozpoznawanie miejsc splicingu (SS) przez spliceosom, kompleks rybonukleoprotein zawierający małe rybonukleoproteiny (snRNP U1, U2, U4 i U6), małe RNA (snRNA) i kilka białek regulatorowych1 jest niezbędne do splicingu.
Oprócz usuwania intronów (konstytutywnego splicingu), u eukariontów, introny mogą być zachowane, a eksony mogą być wykluczone, konfigurując proces zwany alternatywnym splicing mRNA (AS). Alternatywny splicing pre-mRNA rozszerza zdolność kodowania genomów eukariotycznych, umożliwiając produkcję dużej i zróżnicowanej liczby białek ze stosunkowo niewielkiej liczby genów. Szacuje się, że 95-100% ludzkich mRNA, które zawierają więcej niż jeden ekson, może zostać poddanych alternatywnemu splicingowi2,3. Ma to fundamentalne znaczenie dla procesów biologicznych, takich jak rozwój neuronów, aktywacja apoptozy i komórkowa reakcja na stres4, zapewniając organizmowi alternatywy do regulacji funkcjonowania komórek przy użyciu tego samego repertuaru genów.
Maszyneria niezbędna do alternatywnego łączenia jest taka sama, jak używana do konstytutywnego splicingu, a użycie SS jest głównym czynnikiem decydującym o alternatywnym występowaniu splicingu. Splicing konstytutywny jest związany z wykorzystaniem silnych miejsc splicingu, które są zwykle bardziej podobne do motywów konsensusu dla rozpoznawania spliceosomów5.
Alternatywne eksony są zazwyczaj rozpoznawane mniej efektywnie niż konstytutywne eksony, gdy ich cis-regulatorowe elementy, sekwencje w 5'SS i 3'SS flankujące te eksony, wykazują gorszą zdolność wiązania ze spliceosomem. mRNA zawiera również regiony zwane wzmacniaczami lub tłumikami zlokalizowanymi w eksonach (egzoniczne wzmacniacze splicingu (ESE) i egzoniczne tłumiki splicingu (ESS)) oraz introny (introniczne wzmacniacze splicingu (ISE) i introniczne tłumiki splicingu (ISS)) które odpowiednio zwiększają lub tłumią użycie eksonów<klasa sup="xref">5. Sekwencje te są rozpoznawane przez elementy transregulacyjne lub czynniki splicingowe (SF). SF są reprezentowane głównie przez dwie rodziny białek, czynniki splicingowe bogate w serynę/argininę (SRSF), które wiążą się z ESE, oraz rodzinę heterogenicznych rybonukleoprotein jądrowych (hnRNP), które wiążą się z sekwencjami ESSs5.
Alternatywny splicing może być modulowany przez fosforylację/defosforylację czynników trans-, modyfikując partnerów interakcji i lokalizację komórkową czynników splicingowych6,7,8. Zidentyfikowanie nowych regulatorów czynników splicingu może dostarczyć nowych narzędzi do regulacji splicingu, a w konsekwencji niektórych metod leczenia raka.
Anufrieva et al.9, w profilu ekspresji genów mikromacierzy mRNA, zaobserwował stałe zmiany w poziomach składników spliceosomalnych w 101 liniach komórkowych i po różnych warunkach stresu (leki na bazie platyny, promieniowanie gamma, inhibitory topoizomerazy, inhibitory kinazy tyrozynowej i taksany). Związek między wzorcem splicingu a skutecznością chemioterapii został już wykazany w komórkach raka płuc, które są oporne na chemioterapię, wykazując zmiany w częstości wariantów kaspazy-910. Komórki HEK293 leczone panelem chemioterapeutyków wykazują zmiany w splicingu ze wzrostem wariantów proapoptotycznych. Gabriel et al.11 zaobserwowali zmiany w co najmniej 700 zdarzeniach splicingu po leczeniu cisplatyną w różnych liniach komórkowych, wskazując, że szlaki splicingu są dotknięte cisplatyną. Modulatory splicingu wykazały już działanie przeciwnowotworowe, co pokazuje, że splicing jest ważny dla rozwoju nowotworu, a przede wszystkim odpowiedzi na chemioterapię12. W związku z tym scharakteryzowanie nowych białek, które regulują splicing po czynnikach stresorów komórkowych, takich jak chemioterapeutyki, jest bardzo ważne dla odkrycia nowych strategii leczenia.
Wskazówki dotyczące alternatywnej regulacji splicingu z badań interaktomowych, szczególnie ważne dla scharakteryzowania funkcji nowych lub niescharakteryzowanych białek, mogą wymagać bardziej ogólnego i prostego podejścia do weryfikacji rzeczywistej roli białka w AS. Minigeny są ważnymi narzędziami do analizy ogólnej roli białka wpływającego na regulację splicingu. Zawierają one segmenty z genu będącego przedmiotem zainteresowania, zawierające naprzemiennie splicingowane i flankujące regiony genomowe13. Użycie narzędzia minigenu umożliwia analizę splicingu in vivo z kilkoma zaletami, takimi jak długość minigenu, która jest niewielka i dlatego nie stanowi ograniczenia dla reakcji amplifikacji; ten sam minigen może być oceniany w różnych liniach komórkowych; Wszystkie składniki komórkowe, głównie ich regulujące modyfikacje potranslacyjne (fosforylacja i zmiany w kompartmentach komórkowych) są obecne i można się do nich zaadresować<klasa SUP="xref">13,<klasa SUP="Xref">14. Co więcej, zmiany w alternatywnym wzorcu splicingu można zaobserwować po stresie komórkowym, a zastosowanie systemu minigenu pozwala zidentyfikować szlak modulowany przez różne bodźce.
Istnieje już kilka systemów minigenów, które są specyficzne dla różnych rodzajów zdarzeń splicingu13,14, jednakże, jako test wstępny, minigene E1A15 jest bardzo dobrze ugruntowanym alternatywnym systemem reporterowym do badania selekcji 5'SS in vivo. Tylko z jednego genu, E1A, pięć mRNA jest wytwarzanych przez alternatywne splicingowanie oparte na wyborze trzech różnych miejsc splicingu 5′ i jednego głównego lub jednego mniejszego miejsca splicingu 3′16,17,18. Ekspresja wariantów E1A zmienia się w zależności od okresu infekcji adenowirusowej19,20.
Pokazaliśmy wcześniej, że obie izoformy Nek4 oddziałują z czynnikami splicingowymi, takimi jak SRSF1 i hnRNPA1, i podczas gdy izoforma 2 zmienia alternatywny splicing minigenu E1A, izoforma 1 nie ma wpływu na to21. Ponieważ izoforma 1 jest najliczniejszą izoformą i zmienia oporność na chemioterapię i odpowiedź na uszkodzenie DNA, oceniamy, czy może zmienić alternatywny splicing minigenu E1A w warunkach stresu.
Test Minigene jest prostą, tanią i szybką metodą, ponieważ wymaga jedynie ekstrakcji RNA, syntezy cDNA, amplifikacji i analiz żelu agarozowego, i może być użytecznym narzędziem do oceny od możliwego wpływu na alternatywny splicing przez białko będące przedmiotem zainteresowania, aż do wpływu różnych zabiegów na komórkowy alternatywny wzór splicingu.

<table><tbody><tr><td>100 pb Drabinka DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A9539-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatyna</td><td>Sigma</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>DEPC woda</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9920</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>ThermoFisher</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca - FBS</td><td>Mikroskop</td> fluorescencyjny ThermoFisher <td>12657029</td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji obrazowania żelu Leica DMIL LED FLUO - ChemiDoc Gel Imagin System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP - pEGFPC3</td> Stabilne komórki <td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> HEK293 - HEK293 Flp-In <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Wygenerowane z Flp-In&trade; T-REx&handel; 293 - Invitrogen i opisany w ref 21</td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td>Używany do konserwacji komórek Flp-In</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazu - oprogramowanie</td><td></td><td></td> FIJI <td>ref. 32</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów - jetOPTIMUS Polyplus Odczynnik</td><td>Polyplus</td><td>117-07</td><td></td></tr><tr><td>Oligo DT</td><td>ThermoFisher</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek Paclitxel</td><td>Invitrogen</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>/ absorbancja UV</td><td>Biotech</td><td></td><td>Epoch Biotek / adapter Take3</td></tr><tr>plazmid <td></td><td></td><td>pMTE1A</td><td>Dostarczone przez dr Adriana Krainera</td></tr><tr><td>pMTE1A</td><td>F Invitrogen</td><td>&nbsp; 5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td><td></td></tr><tr><td>pMTE1A R</td><td>Invitrogen</td><td>5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>F5810R</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza - M-MLV</td><td>ThermoFisher</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza - Indeks górny IV</td><td>ThermoFisher</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor rybukleazy RNAse OUT</td><td>ThermoFisher</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakcja RNA odczynnik na bazie fenolu i chloroformu - Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe Barwnik żelowy DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq</td><td>Platinum Thermo</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma</td><td>T3383</td><td>Używany do indukcji ekspresji Flaga pusta lub Nek4- Flag</td></tr><tr><td>Termocykler Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie narzędzia e1a minigene do badania zmian splicingu mrna

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

przetwarzanie mRNA obejmuje wiele jednoczesnych etapów przygotowania mRNA do translacji, takich jak capping 5', dodawanie poli-A i splicing. Oprócz konstytutywnego splicingu, alternatywny splicing mRNA umożliwia ekspresję wielofunkcyjnych białek z jednego genu. Ponieważ badania interaktomu są na ogół pierwszą analizą nowych lub nieznanych białek, powiązanie białka przynęty z czynnikami splicingu wskazuje, że może ono uczestniczyć w procesie splicingu mRNA, ale określenie, w jakim kontekście lub jakie geny są regulowane, jest procesem empirycznym. Dobrym punktem wyjścia do oceny tej funkcji jest użycie klasycznego narzędzia minigene. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie minigenu adenowirusowego E1A do oceny alternatywnych zmian splicingu po różnych bodźcach stresu komórkowego. Oceniliśmy splicing minigenu E1A w HEK293 stabilnie nadekspresjonującym białko Nek4 po różnych zabiegach stresowych. Protokół obejmuje transfekcję minigenu E1A, leczenie komórkowe, ekstrakcję RNA i syntezę cDNA, a następnie analizę PCR i żelu oraz kwantyfikację wariantów splicingu E1A. Zastosowanie tej prostej i sprawdzonej metody w połączeniu z konkretnymi terapiami jest wiarygodnym punktem wyjścia do rzucenia światła na procesy komórkowe lub na to, jakie geny mogą być regulowane przez splicing mRNA.

W celu oceny zmian w profilu splicingu w komórkach po ekspozycji na chemioterapię przeprowadzono analizę miejsc splicingowych 5´ z wykorzystaniem minigenu E1A. Oceńiono rolę Nek4 – izoformy 1 w regulacji alternatywnego splicingu w stabilnych komórkach HEK293 po leczeniu paklitakselem lub cisplatyną.
Region E1A adenowirusa odpowiada za produkcję trzech głównych mRNA z jednego prekursora RNA dzięki wykorzystaniu różnych donorów sp...

Ten protokół przedstawia szybkie i użyteczne narzędzie do oceny roli białka o niescharakteryzowanej funkcji w alternatywnej regulacji splicingu po leczeniu chemioterapeutycznym.

Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących wykorzystania minigenu E1A2 do oceny globalnych zmian splicingu mRNA. Jest to szybkie, niedrogie i proste narzędzie do oceny funkcji białka docelowego w alternatywnej regulacji splicingu bez konieczności stosowania specjalnych reżimów lub warunków laboratoryjnych. Zacznij od hodowli komórek HEK 293 ze stabilną ekspresją interesującego genu.Podziel komórki za pomocą 0,25% trypsyny EDTA, a następnie połóż 300 000 komórek na studzience na sześciodołkowych płytkach i inkubuj je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach sprawdź konfluencję i transfekuj stabilne komórki HEK 293 tylko wtedy, gdy zlewają się w 70 do 80%. Ostrożnie usunąć pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą pipety, a następnie dodać dwa mililitry kompletnej pożywki DMEM bez antybiotyków i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.Przygotować probówkę z buforem do transfekcji, następnie dodać dwa mikrogramy DNA pMTE1A, odwirować i dodać dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji. Ponownie wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyjmij płytki z inkubatora i ostrożnie dodawaj mieszaninę transfekcji kroplami.Sześć godzin po transfekcji dodaj tetracyklinę do stabilnych komórek HEK 293 w celu indukcji ekspresji Nek4. 24 godziny po transfekcji sprawdź morfologię komórek i skuteczność transfekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą pipety usuń pożywkę do hodowli komórkowych, a następnie dodaj pożywkę do hodowli komórkowych z chemioterapeutykami.Inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny. Aby zebrać RNA, wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowej i dodaj 0,5 do 1 mililitra odczynnika do ekstrakcji RNA bezpośrednio do studzienki. Jeśli studzienki są bardzo zlewne, użyj jednego mililitra odczynnika do ekstrakcji RNA, aby poprawić jakość RNA.Homogenizuj komórki za pomocą pipety i przenieś je do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Natychmiast przystąp do ekstrakcji RNA lub przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić próbki w dygestorii i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Dodaj 0,1 do 0,2 mililitra chloroformu i energicznie mieszaj, a następnie inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, a następnie zebrać górną fazę wodną i przenieść ją do nowej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Zbierz około 60% całkowitej objętości, ale nie zbieraj DNA ani fazy organicznej.Dodać 0,25 do 0,5 mililitra izopropanolu i czterokrotnie wymieszać próbkę przez odwrócenie. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie odwirować w temperaturze 12 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Przemyć osad RNA dwukrotnie alkoholem etylowym i odwirować w temperaturze 7 500 razy G przez pięć minut, a następnie wyrzucić etanol.Usuń nadmiar etanolu, odwracając rurkę na ręczniku papierowym, a następnie pozostaw rurkę otwartą w dygestorium, aby częściowo wysuszyć granulki przez pięć do 10 minut. Ponownie zawiesić osad RNA w 15 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC. Określ ilościowo całkowite RNA i zweryfikuj jakość RNA, mierząc absorbancję przy 230, 260 i 280 nanometrach.Aby zweryfikować całkowitą jakość RNA, uruchom 1% żel agarozowy wstępnie potraktowany 1,2% 2,5% roztworu podchlorynu sodu przez 30 minut. Przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu jednego do dwóch mikrogramów całkowitego RNA. Połącz RNA, jeden mikrolitr oligo d-T, jeden mikrolitr DNTP i wodę wolną od nukleaz do 12 mikrolitrów.Inkubuj reakcję w termocyklerze przez pięć minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Usuń próbki z termocyklera i dodaj cztery mikrolitry buforu odwrotnej transkryptazy, dwa mikrolitry DTT i jeden mikrolitr inhibitora rybonukleazy. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.Dodaj jeden mikrolitr termostabilnej odwrotnej transkryptazy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 50 minut. Dezaktywuj enzym w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 minut. Wykonaj PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, a następnie załaduj od 20 do 25 mikrolitrów produktu PCR na 3% żel agarozowy zawierający barwnik kwasu nukleinowego i uruchom przy napięciu 100 woltów przez około godzinę.Sfotografuj żel, unikając nasycenia pasm, i określ ilościowo prążki za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Pasma w 631, 493 i 156 parach zasad odpowiadają odpowiednio izoformom 13S, 12S i 9S. Z menu Plik oprogramowania otwórz plik obrazu i przekonwertuj go na skalę szarości.Dostosuj jasność i kontrast, a następnie w razie potrzeby usuń szumy odstające. Narysuj prostokąt wokół pierwszego pasa za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokąta i zaznacz go za pomocą polecenia Analizuj, żele i wybierz pierwszy pas lub za pomocą skrótu klawiaturowego. Użyj myszy, aby kliknąć i przytrzymać środek prostokąta na pierwszym pasie ruchu, a następnie przeciągnij go na następny pas.Przejdź do pozycji Analizuj, Żele i wybierz pozycję Następny pas. Powtórz ten krok dla wszystkich pozostałych pasów ruchu. Po podświetleniu i ponumerowaniu wszystkich pasów ruchu przejdź do opcji Analizuj, Żele i Kreśl pasy, aby narysować wykres profilu każdego pasa.Użyj narzędzia do zaznaczania linii prostej, aby narysować linię u podstawy każdego szczytu, odpowiadającą każdemu pasmu, pomijając szum tła. Po tym, jak wszystkie szczyty z każdego pasa zostaną zamknięte, wybierz narzędzie różdżki i kliknij wewnątrz każdego szczytu. Pomiary powinny pojawić się w oknie wyników dla każdego podświetlonego szczytu.Weź pod uwagę tylko szczyty 13S, 12S i 9S odpowiadające pasmom 631, 493 i 156 par zasad. Skopiuj dane dotyczące intensywności do edytora arkuszy kalkulacyjnych i zsumuj intensywność ze wszystkich trzech pasm dla każdej próbki, a następnie oblicz wartość procentową dla każdej izoformy w stosunku do całości. Wykreślić zawartość procentową każdej izoformy lub różnice w procentowej zawartości w stosunku do próbek niepoddanych działaniu substancji.Plazmid zawierający minigen z E1A wykorzystano do obserwacji wpływu na alternatywny splicing poprzez ocenę proporcji mRNA z każdej wytworzonej izoformy. Podstawowa ekspresja wariantów izoform E1A zależała od linii komórkowej i czasu ekspresji E1A. Stabilna linia komórkowa HEK 293 lub miejsce zawierające rekombinazę HEK 293 wykazywała wyższą ekspresję 13S w porównaniu z komórkami HeLa, ale wykazywała podobne poziomy izoform 13S i 12S po 48 godzinach ekspresji E1A.Komórki wystawione na działanie cisplatyny wykazały przesunięcie w pięciu głównych selekcjach splicingu S-S sprzyjających ekspresji 12S. Efekt ten zaobserwowano w HEK 293 stabilnie wyrażającym pusty wektor flagi, a także izoformę jednego z Nek4. Zmiany w alternatywnym splicingu po leczeniu paklitakselem były bardzo dyskretne, ale kierunki zmian były przeciwne w komórkach eksprymujących Flag i Nek4.Podczas wykonywania tego protokołu ważne jest, aby używać nietransfekowanych i nieodwracalnych kontroli transkryptazy, aby uniknąć błędnej interpretacji z endogenną ekspresją E1A, głównie w przypadku korzystania z komórek HEK 293. Po uzyskaniu pozytywnych wyników można ocenić alternatywny splicing określonych genów związanych z odpowiedzią chemioterapeutyczną. Kiedy obserwuje się pewien efekt, ten prosty protokół może skierować te badania na bardziej spójne szlaki, w których białko odgrywa rolę regulującą alternatywny splicing w odpowiedzi na chemioterapię, na przykład.

using-the-e1a-minigene-tool-to-study-mrna-splicing-changes

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Zdarzenia splicingu tandemowego występują w miejscach oddalonych od siebie o mniej niż 12 nukleotydów. Kwantyfikacja proporcji takich wariantów splicingu jest możliwa przy użyciu bezwzględnego ilościowego podejścia PCR. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób można określić ilościowo warianty splicingu genu STAT3, w których dwa zdarzenia splicingu skutkują włączeniem/wykluczeniem Serine-701 i α/β C-końcami.

Łączenie bezwzględnych i względnych ilościowych danych PCR w celu ilościowego określenia transkryptów wariantu splicingu STAT3

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

Klonujemy i analizujemy geny reporterowe generujące koliste RNA. Te geny reporterowe są większe niż konstrukty do analizy splicingu liniowego i zawierają elementy Alu. Aby zbadać koliste RNA, konstrukty są transfekowane do komórek, a otrzymany RNA jest analizowany za pomocą RT-PCR po usunięciu liniowego RNA.

Wykorzystanie pierwiastka aluminiowego zawierającego minigeny do analizy kolistych RNA

Ten artykuł opisuje eksperymentalne procedury (a) zubożenia U1 snRNP z ekstraktów jądrowych, przy jednoczesnej utracie aktywności splicingu; oraz (b) odtworzenia aktywności splicingu w ekstrakcie zubożonym w U1 przez cząstki snRNP galektyny-3 - U1 związane z kulkami kowalencyjnie sprzężonymi z przeciwciałami anty-galektyny-3.

Uzupełnienie aktywności splicingu przez kompleks galektyny-3 - U1 snRNP na kulkach

Alternatywny splicing (AS) i alternatywna poliadenylacja (APA) rozszerzają różnorodność izoform transkryptu i ich produktów. W tym miejscu opisujemy protokoły bioinformatyczne do analizy masowych testów sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania końca 3' w celu wykrycia i wizualizacji AS i APA różniących się w różnych warunkach eksperymentalnych.

Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

Test ACT1-CUP1, test wzrostu miedzi, zapewnia szybki odczyt splicingu prekursorowego informacyjnego RNA (pre-mRNA) i wpływu zmutowanych czynników splicingu na funkcję spliceosomalną. To badanie zawiera protokół i podkreśla możliwe dostosowanie, aby odpowiedzieć na interesujące nas pytanie dotyczące splingu.

Testy ACT1-CUP1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach

Szybkie wykrywanie i wiarygodna ilościowa identyfikacja zdarzeń edycjonujących RNA na skalę genomową pozostają wyzwaniem i obecnie opierają się na bezpośrednich metodach sekwencjonowania RNA. Opisany tutaj protokół wykorzystuje elektroforezę żelową z gradientem mikrotemperatury (μTGGE) jako prostą, szybką i przenośną metodę wykrywania edycji RNA.

Podejście niesekwencjonujące do szybkiego wykrywania edycji RNA

Poznaj metodę minigenu E1A2 do oceny globalnych zmian splicingu mRNA w komórkach HEK 293 po leczeniu chemioterapią. To szybkie i ekonomiczne narzędzie pozwala badać funkcję białek w regulacji alternatywnego splicingu.

Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA

Przeglądaj więcej filmów