Fenotypowanie funkcji płuc myszy in vivo ze zdolnością dyfuzyjną płuc

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest nauczenie się, jak mierzyć zdolność dyfuzyjną płuc myszy za pomocą skalibrowanego chromatografu gazowego. Osiąga się to poprzez napompowanie płuc znieczulonej myszy gazem zawierającym neon i tlenek węgla, zatrzymanie gazu w płucach przez dziewięć sekund i zebranie gazu. Gaz pobrany z płuc jest następnie rozcieńczany do dwóch mililitrów i wstrzykiwany do chromatografu gazowego.

Zróżnicowany wychwyt neonu i tlenku węgla w płucach służy do obliczenia zdolności dyfuzyjnej. Pomiar ten może być wykorzystany do oceny utraty funkcji płuc w szerokim spektrum modeli chorób płuc. Główną zaletą tej techniki w porównaniu ze wszystkimi innymi istniejącymi metodami pomiaru czynności płuc u myszy jest to, że jest to bardzo prosty, powtarzalny pomiar, który można bezpośrednio porównać z podobnymi pomiarami u ludzi.

Metoda ta może być stosowana do śledzenia zmian w strukturze płuc, które występują w przypadku różnych patologii płuc. Protokół ten rozpoczyna się od skonfigurowania modułu chromatografu gazowego dostarczonego z maszyną do pomiaru pików azotu, tlenu, neonu i tlenku węgla. Do tego zastosowania potrzebne są tylko dane dotyczące neonu i tlenku węgla.

Przyrząd wykorzystuje kolumnę z sitem molekularnym z helem jako gazem nośnym. Ten konkretny chromatograf gazowy ma kolumnę o pojemności 0,8 mililitra, a próbka o pojemności dwóch mililitrów jest używana w celu zapewnienia odpowiedniego oczyszczenia tej kolumny przed rozpoczęciem. Seria pomiarów zawsze kalibruje maszynę przy użyciu dwóch mililitrów gazu bezpośrednio z worka na próbkę gazu.

Pierwszym pikiem, który się pojawia, jest neon, następnie tlen i azot, których nie mierzymy w tej procedurze. Wreszcie pik tlenku węgla pojawia się czas chromatografu gazowego. Zmierzenie wszystkich tych szczytów zajmuje niecałą minutę.

Na początek znieczulij myszy ketaminą i ksylazyną. Potwierdź znieczulenie przez brak ruchu odruchowego w odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi. Następnie, aby chronić oczy, nałóż maść weterynaryjną, a następnie tracheostomię myszy za pomocą kaniuli studen.

Użyj kaniuli o rozmiarze 18 dla dorosłych lub kaniuli o rozmiarze 20 dla bardzo młodych myszy. Następnie uruchom metronom ze słyszalnymi kliknięciami co sekundę. W przypadku myszy starszych niż sześć tygodni użyj trzymililitrowej strzykawki, aby pobrać 0,8 mililitra gazu z worka z mieszanką gazów.

Jeśli mysz ma mniej niż cztery tygodnie, użyj 0,4 mililitra gazu, a następnie podłącz strzykawkę do kaniuli tchawicy i szybko napompuj płuca. Zacznij liczyć w myślach od jednego do 10 synchronicznie z kliknięciami metronomu. Gdy liczba osiągnie 10, szybko wycofaj objętość 0,8 mililitra.

Rozcieńczyć ten wydychany gaz do dwóch mililitrów, dodając pomieszczenie, powietrze i wagę przez co najmniej 15 sekund. Bardzo ważne jest, aby napompować i opróżnić płuca tak szybko, jak to możliwe. Szybkie napompowanie jest bardzo łatwe, ale wymaga trochę praktyki, aby szybko pobrać 0,8 ml, a następnie wstrzyknąć całą próbkę do chromatografu gazowego.

W przypadku analizy ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki podczas przenoszenia do i od zwierzęcia oraz do chromatografu gazowego. Można to zrobić ostrożnie, zakrywając znak palcem Podczas gdy GC mierzy próbkę. Napompuj płuco myszy kolejnym 0,8 mililitra mieszaniny gazów z torby, a następnie przetwórz tę próbkę identycznie jak pierwszą.

Korzystając ze średnich wartości z dwóch pomiarów, oblicz DFCO. Indeks dolny C odnosi się do gazów kalibracyjnych, a indeks dolny dziewięć odnosi się do próbek pobranych od zwierzęcia. Po dziewięciosekundowym wstrzymaniu oddechu.

Nominalna kontrolna wartość DFCO pobrana z czarnych sześciu myszy C 57 wynosi około 0,77. W badaniu z zastosowaniem modelu grypy PR 8 zaobserwowano postępującą utratę funkcji w szóstym i ósmym dniu w modelu rozedmy płuc 21 dni po instalacji elastazy. DFCO było umiarkowanie obniżone, ale zaobserwowano znacznie większe zmiany w modelu zwłóknienia wywołanego instalacją Blio Mycin.

Szlak zwłóknienia spowodowany przez bleomycynę spowodował największą zmianę DFCO zaobserwowaną w jakimkolwiek z modeli patologicznych. Jest to ważne, ponieważ zdolność dyfuzji jest również wiarygodnym markerem zwłóknienia u ludzi. Gen CFTR odgrywa kluczową rolę w mukowiscydozie, a w badaniu myszy pozbawionych tego genu nastąpił znaczny spadek DFCO.

DFCO zostało dodatkowo zmniejszone w przypadku infekcji grzybiczej u tych myszy z nokautem. Powszechnie stosowanym modelem urazu płuc jest LPS. U myszy narażonych na LPS nastąpiła postępująca zależna od czasu utrata funkcji płuc od pierwszego do czwartego dnia, co oceniano za pomocą pomiarów DFCO, pomiar DFCO można z powodzeniem wykonać u myszy w wieku dwóch tygodni

Mniejszy rozmiar płuca wymaga mniejszej objętości napompowania wynoszącej 0,4 mililitra. DFCO mierzone przy tej mniejszej objętości jest w stanie wykazać oczekiwany wzrost w miarę dojrzewania płuc po opanowaniu. Technikę tę można wykonać w ciągu zaledwie kilku minut na mysz przed wykonaniem jakichkolwiek innych pomiarów lub ocen funkcji płuc.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że etap napełniania i opróżniania został wykonany szybko oraz aby zachować ostrożność podczas przenoszenia próbki, aby zapobiec zanieczyszczeniu.