Fenotypowanie funkcji płuc myszy in vivo ze zdolnością dyfuzyjną płuc
6 stycznia 2015
Opisujemy sposób szybkiego i prostego pomiaru zdolności dyfuzyjnej płuc u myszy i pokazujemy, że jest ona wystarczająco wrażliwa na zmiany fenotypu w wielu powszechnych patologiach płuc. Metryka ta ma zatem bezpośrednie znaczenie translacyjne dla modeli mysich, ponieważ zdolność dyfuzji można również łatwo zmierzyć u ludzi.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest nauczenie się, jak mierzyć zdolność dyfuzyjną płuc myszy za pomocą skalibrowanego chromatografu gazowego. Osiąga się to poprzez napompowanie płuc znieczulonej myszy gazem zawierającym neon i tlenek węgla, zatrzymanie gazu w płucach przez dziewięć sekund i zebranie gazu. Gaz pobrany z płuc jest następnie rozcieńczany do dwóch mililitrów i wstrzykiwany do chromatografu gazowego.
Zróżnicowany wychwyt neonu i tlenku węgla w płucach służy do obliczenia zdolności dyfuzyjnej. Pomiar ten może być wykorzystany do oceny utraty funkcji płuc w szerokim spektrum modeli chorób płuc. Główną zaletą tej techniki w porównaniu ze wszystkimi innymi istniejącymi metodami pomiaru czynności płuc u myszy jest to, że jest to bardzo prosty, powtarzalny pomiar, który można bezpośrednio porównać z podobnymi pomiarami u ludzi.
Metoda ta może być stosowana do śledzenia zmian w strukturze płuc, które występują w przypadku różnych patologii płuc. Protokół ten rozpoczyna się od skonfigurowania modułu chromatografu gazowego dostarczonego z maszyną do pomiaru pików azotu, tlenu, neonu i tlenku węgla. Do tego zastosowania potrzebne są tylko dane dotyczące neonu i tlenku węgla.
Przyrząd wykorzystuje kolumnę z sitem molekularnym z helem jako gazem nośnym. Ten konkretny chromatograf gazowy ma kolumnę o pojemności 0,8 mililitra, a próbka o pojemności dwóch mililitrów jest używana w celu zapewnienia odpowiedniego oczyszczenia tej kolumny przed rozpoczęciem. Seria pomiarów zawsze kalibruje maszynę przy użyciu dwóch mililitrów gazu bezpośrednio z worka na próbkę gazu.
Pierwszym pikiem, który się pojawia, jest neon, następnie tlen i azot, których nie mierzymy w tej procedurze. Wreszcie pik tlenku węgla pojawia się czas chromatografu gazowego. Zmierzenie wszystkich tych szczytów zajmuje niecałą minutę.
Na początek znieczulij myszy ketaminą i ksylazyną. Potwierdź znieczulenie przez brak ruchu odruchowego w odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi. Następnie, aby chronić oczy, nałóż maść weterynaryjną, a następnie tracheostomię myszy za pomocą kaniuli studen.
Użyj kaniuli o rozmiarze 18 dla dorosłych lub kaniuli o rozmiarze 20 dla bardzo młodych myszy. Następnie uruchom metronom ze słyszalnymi kliknięciami co sekundę. W przypadku myszy starszych niż sześć tygodni użyj trzymililitrowej strzykawki, aby pobrać 0,8 mililitra gazu z worka z mieszanką gazów.
Jeśli mysz ma mniej niż cztery tygodnie, użyj 0,4 mililitra gazu, a następnie podłącz strzykawkę do kaniuli tchawicy i szybko napompuj płuca. Zacznij liczyć w myślach od jednego do 10 synchronicznie z kliknięciami metronomu. Gdy liczba osiągnie 10, szybko wycofaj objętość 0,8 mililitra.
Rozcieńczyć ten wydychany gaz do dwóch mililitrów, dodając pomieszczenie, powietrze i wagę przez co najmniej 15 sekund. Bardzo ważne jest, aby napompować i opróżnić płuca tak szybko, jak to możliwe. Szybkie napompowanie jest bardzo łatwe, ale wymaga trochę praktyki, aby szybko pobrać 0,8 ml, a następnie wstrzyknąć całą próbkę do chromatografu gazowego.
W przypadku analizy ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki podczas przenoszenia do i od zwierzęcia oraz do chromatografu gazowego. Można to zrobić ostrożnie, zakrywając znak palcem Podczas gdy GC mierzy próbkę. Napompuj płuco myszy kolejnym 0,8 mililitra mieszaniny gazów z torby, a następnie przetwórz tę próbkę identycznie jak pierwszą.
Korzystając ze średnich wartości z dwóch pomiarów, oblicz DFCO. Indeks dolny C odnosi się do gazów kalibracyjnych, a indeks dolny dziewięć odnosi się do próbek pobranych od zwierzęcia. Po dziewięciosekundowym wstrzymaniu oddechu.
Nominalna kontrolna wartość DFCO pobrana z czarnych sześciu myszy C 57 wynosi około 0,77. W badaniu z zastosowaniem modelu grypy PR 8 zaobserwowano postępującą utratę funkcji w szóstym i ósmym dniu w modelu rozedmy płuc 21 dni po instalacji elastazy. DFCO było umiarkowanie obniżone, ale zaobserwowano znacznie większe zmiany w modelu zwłóknienia wywołanego instalacją Blio Mycin.
Szlak zwłóknienia spowodowany przez bleomycynę spowodował największą zmianę DFCO zaobserwowaną w jakimkolwiek z modeli patologicznych. Jest to ważne, ponieważ zdolność dyfuzji jest również wiarygodnym markerem zwłóknienia u ludzi. Gen CFTR odgrywa kluczową rolę w mukowiscydozie, a w badaniu myszy pozbawionych tego genu nastąpił znaczny spadek DFCO.
DFCO zostało dodatkowo zmniejszone w przypadku infekcji grzybiczej u tych myszy z nokautem. Powszechnie stosowanym modelem urazu płuc jest LPS. U myszy narażonych na LPS nastąpiła postępująca zależna od czasu utrata funkcji płuc od pierwszego do czwartego dnia, co oceniano za pomocą pomiarów DFCO, pomiar DFCO można z powodzeniem wykonać u myszy w wieku dwóch tygodni
.Mniejszy rozmiar płuca wymaga mniejszej objętości napompowania wynoszącej 0,4 mililitra. DFCO mierzone przy tej mniejszej objętości jest w stanie wykazać oczekiwany wzrost w miarę dojrzewania płuc po opanowaniu. Technikę tę można wykonać w ciągu zaledwie kilku minut na mysz przed wykonaniem jakichkolwiek innych pomiarów lub ocen funkcji płuc.
Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że etap napełniania i opróżniania został wykonany szybko oraz aby zachować ostrożność podczas przenoszenia próbki, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę pomiaru pojemności dyfuzyjnej płuc u myszy przy użyciu skalibrowanego chromatografu gazowego. Technika ta jest wrażliwa na zmiany fenotypu w różnych patologiach płuc, co sprawia, że jest istotna dla badań translacyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Fizjologia oddychania
- Badania translacyjne
Tło
- Pojemność dyfuzyjna płuc jest krytyczną miarą czynności płuc.
- Istniejące metody pomiaru czynności płuc u myszy mogą być złożone.
- Porównawcze badania między myszami a ludźmi są istotne dla translacyjnej istotności.
- Potrzebne są proste i powtarzalne techniki do efektywnych badań.
Cel badania
- Opracowanie prostej metody pomiaru pojemności dyfuzyjnej płuc u myszy.
- Ocenienie utraty czynności płuc w różnych modelach chorób płuc.
- Ułatwienie porównania pomiarów czynności płuc między myszami a ludźmi.
Zastosowane metody
- Inflacja podawanych znieczuleniem płuc myszy mieszanką gazów zawierającą neon i tlenek węgla.
- Trzymanie gazu w płucach przez dziewięć sekund przed pobraniem.
- Rozcieńczenie pobranego gazu do dwóch mililitrów w celu analizy.
- Użycie chromatografu gazowego do zmierzenia różnicowego poboru gazów.
Główne wyniki
- Metoda zapewnia wiarygodne pomiary pojemności dyfuzyjnej płuc.
- Jest wrażliwa na zmiany czynności płuc związane z różnymi patologiami.
- Technika jest prosta i powtarzalna, co zwiększa jej przydatność w badaniach.
- Wyniki można bezpośrednio porównać z podobnymi pomiarami u ludzi.
Wnioski
- Ta metoda oferuje cennego narzędzia do oceny czynności płuc w modelach mysich.
- Wspiera badania translacyjne, łącząc pomiary między myszami a ludźmi.
- Przyszłe badania mogą wykorzystywać tę technikę do skuteczniejszego badania patologii płuc.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Measuring lung diffusing capacity in mice provides a translational pulmonary function test that enables direct comparison with human clinical data. This approach supports phenotypic characterization of lung disease models and enhances predictive confidence in preclinical target validation. The method’s simplicity and reproducibility facilitate integration into discovery workflows for mechanistic de-risking and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lung function loss across emphysema, fibrosis, acute lung injury, and infection models.
- Operational Value: Provides a rapid, reproducible assay for functional target validation in murine lung pathology studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, gas-exchange-based readouts suitable for screening compound effects on lung structure and function.
- Operational Value: Standardized procedure with <1-minute readout supports high-throughput phenotypic screening in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human diffusing capacity measurements, enabling cross-species biomarker alignment and translational continuity.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by detecting early functional changes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering a phenotypic bridge between murine models and human clinical endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting structural lung changes via functional gas exchange metrics.
- Screening: Enables assay readiness through standardized gas collection and chromatographic analysis of neon and carbon monoxide uptake.
- Analytics: Generates quantitative diffusing capacity (DFCO) values that allow comparison of lung function across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects murine phenotypes to human clinical relevance through direct comparability of diffusing capacity measurements.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for longitudinal lung function monitoring across multiple disease models and study phases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lung pathology models through quantitative phenotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via rapid gas injection, breath-hold, and GC analysis workflow.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, translationally relevant functional readouts that reduce late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on lung function preservation or improvement in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, tracheal cannulation, and gas handling techniques.
- Dependent on access to a calibrated gas chromatograph with molecular sieve column and helium carrier gas.
- Necessitates cross-team standardization of gas volumes, inflation timing, and sample dilution protocols.
- Involves adaptation considerations for neonatal vs. adult mice due to lung size and required gas volumes (0.4 mL vs. 0.8 mL).
- Includes practical limitations such as the need to prevent sample contamination during transfer and the importance of rapid lung inflation/deflation for accurate measurements.
