Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy
15 października 2019
Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.
Jest to protokół izolacji pierwotnych komórek macierzystych mięśni myszy w celu zbadania metabolizmu ex vivo. Ten protokół zapewnia znacznie większą populację komórek macierzystych w porównaniu z innymi protokołami, które wypróbowaliśmy w przeszłości. I co ważne, kiedy już zróżnicujemy te komórki macierzyste w miotuby, wykazują one normalną fizjologię, a więc coś takiego jak rytm okołodobowy.
Próbując tej procedury po raz pierwszy, rób szczegółowe notatki i zapisz kilka obrazów, ponieważ każdy eksplant tkankowy wygląda inaczej i wystąpią różnice w wyrostku mioblastów. Bez wizualnej demonstracji trudno jest stwierdzić, czy izolujesz właściwe komórki. Skorzystaliśmy z hojnej pomocy innych osób, które pokazały nam tę metodę, gdy opracowaliśmy ją w naszym laboratorium.
Po przygotowaniu naczynia do sekcji zgodnie z rękopisem przygotuj wilgotną komorę, umieszczając dwa do trzech arkuszy grubego chłonnego papieru w plastikowej torbie i za pomocą pipety zwilż powierzchnię papieru sterylną wodą. Umieść komorę w świetle UV na pięć minut w celu sterylizacji. Wypreparuj pożądany mięsień od cztero- do ośmiotygodniowej myszy i delikatnie spłucz w PBS zawierającym 40 mikrogramów na mililitr gentamycyny w celu sterylizacji.
Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść mięsień na sterylną 10-centymetrową, niepowlekaną szalkę Petriego. Dodaj 0,5 do jednego mililitra pożywki galwanicznej na mięsień, tak aby tkanka była wilgotna, ale nie pływała. Użyj sterylnego skalpela lub żyletki, aby delikatnie pokroić mięsień na małe fragmenty.
Za pomocą kleszczy lub pipety przenieś fragmenty mięśni na powierzchnię wstępnie pokrytej sześciocentymetrowej płytki. Bardzo delikatnie nałóż dodatkowe 0,8 mililitra podłoża galwanicznego na tkankę. Umieść sześciocentymetrowe naczynie zawierające fragmenty mięśni w wilgotnej komorze i umieść je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 48 godzin.
Przygotować i podgrzać pożywkę mioblastyczną, trypsynę i PBS-gentamycynę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby pokryć kolbę T25 dla każdej grupy mięśni, dodaj dwa mililitry roztworu powlekającego na powierzchnię kolby, delikatnie wstrząsnij, aby uzyskać równomierną powłokę na powierzchni i inkubuj kolbę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Teraz za pomocą pipety usuń podłoże galwaniczne z eksplantatów mięśni i delikatnie spłucz eksplantaty mięśni dwoma mililitrami PBS-gentamycyny.
Szybko wyjmij PBS i nie pozwól, aby płyta znajdowała się w PBS. Następnie delikatnie dodaj jeden mililitr PBS-gentamycyny i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną minutę. Użyj pipety P1000, aby zebrać PBS z komórkami do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.
Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny do płytki i włóż ją do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty. Delikatnie postukaj w płytki, aby usunąć mioblasty. Zbierz trypsynę z komórkami i połącz z kolekcją PBS.
Dodaj osiem mililitrów pożywki mioblastowej do probówki wirówkowej i delikatnie odwróć, aby wymieszać. Delikatnie nałóż dwa mililitry roztworu galwanicznego na płytki mięśniowe i włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wirować probówki wirówkowe zawierające komórki w wirówce przez trzy minuty w temperaturze 200 razy g.
Odessać supernatant i utrzymać około jednego mililitra w probówce. Delikatnie dodać pożywkę mioblastyczną, przenieść komórki do wstępnie pokrytej kolby i umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę z kolb P0 mioblast T25.
Przepłukać komórki krótko dwoma mililitrami ciepłej PBS-gentamycyny, a następnie odessać PBS z kolby. Odpipetować dwa mililitry ciepłego PBS do każdej kolby zawierającej mioblasty. Umieścić kolby z PBS w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty.
Następnie mocno postukaj w bok kolby, aby usunąć komórki. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym czy nie ma swobodnie unoszących się mioblastów. Umieść kolby pionowo w kapturze do hodowli tkankowych i przepłucz dno kolb 10 mililitrami pożywki mioblastowej dwa do trzech razy, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte.
Zbierz mieszaninę pożywek komórkowych w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować przez trzy minuty w temperaturze 200 razy g. Zassać pożywkę, aby pozostawić około jednego mililitra w probówce, uważając, aby uniknąć osadu komórkowego.
Delikatnie dodaj odpowiednią objętość pożywki mioblastowej do probówki wirówkowej i delikatnie wymieszaj. Rozprowadzić mieszaninę komórek do nowych kolb T75 po sześć mililitrów każda. Dodać 10 mililitrów pożywki mioblastowej do każdej nowej kolby T75.
Delikatnie potrząśnij kolbami poziomo, aby rozprowadzić komórki i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. W tym protokole komórki pierwotne wyłonione z eksplantatów obserwowano pod standardowym mikroskopem świetlnym. Wczesne zbiory mioblastów pojawiały się jako małe okrągłe i jasne kule.
Różnicowanie mioblastów trwało od czterech do sześciu dni, podczas których morfologia komórek zmieniła się z pojedynczych okrągłych kul na wydłużone, połączone, długie, wielojądrowe włókna. Uzyskano w pełni zróżnicowane rurki miotube, które były gotowe do pomiaru wskaźników zużycia tlenu. Ogniwa te mogą być wykorzystywane do wielu dalszych zastosowań.
Na przykład, często używamy ich do badania strumienia substratu w instrumentach Seahorse.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje izolację pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy, co umożliwia badanie metabolizmu komórek mięśniowych ex vivo. Metoda ta pozwala na uzyskanie większej populacji komórek macierzystych w porównaniu z poprzednimi technikami, co umożliwia przeprowadzenie szczegółowych badań fizjologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Fizjologia mięśni
Wprowadzenie
- Mioblasty to komórki prekursorowe, które różnicują się w miotuby i włókna mięśni szkieletowych.
- Zrozumienie metabolizmu komórek mięśniowych jest kluczowe dla wielu badań biologicznych.
- Poprzednie protokoły pozwalały na uzyskanie mniejszych populacji komórek macierzystych mięśni.
- Demonstracja wizualna jest niezbędna do prawidłowej izolacji właściwych komórek.
Cel badania
- Przedstawienie efektywnej metody izolacji pierwotnych mioblastów.
- Umożliwienie prowadzenia badań molekularnych i genetycznych komórek mięśniowych.
- Kierowanie uwagi na metabolizm i fizjologię komórek mięśniowych.
Zastosowane metody
- Izolacja pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych myszy.
- Hodowla mioblastów w celu ich różnicowania w miotuby.
- Dokumentacja wizualna eksplantów tkankowych podczas procedury.
- Porównanie z wcześniejszymi protokołami izolacji.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na uzyskanie większej populacji mioblastów.
- Miotuby pochodzące z tych komórek wykazują prawidłowe cechy fizjologiczne.
- Zmienność eksplantów tkankowych wymaga uważnej obserwacji i dokumentacji.
- Skuteczność izolacji jest zwiększona dzięki wskazówkom wizualnym od doświadczonych badaczy.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu metabolizmu komórek mięśniowych.
- Zapewnia ona niezawodne podejście do pozyskiwania pierwotnych mioblastów.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten protokół w różnych projektach badawczych dotyczących mięśni.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Skuteczna izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantów mięśni szkieletowych myszy umożliwia powtarzalne modelowanie metabolizmu komórek mięśniowych ex vivo w celu wczesnego etapu poszukiwania leków. System ten pozwala na precyzyjne badanie szlaków metabolicznych, wykorzystania substratów oraz zaburzeń genetycznych w skalowalnym, standaryzowanym formacie. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w zakresie walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka mechanistycznego w programach terapeutycznych związanych z mięśniami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków metabolicznych i funkcjonalną walidację celów w pierwotnych komórkach mięśniowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczenie fizjologicznie istotnych modeli miotubek z prawidłowym rytmem okołodobowym.
- Ułatwia prowadzenie badań opartych na hipotezach dotyczących metabolizmu mięśni i funkcji genów z wykorzystaniem egzogennego DNA lub wektorów wirusowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia odtwarzalne źródło pierwotnych mioblastów do ilościowych analiz metabolicznych, w tym analizy strumienia substratów.
- Wspiera standaryzację i skalowalność testów w celu późniejszego przesiewu związków w układach komórek mięśniowych.
- Umożliwia przygotowanie zróżnicowanych miotub, odpowiednich do wysokoprzepustowych odczytów metabolicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia istotny w kontekście chorób system ex vivo do badania fenotypów metabolicznych w różnych modelach mysich.
- Jest zgodny z translacyjnymi strategiami biomarkerowymi, umożliwiając bezpośredni pomiar zużycia tlenu i wykorzystania substratów.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, łącząc biologię mięśni in vitro i in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków, począwszy od wczesnej walidacji celu, poprzez opracowanie testów, aż po przedkliniczne badania metaboliczne.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w pierwotnych komórkach mięśniowych.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, skalowalne populacje komórek do ilościowych analiz metabolicznych.
- Analityka: Umożliwia pomiar tempa zużycia tlenu oraz strumienia substratów do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Zapewnia platformę ex vivo do korelacji wyników metabolicznych z modelami in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany schemat postępowania do wielokrotnego zastosowania w projektach dotyczących metabolizmu mięśni.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad metabolizmem mięśni.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, skalowalność i standaryzację procedur pracy z pierwotnymi komórkami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową we wczesnych fazach programów ukierunkowanych na cele mięśniowe.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój terapeutycznych zasobów związanych z mięśniami.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach izolacji i różnicowania pierwotnych komórek.
- Wymaga dostępu do sterylnych urządzeń do hodowli tkankowej oraz aparatury do analiz metabolicznych.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Może wymagać adaptacji dla różnych modeli mysich lub źródeł tkanki mięśniowej.
- Dokumentacja wizualna i szkolenia są kluczowe ze względu na zmienność wzrostu eksplantów.
