Name: Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj generowanie modelu POChP u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon. Ta metoda pozwala badać mechanizmy choroby i testować nowe leki w ciągu sześciu do ośmiu tygodni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność Panu Boyin Qin (Centrum Kliniczne Zdrowia Publicznego w Szanghaju) za pomoc techniczną przy ocenie μCT w tym protokole.

UWAGA: Model OE został wygenerowany i wykorzystany w wcześniej zgłoszonych badaniach30,31,32. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Jiaotong w Szanghaju.
1. Myszy
<ol>
	<li>Wolne od patogenów, 7- do 9-tygodniowe samice myszy BALB/c trzymane są w indywidualnych wentylowanych klatkach w pomieszczeniu dla zwierząt w kontrolowanej temperaturze (20 °C) i wilgotności (40 - 60%). Zapewnij 12 godzin światła i 12 godzin ciemności w obiekcie. Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum.</li>
</ol>
2. Narażenie na ozon lub powietrze
<ol>
	<li>Wytwarzanie ozonu za pomocą generatora elektrycznego w akrylowej skrzynce uszczelniającej (np. Perspex). Wydmuchaj powietrze ze skrzynki za pomocą małej dmuchawy powietrza przez rurę odpowietrzającą, która jest podłączona po wewnętrznej i zewnętrznej stronie skrzynki. Monitorować stężenie ozonu w pojemniku za pomocą sondy ozonu. Poczekaj, aż stężenie ozonu w pudełku osiągnie 2,5 części na milion (ppm). 
	UWAGA: Sonda ozonu może automatycznie włączać i wyłączać generator ozonu i może utrzymywać poziom ozonu w pudełku na poziomie 2.5 ppm.</li>
	<li>Umieść myszy w pudełku, gdy poziom ozonu osiągnie 2,5 ppm. Trzymaj myszy w pudełku przez 3 godziny za każdym razem, aby wystawić je na działanie ozonu. 
	UWAGA: Pudełko może utrzymać poziom ozonu 2,5 ppm w ciągu 3 godzin, automatycznie włączając lub wyłączając generator ozonu i wydmuchując CO2 wytwarzany przez myszy po wyjęciu z pudełka.</li>
	<li>Poddać dwie ekspozycje na ozon (każde z nich trwało 3 godziny) tygodniowo (raz na 3 dni) przez 7 tygodni; wystawić myszy kontrolne na działanie powietrza w tym samym czasie i przez ten sam okres.</li>
</ol>
3. Tomografia mikrokomputerowa
<ol>
	<li>Pod koniec 7. tygodnia znieczulij myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g), dostosuj dawkę do indywidualnych sytuacji, aby upewnić się, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi. Monitoruj i utrzymuj mysz na stałej częstotliwości oddychania; i upewnij się, że podczas zabiegów nie ma żadnych dobrowolnych ruchów.</li>
	<li>Umieść znieczulone myszy w komorze mikrotomografii komputerowej (μCT).</li>
	<li>Skalibruj μCT przy użyciu standardowego protokołu i instrukcji producenta. Ustaw lampę rentgenowską na 50 kV, a prąd na 450 μA. 
	UWAGA: Zarówno promieniowanie rentgenowskie, jak i detektor obracają się wokół myszy.</li>
	<li>Wykonaj analizę μCT, uzyskując 515 projekcji o efektywnym rozmiarze piksela 0,092 mm, czasie naświetlania 300 ms dla jednego wycinka i grubości warstwy 0,093 mm.</li>
	<li>Zrekonstruuj płuco na podstawie uzyskanych obrazów za pomocą oprogramowania. Dostosuj jasność obrazu w skali szarości, ustawiając minimum i maksimum skali szarości odpowiednio na -750 i -550 jednostek Hounsfielda. 
	UWAGA: Oprogramowanie automatycznie obliczy objętość miąższu płuca i obszar o niskim tłumieniu (LAA)34,35.</li>
	<li>Oblicz procentową zawartość LAA (LAA%), dzieląc objętość LAA przez całkowitą objętość płuc.</li>
</ol>
4. Test na bieżni
<ol>
	<li>Poddaj myszy testowi adaptacyjnemu z prędkością 10 m/min przez 10 minut na uruchomionej bieżni. Uwaga: Prąd jest zawsze wyłączony podczas przeprowadzania zabiegu. </li>
	<li>Przeprowadź test zmęczeniowy na myszach.
	<ol>
		<li>Rozgrzewaj myszy z prędkością 10 m/min przez 5 minut.</li>
		<li>Zwiększ prędkość do 15 m/min na 10 min.</li>
		<li>Zwiększ intensywność ćwiczeń: zwiększ prędkość o 5 m/min, zaczynając od 20 m/min, co 30 minut, aż myszy nie będą w stanie kontynuować biegu36.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz całkowity dystans biegu i czas biegu odpowiednio jako dystans zmęczenia i czas zmęczenia.</li>
</ol>
5. Pomiary funkcji płuc
<ol>
	<li>Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g), dostosować dawkę do indywidualnych sytuacji, aby zobaczyć, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi i poczekać, aż myszy utrzymają spontaniczny oddech. Monitoruj i utrzymuj mysz na stałej częstotliwości oddychania; i upewnij się, że podczas zabiegów nie ma żadnych dobrowolnych ruchów.</li>
	<li>Ostrożnie przeprowadź tracheostomię myszy i umieść je w pletyzmografie ciała, który jest podłączony do respiratora sterowanego komputerowo. 
	UWAGA: Wentylacja jest sterowana za pomocą zaworu umieszczonego proksymalnie do rurki dotchawiczej. Konfiguracja zapewnia różne manewry półautomatyczne, w tym manewr quasi-statycznej objętości ciśnienia i manewr szybkiej objętości przepływu.</li>
	<li>Nałóż znieczuloną mysz na średnią częstotliwość oddychania 150 oddechów/min poprzez wentylację sterowaną ciśnieniem, aż do uzyskania regularnego wzorca oddychania i całkowitego wydechu przy każdym cyklu oddychania.</li>
	<li>Wykonać manewr quasi-statyczne ciśnienie-objętość za pomocą urządzenia, wykorzystując podciśnienia generowane w pletyzmografie.</li>
	<li>Wykonaj manewr szybkiego przepływu w quasi-statycznych pętlach ciśnienie-objętość, aby zarejestrować FVC i FEV. Napompuj płuco do +30 cm H2O i natychmiast po tym podłącz je do silnie ujemnego ciśnienia, aby wymusić wydech, aż objętość resztkowa osiągnie -30 cm H2O. Zapisz FEV w pierwszych 25, 50 i 75 ms wydechu (odpowiednio FEV25, FEV50 i FEV75). Odrzuć nieoptymalne manewry. Dla każdego testu z każdą pojedynczą myszą należy wykonać co najmniej trzy dopuszczalne manewry, aby uzyskać wiarygodną średnią dla wszystkich parametrów numerycznych.</li>
</ol>
6. Kolekcja BALF
<ol>
	<li>Po znieczuleniu końcowym za pomocą pelltobarbitalum natricum ((1%, 1,8-2,4 ml/100 g) dostosuj dawkę do indywidualnych sytuacji, aby zobaczyć, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi i traci oddech), przepłucz myszy 2 ml PBS przez rurkę dotchawiczą o średnicy 1 mm, a następnie pobierz BALF10.</li>
	<li>Pobrane porcje płukania należy połączyć i odwirować w temperaturze 4 °C i 250 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Zebrać sklarowany osad do natychmiastowego użycia i przechowywać pozostałą część w temperaturze -80 °C lub ciekłym azocie.</li>
	<li>Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS, a następnie odwirować (1 400 x g, 6 min) 250 μl zawieszonych komórek na szkiełkach za pomocą wirówki do szkiełkowania.</li>
	<li>Nałóż barwienie Wrighta na komórki na szkiełkach zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Policz 200 komórek na mysz; zidentyfikuj komórki jako makrofagi lub neutrofile, zgodnie ze standardową morfologią, pod 400-krotnym powiększeniem; i policz ich liczbę.</li>
</ol>
7. Pobieranie próbek krwi z serca
<ol>
	<li>Zbierz krew przez nakłucie serca, załaduj ją do probówek o pojemności 1,5 ml i trzymaj na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki krwi przez 5 minut w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant (surowicę) do nowej probówki i przechowywać go w temperaturze -80 °C lub ciekłego azotu.</li>
	<li>Przygotuj surowicę do testów wykrywania IL-1β, IL-10 i TNF-α przy użyciu odpowiednich zestawów ELISA.</li>
</ol>
8. Analiza morfometryczna płuc
<ol>
	<li>Wypreparuj płuca i tchawice myszy.
	<ol>
		<li>Umieść każdą uśpioną mysz na desce chirurgicznej natychmiast po złożeniu jej w ofierze.</li>
		<li>Wypreparuj platysmę i przednie mięśnie tchawicy, aby uwidocznić i uzyskać dostęp do pierścieni tchawicy.</li>
		<li>Otwórz klatkę piersiową. Wypreparuj płuca i tchawicę, ale nie oddzielaj serca od płuc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłączyć cewnik dotchawiczy do strzykawki zawierającej 4% paraformaldehydu przez rurkę polietylenową PE90. 
	Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Nosić rękawice i okulary ochronne i używać roztworu wewnątrz dygestorium.</li>
	<li>Całkowicie napompuj płuca za pomocą 4% paraformaldehydu (10 kropli, ~200 μL) przez cewnik dotchawiczy. Usuń serce po zakończeniu pompowania.</li>
	<li>Utrzymuj płuca w 15 ml probówce zawierającej 10 ml 4% paraformaldehydu przez co najmniej 4 godziny.</li>
	<li>Osadź płuca w parafinie. Uzyskać skrawki 5 μm przez cięcie bloku parafinowego za pomocą mikrotomu obrotowego. Podczas cięcia należy odsłonić maksymalną powierzchnię tkanki płucnej w obszarze drzewa oskrzelowego.</li>
	<li>W celu analizy morfometrycznej należy wykonać barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) na skrawkach.</li>
	<li>Zobrazuj skrawki za pomocą pionowego mikroskopu jasnego pola (soczewka obiektywowa, 20x; czas naświetlania, 1,667 ms).</li>
	<li>Niech dwóch badaczy zaślepionych protokołem leczenia niezależnie policzyć skrawki histologiczne. Użyj średniej odległości przecięcia liniowego (Lm) jako parametru do pomiaru odległości ściany przegrody międzypęcherzykowej. Określ Lm, wykonując następujące czynności:
	<ol>
		<li>Otwórz obrazy sekcji w Photoshopie i narysuj siatkę siatki na obrazie z pięcioma liniami o długości 550 μm.</li>
		<li>Policz liczbę pęcherzyków płucnych w poprzek linii siatki.</li>
		<li>Oblicz Lm, dzieląc długość linii siatki przez liczbę pęcherzyków płucnych. Aby określić ilościowo, narysuj pięć sekcji na mysz. Zdobądź dziesięć obrazów każdej sekcji (po jednym obrazie na pole) i oceń losowo. Podczas selekcji pól należy unikać pól dróg powietrznych i naczyń, przesuwając jedno pole do przodu lub w innym kierunku. 
		Uwaga: Dane przedstawiono jako średnią ± S.E.M. Przeprowadzono niesparowany test t w celu porównania myszy narażonych na działanie powietrza i myszy narażonych na działanie ozonu. Do obliczenia istotnej różnicy wykorzystano trzy zwierzęta z każdej grupy. Wartość p wynosząca <0,05 została uznana za istotną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S. i W.W. są obecnymi pracownikami i posiadaczami opcji na akcje Cellular Biomedicine Group (NASDAQ: CBMG). Pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

W niniejszej pracy przedstawiono wiarygodną metodę generowania nowego modelu POChP. W porównaniu z innymi modelami (tj. modelami LPS lub PPE), ten model OE podsumowuje proces patologiczny pacjentów z POChP. Ponieważ dym papierosowy jest głównym materiałem niebezpiecznym, który powoduje POChP u ludzi40, model CS pozostaje najpopularniejszym modelem POChP41,42. Jednak model CS wymaga od 3 do 12 miesięcy okresu badawczo-rozwojowego d...

Oszacowano, że POChP, w tym rozedma płuc i przewlekłe zapalenie oskrzeli, może być trzecią najczęstszą przyczyną zgonów na świecie w 2020 roku1,2. Potencjalna częstość występowania POChP w populacji powyżej 40 roku życia szacowana jest na 12,7% u mężczyzn i 8,3% u kobiet w ciągu najbliższych 40 lat3. Obecnie nie są dostępne żadne leki, które mogłyby odwrócić postępujące pogorszenie stanu zdrowia u pacjentów z POChP4. Wiarygodne modele zwierzęce POChP nie tylko wymagają naśladowania procesu patologicznego choroby, ale także wymagają krótkiego okresu pokoleniowego. Obecne modele POChP, w tym LPS lub model indukowany przez PPE, mogą wywoływać objawy podobne do rozedmy płuc5,6. Jednorazowe podanie lub tygodniowa prowokacja LPS lub PPE myszom lub szczurom powoduje wyraźną neutrofilię w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), zwiększa mediatory prozapalne (np. TNF-α i IL-1β) w BALF lub surowicy, wytwarza powiększone przestrzenie powietrzne w postaci zniszczenia miąższu płuc i ogranicza przepływ powietrza5,6,7,8,9,10. Jednak LPS lub PPE nie są przyczynami POChP u ludzi, a zatem nie naśladują procesu patologicznego11. Model indukowany przez CS spowodował trwałe ograniczenie przepływu powietrza, zniszczenie miąższu płuc i zmniejszoną funkcjonalną wydolność wysiłkową. Jednak tradycyjny protokół CS wymaga co najmniej 3 miesięcy na wygenerowanie modelu POChP12,13,14,15. Dlatego ważne jest, aby wygenerować nowy, bardziej wydajny model zwierzęcy, który spełnia te dwa wymagania.
Ostatnio, oprócz palenia papierosów, zanieczyszczenie powietrza i narażenie zawodowe stały się częstszymi przyczynami POChP16,17,18. Ozon, jako jedno z głównych zanieczyszczeń (choć nie główny składnik zanieczyszczenia powietrza), może bezpośrednio reagować z drogami oddechowymi i uszkadzać tkankę płucną zarówno dzieci, jak i młodych dorosłych19,20,21,22,23,24,25. Ozon, a także inne stymulatory, w tym LPS, PPE i CS, są zaangażowane w poważne biochemiczne szlaki stresu oksydacyjnego płuc i uszkodzenia DNA oraz są związane z inicjacją i promocją POChP26,27. Innym czynnikiem jest to, że objawy u niektórych pacjentów z POChP pogarszają się po ekspozycji na ozon, co wskazuje, że ozon może zaburzać czynność płuc18,28,29. Dlatego wygenerowaliśmy nowy model POChP, wielokrotnie wystawiając myszy na działanie wysokich stężeń ozonu przez 7 tygodni; Spowodowało to wady przepływu powietrza i uszkodzenie miąższu płuc podobne do tych z poprzednich badań30,31,32. W tym badaniu rozszerzyliśmy protokół OE na samice myszy i z powodzeniem odtworzyliśmy rozedmę płuc zaobserwowaną u samców myszy w naszych poprzednich badaniach30,31,32. Ponieważ śmiertelność z powodu POChP zmniejszyła się u mężczyzn, ale wzrosła u kobiet w wielu krajach33, potrzebny jest model POChP u kobiet, aby zbadać mechanizmy i opracować metody terapeutyczne dla kobiet chorych na POChP. Możliwość zastosowania modelu OE do wszystkich płci stanowi dodatkowe wsparcie dla jego stosowania jako modelu POChP.

W <table><tbody><tr>tym badaniu wykorzystano <td>myszy BALB / c</td><td>Slac Laboratory Animal, Szanghaj, Chiny</td> W <td>tym badaniu wykorzystano 7-dniowe do 9-tygodniowe samice myszy BALB/c.</td><td></td></tr><tr><td>Indywidualne klatki wentylowane</td><td>Suhang, Szanghaj, Chiny</td><td>Numer modelu: MU64S7</td><td>Klatki służyły do trzymania myszy w pomieszczeniu dla zwierząt.</td></tr><tr><td>Uszczelnienie pudełka z pleksiglasu</td><td>Suhang, Szanghaj, Chiny</td><td>Nie dotyczy</td><td>Pudełko zostało użyte&nbsp; do przechowywania generatora ozonu. Myszy były wystawione na działanie ozonu w pudełku.</td></tr><tr><td>Generator elektryczny</td><td>Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Niemcy</td><td>Model 500&nbsp;</td><td>Urządzenie służyło do wytwarzania ozonu.</td></tr><tr><td>Sonda ozonu</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, Wielka Brytania</td><td>Ozon 300</td><td>Urządzenie służyło do monitorowania i kontrolowania wytwarzania ozonu.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P3761</td><td>Myszy znieczulono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pelltobarbitalum natricum.</td></tr><tr><td>Mikrotomografia komputerowa</td><td>GE Healthcare, Londyn, ON, Kanada</td><td>RS0800639-0075</td><td>To urządzenie służyło do pozyskiwania obrazów płuc.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 Oprogramowanie ABA</td><td>GE Healthcare, Londyn, ON, Kanada</td><td>Micro-view 2.01&nbsp;</td><td>Urządzenie to służyło do rekonstrukcji płuca i analizy objętości LAA płuca.</td></tr><tr><td>Maszyna do bieżni&nbsp;</td><td>Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, Chiny</td><td>DSPT-208</td><td>Ta maszyna została przeprowadzona do testu zmęczeniowego.</td></tr><tr><td>Pletyzmograf ciała</td><td>eSpira&trade; System wymuszonych manewrów, EMMS, Edynburg, Wielka Brytania</td><td>System wymuszonych manewrów</td><td>Urządzenie to służyło do badania spirometrycznej czynności płuc.</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>eSpira&handel; System wymuszonych manewrów, EMMS, Edynburg, Wielka Brytania</td><td>System wymuszonych manewrów</td><td>Urządzenie to służyło do badania spirometrycznej czynności płuc.</td></tr><tr><td>Wirówka do szkiełkowania Denville</td><td>Scientific, Holliston, MA, USA</td><td>C1183&nbsp;</td><td>Służył do obracania komórek BALF na szkiełkach.</td></tr><tr><td>Wright Staining</td><td>Hanhong, Szanghaj, Chiny</td><td>RE04000054</td><td>&nbsp; Używano go do barwienia makrofagów, neutrofili w zawieszonym BALF.</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA, USA</td><td>4000</td><td>Służył do liczenia komórek.</td></tr><tr><td>IL-1 i beta;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100704</td><td>Użyto ich do przetestowania odpowiednich czynników w surowicy.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab46103</td><td>Użyto ich do przetestowania odpowiednich czynników w surowicy.</td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100747</td><td>Wykorzystano je do przetestowania odpowiednich czynników w surowicy.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P6148</td><td>Płuco było napompowane 4% paraformaldehydem.</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Hualing, Szanghaj, Chiny</td><td>56#</td><td>Służyła do osadzania płuc.</td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy</td><td>Leica, Wetzlar,&nbsp; Hesja, Niemcy</td><td>RM2255</td><td>Służył do cięcia płuc.</td></tr><tr><td>Hgaematoksylina i eozyna (H& E) roztwór barwiący</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>G1120</td><td>H& Barwienie E wykonano do analizy morfometrycznej.</td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop jasnego pola</td><td>Olympus, Center Valley, PA, USA</td><td>CX41</td><td>Służył do obrazowania H& Szkiełka do barwienia E.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, San Jose, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Służył do liczenia pęcherzyków płucnych na H& E poplamione obrazy.</td></tr><tr><td>GraphPad pryzmat 5</td><td>Graphpad Software Inc., San Diego, CA</td><td>GraphPad pryzmat 5</td><td>Był używany do analizy danych i tworzenia liczb.</td></tr></tbody></table>

generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) charakteryzuje się uporczywym ograniczeniem przepływu powietrza i niszczeniem miąższu płuc. Występuje bardzo często w starzejących się społeczeństwach. Obecne konwencjonalne terapie POChP koncentrują się głównie na lekach modyfikujących objawy; W związku z tym pilnie potrzebne jest opracowanie nowych terapii. Kwalifikowane modele zwierzęce POChP mogą pomóc w scharakteryzowaniu mechanizmów leżących u podstaw POChP i mogą być wykorzystane do badań przesiewowych nowych leków. Obecne modele POChP, takie jak lipopolisacharyd (LPS) lub model rozedmy płuc wywołanej elastazą trzustkową świń (PPE), generują zmiany podobne do POChP w płucach i drogach oddechowych, ale poza tym nie przypominają patogenezy POChP u ludzi. Model wywołany dymem papierosowym (CS) pozostaje jednym z najpopularniejszych, ponieważ nie tylko symuluje zmiany podobne do POChP w układzie oddechowym, ale także opiera się na jednym z głównych materiałów niebezpiecznych, które powodują POChP u ludzi. Jednak czasochłonne i pracochłonne aspekty modelu indukowanego przez CS znacznie ograniczają jego zastosowanie w badaniach przesiewowych nowych leków. W tym badaniu udało nam się wygenerować nowy model POChP, wystawiając myszy na wysoki poziom ozonu. Model ten wykazał, co następuje: 1) zmniejszona natężona objętość wydechowa 25, 50 i 75 / natężona pojemność życiowa (FEV25 / FVC, FEV50 / FVC i FEV75 / FVC), co wskazuje na pogorszenie czynności płuc; 2) powiększone pęcherzyki płucne, ze zniszczeniem miąższu płuc; 3) skrócenie czasu zmęczenia i dystansu; i 4) zwiększony stan zapalny. Podsumowując, dane te pokazują, że model narażenia na ozon (OE) jest wiarygodnym modelem zwierzęcym, który jest podobny do człowieka, ponieważ nadmierna ekspozycja na ozon jest jednym z czynników etiologicznych POChP. Dodatkowo, w oparciu o nasze wcześniejsze prace, stworzenie modelu OE zajęło tylko 6-8 tygodni, podczas gdy potrzeba 3-12 miesięcy na wywołanie modelu dymu papierosowego, co wskazuje, że model OE może być dobrym wyborem do badań nad POChP.

Przykłady trójwymiarowych obrazów µCT dla każdej grupy przedstawiono na Rysunku 1a. Myszy eksponowane na ozon miały istotnie większą całkowitą objętość płuc (Rysunek 1a i b) oraz LAA% (Rysunek 1c) niż myszy kontrolne eksponowane na powietrze. Objętość płuc i LAA% pozostały podwyższone po sześciu tygodniach ekspozycji na ozon31...

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wywołanie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez ekspozycję na ozon (OE) u myszy. Ten nowy model OE może zostać wykorzystany do charakterystyki mechanizmów leżących u podstaw POChP oraz do przesiewu nowych leków. Główną zaletą tego modelu OE jest to, że odzwierciedla on procesy patologiczne występujące u pacjentów z POChP.Może on zostać wygenerowany w ciągu zaledwie sześciu do ośmiu tygodni. Procedurę zaprezentuje Weijaian Sang, pracownik naukowy w naszej grupie. Aby wygenerować ozon, należy użyć generatora elektrycznego oraz niewielkiego dmuchawy do powietrza, aby wydmuchać powietrze do uszczelnionej skrzynki z pleksiglasu przez rurę wentylacyjną podłączoną wewnątrz i na zewnątrz skrzynki, wykorzystując sondę ozonową do monitorowania stężenia ozonu wewnątrz skrzynki.Gdy stężenie ozonu osiągnie 2,5 parts per million, należy umieścić myszy w komorze na 3 godziny. Pod koniec 7. tygodnia należy przeprowadzić obrazowanie zwierząt poddanych działaniu ozonu za pomocą mikrotomografii komputerowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Aby zbadać zmiany wywołane ozonem oraz wydolność funkcjonalną, taką jak zmęczenie płuc, należy najpierw rozgrzać myszy, prowadząc je z prędkością 10 meters per minute na bieżni.Po 5 minutach zwiększyć prędkość do 15 metrów na minutę na okres 10 minut. Następnie zwiększać prędkość o pięć metrów na minutę co 30 minut, aż myszy nie będą w stanie dalej biec. Całkowity dystans oraz czas biegu dla każdego zwierzęcia należy zapisać odpowiednio jako dystans zmęczeniowy i czas zmęczeniowy.Aby zmierzyć funkcje płuc zwierząt poddanych działaniu ozonu, należy umieścić znieczuloną mysz w pletyzmografie całego ciała podłączonym do wentylatora sterowanego komputerowo. Należy zastosować wentylację sterowaną ciśnieniem, aby narzucić znieczulonemu zwierzęciu średnią częstotliwość oddechów na poziomie 150 oddechów na minutę, aż do uzyskania regularnego wzorca oddechowego oraz pełnego wydechu w każdym cyklu oddechowym. Następnie należy zapisać wymuszoną objętość wydechową w pierwszych 25, 50 i 75 milisekundach wydechu, odrzucając wszelkie nieoptymalne manewry.Po podaniu znieczulenia terminalnego należy użyć rurki endotrachealnej o średnicy 1 mm do dwukrotnego przemycia dróg oddechowych zwierząt, stosując 1 mL PBS na każde przemycie. Alikwoty pobranego płynu z każdego zwierzęcia należy połączyć w celu odwirowania, a nadłoża zebrać w ciekłym azocie. Osady należy zawiesić ponownie w świeżym PPS w celu policzenia komórek, a dla każdej myszy przygotować dwa uchwyty z podstawką szkiełkiem, kartą filtrującą i lejkem.Dodaj około 100 do 125 µL ponownie zawiesionych komórek do każdego lejka. Umieść uchwyty w cyto-centryfudze i odwiruj komórki na szkiełka. Następnie zastosuj odpowiedni roztwór barwiący do komórek zgodnie z instrukcjami producenta i policz 200 komórek na mysz przy 400-krotnym powiększeniu.W celu pobrania krwi z serca, pobierz około 500 µL krwi od zwierząt eksponowanych na ozon poprzez punkcję serca. Następnie przelej krew do probówek 1,5 mL znajdujących się w lodzie. Po 30 minutach w lodzie odwiruj próbki krwi i przenieś nadsączniki surowicy do nowych probówek w celu przechowywania w ciekłym azocie.Próbki można później rozmrozić w celu oceny poziomu ekspresji cytokin w surowicy za pomocą metody ELISA zgodnie ze standardowymi protokołami. W celu przeprowadzenia analizy morfometrycznej płuc, po pobraniu krwi z serca, ułóż pierwszą mysz w pozycji na plecach. Następnie otwórz jamę klatki piersiowej i odsunij mięsień platysma oraz przednie mięśnie tchawicy, aby uzyskać dostęp do pierścieni tchawicy.Pobierz płuca oraz tchawicę, nie oddzielając serca od płuc. Następnie użyj rurki polietylenowej PE90, aby połączyć cewnik endotrachealny ze strzykawką zawierającą 4% formaldehyd i całkowicie nadmuchaj płuca, używając około 200 µL paraformaldehydu. Następnie umieść płuca w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml świeżego 4% formaldehydu na co najmniej cztery godziny.W ocenie przeprowadzonej za pomocą mikrotomografii komputerowej myszy eksponowane na ozon wykazują znacznie większą całkowitą objętość płuc oraz większy procent obszarów o niskim tłumieniu w porównaniu z grupą kontrolną eksponowaną na powietrze otoczenia. Fenotyp rozedmy potwierdzają również powiększone pęcherzyki płucne oraz zwiększone średnie przerwy liniowe. Ocena funkcji płuc za pomocą pletyzmografu wykazuje, że wszystkie parametry, które ulegają obniżeniu u myszy eksponowanych na ozon, są zgodne z typowymi deficytami czynnościowymi płuc obserwowanymi u pacjentów z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc.Ponadto ekspozycja na ozon znacznie skraca czas i dystans zmęczeniowy w testach tolerancji wysiłkowej. U zwierząt poddanych działaniu ozonu stwierdzono również znaczący wzrost liczby komórek zapalnych, w tym makrofagów i neutrofili, a także istotny spadek poziomu IL-10 oraz wzrost poziomu IL-1 beta i TNF alfa, co wykazuje, że model ekspozycji na ozon odzwierciedla objawy charakterystyczne dla ludzkiej przewlekłej obturacyjnej choroby płuc. Zastosowanie tej procedury u innych szczepów myszy, takich jak myszy C57 BR6, pozwala na stworzenie tego modelu OE. Po opracowaniu technika ten otwiera badaczom zajmującym się chorobami płuc drogę do zgłębiania mechanizmów leżących u podstaw COPD.Należy pamiętać, że praca z paraformaldehydem może być niebezpieczna i podczas pracy z tym odczynnikiem zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, okularów ochronnych oraz używanie roztworu wewnątrz dygestorium.

generation-chronic-obstructive-pulmonary-disease-model-mice-repeated

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procedur wymaganych do wykonania pomiarów mechaniki układu oddechowego, jak również oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada).

Ocena mechaniki układu oddechowego u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji

Opisujemy metodę koralików agarowych w celu ustalenia trwałego, długotrwałego przewlekłego zakażenia dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa w modelu mysim.

Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Prezentowany tutaj jest użyteczny protokół do unieruchomienia płuc, który tworzy stabilne warunki do oceny histologicznej próbek płuc z mysiego modelu rozedmy płuc. Główną zaletą tego modelu jest to, że może naprawić wiele płuc przy tym samym stałym ciśnieniu bez zapadania się płuc lub opróżniania.

Unieruchomienie płuc pod stałym ciśnieniem w celu oceny rozedmy płuc u myszy

Tutaj opisujemy metodę oceny ekspresji miRNA w płucach, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne, używając myszy wystawionych na działanie ozonu lub przefiltrowanego powietrza na różnych etapach cyklu rujowego.

Profilowanie mikroRNA płuc w cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu

Ten manuskrypt opisuje protokół określający, czy narażenie na ozon, podstawowe zanieczyszczenie powietrza, upośledza efferocytozę makrofagów pęcherzykowych in vivo. Protokół ten wykorzystuje powszechnie stosowane odczynniki i techniki i może być dostosowany do wielu modeli uszkodzenia płuc w celu określenia wpływu na efferocytozę makrofagów pęcherzykowych.

Ocena in vivo efferocytozy makrofagów pęcherzykowych po ekspozycji na ozon

Myszy narażone na działanie ozonu i endotoksyn bakteryjnych wykazują rozległą śmierć komórek, w tym neutrofili. Zaobserwowaliśmy adaptacje komórkowe, takie jak zakłócenie blaszek cytoszkieletu, zwiększona ekspresja komórkowa podjednostki syntazy ATP kompleksu V β i angiostatyny w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym, supresja odpowiedzi immunologicznej płuc i opóźniona rekrutacja neutrofili.

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

Różne modele zwierzęce zwłóknienia płuc zostały stworzone przy użyciu bleomycyny, aby wyjaśnić patogenezę zwłóknienia płuc i znaleźć nowe cele leków. Jednak większość modeli zwłóknienia płuc ukierunkowanych na tkankę płucną ma nierównomierne podawanie leków. W tym miejscu proponujemy model jednolitego zwłóknienia płuc wywołanego nebulizacją bleomycyny nosowej.

Mysi model zwłóknienia płuc wywołanego nebulizacją bleomycyny w nosie

Ten protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu krzemicy poprzez wielokrotne wystawienie na działanie zawiesin krzemionki za pomocą kroplówki z nosa. Model ten może wydajnie, wygodnie i elastycznie naśladować patologiczny proces krzemicy u ludzi z wysoką powtarzalnością i oszczędnością.

Mysi model krzemicy utworzony przez wielokrotne wdychanie krystalicznego pyłu krzemionkowego

Protokół ten określa metodę wywoływania zwłóknienia płuc u myszy poprzez wielokrotne podawanie bleomycyny do jamy ustnej i gardła, uzyskując cechy patologiczne bardzo podobne do idiopatycznego zwłóknienia płuc.

Wyrafinowany mysi model idiopatycznego włóknienia płuc

Przedstawiamy protokół modelowania włóknienia płuc u myszy z wykorzystaniem aerozozolizowanej bleomycyny podanej przez tchawicę. Ta zoptymalizowana metoda umożliwia jednolite, ilościowe i precyzyjne podanie bez nacięcia chirurgicznego, zwiększając powtarzalność i wiarygodność włóknienia wywołanego bleomycyną.

Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

Poznaj generowanie modelu POChP u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon. Ta metoda pozwala badać mechanizmy choroby i testować nowe leki w ciągu sześciu do ośmiu tygodni.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Przeglądaj więcej filmów