Name: Fenotypowanie funkcji płuc myszy in vivo ze zdolnością dyfuzyjną płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę pomiaru dyfuzyjnej zdolności płuc u myszy za pomocą skalibrowanego chromatografu gazowego. Technika ta umożliwia ocenę funkcji płuc w różnych modelach chorób z możliwością bezpośredniego porównania z danymi ludzkimi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH HL-10342

UWAGA: Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Przygotuj 6 myszy kontrolnych C57BL/6 do pomiaru DFCO, znieczulając je ketaminą i ksylazyną, jak opisano w kroku 2.3 poniżej.</li>
	<li>Przygotuj wszystkie inne myszy z różnymi patologiami płuc pokazanymi w Tabeli 1, stosując tę samą procedurę, co w przypadku kontroli. Szczegółowe informacje potrzebne do ustalenia każdego z tych modeli można znaleźć w odpowiednich odniesieniach. Myszy kontrolne i te z innych kohort patologicznych są w wieku 6-12 tygodni.</li>
</ol>
2. Pomiar współczynnika dyfuzji tlenku węgla (DFCO)
<ol>
	<li>Skonfiguruj moduł chromatografu gazowego dostarczony z maszyną do pomiaru pików azotu, tlenu, neonu i tlenku węgla. Do tego zastosowania należy używać wyłącznie danych neonu i CO. 
	UWAGA: Ten instrument wykorzystuje kolumnę sita molekularnego z helem jako gazem nośnym, z folią 12,00 μm, średnicą wewnętrzną 320,00 μm i długością 10 m. Kolumna chromatografu ma objętość 0,8 ml, ale użyliśmy 2 ml, aby zapewnić odpowiednie udrażnienie rurki łączącej z próbką.</li>
	<li>Na początku każdego dnia doświadczalnego, przed wykonaniem pomiarów próbek od myszy, należy pobrać próbkę o objętości 2 ml bezpośrednio z worka na mieszaninę gazów zawierającego około 0,5% Ne, 0,5% CO i powietrza równoważącego, a następnie użyć tej próbki do kalibracji chromatografu gazowego.</li>
	<li>Znieczulij myszy ketaminą (90 mg/kg) i ksylazyną (15 mg/kg) i potwierdź znieczulenie przez brak ruchu odruchowego. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Tracheostomię myszy za pomocą kaniuli igłowej (18 G u dorosłych lub 20 G u bardzo młodych myszy). 
	UWAGA: DFCO jest zakończone w mniej niż 10 minut po znieczuleniu i przed jakąkolwiek wentylacją mechaniczną lub innymi zabiegami.</li>
	<li>U myszy w wieku powyżej 6 tygodni należy użyć strzykawki o pojemności 3 ml, aby pobrać 0,8 ml gazu z worka z mieszaniną gazów. Podłącz strzykawkę do kaniuli tchawicy i szybko napompuj płuco. Za pomocą metronomu odlicz 9 sekund, a następnie szybko odciągnij 0,8 ml (wydychane powietrze).</li>
	<li>To pobrane 0,8 ml wydychanego powietrza rozcieńczyć do 2 ml powietrzem z pomieszczenia, pozostawić na co najmniej 15 sekund. Następnie wstrzyknąć całą próbkę do chromatografu gazowego w celu analizy.</li>
	<li>Analizując tę pierwszą próbkę DFCO, napompuj płuco myszy drugim 0,8 ml z worka z mieszaniną gazów, a następnie przetrzyj tę próbkę identycznie jak pierwszą próbkę. Uśrednij dwa pomiary DFCO. 
	UWAGA: Do pomiarów u myszy w wieku zaledwie 2 tygodni należy użyć objętości 0,4 ml, ponieważ 0,8 ml to zbyt duża objętość, aby dokonać pomiarów w płucach bardzo młodych myszy. Lepiej jest użyć objętości 0,8 ml dla myszy starszych niż 6 tygodni, a jeśli objętość 0,4 ml jest potrzebna dla niektórych myszy, należy ją stosować konsekwentnie dla wszystkich myszy w badanej kohorcie.</li>
	<li>Obliczyć DFCO jako 1 – (CO9 / COc) / (Ne9 / Nec), gdzie indeksy dolne c i 9 odnoszą się odpowiednio do stężeń wstrzykiwanych gazów kalibracyjnych i gazów usuwanych po 9-sekundowym czasie wstrzymania oddechu.</li>
	<li>Analizuj i porównuj różnice za pomocą jednokierunkowej ANOVA i oceń poziom istotności za pomocą poprawki Tukeya dla wielokrotnych porównań we wszystkich myszach kohortowych. Za wartość znaczącą należy uznać p <0,05. 
	UWAGA: Wszystkie myszy użyte tutaj były częścią badań eksperymentalnych obejmujących kilka kolejnych pomiarów wentylacji płuc, mechaniki, płukania płuc lub histologii, które nie są tutaj opisane. Ponadto, ponieważ metoda jest taka sama we wszystkich modelach eksperymentalnych, jak to zostało zrobione powyżej u myszy kontrolnych, przedstawiono tylko wyniki z różnych modeli patologicznych. Więcej informacji na temat tych modeli znajduje się w tabeli uzupełniającej.</li>
	<li>Poddaj zwierzęta eutanazji przez przedawkowanie głębokiego znieczulenia, a następnie zwichnięcie szyjki macicy lub ścięcie głowy. W razie potrzeby należy usunąć komórki i/lub tkanki płuc od martwych myszy w celu dalszego przetwarzania i analizy biologicznej lub histologicznej.</li>
</ol>

<ol><li>Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+breath+holding+technique+for+the+clinical+measurement+of+the+diffusing+capacity+of+the+lung+for+carbon+monoxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide.</a> J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).</li>
<li>Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusing+capacity+and+forced+vital+capacity+in+5%2C003+asbestos-exposed+workers%3A+Relationships+to+interstitial+fibrosis+%28ILO+profusion+score%29+and+pleural+thickening%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ind+Med%22%5BJournal%5D)">Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening.</a> Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).</li>
<li>Enelow, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+consequences+of+alveolar+cell+recognition+by+CD8%28%2B%29+T+lymphocytes+in+experimental+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease.</a> J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).</li>
<li>Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+mechanical+and+immunologic+dysfunction+in+a+murine+model+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS.</a> Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).</li>
<li>Wegner, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+adhesion+molecule-1+contributes+to+pulmonary+oxygen+toxicity+in+mice%3A+role+of+leukocytes+revised%5BTitle%5D)+AND+%22Lung%22%5BJournal%5D)">Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised.</a> Lung. 170 (5), 267-279 (1992).</li>
<li>Reinhard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbred+strain+variation+in+lung+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Inbred strain variation in lung function.</a> Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).</li>
<li>Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+Clara+cell+toxin%2C+4-ipomeanol%2C+on+pulmonary+function+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats.</a> J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).</li>
<li>Depledge, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration+and+lung+function+in+the+mouse%2C+Mus+musculus+%28with+a+note+on+mass+exponents+and+respiratory+variables%29%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables).</a> Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).</li>
<li>Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+measuring+carbon+monoxide+uptake+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).</li>
<li>Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Carbon+Monoxide+Diffusing+Capacity+in+the+Mouse+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung.</a> J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).</li>
<li>Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+regulates+epithelial+cell+response+to+Aspergillus+and+resultant+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation.</a> Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).</li>
<li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).</li>
<li>Yildirim, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palifermin+induces+alveolar+maintenance+programs+in+emphysematous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).</li>
<li>Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+vaccination+as+a+novel+treatment+for+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis.</a> PLoS One. 7 (2), e31299(2012).</li>
<li>Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li>
<li>Martinez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+course+of+patients+with+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+lethal+intestinal+defect+in+a+mouse+model+of+cystic+fibrosis+by+human+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR.</a> Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).</li>
</ol>

Żadnych konfliktów interesów i nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy zdefiniowaliśmy nową metrykę do ilościowego określenia zdolności płuc myszy do wymiany gazów. Wskaźnik ten jest analogiczny do zdolności dyfuzyjnej, powszechnej miary klinicznej, która mierzy podstawową funkcję płuc, czyli ich zdolność do wymiany gazu. Zdolność dyfuzyjna jest jedynym pomiarem funkcjonalnym płuc, który można łatwo i szybko wykonać zarówno u myszy, jak i u ludzi. W przypadku wykrywania chorób płuc u myszy głównym celem jest ilościowe określenie zmian w czynności płuc między kohortami kon...

Mysz jest teraz głównym zwierzęciem używanym do modelowania różnych chorób płuc. Aby zbadać mechanizmy, które leżą u podstaw takich patologii, potrzebne są metody fenotypowe, które mogą określić ilościowo zmiany patologiczne. Chociaż istnieje wiele badań na myszach, w których mierzy się mechanikę wentylacji, pomiary te są na ogół niezwiązane ze standardowymi ocenami czynności płuc zwykle wykonywanymi u ludzi. Jest to niefortunne, ponieważ możliwość wykonywania równoważnych pomiarów u myszy i ludzi może ułatwić przełożenie wyników w modelach mysich na choroby ludzkie.
Jednym z najczęstszych i najłatwiejszych do wykonania pomiarów u ludzi jest zdolność dyfuzji tlenku węgla (DLCO)1,2, ale ten pomiar rzadko był wykonywany w modelach mysich. W tych badaniach, w których zgłoszono3-7 przypadków, nie przeprowadzono badań uzupełniających, częściowo dlatego, że procedury są często uciążliwe lub mogą wymagać skomplikowanego sprzętu. Innym podejściem jest zastosowanie metody ponownego oddychania CO w systemie w stanie ustalonym, który ma tę zaletę, że jest w stanie zmierzyć dyfuzję CO u świadomych myszy. Jednak ta metoda jest bardzo uciążliwa, a wyniki mogą się różnić w zależności od poziomu wentylacji myszy, a także stężeń O2 i CO2 8,9. Wydaje się, że trudności te uniemożliwiły rutynowe stosowanie zdolności dyfuzyjnej do wykrywania patologii płuc u myszy, pomimo jej kilku zalet.
Aby obejść problemy z pomiarem zdolności dyfuzyjnej u myszy, ostatnio opisano szczegóły prostego sposobu jej pomiaru u myszy10. Procedura eliminuje trudny problem pobierania próbek niezanieczyszczonego gazu pęcherzykowego poprzez szybkie pobranie próbki objętości równej całemu wdychanemu gazowi. Procedura ta daje bardzo powtarzalny pomiar, określany jako współczynnik dyfuzji tlenku węgla (DFCO), który jest wrażliwy na wiele patologicznych zmian w fenotypie płuc. DFCO oblicza się zatem jako 1 – (CO9 / COc) / (Ne9 / Nec), gdzie indeksy dolne c i 9 odnoszą się odpowiednio do stężeń wstrzykiwanych gazów kalibracyjnych i gazów usuwanych po 9-sekundowym czasie wstrzymania oddechu. DFCO jest zmienną bezwymiarową, która waha się między 0 a 1, gdzie 1 oznacza całkowity absorpcję całego CO, a 0 oznacza brak absorpcji CO.
W tej prezentacji pokazujemy, jak dokonać pomiaru zdolności dyfuzyjnej i jak można go użyć do udokumentowania zmian w prawie wszystkich istniejących modelach chorób płuc myszy, w tym rozedmy płuc, zwłóknienia, ostrego uszkodzenia płuc oraz infekcji wirusowych i grzybiczych.

<table><tbody><tr><td>Chromatograf gazowy</td><td>Inficon</td><td>Micro GC Model 3000A</td><td>Agilent produkuje porównywalny model</td></tr><tr><td>18 G Igła Luer Becton</td><td>Dickenson</td><td></td><td>Kilku innych możliwych sprzedawców</td></tr><tr><td>Plastikowa strzykawka 3 ml</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td>Kilku innych możliwych dostawców</td></tr><tr><td>Worki na próbki gazu polipropylenowego</td><td>Pojemność SKC 1 lub 2 L</td><td></td><td>dobrze sprawdzają się inne gazoszczelne worki</td></tr><tr><td>Zbiornik gazu, 0,3% Ne, 0,3% CO, powietrze równoważące; (rozmiar ME)</td><td>Airgas, Inc</td><td>Z04 NI785ME3012</td><td>Jest to standardowa mieszanina stosowana do DLCO u ludzi</td></tr><tr><td>25 TCID50 / myszy wirusa grypy A / PR8 rozcieńczonego w buforze fosforanowym soli fizjologicznej.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastaza trzustkowa wieprzowa</td><td>Produkty elastynowe, Owensville, MO</td><td></td><td>5.4</td></tr><tr><td>U Bleomycin</td><td>APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL</td><td></td><td>0,25 U</td></tr><tr><td>Escherichia coli LPS</td><td>Sigma L2880</td><td></td><td>3 &mu; g/g masy ciała; O55: B5</td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatus (izolat Af293) konidia zebrano z dojrzałych kolonii wyhodowanych na agarze z dekstrozą ziemniaczaną.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fenotypowanie funkcji płuc myszy in vivo ze zdolnością dyfuzyjną płuc

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

Mysz jest teraz głównym zwierzęciem używanym do modelowania różnych chorób płuc. Aby zbadać mechanizmy, które leżą u podstaw takich patologii, potrzebne są metody fenotypowe, które mogą określić ilościowo zmiany patologiczne. Ponadto, aby zapewnić znaczenie translacyjne dla modeli mysich, takie pomiary powinny być testami, które można łatwo przeprowadzić zarówno na ludziach, jak i na myszach. Niestety, w obecnym piśmiennictwie niewiele fenotypowych pomiarów czynności płuc ma bezpośrednie zastosowanie u ludzi. Jednym z wyjątków jest zdolność dyfuzji tlenku węgla, która jest pomiarem rutynowo wykonywanym u ludzi. W niniejszym raporcie opisujemy sposób szybkiego i prostego pomiaru tej zdolności dyfuzyjnej u myszy. Procedura polega na krótkim napompowaniu płuc gazami znakującymi w znieczulonej myszy, a następnie 1-minutowym czasie analizy gazu. Przetestowaliśmy zdolność tej metody do wykrywania kilku patologii płuc, w tym rozedmy płuc, zwłóknienia, ostrego uszkodzenia płuc oraz grypy i grzybiczych infekcji płuc, a także monitorowania dojrzewania płuc u młodych szczeniąt. Wyniki wskazują na znaczne zmniejszenie wszystkich patologii płuc, a także wzrost zdolności dyfuzji wraz z dojrzewaniem płuc. Ten pomiar zdolności dyfuzyjnej płuc zapewnia zatem test czynnościowy płuc, który ma szerokie zastosowanie dzięki zdolności do wykrywania fenotypowych zmian strukturalnych w większości istniejących patologicznych modeli płuc.

Rysunek 1 przedstawia pomiary DFCO u dorosłych myszy w grupach A, B, C, D, E i F. Odnotowano istotne spadki zarówno przy infekcjach Aspergillus, jak i grypą, a także istotne spadki w modelach włóknienia, rozedmy i ostrego uszkodzenia płuc. Rysunek 2 przedstawia zmiany rozwojowe DFCO w czasie w grupie G, w miarę starzenia się myszy od 2. do 6. tygodnia. W tym przedziale czasowym zaobserwowano niewielki, ale istotny wzrost wraz z rozwojem płuc. Efekt zastosowania mniejszej objętości inflac...

Opisujemy sposób szybkiego i prostego pomiaru zdolności dyfuzyjnej płuc u myszy i pokazujemy, że jest ona wystarczająco wrażliwa na zmiany fenotypu w wielu powszechnych patologiach płuc. Metryka ta ma zatem bezpośrednie znaczenie translacyjne dla modeli mysich, ponieważ zdolność dyfuzji można również łatwo zmierzyć u ludzi.

Fenotypowanie funkcji płuc myszy in vivo ze zdolnością dyfuzyjną płuc

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest nauczenie się, jak mierzyć zdolność dyfuzyjną płuc myszy za pomocą skalibrowanego chromatografu gazowego. Osiąga się to poprzez napompowanie płuc znieczulonej myszy gazem zawierającym neon i tlenek węgla, zatrzymanie gazu w płucach przez dziewięć sekund i zebranie gazu. Gaz pobrany z płuc jest następnie rozcieńczany do dwóch mililitrów i wstrzykiwany do chromatografu gazowego.Zróżnicowany wychwyt neonu i tlenku węgla w płucach służy do obliczenia zdolności dyfuzyjnej. Pomiar ten może być wykorzystany do oceny utraty funkcji płuc w szerokim spektrum modeli chorób płuc. Główną zaletą tej techniki w porównaniu ze wszystkimi innymi istniejącymi metodami pomiaru czynności płuc u myszy jest to, że jest to bardzo prosty, powtarzalny pomiar, który można bezpośrednio porównać z podobnymi pomiarami u ludzi.Metoda ta może być stosowana do śledzenia zmian w strukturze płuc, które występują w przypadku różnych patologii płuc. Protokół ten rozpoczyna się od skonfigurowania modułu chromatografu gazowego dostarczonego z maszyną do pomiaru pików azotu, tlenu, neonu i tlenku węgla. Do tego zastosowania potrzebne są tylko dane dotyczące neonu i tlenku węgla.Przyrząd wykorzystuje kolumnę z sitem molekularnym z helem jako gazem nośnym. Ten konkretny chromatograf gazowy ma kolumnę o pojemności 0,8 mililitra, a próbka o pojemności dwóch mililitrów jest używana w celu zapewnienia odpowiedniego oczyszczenia tej kolumny przed rozpoczęciem. Seria pomiarów zawsze kalibruje maszynę przy użyciu dwóch mililitrów gazu bezpośrednio z worka na próbkę gazu.Pierwszym pikiem, który się pojawia, jest neon, następnie tlen i azot, których nie mierzymy w tej procedurze. Wreszcie pik tlenku węgla pojawia się czas chromatografu gazowego. Zmierzenie wszystkich tych szczytów zajmuje niecałą minutę.Na początek znieczulij myszy ketaminą i ksylazyną. Potwierdź znieczulenie przez brak ruchu odruchowego w odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi. Następnie, aby chronić oczy, nałóż maść weterynaryjną, a następnie tracheostomię myszy za pomocą kaniuli studen.Użyj kaniuli o rozmiarze 18 dla dorosłych lub kaniuli o rozmiarze 20 dla bardzo młodych myszy. Następnie uruchom metronom ze słyszalnymi kliknięciami co sekundę. W przypadku myszy starszych niż sześć tygodni użyj trzymililitrowej strzykawki, aby pobrać 0,8 mililitra gazu z worka z mieszanką gazów.Jeśli mysz ma mniej niż cztery tygodnie, użyj 0,4 mililitra gazu, a następnie podłącz strzykawkę do kaniuli tchawicy i szybko napompuj płuca. Zacznij liczyć w myślach od jednego do 10 synchronicznie z kliknięciami metronomu. Gdy liczba osiągnie 10, szybko wycofaj objętość 0,8 mililitra.Rozcieńczyć ten wydychany gaz do dwóch mililitrów, dodając pomieszczenie, powietrze i wagę przez co najmniej 15 sekund. Bardzo ważne jest, aby napompować i opróżnić płuca tak szybko, jak to możliwe. Szybkie napompowanie jest bardzo łatwe, ale wymaga trochę praktyki, aby szybko pobrać 0,8 ml, a następnie wstrzyknąć całą próbkę do chromatografu gazowego.W przypadku analizy ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki podczas przenoszenia do i od zwierzęcia oraz do chromatografu gazowego. Można to zrobić ostrożnie, zakrywając znak palcem Podczas gdy GC mierzy próbkę. Napompuj płuco myszy kolejnym 0,8 mililitra mieszaniny gazów z torby, a następnie przetwórz tę próbkę identycznie jak pierwszą.Korzystając ze średnich wartości z dwóch pomiarów, oblicz DFCO. Indeks dolny C odnosi się do gazów kalibracyjnych, a indeks dolny dziewięć odnosi się do próbek pobranych od zwierzęcia. Po dziewięciosekundowym wstrzymaniu oddechu.Nominalna kontrolna wartość DFCO pobrana z czarnych sześciu myszy C 57 wynosi około 0,77. W badaniu z zastosowaniem modelu grypy PR 8 zaobserwowano postępującą utratę funkcji w szóstym i ósmym dniu w modelu rozedmy płuc 21 dni po instalacji elastazy. DFCO było umiarkowanie obniżone, ale zaobserwowano znacznie większe zmiany w modelu zwłóknienia wywołanego instalacją Blio Mycin.Szlak zwłóknienia spowodowany przez bleomycynę spowodował największą zmianę DFCO zaobserwowaną w jakimkolwiek z modeli patologicznych. Jest to ważne, ponieważ zdolność dyfuzji jest również wiarygodnym markerem zwłóknienia u ludzi. Gen CFTR odgrywa kluczową rolę w mukowiscydozie, a w badaniu myszy pozbawionych tego genu nastąpił znaczny spadek DFCO.DFCO zostało dodatkowo zmniejszone w przypadku infekcji grzybiczej u tych myszy z nokautem. Powszechnie stosowanym modelem urazu płuc jest LPS. U myszy narażonych na LPS nastąpiła postępująca zależna od czasu utrata funkcji płuc od pierwszego do czwartego dnia, co oceniano za pomocą pomiarów DFCO, pomiar DFCO można z powodzeniem wykonać u myszy w wieku dwóch tygodni.Mniejszy rozmiar płuca wymaga mniejszej objętości napompowania wynoszącej 0,4 mililitra. DFCO mierzone przy tej mniejszej objętości jest w stanie wykazać oczekiwany wzrost w miarę dojrzewania płuc po opanowaniu. Technikę tę można wykonać w ciągu zaledwie kilku minut na mysz przed wykonaniem jakichkolwiek innych pomiarów lub ocen funkcji płuc.Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że etap napełniania i opróżniania został wykonany szybko oraz aby zachować ostrożność podczas przenoszenia próbki, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

phenotyping-mouse-pulmonary-function-vivo-with-lung-diffusing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procedur wymaganych do wykonania pomiarów mechaniki układu oddechowego, jak również oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada).

Ocena mechaniki układu oddechowego u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Tutaj prezentujemy protokół prostego i wiarygodnego pomiaru krzywej ciśnienia i objętości płuc u myszy, pokazując, że jest ona wystarczająco czuła, aby wykryć fenotypowe zmiany miąższowe w dwóch powszechnych patologiach płuc, zwłóknieniu płuc i rozedmie płuc. Ta metryka zapewnia sposób na ilościowe określenie zmian strukturalnych płuc wraz z rozwijającą się patologią.

Pomiar krzywej ciśnienie-objętość w płucach myszy

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Częstość występowania otyłości wzrasta i zwiększa ryzyko przewlekłych chorób płuc. Aby ustalić podstawowe mechanizmy i strategie zapobiegawcze, potrzebne są dobrze zdefiniowane modele zwierzęce. W tym miejscu przedstawiamy trzy metody (test tolerancji glukozy, pletysmografia ciała i stabilizacja płuc) w celu zbadania wpływu otyłości na wyniki płucne u myszy.

Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.

Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Prezentowany tutaj jest użyteczny protokół do unieruchomienia płuc, który tworzy stabilne warunki do oceny histologicznej próbek płuc z mysiego modelu rozedmy płuc. Główną zaletą tego modelu jest to, że może naprawić wiele płuc przy tym samym stałym ciśnieniu bez zapadania się płuc lub opróżniania.

Unieruchomienie płuc pod stałym ciśnieniem w celu oceny rozedmy płuc u myszy

Przedstawiamy protokół modelowania włóknienia płuc u myszy z wykorzystaniem aerozozolizowanej bleomycyny podanej przez tchawicę. Ta zoptymalizowana metoda umożliwia jednolite, ilościowe i precyzyjne podanie bez nacięcia chirurgicznego, zwiększając powtarzalność i wiarygodność włóknienia wywołanego bleomycyną.

Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

Ortotopowe modele zwierzęce raka jajnika lepiej odwzorowują przebieg choroby u ludzi, a tym samym zwiększają naszą wiedzę na temat progresji nowotworu i odpowiedzi guza na terapię. W modelu mysim wykonuje się wstrzyknięcie do wnętrza woreczka otrzewnej komórek nowotworu jajnika wykazujących ekspresję lucyferazy. Leczenie podaje się poprzez zgłębnik żołądkowy. Wzrost guza monitoruje się za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obrazowanie in vivo i leczenie terapeutyczne w ortotopowym modelu raka jajnika u myszy

Poniższy protokół opisuje proces izolacji, wentylacji i instrumentacji płuc myszy w celu pomiaru stacjonarnych lub pulsacyjnych zależności między ciśnieniem a przepływem w naczyniach płucnych, aby określić wpływ przepływu krwi, przepływu powietrza, zmian w drogach oddechowych i zmian naczyniowych na obciążenie następcze prawej komory.

Charakterystyka izolowanego, wentylowanego i opomiarowanego płuca mysiego poddanego perfuzji przepływem pulsacyjnym

Poznaj metodę pomiaru dyfuzyjnej zdolności płuc u myszy za pomocą skalibrowanego chromatografu gazowego. Technika ta umożliwia ocenę funkcji płuc w różnych modelach chorób z możliwością bezpośredniego porównania z danymi ludzkimi.

Fenotypowanie funkcji płuc myszy in vivo ze zdolnością dyfuzyjną płuc

Przeglądaj więcej filmów