Name: Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj izolację pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych myszy do badań metabolizmu komórek mięśniowych ex vivo. Ta metoda zapewnia większą populację komórek macierzystych niż wcześniejsze protokoły.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni dr Matthew Wattowi z Uniwersytetu w Melbourne i dr Anastasii Kralli z Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa za pomoc w przyjęciu tego protokołu opartego na pracy Mokbel et al.6. Dziękujemy również dr Sabine Jordan za pomoc w opracowaniu i przyjęciu tego protokołu w naszym laboratorium. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health R01s DK097164 i DK112927 do K.A.L.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Scripps Research dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Pobieranie i przetwarzanie eksplantatów tkanki mięśniowej
<ol>
	<li>Dzień przed sekcją wysterylizuj cały sprzęt do preparacji (kleszcze, żyletki i nożyczki) i przygotuj wszystkie wymagane media: sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pożywkę galwaniczną MB (12,5 ml DMEM, 12,5 ml HAMS F12, 20 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml suplementu pożywki z płynem owodniowym) i roztwór powlekający (24 ml DMEM, 24 ml HAMS F12, 1,7 ml kolagenu, 1 ml matrigelu).</li>
	<li>W dniu sekcji pokryj jedno 6-centymetrowe naczynie roztworem powlekającym dla każdego mięśnia, który ma być wycięty. Dodać 2 ml roztworu powlekającego na powierzchnię każdej płytki, delikatnie wstrząsnąć, aby uzyskać równomierną warstwę na powierzchni, a następnie inkubować płytki z roztworem w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć roztwór powlekający z płytek i powrócić do roztworu podstawowego. 
	nuta: Roztwór powlekający może być ponownie używany przez okres do sześciu miesięcy i powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłucz płytki dwukrotnie 2 ml PBS, aby usunąć niezwiązany kolagen i matrigel.</li>
	<li>Podczas sekcji należy umieścić płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj wilgotną komorę, umieszczając 2-3 arkusze grubego papieru chłonnego w plastikowej torbie lub sterylnym naczyniu o średnicy 15 cm i za pomocą pipety zwilż powierzchnię papieru sterylną wodą.</li>
	<li>Umieść komorę w świetle UV na 5 minut w celu sterylizacji.</li>
	<li>Wypreparuj pożądane mięśnie myszy w wieku od 4 do 8 tygodni. Aby wysterylizować tkankę mięśniową, należy delikatnie przepłukać PBS zawierający 40 μg/ml gentamycyny. 
	nuta: W przypadku mięśni czworogłowych i mięśni brzuchatego łydki należy układać jeden mięsień na płytkę. W przypadku mięśnia płaszczkowatego, podeszwowego i EDL połącz mięśnie obu nóg na jednej płytce.</li>
	<li>Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść mięsień na sterylną 10 cm, niepowlekaną szalkę Petriego. Dodaj 0,5-1,0 ml pożywki galwanicznej na mięsień, tak aby tkanka była wilgotna, ale nie unosiła się na wodzie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Użyj sterylnego skalpela lub żyletki, aby delikatnie pokroić mięsień na małe fragmenty (około 1-3 mm3). 
	nuta: Ważne jest, aby zminimalizować przenoszenie tkanki mięśniowej dla najlepszych wyników.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy lub pipety przenieś fragmenty mięśni na powierzchnię wstępnie pokrytej płytki o średnicy 6 cm. Bardzo delikatnie nałóż dodatkowe 0,8 ml pożywki galwanicznej na tkankę. Powinno być wystarczająco dużo podłoża, aby utrzymać kawałki tkanki nawodnione, ale nie unoszące się na wodzie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Umieść 6-centymetrowe szalki zawierające fragmenty mięśni w wilgotnej komorze i wróć do inkubatora (37 °C, 5% CO2) na 48 godzin (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1C). 
	nuta: Ważne jest, aby fragmenty mięśni przylegały do powierzchni płytki, aby umożliwić przerost mioblastów. Nie przesuwaj płyt/komory przez co najmniej 48 godzin.</li>
	<li>Po 48 godzinach dokładnie sprawdź płytki, aby upewnić się, że fragmenty mięśni przylegają. Nałożyć 2 ml pożywki galwanicznej, uważając, aby nie usunąć fragmentów. 
	nuta: Jeśli na płytkach widoczne są zanieczyszczenia lub zanieczyszczenia, ostrożnie umyj kawałki mięśni. Umieść 2 ml roztworu PBS/gentamycyny na krawędzi płytki i delikatnie przechyl, aby przemyć tkankę mięśniową. Wyjmij PBS i powtórz krok prania. Po drugim praniu nałóż 2 ml pożywki galwanicznej.</li>
	<li>Płytki należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 3 dni (5 dni od pierwotnego rozwarstwienia) przed pobraniem mioblastów. Sprawdzaj co drugi dzień pod kątem przerostu mioblastów. 
	nuta: Wygląd komórek wyłaniających się z eksplantatów mięśniowych będzie zmienny i niejednorodny. Pierwotne mioblasty pojawiają się jako małe, okrągłe i jasne komórki. Nie jest jednak ani konieczne, ani wiarygodne identyfikowanie ich po wyglądzie na tym etapie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Zbieranie wyrastających mioblastów
<ol>
	<li>Przygotuj i podgrzej pożywkę Myoblast (17,5 ml DMEM, 17,5 ml HAMS F12, 10 ml FBS, 5 ml suplementu pożywki z płynem owodniowym), trypsynę i PBS/gentamycynę. Pokryć jedną kolbę T25 na każdą zbieraną grupę mięśni roztworem powlekającym, jak opisano w kroku 1.2 (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Usuń podłoże galwaniczne i delikatnie opłucz eksplantaty mięśni 2 ml PBS/gentamycyny. Szybko wyjmij PBS (płukać jedną płytkę na raz i nie pozwól, aby na tym etapie płyta znajdowała się w PBS).</li>
	<li>Delikatnie dodać 1 ml PBS/gentamycyny i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 minutę.</li>
	<li>Użyj pipety P1000, aby zebrać PBS/komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 1 ml trypsyny do płytki i ponownie umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 minuty. Delikatnie postukać w płytki, aby usunąć mioblasty. Zbierz trypsynę/komórki i połącz z kolekcją PBS. Dodaj 8 ml pożywki Myoblast do probówki wirówkowej i delikatnie odwróć, aby wymieszać.</li>
	<li>Delikatnie nanieść 2 ml roztworu galwanicznego na płytki mięśniowe i ponownie umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wirować probówki wirówkowe zawierające komórki w wirówce przez 3 minuty przy 200 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant do ~1 ml, uważając, aby uniknąć osadu komórkowego. Delikatnie dodać pożywkę Myoblast (patrz Tabela 1) i przenieść komórki do wstępnie powlekanej kolby i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C. To są żniwa P0. Jeśli obserwuje się je pod mikroskopem, może być bardzo mało komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Opisany powyżej zbiór powtarzać co drugi dzień do trzech razy. Po trzecim zbiorze wyrzuć eksplantaty.</li>
</ol>
3. Ekspansja i wzbogacanie proliferujących mioblastów
UWAGA: Zbiory P0 będą niejednorodne (~60% mioblastów). Kolejne 2 pasaże wykorzystują PBS do selektywnego zbierania mioblastów. Wiele z bardziej przylegających komórek pozostanie w tyle, a szybko proliferujące mioblasty będą czyste ≥95% w ciągu 2 pasaży. Po ustaleniu mioblastów należy je utrzymywać w niskiej gęstości, aby uniknąć spontanicznego różnicowania.
<ol>
	<li>Dla każdej kolby T25 zawierającej ~40-50% zlewających się komórek z sekcji 2, pokryj jedną kolbę T75 5 ml roztworu powlekającego i umieść w temperaturze 4 °C na 1-4 godziny.</li>
	<li>Usunąć roztwór powlekający z kolb i powrócić do roztworu podstawowego. Przepłukać kolby dwukrotnie 2 ml PBS/gentamycyny i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę z kolb P0 mioblast T25. Krótko przepłukać komórki 2 ml ciepłego PBS/gentamycyny. Odessać PBS z kolby. 
	nuta: Celem tego etapu (ppkt 3.3) jest zmniejszenie możliwości skażenia bakteryjnego. Wykonana szybko i delikatnie nie powinna spowodować utraty mioblastów. W razie potrzeby można go pominąć, aby zmaksymalizować zachowanie mioblastów.</li>
	<li>Odpipetować 2 ml ciepłego PBS (nie trypsyny) do każdej kolby zawierającej mioblasty. Umieścić kolby z PBS w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 3 min. 
	nuta: Mioblasty powinny łatwo odłączyć się od kolb z PBS. Stosowanie PBS zamiast trypsyny na tym etapie ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zanieczyszczenia populacji mioblastów innymi typami komórek.</li>
	<li>Wyjąć komórki z inkubatora w temperaturze 37 °C i mocno postukać w kolby w celu usunięcia komórek. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym czy nie ma swobodnie unoszących się mioblastów.</li>
	<li>Umieścić kolby pionowo w kapturze do hodowli tkankowych i przepłukać dno kolb 10 ml pożywki Myoblast 2-3 razy, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte.</li>
	<li>Zebrać mieszaninę komórek/pożywki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przez 3 minuty przy 200 x g.</li>
	<li>Zassać podłoże do około 1 ml, uważając, aby uniknąć osadu komórkowego. Delikatnie dodaj odpowiednią objętość pożywki Myoblast do probówki wirówkowej i delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Rozprowadzić mieszaninę komórek do nowych kolb T75. Dodać 10 ml pożywki Myoblast do każdej nowej kolby T75. Delikatnie wstrząsnąć kolbami w poziomie, aby rozprowadzić komórki i umieścić na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dwa dni później ponownie przeszliśmy przez PBS, dzieląc każdą kolbę T75 na trzy kolby T75. 
	nuta: Nie pozwól, aby mioblasty zrosły się w więcej niż 50%-60%, ponieważ spowodowałoby to, że zaczną się różnicować i stracą zdolność rozrodczą.</li>
	<li>W przypadku dodatkowych przejść użyj trypsyny. Dwukrotne pasażowanie z PBS daje >95% mioblastów; Próby dalszej poprawy czystości zwykle skutkują gorszym różnicowaniem.</li>
</ol>
4. Różnicowanie pierwotnych mioblastów do miotub
<ol>
	<li>Mioblasty płytki P2 (lub późniejsze pasaże) w pożywkach Myoblast na płytkach powlekanych (patrz Tabela 1 dla sugerowanych objętości powlekania i posiewu oraz liczby komórek). Dwa lub trzy dni później, gdy komórki są w 70-80% zbieżności, zmień pożywkę na pożywkę różnicującą (24 ml DMEM, 24 ml HAMS F12, 1,5 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 0,5 ml insuliny-selenu-transferyny).</li>
	<li>Zmieniaj pożywki różnicujące co drugi dzień podczas różnicowania pierwotnych mioblastów w miotuby. Różnicowanie jest zwykle zakończone w 4-5 dniu i będzie zaznaczone przez wydłużone, zrośnięte komórki, które spontanicznie drgają. Wykonuj eksperymenty na zróżnicowanych miotubach w ciągu 6 dni. Zazwyczaj komórki są oznaczane pięć lub sześć dni po zainicjowaniu różnicowania.</li>
</ol>
5. Pomiar wskaźnika zużycia tlenu w mioblastach lub miotubach na płytkach 96-dołkowych
<ol>
	<li>Pokryj 96-dołkowe płytki 25 μl roztworu powlekającego na studzienkę. Odwirować płytki o masie 58 x g przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.</li>
	<li>Inkubować płytki w roztworze powlekającym przez 1-4 godziny w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety wielokanałowej usunąć roztwór powlekający i przemyć trzykrotnie w 25 μl zimnego PBS/gentamycyny. Odwirować co najmniej jedno z tych płukań, aby upewnić się, że nie zostały uwięzione żadne pęcherzyki.</li>
	<li>Dodać 40 μl pożywki różnicującej do każdego dołka. Odwirować pożywkę na powlekanej płytce bez komórek przez 1 minutę przy 58 x g, aby uniknąć pęcherzyków i usunąć napięcie powierzchniowe, aby uzyskać jednolitą warstwę podłoża.</li>
	<li>Dodać komórki zawieszone w dodatkowych 40 μl pożywki do każdej studzienki. Zakręć ponownie z prędkością 58 x g. 
	nuta: Spójność posiewu jest ważna dla uzyskania najlepszych wyników, a liczba komórek posianych na studzienkę powinna być zoptymalizowana dla każdej konfiguracji eksperymentalnej i prawdopodobnie będzie mieścić się w zakresie ~ 10 000-25 000 mioblastów posianych w pożywkach różnicujących na dołek 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Podczas różnicowania należy delikatnie zmieniać podłoże codziennie. Nie zasysaj podłoża, ale raczej usuń je pipetą, pozostawiając niewielką objętość, aby uniknąć przemieszczenia komórek lub wystawienia ich na działanie powietrza. Na przykład zastąp 50 μl na raz przez trzy powtórzenia, a nie wszystkie 80 μl na raz.</li>
	<li>Użyj 8-15 dołków na warunek. Może być konieczne pominięcie niektórych studzienek, jeśli komórki nie tworzą jednolitej warstwy miotub. 
	nuta: Pomiń studzienki na krawędziach płytki, ponieważ są one bardzo podatne na parowanie. Zróżnicuj konfigurację płytki dla powtórzeń eksperymentalnych, aby uniknąć błędów systematycznych.</li>
	<li>Wykonaj żądany test na zróżnicowanych miotubach w ciągu 1-2 dni od pełnego różnicowania (dzień 4-6 od rozpoczęcia różnicowania). Zalecane przyrządy i odczynniki do pomiaru wskaźników zużycia tlenu są wymienione w Tabeli materiałów.</li>
</ol>

<ol><li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li>
<li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li>
<li>Sjøberg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li>
<li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation%2C+differentiation%2C+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li>
<li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li>
<li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Musarò, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li>
<li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li>
<li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li>
<li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li>
<li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li>
<li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li>
<li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+%CE%B1-glucosidase+deficient+mice%3A+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li>
<li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917(2018).</li>
<li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li>
<li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis%2C+oxidative+capacity%2C+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li>
</ol>

Mięśnie szkieletowe są niezbędne do ustanowienia i utrzymania homeostazy metabolicznej11. Badania nad fizjologią mięśni komplikuje zmienność międzyosobnicza, a także trudności w uzyskiwaniu próbek, szczególnie w przypadku badań na ludziach. Wykazano, że hodowane pierwotne miotube'y podsumowują wiele cech fizjologii mięśni, w tym homeostazę wapnia12, regenerację uszkodzonej tkanki mięśniowej5, zmiany metaboliczne w odpowiedzi naćwicz...

Chociaż często cytowany jako wskaźnik ogólnego zdrowia metabolicznego, wiele badań wykazało, że wskaźnik masy ciała (BMI) u starszych dorosłych nie jest konsekwentnie związany z wyższym ryzykiem śmiertelności. Do tej pory jedynym czynnikiem, który okazał się spójny ze zmniejszoną śmiertelnością w tej populacji, jest zwiększona masa mięśniowa1. Tkanka mięśniowa stanowi jedno z największych źródeł komórek wrażliwych na insulinę w organizmie i dlatego ma kluczowe znaczenie w utrzymaniu ogólnej homeostazy metabolicznej2. Aktywacja tkanki mięśni szkieletowych poprzez ćwiczenia wiąże się ze wzrostem zarówno miejscowej wrażliwości na insulinę, jak i ogólnego stanu zdrowia metabolicznego3. Podczas gdy modele in vivo są niezbędne do badania fizjologii mięśni i wpływu funkcji mięśni na zintegrowany metabolizm, pierwotne hodowle miotubes zapewniają elastyczny system, który zmniejsza złożoność badań na zwierzętach.
Mioblasty pochodzące z mięśni poporodowych mogą być używane do badania wpływu licznych warunków leczenia i wzrostu w wysoce powtarzalny sposób. Jest to od dawna znane i opisano kilka metod izolacji i hodowli mioblastów4,5,6,7,8,9. Niektóre z tych metod wykorzystują mięśnie noworodków i dają stosunkowo niską liczbę mioblastów5,8, co wymaga kilku zwierząt do badań na większą skalę. Ponadto najczęściej stosowane metody hodowli mioblastów wykorzystują "wstępne posiewanie" w celu wzbogacenia mioblastów, które są mniej przylegające niż inne typy komórek. Odkryliśmy, że opisana tutaj alternatywna metoda wzbogacania jest znacznie bardziej wydajna i powtarzalna w przypadku wzbogacania wysoce proliferacyjnej populacji mioblastów. Podsumowując, protokół ten umożliwia izolację wysoce proliferacyjnych mioblastów z eksplantatów mięśniowych młodych dorosłych osobników, poprzez wyrastanie do pożywek hodowlanych. Mioblasty mogą być zbierane wielokrotnie, przez kilka dni, gwałtownie się namnażać i indukować do różnicowania się w miotuby. Protokół ten w sposób powtarzalny generuje dużą liczbę zdrowych komórek mioblastów, które silnie różnicują się w spontanicznie drgające miotuby. Umożliwiło nam to zbadanie metabolizmu i rytmów okołodobowych w pierwotnych miotubach myszy o różnych genotypach. Na koniec zamieszczamy metody przygotowania miotub do badania metabolizmu oksydacyjnego, wykorzystując pomiary wskaźników zużycia tlenu na płytkach 96-dołkowych.

<table><tbody><tr><td>Coating Solution:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td>Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1 000 objętości) przed użyciem; 24 ml</td></tr><tr><td>HAMS F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td>Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1 000 objętości) przed użyciem; 24 ml</td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>1,7 ml</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher</td><td>CB40234A</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Podłoże galwaniczne: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td>Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1,000 objętości) przed użyciem; 12,5 ml</td></tr><tr><td>HAMS F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td>Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1,000 objętościowo) przed użyciem; 12,5 ml</td></tr><tr><td>inaktywowane termicznie FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td>20 ml; można kupić jako zwykły FBS i inaktywować termicznie, umieszczając w 40 &deg; C kąpiel wodna przez 20 minut</td></tr><tr><td>Amniomax</td><td>Life Technologies</td><td>12556023</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Myoblast Media:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td>Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1,000 objętościowo) przed użyciem; 17,5 ml</td></tr><tr><td>HAMS F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td>Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1,000 objętościowo) przed użyciem; 17,5 ml</td></tr><tr><td>Ciepło Inaktywowane technologie życia FBS</td><td></td><td>16000044</td><td>10 ml; można kupić jako zwykły FBS i inaktywować termicznie, umieszczając w 40 &deg; C kąpiel wodna przez 20 min</td></tr><tr><td>Amniomax</td><td>Life Technologies</td><td>12556023</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Differentiation Media:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td>Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1 000 objętości) przed użyciem; 24 ml</td></tr><tr><td>HAMS F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td>Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1 000 objętości) przed użyciem; 24 ml</td></tr><tr><td>Ciepło Inaktywowana surowica końska</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Technologie życia</td><td>insuliny, selenu i transferyny</td><td>41400045</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Inne materiały:</td>PBS Gibco 14040133 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma 472301</td><td></td><td>Przygotuj jako 10% DMSO w Myoblast Pożywki do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>żyletki</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nożyczki</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>papier Whatman</td><td>VWR</td><td>21427-648</td><td></td></tr><tr><td>Płyta 60 mm</td><td>VWR</td><td>734-2318</td><td></td></tr><tr><td>Płyta 10 cm</td><td>VWR</td><td>25382-428 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T25</td><td>Termoby ThermoFisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>Probówki</td> wirówkowe ThermoFisher <td>156499</td><td></td></tr><tr><td>(15 ml)</td><td>BioPioneer</td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>Wskaźniki zużycia tlenu:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analizator</td><td></td><td></td> <td>Agilent Seahorse XFe96Przyrząd służący do pomiaru wskaźników zużycia tlenu odczytywanych przez zakwaszenie pożywki zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>96-dołkowe płytki do użytku w analizatorze XFe96</td></tr><tr><td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td> Składniki <td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>można zakupić od innych dostawców po ustaleniu testu; niektóre zalecenia są wymienione poniżej</td></tr><tr><td>Podłoże Seahorse XF Palmitate-BSA FAO</td><td>Składniki Agilent</td><td>102720-100</td><td>można nabyć od innych dostawców po ustaleniu testu; niektóre zalecenia są wymienione poniżej</td></tr><tr><td>Kwas palmitynowy</td><td>Sigma</td><td>P5585-10G</td><td>do pomiaru utleniania kwasów tłuszczowych</td></tr><tr><td>Karnityna</td><td>Sigma</td><td>C0283-5G</td><td>do pomiaru utleniania kwasów tłuszczowych</td></tr><tr><td>Etomoxir</td><td>Sigma</td><td>E1905</td><td>do pomiaru utleniania kwasów tłuszczowych</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td>stosowany jako kontrola lub w połączeniu z kwasem palmitynowym do stosowania w pomiarze utleniania kwasów tłuszczowych</td></tr></tbody></table>

izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Pierwotne mioblasty to niezróżnicowane, proliferujące prekursory mięśni szkieletowych. Można je hodować i badać jako prekursory mięśni lub indukować do różnicowania się w późniejszych etapach rozwoju mięśni. Przedstawiony tutaj protokół opisuje solidną metodę izolacji i hodowli wysoce proliferacyjnej populacji komórek mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Komórki te są przydatne do badania właściwości metabolicznych mięśni szkieletowych różnych modeli myszy, a także w innych dalszych zastosowaniach, takich jak transfekcja z egzogennym DNA lub transdukcja z wektorami ekspresji wirusa. Poziom zróżnicowania i profil metaboliczny tych komórek zależy od długości ekspozycji i składu pożywki użytej do indukowania różnicowania mioblastów. Metody te zapewniają solidny system do badania metabolizmu komórek mięśniowych myszy ex vivo. Co ważne, w przeciwieństwie do modeli in vivo, opisane tutaj metody zapewniają populację komórek, którą można rozszerzać i badać z wysokim poziomem odtwarzalności.

Postępowanie zgodnie z sekcją 1 dostarczonego protokołu powinno doprowadzić do wyłonienia się z eksplantatów komórek pierwotnych, które będą widoczne pod standardowym mikroskopem świetlnym (Rycina 2). Z każdego eksplantatu tkanki mięśniowej oraz wokół niego będzie widoczny wzrost heterogennej populacji komórek. Mioblasty będą widoczne jako małe, okrągłe, jasne sfery. Postępowanie zgodnie z sekcją 2 protokołu pozwoli na wczesne pozyskanie mioblastów z eksplant...

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Jest to protokół izolacji pierwotnych komórek macierzystych mięśni myszy w celu zbadania metabolizmu ex vivo. Ten protokół zapewnia znacznie większą populację komórek macierzystych w porównaniu z innymi protokołami, które wypróbowaliśmy w przeszłości. I co ważne, kiedy już zróżnicujemy te komórki macierzyste w miotuby, wykazują one normalną fizjologię, a więc coś takiego jak rytm okołodobowy.Próbując tej procedury po raz pierwszy, rób szczegółowe notatki i zapisz kilka obrazów, ponieważ każdy eksplant tkankowy wygląda inaczej i wystąpią różnice w wyrostku mioblastów. Bez wizualnej demonstracji trudno jest stwierdzić, czy izolujesz właściwe komórki. Skorzystaliśmy z hojnej pomocy innych osób, które pokazały nam tę metodę, gdy opracowaliśmy ją w naszym laboratorium.Po przygotowaniu naczynia do sekcji zgodnie z rękopisem przygotuj wilgotną komorę, umieszczając dwa do trzech arkuszy grubego chłonnego papieru w plastikowej torbie i za pomocą pipety zwilż powierzchnię papieru sterylną wodą. Umieść komorę w świetle UV na pięć minut w celu sterylizacji. Wypreparuj pożądany mięsień od cztero- do ośmiotygodniowej myszy i delikatnie spłucz w PBS zawierającym 40 mikrogramów na mililitr gentamycyny w celu sterylizacji.Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść mięsień na sterylną 10-centymetrową, niepowlekaną szalkę Petriego. Dodaj 0,5 do jednego mililitra pożywki galwanicznej na mięsień, tak aby tkanka była wilgotna, ale nie pływała. Użyj sterylnego skalpela lub żyletki, aby delikatnie pokroić mięsień na małe fragmenty.Za pomocą kleszczy lub pipety przenieś fragmenty mięśni na powierzchnię wstępnie pokrytej sześciocentymetrowej płytki. Bardzo delikatnie nałóż dodatkowe 0,8 mililitra podłoża galwanicznego na tkankę. Umieść sześciocentymetrowe naczynie zawierające fragmenty mięśni w wilgotnej komorze i umieść je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 48 godzin.Przygotować i podgrzać pożywkę mioblastyczną, trypsynę i PBS-gentamycynę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby pokryć kolbę T25 dla każdej grupy mięśni, dodaj dwa mililitry roztworu powlekającego na powierzchnię kolby, delikatnie wstrząsnij, aby uzyskać równomierną powłokę na powierzchni i inkubuj kolbę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Teraz za pomocą pipety usuń podłoże galwaniczne z eksplantatów mięśni i delikatnie spłucz eksplantaty mięśni dwoma mililitrami PBS-gentamycyny.Szybko wyjmij PBS i nie pozwól, aby płyta znajdowała się w PBS. Następnie delikatnie dodaj jeden mililitr PBS-gentamycyny i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną minutę. Użyj pipety P1000, aby zebrać PBS z komórkami do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny do płytki i włóż ją do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty. Delikatnie postukaj w płytki, aby usunąć mioblasty. Zbierz trypsynę z komórkami i połącz z kolekcją PBS.Dodaj osiem mililitrów pożywki mioblastowej do probówki wirówkowej i delikatnie odwróć, aby wymieszać. Delikatnie nałóż dwa mililitry roztworu galwanicznego na płytki mięśniowe i włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wirować probówki wirówkowe zawierające komórki w wirówce przez trzy minuty w temperaturze 200 razy g.Odessać supernatant i utrzymać około jednego mililitra w probówce. Delikatnie dodać pożywkę mioblastyczną, przenieść komórki do wstępnie pokrytej kolby i umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę z kolb P0 mioblast T25.Przepłukać komórki krótko dwoma mililitrami ciepłej PBS-gentamycyny, a następnie odessać PBS z kolby. Odpipetować dwa mililitry ciepłego PBS do każdej kolby zawierającej mioblasty. Umieścić kolby z PBS w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty.Następnie mocno postukaj w bok kolby, aby usunąć komórki. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym czy nie ma swobodnie unoszących się mioblastów. Umieść kolby pionowo w kapturze do hodowli tkankowych i przepłucz dno kolb 10 mililitrami pożywki mioblastowej dwa do trzech razy, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte.Zbierz mieszaninę pożywek komórkowych w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować przez trzy minuty w temperaturze 200 razy g. Zassać pożywkę, aby pozostawić około jednego mililitra w probówce, uważając, aby uniknąć osadu komórkowego.Delikatnie dodaj odpowiednią objętość pożywki mioblastowej do probówki wirówkowej i delikatnie wymieszaj. Rozprowadzić mieszaninę komórek do nowych kolb T75 po sześć mililitrów każda. Dodać 10 mililitrów pożywki mioblastowej do każdej nowej kolby T75.Delikatnie potrząśnij kolbami poziomo, aby rozprowadzić komórki i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. W tym protokole komórki pierwotne wyłonione z eksplantatów obserwowano pod standardowym mikroskopem świetlnym. Wczesne zbiory mioblastów pojawiały się jako małe okrągłe i jasne kule.Różnicowanie mioblastów trwało od czterech do sześciu dni, podczas których morfologia komórek zmieniła się z pojedynczych okrągłych kul na wydłużone, połączone, długie, wielojądrowe włókna. Uzyskano w pełni zróżnicowane rurki miotube, które były gotowe do pomiaru wskaźników zużycia tlenu. Ogniwa te mogą być wykorzystywane do wielu dalszych zastosowań.Na przykład, często używamy ich do badania strumienia substratu w instrumentach Seahorse.

isolation-differentiation-primary-myoblasts-from-mouse-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten protokół opisuje solidną, powtarzalną i prostą metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych mioblastów z mięśni szkieletowych osób dorosłych i starszych. Wykorzystywane tutaj mięśnie obejmują mięśnie stóp i nóg. Takie podejście umożliwia wyizolowanie wzbogaconej populacji pierwotnych mioblastów do badań funkcjonalnych.

Przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Różnicowanie mięśni szkieletowych jest bardzo dynamicznym procesem, który szczególnie opiera się na pozycjonowaniu jądra. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia ruchów jąder za pomocą obrazowania żywych komórek podczas różnicowania mioblastów i tworzenia miotubek oraz przeprowadzania ilościowej charakterystyki dynamiki jąder poprzez ekstrakcję informacji z automatycznego śledzenia.

Wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj izolację pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych myszy do badań metabolizmu komórek mięśniowych ex vivo. Ta metoda zapewnia większą populację komórek macierzystych niż wcześniejsze protokoły.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Przeglądaj więcej filmów