Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie dwóch głównych populacji komórek uzyskanych z próbek biopsji mięśni ludzkich z wysoką wydajnością i wydajnością, aby umożliwić ocenę specyficznych markerów fenotypowych i czynników transkrypcyjnych. Osiąga się to poprzez pierwszą dysocjację, próbkę biopsji mięśni ludzkich do zawiesiny pojedynczej komórki w drugim etapie. Po siedmiodniowej hodowli komórki są rozdzielane za pomocą immunomagnetycznych kulek sortujących się na CD 56 dodatnie, które są komórkami miogennymi i frakcje ujemne CD 56, które są fibroblastami.

Komórki są następnie barwione i obrazowane pod kątem pożądanych markerów fenotypowych i białkowych. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna i ilościowa analiza obrazu mogą być wykorzystane do pomiaru intensywności wybranych zlokalizowanych jądrowych czynników transkrypcyjnych w posortowanych populacjach komórek. Głównymi zaletami tej techniki, która wykorzystuje immunomagnetyczne sortowanie komórek w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, jest to, że jest delikatna, umożliwia doskonałe sortowanie ludzkich pierwotnych komórek mięśniowych z wysoką wydajnością i żywotnością oraz może być wykonana szybko.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zwiększenia naszego zrozumienia komórkowych podstaw zwyrodnienia mięśni tłuszczowych obserwowanego w starzeniu się, a także w wielu patologiach mięśni Aby wyizolować komórki prekursorowe pochodzące z mięśni tak szybko, jak to możliwe po uzyskaniu biopsji. Najpierw określ masę próbki tkanki, a następnie kilkakrotnie napęcznij mięsień w podłożu podstawowym, aby zmyć próbkę z nadmiaru krwi. Pozostaw mięśnie w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 sekund, a następnie odessaj z probówki wszystko, z wyjątkiem ostatnich dwóch do trzech mililitrów pożywki.

Następnie odwróć rurkę na sterylną szalkę Petriego, aby pozostały płyn mógł przenieść mięsień na szalkę. Teraz oczyść próbkę z wszelkich widocznych kawałków widocznego tłuszczu lub tkanki łącznej. Następnie obróć naczynie, aby zmobilizować pozostałe media, a następnie odessaj wszystkie media i dodaj trzy mililitry jednego roztworu kolagenazy i enzymu disbe na 100 do 400 miligramów tkanki i pokrój próbkę mięśni na bardzo małe kawałki sześcienne o wielkości od jednego do dwóch milimetrów.

Gdy próbka jest wystarczająco rozdrobniona. Użyj szerokiej pipety o pojemności 25 mililitrów, aby przenieść fragmenty tkanek i roztwór enzymatyczny do sterylnej stożkowej probówki o pojemności od 10 do 20 mililitrów. Umyj płytkę kolejnymi trzema mililitrami roztworu enzymu, a następnie użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść pozostałe fragmenty mięśni do probówki.

Umieść probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 60 minut. Ponowne pobieranie zawiesiny tkankowej co 15 minut za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów. Następnie zakończ dysocjację enzymatyczną za pomocą co najmniej równoważnej ilości świeżo podgrzanej pożywki wzrostowej.

Następnie przepuść zawiesinę komórek przez filtr o średnicy 100 mikrometrów, aby usunąć wszelkie duże kawałki zanieczyszczeń, a następnie odwiruj resztki komórek. Zawiesić osad w siedmiu do ośmiu mililitrach pożywki wzrostowej, a następnie inkubować komórki w niepowlekanej kolbie do hodowli tkankowych T 25. 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez siedem dni.

Pod koniec tygodnia trypsyna obserwuje monowarstwę komórek przez trzy minuty. Kiedy komórki się odłączą, dodaj od pięciu do 10 mililitrów wzrostu mięśni szkieletowych, pożywkę, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu i rozpylić komórki przez odwirowanie. Następnie po zliczeniu zarezerwuj niektóre komórki do scharakteryzowania markerów linii komórkowej i umyj pozostałe komórki w 15 mililitrach wzmocnienia wirówki PBS.

Tym razem ponownie zanurz granulat w 170 mikrolitrach maksymalnego bufora sortującego o temperaturze pokojowej i delikatnie odpipetuj do resus. Zawieś komórki w 35 mikrolitrach dobrze wymieszanych mikrokulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem anty CD 56. Wymieszaj roztwór komórkowy kilka razy pipetą i inkubuj mieszaninę przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatną roślinnością.

W połowie drogi po inkubacji przemyć komórkę i roztwór kulek 10 mililitrami wirówki buforowej do sortowania i reus. Zawieś granulat w jednym mililitrze świeżego bufora do sortowania. Następnie nasmaruj filtr i kolumnę separacji wstępnej 500 mikrolitrami buforu zasilającego.

A następnie natychmiast wymieszaj i przenieś cały mililitr zawiesiny komórek przez filtr separacji wstępnej i do kolumny, przepłucz kolumnę trzykrotnie jednym mililitrem myjki do płukania buforem zasilającym, zbierając frakcję fibroblastów niezatrzymujących, przechodząc przez kolumnę do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów zawierającej niewielką ilość pożywki wzrostowej. Następnie wyjmij kolumnę z magnesu i wciśnij tłok w górną część kolumny, aby zebrać dodatnią frakcję komórek CD 56. W oddzielnej stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów zawierającej ciepły wzrost, z tego etapu emitowane jest średnie podłoże

Jeśli ma zostać przeprowadzone podwójne sortowanie, zastanów się nad dodatnimi i ujemnymi zebranymi frakcjami komórek. Jeśli w celu uzyskania dodatkowej czystości wymagane jest podwójne pozyskiwanie, nie należy umieszczać pożywki w probówce z dodatnim wynikiem CD 56 przy pierwszym sortowaniu, ale powtórzyć kroki, zaczynając od smarowania filtra i kolumny w odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym. Utrwalić dodatnie kultury komórkowe CD 56 w ich pożywce, używając równoważnej objętości lodowatego, 8% para formaldehydu.

10 minut z łagodną roślinnością. Następnie odessać utrwalacz i dwukrotnie przemyć komórki PBS w celu immunobarwienia antygenów powierzchniowych komórek. Zablokuj komórki na co najmniej godzinę w 1% BSA w PBS, a następnie oznacz komórki odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie drugorzędowymi.

Zoptymalizuj wzmocnienie detektora, moc lasera i ustawienia ekspozycji odpowiednie dla Twojego mikroskopu i barwienia. Przed obrazowaniem komórki wykonują obrazy komórek w żądanej liczbie kanałów detekcji i w więcej niż sześciu różnych polach widzenia. Do analizy otwórz odpowiednie pliki obrazów TIFF i przeciągnij obrazy jeden na drugi, aby nałożyć odpowiednie odpowiednie kanały.

Każdy kanał pojawi się jako osobna warstwa w panelu warstw. Następnie w oknie analizy wybierz punkty danych, a następnie niestandardowe i wybierz żądane pomiary. Aby przeanalizować intensywność fluorescencji jądrowej, otwórz okno dialogowe zakresu kolorów i wybierz próbkowane kolory z menu rozwijanego.

Następnie, trzymając Shift, wybierz tony charakterystyczne dla oznaczonych jąder. Kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać tę maskę wyboru zakresu kolorów do użycia z innymi obrazami wybranymi w tej samej sesji. Po wybraniu jąder napisz klik i wybierz wypełnienie.

Następnie wybierz z menu rozwijanego i potwierdź, że krycie jest ustawione na 100%Następnie kliknij wybierz i odwróć. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i ponownie wybierz Wypełnij i wybierz białe wypełnienie z menu rozwijanego. Wykonaj algorytm przełomowy, aby oddzielić częściowo nakładające się jądra na teraz podwójnej warstwie jądrowej.

Przejdź do wyboru, a następnie zakres kolorów, a następnie cienie, aby wybrać poszczególne oddzielone jądra. Następnie przenieś zaznaczenie na warstwę zawierającą 16-bitowy obraz w skali szarości żądanego znacznika i kliknij przycisk Zapisz pomiary. Na koniec należy wyeksportować wybrane pomiary jako pliki tekstowe do odpowiedniego oprogramowania analitycznego w celu dalszej obróbki oleju.

Barwienie na czerwono oczyszczonych populacji komórek w połączeniu z barwieniem immunologicznym dla markerów linii adipogennej i miogennej ujawnia, że tylko frakcja fibroblastów jest zdolna do różnicowania epigenicznego z masowym nagromadzeniem tłuszczu przez fibroblasty widocznym gołym okiem i z dalszym wykazaniem ich całkowitej transformacji przez silną ekspresję jądrowego PPAR gamma przez te komórki do 15 dnia leczenia, komórki te uwolniły pozostały antygen tkanki łącznej TE 7A na swój substrat. W przeciwieństwie do tego, komórki miogenne utrzymują swój normalny fenotyp, w tym ekspresję łańcucha ciężkiego desminy i miozyny bez regulacji w górę ekspresji jądrowej PPAR gamma. Na tym rysunku przedstawiono przykład analizy ilościowej pola dodatnich komórek miogennych Desmonda oraz pola, z którego uzyskano te dane, ilustrując zmienność ekspresji miogennej w poszczególnych jądrach w tej określonej gęstości wysiewu i punkcie czasowym.

Na tym wykresie pokazano użyteczność metody do bezpośredniego porównywania poziomów czynników transkrypcyjnych w różnych typach komórek na poziomie komórki. Na przykład te CD 56-ujemne fibroblasty mięśniowe wyrażają wysoki poziom jądrowego adipogennego czynnika transkrypcyjnego, PPAR gamma, podczas gdy różne komórki miogenne CD 56 dodatnie utrzymują tylko bardzo niski poziom czynnika transkrypcyjnego receptora jądrowego po ekspozycji na pożywkę indukującą adipocyty. Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się biologią mięśni badać mechanizmy decyzji o losie komórek w zdrowych lub patologicznych próbkach mięśni ludzkich.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć po pierwsze dobre zrozumienie, jak uzyskać wysoką wydajność oczyszczonych i dobrze scharakteryzowanych komórek pochodzących z ludzkich mięśni, a po drugie, jak przeprowadzić obiektywną analizę ilościową składników komórkowych zidentyfikowanych za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.