Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wywołanie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc lub C-O-P-D poprzez ekspozycję na ozon, O-E u myszy. Ten nowy model OE może mieć miejsce w charakterystyce mechanizmu leżącego u podstaw POChP i może być wykorzystany do badań przesiewowych nowych leków. Główną zaletą tego modelu OE jest to, że podsumowuje on procesy patologiczne pacjentów z POChP.

Można go wygenerować w ciągu zaledwie sześciu do ośmiu tygodni. Procedurę zademonstruje mi Weijaian Sang, pracownik naukowy naszej grupy. Aby wytworzyć ozon, użyj generatora elektrycznego i małej dmuchawy powietrza, aby wydmuchać powietrze na zewnątrz, uszczelniając skrzynkę z pleksiglasu przez rurę odpowietrzającą podłączoną wewnątrz i na zewnątrz skrzynki za pomocą sondy ozonu do monitorowania stężenia ozonu w skrzynce.

Gdy stężenie ozonu osiągnie 2,5 części na milion, umieść myszy w pudełku na 3 godziny. Pod koniec 7 tygodnia należy zobrazować zwierzęta poddane działaniu ozonu za pomocą mikrotomografii komputerowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Aby przetestować zmiany wywołane ozonem i zdolności funkcjonalne, takie jak zmęczenie płuc, najpierw rozgrzej myszy z prędkością 10 metrów na minutę na bieżni.

Po 5 minutach zwiększ prędkość do 15 metrów na minutę przez 10 minut. Kontynuuj zwiększanie prędkości o pięć metrów na minutę co 30 minut, aż myszy przestaną biegać. Rejestrowanie całkowitego dystansu biegu i czasu biegu dla każdego zwierzęcia odpowiednio jako dystans zmęczenia i czas zmęczenia.

Aby zmierzyć czynność płuc zwierząt narażonych na działanie ozonu, umieść znieczuloną mysz w pletyzmografie podłączonym do sterowanego komputerowo respiratora. Stosować wentylację sterowaną ciśnieniem, aby narzucić znieczulonemu zwierzęciu średnią częstotliwość oddychania wynoszącą 150 oddechów na minutę, aż do uzyskania regularnego wzorca oddychania i całkowitego wydechu przy każdym cyklu oddychania. Następnie zapisz wymuszoną objętość wydechową w pierwszych 25, 50 i 75 milisekundach wydechu, odrzucając wszelkie nieoptymalne manewry.

Po znieczuleniu końcowym użyj rurki dotchawiczej o średnicy jednego milimetra, aby przepłukać zwierzęta dwa razy jednym mililitrem PBS na płukanie. Zebrać odzyskane alokwaty z płukania od każdego zwierzęcia do odwirowania i zebrać supernatanty na ciekłym azocie. Ponownie zawieś granulki w świeżym PPS do liczenia i wyposaż dwa uchwyty na mysz w szkiełko mikroskopowe, kartę filtracyjną i lejek.

Dodaj około 100 do 125 mikrolitrów ponownie zawieszonych komórek do każdego lejka. Załaduj uchwyty do wirówki cytowirowej i obróć komórki na szkiełkach. Następnie nałóż odpowiedni roztwór barwiący na komórki zgodnie z instrukcjami producenta i policz 200 komórek na mysz pod 400-krotnym powiększeniem.

W celu pobrania próbek krwi sercowej należy pobrać około 500 mikrolitrów krwi od zwierząt narażonych na działanie ozonu poprzez nakłucie serca. I dodaj krew do 1,5 mililitrowych probówek na lodzie. Po 30 minutach na lodzie odwirować próbki krwi i przenieść supernatanty surowicy do nowych probówek w celu przechowywania na ciekłym azocie.

Próbki można później rozmrozić w celu oceny poziomu ekspresji cytokin w surowicy za pomocą testu ELISA zgodnie ze standardowymi protokołami. W celu analizy morfometrycznej płuc należy umieścić pierwszą mysz w pozycji leżącej na plecach po pobraniu próbek serca. Następnie otwórz klatkę piersiową i wypreparuj platysmę i mięśnie tchawicy przednie, aby uzyskać dostęp do pierścieni tchawicy.

Zbierz płuca i tchawicę bez oddzielania serca od płuc. Następnie użyj rurki polietylenowej PE90, aby połączyć cewnik dotchawiczy ze strzykawką zawierającą 4% formaldehydu energetycznego i całkowicie napompuj płuca około 200 mikrolitrami paraformaldehydu. Następnie umieść płuca w 15-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów świeżego formaldehydu o czteroprocentowej mocy na co najmniej cztery godziny.

Jak oceniono za pomocą tomografii mikrokomputerowej, myszy narażone na działanie ozonu wykazują znacznie większą całkowitą objętość płuc i procent obszaru o niskim tłumieniu niż zwierzęta kontrolne narażone na działanie otaczającego powietrza. O fenotypie rozedmy płuc świadczy również powiększenie pęcherzyków płucnych i zwiększona średnia liczba przecięć liniowych. Ocena czynności płuc za pomocą pletyzmografu pokazuje, że wszystkie parametry, które zmniejszają się u myszy narażonych na działanie ozonu, są zgodne z typowymi wadami czynnościowymi płuc obserwowanymi u pacjentów z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc.

Co więcej, ekspozycja na ozon znacznie skraca czas zmęczenia i dystans zmęczenia w testach tolerancji wysiłku. Zwierzęta leczone ozonem wykazują również znaczny wzrost liczby komórek zapalnych, w tym makrofagów i neutrofili, a także znaczny spadek IL-10 i wzrost IL-1 beta i TNF alfa, co pokazuje, że model ekspozycji na ozon podsumowuje objawy podobne do przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u ludzi. Postępując zgodnie z tą procedurą na innych szczepach myszy, takich jak myszy C57 BR6, można użyć do wygenerowania tego modelu OE Po opracowaniu technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się chorobami płuc do zbadania mechanizmów leżących u podstaw POChP.

Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niebezpieczna i że podczas pracy z tym odczynnikiem należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, okularów ochronnych i stosowanie roztworu wewnątrz okapu wyciągowego.