Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących wykorzystania minigenu E1A2 do oceny globalnych zmian splicingu mRNA. Jest to szybkie, niedrogie i proste narzędzie do oceny funkcji białka docelowego w alternatywnej regulacji splicingu bez konieczności stosowania specjalnych reżimów lub warunków laboratoryjnych. Zacznij od hodowli komórek HEK 293 ze stabilną ekspresją interesującego genu.

Podziel komórki za pomocą 0,25% trypsyny EDTA, a następnie połóż 300 000 komórek na studzience na sześciodołkowych płytkach i inkubuj je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach sprawdź konfluencję i transfekuj stabilne komórki HEK 293 tylko wtedy, gdy zlewają się w 70 do 80%. Ostrożnie usunąć pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą pipety, a następnie dodać dwa mililitry kompletnej pożywki DMEM bez antybiotyków i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.

Przygotować probówkę z buforem do transfekcji, następnie dodać dwa mikrogramy DNA pMTE1A, odwirować i dodać dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji. Ponownie wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyjmij płytki z inkubatora i ostrożnie dodawaj mieszaninę transfekcji kroplami.

Sześć godzin po transfekcji dodaj tetracyklinę do stabilnych komórek HEK 293 w celu indukcji ekspresji Nek4. 24 godziny po transfekcji sprawdź morfologię komórek i skuteczność transfekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą pipety usuń pożywkę do hodowli komórkowych, a następnie dodaj pożywkę do hodowli komórkowych z chemioterapeutykami.

Inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny. Aby zebrać RNA, wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowej i dodaj 0,5 do 1 mililitra odczynnika do ekstrakcji RNA bezpośrednio do studzienki. Jeśli studzienki są bardzo zlewne, użyj jednego mililitra odczynnika do ekstrakcji RNA, aby poprawić jakość RNA.

Homogenizuj komórki za pomocą pipety i przenieś je do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Natychmiast przystąp do ekstrakcji RNA lub przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić próbki w dygestorii i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Dodaj 0,1 do 0,2 mililitra chloroformu i energicznie mieszaj, a następnie inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, a następnie zebrać górną fazę wodną i przenieść ją do nowej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Zbierz około 60% całkowitej objętości, ale nie zbieraj DNA ani fazy organicznej.

Dodać 0,25 do 0,5 mililitra izopropanolu i czterokrotnie wymieszać próbkę przez odwrócenie. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie odwirować w temperaturze 12 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Przemyć osad RNA dwukrotnie alkoholem etylowym i odwirować w temperaturze 7 500 razy G przez pięć minut, a następnie wyrzucić etanol.

Usuń nadmiar etanolu, odwracając rurkę na ręczniku papierowym, a następnie pozostaw rurkę otwartą w dygestorium, aby częściowo wysuszyć granulki przez pięć do 10 minut. Ponownie zawiesić osad RNA w 15 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC. Określ ilościowo całkowite RNA i zweryfikuj jakość RNA, mierząc absorbancję przy 230, 260 i 280 nanometrach.

Aby zweryfikować całkowitą jakość RNA, uruchom 1% żel agarozowy wstępnie potraktowany 1,2% 2,5% roztworu podchlorynu sodu przez 30 minut. Przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu jednego do dwóch mikrogramów całkowitego RNA. Połącz RNA, jeden mikrolitr oligo d-T, jeden mikrolitr DNTP i wodę wolną od nukleaz do 12 mikrolitrów.

Inkubuj reakcję w termocyklerze przez pięć minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Usuń próbki z termocyklera i dodaj cztery mikrolitry buforu odwrotnej transkryptazy, dwa mikrolitry DTT i jeden mikrolitr inhibitora rybonukleazy. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Dodaj jeden mikrolitr termostabilnej odwrotnej transkryptazy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 50 minut. Dezaktywuj enzym w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 minut. Wykonaj PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, a następnie załaduj od 20 do 25 mikrolitrów produktu PCR na 3% żel agarozowy zawierający barwnik kwasu nukleinowego i uruchom przy napięciu 100 woltów przez około godzinę.

Sfotografuj żel, unikając nasycenia pasm, i określ ilościowo prążki za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Pasma w 631, 493 i 156 parach zasad odpowiadają odpowiednio izoformom 13S, 12S i 9S. Z menu Plik oprogramowania otwórz plik obrazu i przekonwertuj go na skalę szarości.

Dostosuj jasność i kontrast, a następnie w razie potrzeby usuń szumy odstające. Narysuj prostokąt wokół pierwszego pasa za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokąta i zaznacz go za pomocą polecenia Analizuj, żele i wybierz pierwszy pas lub za pomocą skrótu klawiaturowego. Użyj myszy, aby kliknąć i przytrzymać środek prostokąta na pierwszym pasie ruchu, a następnie przeciągnij go na następny pas

Przejdź do pozycji Analizuj, Żele i wybierz pozycję Następny pas. Powtórz ten krok dla wszystkich pozostałych pasów ruchu. Po podświetleniu i ponumerowaniu wszystkich pasów ruchu przejdź do opcji Analizuj, Żele i Kreśl pasy, aby narysować wykres profilu każdego pasa.

Użyj narzędzia do zaznaczania linii prostej, aby narysować linię u podstawy każdego szczytu, odpowiadającą każdemu pasmu, pomijając szum tła. Po tym, jak wszystkie szczyty z każdego pasa zostaną zamknięte, wybierz narzędzie różdżki i kliknij wewnątrz każdego szczytu. Pomiary powinny pojawić się w oknie wyników dla każdego podświetlonego szczytu.

Weź pod uwagę tylko szczyty 13S, 12S i 9S odpowiadające pasmom 631, 493 i 156 par zasad. Skopiuj dane dotyczące intensywności do edytora arkuszy kalkulacyjnych i zsumuj intensywność ze wszystkich trzech pasm dla każdej próbki, a następnie oblicz wartość procentową dla każdej izoformy w stosunku do całości. Wykreślić zawartość procentową każdej izoformy lub różnice w procentowej zawartości w stosunku do próbek niepoddanych działaniu substancji.

Plazmid zawierający minigen z E1A wykorzystano do obserwacji wpływu na alternatywny splicing poprzez ocenę proporcji mRNA z każdej wytworzonej izoformy. Podstawowa ekspresja wariantów izoform E1A zależała od linii komórkowej i czasu ekspresji E1A. Stabilna linia komórkowa HEK 293 lub miejsce zawierające rekombinazę HEK 293 wykazywała wyższą ekspresję 13S w porównaniu z komórkami HeLa, ale wykazywała podobne poziomy izoform 13S i 12S po 48 godzinach ekspresji E1A.

Komórki wystawione na działanie cisplatyny wykazały przesunięcie w pięciu głównych selekcjach splicingu S-S sprzyjających ekspresji 12S. Efekt ten zaobserwowano w HEK 293 stabilnie wyrażającym pusty wektor flagi, a także izoformę jednego z Nek4. Zmiany w alternatywnym splicingu po leczeniu paklitakselem były bardzo dyskretne, ale kierunki zmian były przeciwne w komórkach eksprymujących Flag i Nek4.

Podczas wykonywania tego protokołu ważne jest, aby używać nietransfekowanych i nieodwracalnych kontroli transkryptazy, aby uniknąć błędnej interpretacji z endogenną ekspresją E1A, głównie w przypadku korzystania z komórek HEK 293. Po uzyskaniu pozytywnych wyników można ocenić alternatywny splicing określonych genów związanych z odpowiedzią chemioterapeutyczną. Kiedy obserwuje się pewien efekt, ten prosty protokół może skierować te badania na bardziej spójne szlaki, w których białko odgrywa rolę regulującą alternatywny splicing w odpowiedzi na chemioterapię, na przykład.