Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA

Ten protokół przedstawia szybkie i użyteczne narzędzie do oceny roli białka o niescharakteryzowanej funkcji w alternatywnej regulacji splicingu po leczeniu chemioterapeutycznym.

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących wykorzystania minigenu E1A2 do oceny globalnych zmian splicingu mRNA. Jest to szybkie, niedrogie i proste narzędzie do oceny funkcji białka docelowego w alternatywnej regulacji splicingu bez konieczności stosowania specjalnych reżimów lub warunków laboratoryjnych. Zacznij od hodowli komórek HEK 293 ze stabilną ekspresją interesującego genu.

Podziel komórki za pomocą 0,25% trypsyny EDTA, a następnie połóż 300 000 komórek na studzience na sześciodołkowych płytkach i inkubuj je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach sprawdź konfluencję i transfekuj stabilne komórki HEK 293 tylko wtedy, gdy zlewają się w 70 do 80%. Ostrożnie usunąć pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą pipety, a następnie dodać dwa mililitry kompletnej pożywki DMEM bez antybiotyków i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.

Przygotować probówkę z buforem do transfekcji, następnie dodać dwa mikrogramy DNA pMTE1A, odwirować i dodać dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji. Ponownie wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyjmij płytki z inkubatora i ostrożnie dodawaj mieszaninę transfekcji kroplami.

Sześć godzin po transfekcji dodaj tetracyklinę do stabilnych komórek HEK 293 w celu indukcji ekspresji Nek4. 24 godziny po transfekcji sprawdź morfologię komórek i skuteczność transfekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą pipety usuń pożywkę do hodowli komórkowych, a następnie dodaj pożywkę do hodowli komórkowych z chemioterapeutykami.

Inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny. Aby zebrać RNA, wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowej i dodaj 0,5 do 1 mililitra odczynnika do ekstrakcji RNA bezpośrednio do studzienki. Jeśli studzienki są bardzo zlewne, użyj jednego mililitra odczynnika do ekstrakcji RNA, aby poprawić jakość RNA.

Homogenizuj komórki za pomocą pipety i przenieś je do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Natychmiast przystąp do ekstrakcji RNA lub przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić próbki w dygestorii i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Dodaj 0,1 do 0,2 mililitra chloroformu i energicznie mieszaj, a następnie inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, a następnie zebrać górną fazę wodną i przenieść ją do nowej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Zbierz około 60% całkowitej objętości, ale nie zbieraj DNA ani fazy organicznej.

Dodać 0,25 do 0,5 mililitra izopropanolu i czterokrotnie wymieszać próbkę przez odwrócenie. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie odwirować w temperaturze 12 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Przemyć osad RNA dwukrotnie alkoholem etylowym i odwirować w temperaturze 7 500 razy G przez pięć minut, a następnie wyrzucić etanol.

Usuń nadmiar etanolu, odwracając rurkę na ręczniku papierowym, a następnie pozostaw rurkę otwartą w dygestorium, aby częściowo wysuszyć granulki przez pięć do 10 minut. Ponownie zawiesić osad RNA w 15 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC. Określ ilościowo całkowite RNA i zweryfikuj jakość RNA, mierząc absorbancję przy 230, 260 i 280 nanometrach.

Aby zweryfikować całkowitą jakość RNA, uruchom 1% żel agarozowy wstępnie potraktowany 1,2% 2,5% roztworu podchlorynu sodu przez 30 minut. Przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu jednego do dwóch mikrogramów całkowitego RNA. Połącz RNA, jeden mikrolitr oligo d-T, jeden mikrolitr DNTP i wodę wolną od nukleaz do 12 mikrolitrów.

Inkubuj reakcję w termocyklerze przez pięć minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Usuń próbki z termocyklera i dodaj cztery mikrolitry buforu odwrotnej transkryptazy, dwa mikrolitry DTT i jeden mikrolitr inhibitora rybonukleazy. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Dodaj jeden mikrolitr termostabilnej odwrotnej transkryptazy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 50 minut. Dezaktywuj enzym w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 minut. Wykonaj PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, a następnie załaduj od 20 do 25 mikrolitrów produktu PCR na 3% żel agarozowy zawierający barwnik kwasu nukleinowego i uruchom przy napięciu 100 woltów przez około godzinę.

Sfotografuj żel, unikając nasycenia pasm, i określ ilościowo prążki za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Pasma w 631, 493 i 156 parach zasad odpowiadają odpowiednio izoformom 13S, 12S i 9S. Z menu Plik oprogramowania otwórz plik obrazu i przekonwertuj go na skalę szarości.

Dostosuj jasność i kontrast, a następnie w razie potrzeby usuń szumy odstające. Narysuj prostokąt wokół pierwszego pasa za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokąta i zaznacz go za pomocą polecenia Analizuj, żele i wybierz pierwszy pas lub za pomocą skrótu klawiaturowego. Użyj myszy, aby kliknąć i przytrzymać środek prostokąta na pierwszym pasie ruchu, a następnie przeciągnij go na następny pas

Przejdź do pozycji Analizuj, Żele i wybierz pozycję Następny pas. Powtórz ten krok dla wszystkich pozostałych pasów ruchu. Po podświetleniu i ponumerowaniu wszystkich pasów ruchu przejdź do opcji Analizuj, Żele i Kreśl pasy, aby narysować wykres profilu każdego pasa.

Użyj narzędzia do zaznaczania linii prostej, aby narysować linię u podstawy każdego szczytu, odpowiadającą każdemu pasmu, pomijając szum tła. Po tym, jak wszystkie szczyty z każdego pasa zostaną zamknięte, wybierz narzędzie różdżki i kliknij wewnątrz każdego szczytu. Pomiary powinny pojawić się w oknie wyników dla każdego podświetlonego szczytu.

Weź pod uwagę tylko szczyty 13S, 12S i 9S odpowiadające pasmom 631, 493 i 156 par zasad. Skopiuj dane dotyczące intensywności do edytora arkuszy kalkulacyjnych i zsumuj intensywność ze wszystkich trzech pasm dla każdej próbki, a następnie oblicz wartość procentową dla każdej izoformy w stosunku do całości. Wykreślić zawartość procentową każdej izoformy lub różnice w procentowej zawartości w stosunku do próbek niepoddanych działaniu substancji.

Plazmid zawierający minigen z E1A wykorzystano do obserwacji wpływu na alternatywny splicing poprzez ocenę proporcji mRNA z każdej wytworzonej izoformy. Podstawowa ekspresja wariantów izoform E1A zależała od linii komórkowej i czasu ekspresji E1A. Stabilna linia komórkowa HEK 293 lub miejsce zawierające rekombinazę HEK 293 wykazywała wyższą ekspresję 13S w porównaniu z komórkami HeLa, ale wykazywała podobne poziomy izoform 13S i 12S po 48 godzinach ekspresji E1A.

Komórki wystawione na działanie cisplatyny wykazały przesunięcie w pięciu głównych selekcjach splicingu S-S sprzyjających ekspresji 12S. Efekt ten zaobserwowano w HEK 293 stabilnie wyrażającym pusty wektor flagi, a także izoformę jednego z Nek4. Zmiany w alternatywnym splicingu po leczeniu paklitakselem były bardzo dyskretne, ale kierunki zmian były przeciwne w komórkach eksprymujących Flag i Nek4.

Podczas wykonywania tego protokołu ważne jest, aby używać nietransfekowanych i nieodwracalnych kontroli transkryptazy, aby uniknąć błędnej interpretacji z endogenną ekspresją E1A, głównie w przypadku korzystania z komórek HEK 293. Po uzyskaniu pozytywnych wyników można ocenić alternatywny splicing określonych genów związanych z odpowiedzią chemioterapeutyczną. Kiedy obserwuje się pewien efekt, ten prosty protokół może skierować te badania na bardziej spójne szlaki, w których białko odgrywa rolę regulującą alternatywny splicing w odpowiedzi na chemioterapię, na przykład.