Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Jest to protokół izolacji pierwotnych komórek macierzystych mięśni myszy w celu zbadania metabolizmu ex vivo. Ten protokół zapewnia znacznie większą populację komórek macierzystych w porównaniu z innymi protokołami, które wypróbowaliśmy w przeszłości. I co ważne, kiedy już zróżnicujemy te komórki macierzyste w miotuby, wykazują one normalną fizjologię, a więc coś takiego jak rytm okołodobowy.

Próbując tej procedury po raz pierwszy, rób szczegółowe notatki i zapisz kilka obrazów, ponieważ każdy eksplant tkankowy wygląda inaczej i wystąpią różnice w wyrostku mioblastów. Bez wizualnej demonstracji trudno jest stwierdzić, czy izolujesz właściwe komórki. Skorzystaliśmy z hojnej pomocy innych osób, które pokazały nam tę metodę, gdy opracowaliśmy ją w naszym laboratorium.

Po przygotowaniu naczynia do sekcji zgodnie z rękopisem przygotuj wilgotną komorę, umieszczając dwa do trzech arkuszy grubego chłonnego papieru w plastikowej torbie i za pomocą pipety zwilż powierzchnię papieru sterylną wodą. Umieść komorę w świetle UV na pięć minut w celu sterylizacji. Wypreparuj pożądany mięsień od cztero- do ośmiotygodniowej myszy i delikatnie spłucz w PBS zawierającym 40 mikrogramów na mililitr gentamycyny w celu sterylizacji.

Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść mięsień na sterylną 10-centymetrową, niepowlekaną szalkę Petriego. Dodaj 0,5 do jednego mililitra pożywki galwanicznej na mięsień, tak aby tkanka była wilgotna, ale nie pływała. Użyj sterylnego skalpela lub żyletki, aby delikatnie pokroić mięsień na małe fragmenty.

Za pomocą kleszczy lub pipety przenieś fragmenty mięśni na powierzchnię wstępnie pokrytej sześciocentymetrowej płytki. Bardzo delikatnie nałóż dodatkowe 0,8 mililitra podłoża galwanicznego na tkankę. Umieść sześciocentymetrowe naczynie zawierające fragmenty mięśni w wilgotnej komorze i umieść je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 48 godzin.

Przygotować i podgrzać pożywkę mioblastyczną, trypsynę i PBS-gentamycynę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby pokryć kolbę T25 dla każdej grupy mięśni, dodaj dwa mililitry roztworu powlekającego na powierzchnię kolby, delikatnie wstrząsnij, aby uzyskać równomierną powłokę na powierzchni i inkubuj kolbę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Teraz za pomocą pipety usuń podłoże galwaniczne z eksplantatów mięśni i delikatnie spłucz eksplantaty mięśni dwoma mililitrami PBS-gentamycyny.

Szybko wyjmij PBS i nie pozwól, aby płyta znajdowała się w PBS. Następnie delikatnie dodaj jeden mililitr PBS-gentamycyny i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną minutę. Użyj pipety P1000, aby zebrać PBS z komórkami do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny do płytki i włóż ją do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty. Delikatnie postukaj w płytki, aby usunąć mioblasty. Zbierz trypsynę z komórkami i połącz z kolekcją PBS.

Dodaj osiem mililitrów pożywki mioblastowej do probówki wirówkowej i delikatnie odwróć, aby wymieszać. Delikatnie nałóż dwa mililitry roztworu galwanicznego na płytki mięśniowe i włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wirować probówki wirówkowe zawierające komórki w wirówce przez trzy minuty w temperaturze 200 razy g.

Odessać supernatant i utrzymać około jednego mililitra w probówce. Delikatnie dodać pożywkę mioblastyczną, przenieść komórki do wstępnie pokrytej kolby i umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę z kolb P0 mioblast T25.

Przepłukać komórki krótko dwoma mililitrami ciepłej PBS-gentamycyny, a następnie odessać PBS z kolby. Odpipetować dwa mililitry ciepłego PBS do każdej kolby zawierającej mioblasty. Umieścić kolby z PBS w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty.

Następnie mocno postukaj w bok kolby, aby usunąć komórki. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym czy nie ma swobodnie unoszących się mioblastów. Umieść kolby pionowo w kapturze do hodowli tkankowych i przepłucz dno kolb 10 mililitrami pożywki mioblastowej dwa do trzech razy, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte.

Zbierz mieszaninę pożywek komórkowych w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować przez trzy minuty w temperaturze 200 razy g. Zassać pożywkę, aby pozostawić około jednego mililitra w probówce, uważając, aby uniknąć osadu komórkowego.

Delikatnie dodaj odpowiednią objętość pożywki mioblastowej do probówki wirówkowej i delikatnie wymieszaj. Rozprowadzić mieszaninę komórek do nowych kolb T75 po sześć mililitrów każda. Dodać 10 mililitrów pożywki mioblastowej do każdej nowej kolby T75.

Delikatnie potrząśnij kolbami poziomo, aby rozprowadzić komórki i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. W tym protokole komórki pierwotne wyłonione z eksplantatów obserwowano pod standardowym mikroskopem świetlnym. Wczesne zbiory mioblastów pojawiały się jako małe okrągłe i jasne kule.

Różnicowanie mioblastów trwało od czterech do sześciu dni, podczas których morfologia komórek zmieniła się z pojedynczych okrągłych kul na wydłużone, połączone, długie, wielojądrowe włókna. Uzyskano w pełni zróżnicowane rurki miotube, które były gotowe do pomiaru wskaźników zużycia tlenu. Ogniwa te mogą być wykorzystywane do wielu dalszych zastosowań.

Na przykład, często używamy ich do badania strumienia substratu w instrumentach Seahorse.