Name: Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj izolację komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych przy użyciu sortowania immunomagnetycznego CD56. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność i żywotność komórek do analizy markerów fenotypowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Carlowi Hobbsowi i Lindsey Majoram za ich pomoc techniczną, a profesorowi Patowi Doherty'emu za korzystanie z urządzeń mikroskopowych. Dr Agley był wspierany przez stypendium z King's College London. Potwierdza się również finansowanie z Spurrell Trust.

<ol><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibres.</a> J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Hawke, T. J., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+satellite+cells%3A+physiology+to+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology.</a> J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).</li>
<li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+and+the+Muscle+Stem+Cell+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche.</a> Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).</li>
<li>Alsharidah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+muscle+precursor+cells+obtained+from+young+and+old+donors+produce+similar+proliferative%2C+differentiation+and+senescent+profiles+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture.</a> Aging Cell. 12, 333-344 (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fibroblasts%2C+but+not+myogenic+cells%2C+readily+undergo+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation.</a> J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138, 3625-3637 (2011).</li>
<li>Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+myoblasts+with+the+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter.</a> Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).</li>
<li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J. Vis Exp. , e50074(2013).</li>
<li>Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Self-Renewal+and+Commitment+of+Satellite+Stem+Cells+in+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle.</a> Cell. 129, 999-1010 (2007).</li>
<li>Mackey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+satellite+cell+number+and+activity+status+in+human+skeletal+muscle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+a+d+Nerve%22%5BJournal%5D)">Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies.</a> Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).</li>
<li>Stewart, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proliferating+human+skeletal+muscle-derived+cells+in+vitro%3A+Differential+modulation+of+myoblast+markers+by+TGF-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2.</a> J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).</li>
<li>Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11, 231-238 (1990).</li>
<li>Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+C+%22Metastasis+Research+Protocols%22">Metastasis Research Protocols</a>. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Image+Analysis+Method+for+the+Precise+Selection+and+Quantitation+of+Fluorescently+Labeled+Cellular+Constituents%3A+Application+to+the+Measurement+of+Human+Muscle+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).</li>
<li>Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDanoviz%2C+M+%22Myogenesis%22">Myogenesis</a>. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).</li>
<li>Bergström, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man.+Determined+by+neutron+activation+analysis+on+needle+biopsy+specimens.+A+study+on+normal+subjects%2C+kidney+patients%2C+and+patients+with+chronic+diarrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).</li>
<li>Chazaud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+attract+monocytes+and+use+macrophages+as+a+support+to+escape+apoptosis+and+enhance+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth.</a> The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).</li>
<li>Abou-Khalil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+and+Paracrine+Angiopoietin+1%2FTie-2+Signaling+Promotes+Muscle+Satellite+Cell+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal.</a> Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).</li>
<li>Timpl, R., Kvonder Mark, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+fibronectin+in+selecting+myogenic+versus+fibrogenic+cells+from+skeletal+muscle+cells+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in.</a> 117, 628-635 (1986).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Meth. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+O+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+quantitative+colocalization+analysis%3A+Focus+on+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).</li>
<li>Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+seeing+is+not+believing%3A+improving+the+visibility+of+your+fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+39+steps%3A+A+cautionary+tale+of+quantitative+3-D+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy.</a> Biotechniques. 28, 884-887 (2000).</li>
<li>Bolte, S., Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li>
<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+-+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls.</a> J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Bareja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Mouse+Skeletal+Muscle+Stem+Cells%3A+Convergent+and+Divergent+Mechanisms+of+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis.</a> PLoS ONE. 9, e90398(2014).</li>
<li>Castiglioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Progenitors+that+Exhibit+Myogenic%2FOsteogenic+Bipotency+In+by+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting+from+Human+Fetal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle.</a> Stem Cell Reports. 2, 560(2014).</li>
<li>Fukada, S. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90-positive+cells%2C+an+additional+cell+population%2C+produce+laminin+%CE%B12+upon+transplantation+to+dy3k%2Fdy3k+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice.</a> Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).</li>
<li>Stickland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+development+in+the+human+fetus+as+exemplified+by+m.+sartorius%3A+a+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study.</a> J. Anat. 132, 557-579 (1981).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisaliśmy procedurę sortowania immunomagentycznego w celu selektywnego wzbogacania prekursorów pochodzących z ludzkich mięśni z małych próbek materiału do biopsji mięśni. Technika ta okazała się nieoceniona w naszym laboratorium w przezwyciężaniu utraty kultur pochodzących z ludzkich mięśni na rzecz fibroblastów, ale także w zrozumieniu unikalnego zachowania różnych populacji przodków pochodzących z mięśni. Po oczyszczeniu komórki miogenne mogą być badane pod kątem zmian w ekspresji białek i/lub genów lub wykorzystywane...

Naprawa i regeneracja mięśni szkieletowych wymaga działania komórek satelitarnych1, miogennych komórek macierzystych2,3. In vivo komórki te istnieją w odwracalnym stanie spoczynku zlokalizowanym między sarkolemmą a blaszką podstawną każdego włókna mięśniowego, ale stają się aktywowane do proliferacji, łączenia i różnicowania w miarę uszkodzenia, naprawy i regeneracji tkanki mięśniowej3. Komórki satelitarne można wyizolować z próbek biopsji mięśni ludzkich u młodych i starszych osób za pomocą trawienia enzymatycznego4, a następnie badać ich właściwości miogenne w hodowli pierwotnej5. Skuteczność tego procesu izolacji zarówno w odniesieniu do wydajności, jak i czystości populacji komórek zależy od zastosowanych metod i może się różnić w zależności od próbki. Dwa główne typy komórek adherentnych uzyskane z trawienia enzymatycznego to komórki satelitarne (obecnie nazywane komórkami miogennymi lub komórkami prekursorowymi mięśni), zidentyfikowane początkowo jako komórki CD56 + / desmina oraz fibroblasty pochodzące z mięśni, zidentyfikowane jako komórki CD56 i TE7 + 5. Fibroblasty mają szybkie tempo proliferacji i nie ulegają nieodwracalnemu zatrzymaniu wzrostu i końcowemu różnicowaniu w kontakcie komórka-komórka, jak komórki miogenne; Tak więc w populacjach mieszanych fibroblasty mogą przejechać komórki miogenne, aby zdominować hodowlę.
Fibroblasty były często postrzegane jako podrażnienie dla biologów mięśniowych, jednak obecnie rośnie zainteresowanie fibroblastami jako komórkami wartymi zbadania samo w sobie, szczególnie że wykazano, że odgrywają one rolę współpracy z komórkami miogennymi podczas naprawy mięśni6. Izolacja i oczyszczanie różnych typów komórek z ludzkich mięśni jest zatem ważnym czynnikiem metodologicznym przy próbie zbadania wrodzonego zachowania obu typów komórek w hodowli. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) to metoda, za pomocą której komórki mogą być sortowane do dalszych badań i/lub liczone i analizowane. Wykazano, że FACS niezawodnie wzbogaca ludzkie komórki miogenne, ale wydajność komórek do późniejszej hodowli nie była do tej pory wysoka7. Biorąc pod uwagę ograniczony potencjał replikacyjny komórek somatycznych, takich jak komórki miogenne pochodzące z komórek satelitarnych, oraz bardzo słabą proliferację i różnicowanie związane ze starzeniemsię 4, wymagane są łagodniejsze podejścia. Hodowle pojedynczych włókien mięśniowych oferują inny, mniej agresywny sposób pozyskiwania mysich komórek satelitarnych, które nadal znajdują się w swojej niszy sublaminalnej i po ich aktywacji w hodowli8,9. Jednak często nie jest to możliwe z materiału do biopsji mięśni ludzkich (ponieważ włókna rzadko można uzyskać od ścięgna do ścięgna), co oznacza, że technika ta może nie być dostępna dla wielu laboratoriów badawczych zainteresowanych badaniem komórek pochodzących z ludzkich mięśni. Co więcej, technika pojedynczego włókna zapewnia tylko bardzo ograniczoną liczbę komórek.
Tutaj opisujemy system sortowania oparty na delikatnym trawieniu enzymatycznym komórek za pomocą kolagenazy i dyspazy, po którym następują dwie kolejne rundy magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (MACS), co daje zarówno wysoką czystość (>95% komórek miogennych), jak i wydajność (~2,8 x 10>6 ± 8,87 x 105 komórek/g tkanki) do eksperymentów w hodowli. CD56 jest uważany za złoty standard markera powierzchniowego do identyfikacji ludzkich komórek satelitarnych in situ10 i in vitro11 i stanowi idealnego kandydata na marker powierzchniowy do mocowania kulek. W tym podejściu przeciwciała CD56 sprzężone z tlenkiem żelaza i kulkami superparamagnetycznymi zawierającymi polisacharydy są wiązane z komórkami i przechodzą przez kolumnę do separacji komórek magnetycznych o wysokim gradiencie, umieszczoną w silnym polu magnetycznym12,13. Kolumny separacyjne wypełnione są matrycą z ferromagnetycznej wełny stalowej lub kulek żelaznych, które służą do skupiania linii pola magnetycznego w kierunku ich powierzchni, generując silne gradienty pola magnetycznego (~4tesla)14. W kolumnach tych nawet lekko magnetyczne komórki są przyciągane i adsorbowane do ich powierzchni14. Komórki niezwiązane (CD56\u2012) przechodzą przez kolumnę, natomiast komórki CD56+ znakowane mikrokulkami magnetycznymi są zatrzymywane do momentu usunięcia z pola magnetycznego12,15.
Zawiesiny komórek z dowolnego etapu procesu sortowania mogą być powlekane z pożądaną gęstością do dalszych eksperymentów. Po danej interwencji składniki komórkowe można zidentyfikować za pomocą immunocytochemii, zobrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szerokokątnej lub konfokalnej i przeanalizować ilościowo przy użyciu podejścia do analizy obrazu, które umożliwia szybki obiektywny pomiar wszystkich znakowanych komórek na dowolnym obrazie. W naszym laboratorium zastosowaliśmy to podwójne sortowanie immunomagnetyczne, a następnie analizę obrazu16, aby wykazać, że CD56 – ludzkie fibroblasty łatwo różnicują się w adipocyty, podczas gdy komórki miogenne pochodzenia satelitarnego są wysoce odporne na tę konwersję adipogenną5.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza&nbsp; D</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11088866001</tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td>Przed użyciem należy wysterylizować filtrem</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA(</td><td>Gibco) Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>100 &#956; m sitko komórkowe</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kolagenu (3 mg/ml w 0,1% kwasie octowym)</td><td>Sigma, Dorset, Wielka Brytania</td><td>C8919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Minisart SRP15 (0,2 &#956; m)</td> <td>Sartorius</td><td>17573ACK</td><td>Membrana politetrafluoroetylenowa (PTFE)</td></tr><tr><td>CD56 ludzkie mikrogranulki</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-401</td><td>Należy pamiętać o ograniczonym okresie trwałości mikrogranulek</td></tr><tr><td>Mikrogranulki antyfibroblastowe, ludzkie</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtry do separacji wstępnej</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny wielkokomórkowe</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-202</td><td>Kolumny te są wyposażone w rezystor przepływu. Użycie rezystora przepływowego nie jest konieczne do uzyskania opisanej tutaj wysokiej czystości miogenicznej.</td></tr><tr><td>Kolumny LS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separator MiniMacs</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>Ten separator pasuje do kolumny o dużej komórki, ale nie do kolumny LS.&nbsp;</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotech&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Wielostanowiskowy MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td></td><td>Przed użyciem należy wysterylizować filtr</td></tr><tr><td>Czerwony O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan trietylu</td><td>Sigma</td><td>538728</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper</td><td>Sigma</td><td>Z241121-1PAK</td><td>Nr 42, bezpopiołowy. Aby przygotować filtr, złóż okrągłą bibułę filtracyjną, aby utworzyć półkole, a następnie ponownie złóż półkole na pół, aby utworzyć kształt stożka. Dopasuj stożek do lejka w celu filtrowania.&nbsp;</td></tr><tr><td>Odczynnik molekularny</td> <td>ProLong Gold Antifade</td>, Invitrogen <td>P36930</td><td>Można go kupić z DAPI lub bez i nie gasi początkowej fluorescencji.</td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Carl Zeiss</td><td>Kontakt Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Extended</td><td>Adobe (zakupiony w Pugh Computers)</td><td>ADPH16982*&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Naprawa i regeneracja mięśni szkieletowych wymaga działania komórek satelitarnych, które są rezydującymi komórkami macierzystymi mięśni. Można je wyizolować z próbek biopsji mięśni ludzkich za pomocą trawienia enzymatycznego, a ich właściwości miogenne badano w hodowli. Ilościowo, dwa główne typy komórek adhezyjnych uzyskane z trawienia enzymatycznego to: (i) komórki satelitarne (zwane komórkami miogennymi lub komórkami prekursorowymi mięśni), zidentyfikowane początkowo jako CD56 +, a później jako komórki CD56 + / desmina + oraz (ii) fibroblasty pochodzące z mięśni, zidentyfikowane jako CD56- i TE-7 +. Fibroblasty namnażają się bardzo wydajnie w hodowli, a w mieszanych populacjach komórek komórki te mogą przełamywać komórki miogenne, aby zdominować hodowlę. Izolacja i oczyszczanie różnych typów komórek z ludzkich mięśni jest zatem ważnym czynnikiem metodologicznym przy próbie zbadania wrodzonego zachowania każdego typu komórki w hodowli. Tutaj opisujemy system sortowania oparty na delikatnym trawieniu enzymatycznym komórek za pomocą kolagenazy i dyspazy, a następnie sortowaniu komórek aktywowanych magnetycznie (MACS), co daje zarówno wysoką czystość (>95% komórek miogennych), jak i dobrą wydajność (~2,8 x 106 ± 8,87 x 105 komórek/g tkanki po 7 dniach in vitro) do eksperymentów w hodowli. Podejście to opiera się na inkubacji mieszanej populacji komórek pochodzących z mięśni za pomocą mikrokulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem przeciwko CD56, a następnie przepuszczaniu komórek przez pole magnetyczne. Komórki CD56 + związane z mikrokulkami są zatrzymywane przez pole, podczas gdy komórki CD56 przechodzą bez przeszkód przez kolumnę. Zawiesiny komórek z dowolnego etapu procesu sortowania mogą być powlekane i hodowane. Po danej interwencji morfologię komórki oraz ekspresję i lokalizację białek, w tym jądrowych czynników transkrypcyjnych, można określić ilościowo za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego za pomocą specyficznych przeciwciał oraz pakietu do przetwarzania i analizy obrazu.

Oczyszczone komórki miogenne oraz fibroblasty można hodować w medium do różnicowania adipogennego przez trzy dni, a następnie w medium odżywczym do adipogenezy przez okres od 7 do 30 dni, aby ocenić ich potencjał do adipogenezy. Wykorzystując oczyszczone populacje komórek, barwienie Oil Red O w połączeniu z immunobarwieniem markerów linii adipogennej i miogennej wykazało, że tylko frakcja fibroblastów była zdolna do różnicowania adipogennego (Rysunek 2). Masywna akumulacja tłuszczu przez fibroblasty jest...

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie dwóch głównych populacji komórek uzyskanych z próbek biopsji mięśni ludzkich z wysoką wydajnością i wydajnością, aby umożliwić ocenę specyficznych markerów fenotypowych i czynników transkrypcyjnych. Osiąga się to poprzez pierwszą dysocjację, próbkę biopsji mięśni ludzkich do zawiesiny pojedynczej komórki w drugim etapie. Po siedmiodniowej hodowli komórki są rozdzielane za pomocą immunomagnetycznych kulek sortujących się na CD 56 dodatnie, które są komórkami miogennymi i frakcje ujemne CD 56, które są fibroblastami.Komórki są następnie barwione i obrazowane pod kątem pożądanych markerów fenotypowych i białkowych. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna i ilościowa analiza obrazu mogą być wykorzystane do pomiaru intensywności wybranych zlokalizowanych jądrowych czynników transkrypcyjnych w posortowanych populacjach komórek. Głównymi zaletami tej techniki, która wykorzystuje immunomagnetyczne sortowanie komórek w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, jest to, że jest delikatna, umożliwia doskonałe sortowanie ludzkich pierwotnych komórek mięśniowych z wysoką wydajnością i żywotnością oraz może być wykonana szybko.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zwiększenia naszego zrozumienia komórkowych podstaw zwyrodnienia mięśni tłuszczowych obserwowanego w starzeniu się, a także w wielu patologiach mięśni Aby wyizolować komórki prekursorowe pochodzące z mięśni tak szybko, jak to możliwe po uzyskaniu biopsji. Najpierw określ masę próbki tkanki, a następnie kilkakrotnie napęcznij mięsień w podłożu podstawowym, aby zmyć próbkę z nadmiaru krwi. Pozostaw mięśnie w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 sekund, a następnie odessaj z probówki wszystko, z wyjątkiem ostatnich dwóch do trzech mililitrów pożywki.Następnie odwróć rurkę na sterylną szalkę Petriego, aby pozostały płyn mógł przenieść mięsień na szalkę. Teraz oczyść próbkę z wszelkich widocznych kawałków widocznego tłuszczu lub tkanki łącznej. Następnie obróć naczynie, aby zmobilizować pozostałe media, a następnie odessaj wszystkie media i dodaj trzy mililitry jednego roztworu kolagenazy i enzymu disbe na 100 do 400 miligramów tkanki i pokrój próbkę mięśni na bardzo małe kawałki sześcienne o wielkości od jednego do dwóch milimetrów.Gdy próbka jest wystarczająco rozdrobniona. Użyj szerokiej pipety o pojemności 25 mililitrów, aby przenieść fragmenty tkanek i roztwór enzymatyczny do sterylnej stożkowej probówki o pojemności od 10 do 20 mililitrów. Umyj płytkę kolejnymi trzema mililitrami roztworu enzymu, a następnie użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść pozostałe fragmenty mięśni do probówki.Umieść probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 60 minut. Ponowne pobieranie zawiesiny tkankowej co 15 minut za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów. Następnie zakończ dysocjację enzymatyczną za pomocą co najmniej równoważnej ilości świeżo podgrzanej pożywki wzrostowej.Następnie przepuść zawiesinę komórek przez filtr o średnicy 100 mikrometrów, aby usunąć wszelkie duże kawałki zanieczyszczeń, a następnie odwiruj resztki komórek. Zawiesić osad w siedmiu do ośmiu mililitrach pożywki wzrostowej, a następnie inkubować komórki w niepowlekanej kolbie do hodowli tkankowych T 25. 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez siedem dni.Pod koniec tygodnia trypsyna obserwuje monowarstwę komórek przez trzy minuty. Kiedy komórki się odłączą, dodaj od pięciu do 10 mililitrów wzrostu mięśni szkieletowych, pożywkę, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu i rozpylić komórki przez odwirowanie. Następnie po zliczeniu zarezerwuj niektóre komórki do scharakteryzowania markerów linii komórkowej i umyj pozostałe komórki w 15 mililitrach wzmocnienia wirówki PBS.Tym razem ponownie zanurz granulat w 170 mikrolitrach maksymalnego bufora sortującego o temperaturze pokojowej i delikatnie odpipetuj do resus. Zawieś komórki w 35 mikrolitrach dobrze wymieszanych mikrokulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem anty CD 56. Wymieszaj roztwór komórkowy kilka razy pipetą i inkubuj mieszaninę przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatną roślinnością.W połowie drogi po inkubacji przemyć komórkę i roztwór kulek 10 mililitrami wirówki buforowej do sortowania i reus. Zawieś granulat w jednym mililitrze świeżego bufora do sortowania. Następnie nasmaruj filtr i kolumnę separacji wstępnej 500 mikrolitrami buforu zasilającego.A następnie natychmiast wymieszaj i przenieś cały mililitr zawiesiny komórek przez filtr separacji wstępnej i do kolumny, przepłucz kolumnę trzykrotnie jednym mililitrem myjki do płukania buforem zasilającym, zbierając frakcję fibroblastów niezatrzymujących, przechodząc przez kolumnę do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów zawierającej niewielką ilość pożywki wzrostowej. Następnie wyjmij kolumnę z magnesu i wciśnij tłok w górną część kolumny, aby zebrać dodatnią frakcję komórek CD 56. W oddzielnej stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów zawierającej ciepły wzrost, z tego etapu emitowane jest średnie podłoże.Jeśli ma zostać przeprowadzone podwójne sortowanie, zastanów się nad dodatnimi i ujemnymi zebranymi frakcjami komórek. Jeśli w celu uzyskania dodatkowej czystości wymagane jest podwójne pozyskiwanie, nie należy umieszczać pożywki w probówce z dodatnim wynikiem CD 56 przy pierwszym sortowaniu, ale powtórzyć kroki, zaczynając od smarowania filtra i kolumny w odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym. Utrwalić dodatnie kultury komórkowe CD 56 w ich pożywce, używając równoważnej objętości lodowatego, 8% para formaldehydu.10 minut z łagodną roślinnością. Następnie odessać utrwalacz i dwukrotnie przemyć komórki PBS w celu immunobarwienia antygenów powierzchniowych komórek. Zablokuj komórki na co najmniej godzinę w 1% BSA w PBS, a następnie oznacz komórki odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie drugorzędowymi.Zoptymalizuj wzmocnienie detektora, moc lasera i ustawienia ekspozycji odpowiednie dla Twojego mikroskopu i barwienia. Przed obrazowaniem komórki wykonują obrazy komórek w żądanej liczbie kanałów detekcji i w więcej niż sześciu różnych polach widzenia. Do analizy otwórz odpowiednie pliki obrazów TIFF i przeciągnij obrazy jeden na drugi, aby nałożyć odpowiednie odpowiednie kanały.Każdy kanał pojawi się jako osobna warstwa w panelu warstw. Następnie w oknie analizy wybierz punkty danych, a następnie niestandardowe i wybierz żądane pomiary. Aby przeanalizować intensywność fluorescencji jądrowej, otwórz okno dialogowe zakresu kolorów i wybierz próbkowane kolory z menu rozwijanego.Następnie, trzymając Shift, wybierz tony charakterystyczne dla oznaczonych jąder. Kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać tę maskę wyboru zakresu kolorów do użycia z innymi obrazami wybranymi w tej samej sesji. Po wybraniu jąder napisz klik i wybierz wypełnienie.Następnie wybierz z menu rozwijanego i potwierdź, że krycie jest ustawione na 100%Następnie kliknij wybierz i odwróć. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i ponownie wybierz Wypełnij i wybierz białe wypełnienie z menu rozwijanego. Wykonaj algorytm przełomowy, aby oddzielić częściowo nakładające się jądra na teraz podwójnej warstwie jądrowej.Przejdź do wyboru, a następnie zakres kolorów, a następnie cienie, aby wybrać poszczególne oddzielone jądra. Następnie przenieś zaznaczenie na warstwę zawierającą 16-bitowy obraz w skali szarości żądanego znacznika i kliknij przycisk Zapisz pomiary. Na koniec należy wyeksportować wybrane pomiary jako pliki tekstowe do odpowiedniego oprogramowania analitycznego w celu dalszej obróbki oleju.Barwienie na czerwono oczyszczonych populacji komórek w połączeniu z barwieniem immunologicznym dla markerów linii adipogennej i miogennej ujawnia, że tylko frakcja fibroblastów jest zdolna do różnicowania epigenicznego z masowym nagromadzeniem tłuszczu przez fibroblasty widocznym gołym okiem i z dalszym wykazaniem ich całkowitej transformacji przez silną ekspresję jądrowego PPAR gamma przez te komórki do 15 dnia leczenia, komórki te uwolniły pozostały antygen tkanki łącznej TE 7A na swój substrat. W przeciwieństwie do tego, komórki miogenne utrzymują swój normalny fenotyp, w tym ekspresję łańcucha ciężkiego desminy i miozyny bez regulacji w górę ekspresji jądrowej PPAR gamma. Na tym rysunku przedstawiono przykład analizy ilościowej pola dodatnich komórek miogennych Desmonda oraz pola, z którego uzyskano te dane, ilustrując zmienność ekspresji miogennej w poszczególnych jądrach w tej określonej gęstości wysiewu i punkcie czasowym.Na tym wykresie pokazano użyteczność metody do bezpośredniego porównywania poziomów czynników transkrypcyjnych w różnych typach komórek na poziomie komórki. Na przykład te CD 56-ujemne fibroblasty mięśniowe wyrażają wysoki poziom jądrowego adipogennego czynnika transkrypcyjnego, PPAR gamma, podczas gdy różne komórki miogenne CD 56 dodatnie utrzymują tylko bardzo niski poziom czynnika transkrypcyjnego receptora jądrowego po ekspozycji na pożywkę indukującą adipocyty. Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się biologią mięśni badać mechanizmy decyzji o losie komórek w zdrowych lub patologicznych próbkach mięśni ludzkich.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć po pierwsze dobre zrozumienie, jak uzyskać wysoką wydajność oczyszczonych i dobrze scharakteryzowanych komórek pochodzących z ludzkich mięśni, a po drugie, jak przeprowadzić obiektywną analizę ilościową składników komórkowych zidentyfikowanych za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

isolation-quantitative-immunocytochemical-characterization-primary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Miofibroblast jest wpływową komórką zrębu przewodu pokarmowego, która reguluje ważne procesy fizjologiczne zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym. Opisujemy technikę, która pozwala na izolację pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy, którą można wykorzystać do eksperymentów in vitro.

Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

Przedstawiamy protokół generowania pierwotnych kultur mysich i ludzkich komórek zrębu przełyku z fenotypem miofibroblastów. Hodowane komórki mają morfologię wrzecionowatą, wykazują ekspresję α-SMA i wimentyny oraz nie mają markerów powierzchni komórek nabłonkowych, krwiotwórczych i śródbłonkowych. Scharakteryzowane komórki zrębu mogą być wykorzystane w badaniach funkcjonalnych oddziaływań nabłonkowo-zrębowych.

Izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka

Ten protokół opisuje techniki izolacji żywych komórek i pierwotnej hodowli linii komórkowych miogennych i fibroblastów z tkanki mięśniowej lub skórnej.  Opisana jest również technika unieśmiertelniania tych linii komórkowych.  Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Prezentujemy techniki izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) uzyskanych z tkanki biopsji mięśni szkieletowych.  hMPC uzyskane i scharakteryzowane za pomocą tych metod mogą być wykorzystane do późniejszego rozwiązywania problemów badawczych związanych z ludzką miogenezą i regeneracją mięśni szkieletowych.

Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Ten protokół opisuje izolację nienaruszonych pojedynczych włókien mięśniowych z utlenianego mięśnia podkolanowego oraz ustanowienie wysoce czystych kultur mioblastów pochodzących z tych włókien. Zoptymalizowana procedura niezawodnie przynosi około 300–500 nienaruszonych miofibryli na jednego mysza, umożliwiając dalszą molekularną i komórkową analizę.

Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Poznaj izolację komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych przy użyciu sortowania immunomagnetycznego CD56. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność i żywotność komórek do analizy markerów fenotypowych.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów