Name: Metoda oceny wpływu zakresu długości fal i natężeń terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę oceny wpływu terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro przy użyciu źródła światła ksenonowego z filtrami interferencyjnymi. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę długości fali i natężenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Badań nad Neurotraumą (Australia Zachodnia). Projekt ten jest finansowany za pośrednictwem Road Trauma Trust Account, ale nie odzwierciedla poglądów ani zaleceń Rady Bezpieczeństwa Ruchu Drogowego.

1. Kalibracja optyczna: Pomiar emisji światła
<ol>
	<li>Aby przygotować aparat do dostarczania światła, podłącz szerokopasmowe źródło światła (np. lampę ksenonową lub wolframową) do odpowiedniego zasilacza. Przed źródłem światła umieść soczewkę kolimującą, aby uzyskać skolimowany strumień światła. Przepuść światło przez cieczowy filtr cieplny, aby usunąć większość ciepła ze strumienia światła. W zależności od zastosowania, skup skolimowany strumień na otworze wlotowym cieczowego światłowodu, który zapewnia bardziej elastyczne dostarczanie światła (np. do inkubatora).</li>
	<li>Na drugim końcu cieczowego światłowodu umieść drugą soczewkę kolimującą, a następnie uchwyt na filtry interferencyjne i filtry neutralne. Sprawdź, czy taka konfiguracja wytwarza równomiernie oświetlony punkt światła o pożądanym pasmie fal i natężeniu. 
	Uwaga: Odległość między końcem światłowodu a płaszczyzną preparatu może wymagać zmiany w zależności od obszaru, który ma być oświetlony, ale należy pamiętać, że wraz ze wzrostem odległości od końca światłowodu natężenie światła będzie spadać. W niniejszym badaniu odległość ta wynosi 14cm i wytwarza przekrój wiązki, który równomiernie oświetla obszar 3x3 dołków na płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Upewnij się, że światło rozproszone z lampy i powiązanych komponentów optycznych nie dociera do preparatu.</li>
	<li>Włącz chłodnicę wodną dla cieczowego filtra cieplnego i upewnij się, że w płaszczu filtra zachodzi wymiana wody. Włącz zasilacz lampy i odczekaj co najmniej 5 min, aby szerokopasmowe źródło światła ustabilizowało się. Uwaga: Stosowanie chłodnicy wodnej jest wymagane, aby zapobiec przegrzaniu urządzenia.</li>
	<li>Wybierz wąskopasmowy filtr interferencyjny (zazwyczaj opisywany przez długość fali centralnej, transmitancję szczytową i szerokość połówkową FWHM), aby wygenerować pożądane pasmo fal oświetlenia. Uwaga: Wąskopasmowe filtry interferencyjne użyte w obecnym badaniu miały wartości 442 nm, 550 nm, 671 nm oraz 810 nm.</li>
	<li>Zmierz światło emitowane przez lampę w płaszczyźnie, w której preparat ma być umieszczony podczas zabiegu. Pomiaru światła dokonaj za pomocą skalibrowanej sondy natężenia promieniowania (kolektora cosinusowego) podłączonej do odpowiedniego spektroradiometru, korzystając z dedykowanego oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Użyj filtrów neutralnych, aby dostosować natężenie światła, aż do uzyskania pożądanego wyniku. Uwaga: W niniejszym badaniu natężenie światła przechodzącego przez każdy filtr interferencyjny jest dostosowane tak, aby zapewnić taką samą wydajność kwantową dla każdego z czterech pasm fal zabiegu. Ważne jest regularne sprawdzanie kalibracji, ponieważ moc lampy może ulec zmianie. 
	Uwaga: Po skonfigurowaniu aparatu komórki są gotowe do naświetlania. Rycina 1 przedstawia aparat do dostarczania światła użyty w obecnym badaniu.</li>
</ol>
<img alt="Układ wzbudzenia optycznego: lampa ksenonowa, źródło zasilania, soczewki, rama do zabiegu; badanie emisji światła." src="/files/ftp_upload/52221/52221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">
Rysunek 1. Obraz aparatury do dostarczania światła. Przedstawiono źródło mocy światła, lampę ksenonową z obudową, soczewkę kolimującą, filtr wodny, aperturę wlotową, ciekły światłowód, drugą soczewkę kolimującą, uchwyt filtra, ramkę terapeutyczną oraz matową czarną kartę. Należy zauważyć, że filtry wąskopasmowe do długości fali i intensywności nie są pokazane.
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Opisana metoda dostarczania R/NIR-LT może być zastosowana do każdego typu komórek lub modelu in vitro ; w związku z tym poniższe opisy hodowli komórkowej mają charakter ogólny i wykorzystują utrwalone techniki hodowli feochromocytomy (PC12), komórek Müllera (rMC1) oraz pierwotnych mieszanych komórek siatkówki.</li>
	<li>Przed wysianiem komórek do naświetlania i testu stresu oksydacyjnego, hodować unieśmiertelnione komórki w odpowiednich pożywkach wzrostowych zawierających właściwe suplementy (np. FBS, antybiotyki) w kolbach T75 do osiągnięcia 70-80% konfluencji.</li>
	<li>Odczepić unieśmiertelnione komórki z kolb T75, stosując metodę odpowiednią dla testowanego typu komórek, np. trypsynę. Jeśli jest to konieczne, przed przystąpieniem do wysiewu komórek na płytki testowe z 96 dołkami, pokryć dołki płytki 10µg/ml poli-L-lizyny przez 1h (np. dla komórek PC12) lub 10µg/ml poli-L-lizyny przez 1h, a następnie inkubować przez noc z 10µg/ml lamininy (np. dla mieszanych komórek siatkówki).</li>
	<li>Odwirować komórki w celu ich zebrania zgodnie z przeznaczeniem (np. 3 min przy 405 x g dla komórek PC12 lub 10 min przy 218 x g dla komórek rMC1), usunąć nadsącz i resuspenderować w 8 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej.</li>
	<li>W przypadku użycia mieszanych komórek siatkówki, przygotować je z noworodków szczura (P0-5) poprzez trawienie enzymatyczne (papainą) zgodnie z ustalonymi procedurami 19</li>
	<li>Policzyć liczbę żywych komórek z wyłączeniem tych wybarwionych 0,4% (w/v) błękitem trypanu, używając komory countingowej (hemocytometru).</li>
	<li>Dostosować gęstość komórek tak, aby po 24 lub 48h hodowli osiągnęły one około 70-80% konfluencji (dla komórek PC12 gęstość wysiewu wynosi 4.0 x 105 żywych komórek/ml, dla komórek rMC1 jest to 2.5 x 105 żywych komórek/ml, a dla mieszanych komórek siatkówki 8 x 105 żywych komórek/ml). Po dodaniu komórek do przezroczystych lub czarnych płytek 96-dołkowych (używanych odpowiednio do testu H2O2 lub DCFH-DA) w 100 µl odpowiedniej pożywki wzrostowej, pozostawić płytkę na płaskiej powierzchni w temperaturze 37°C, 5% CO2 (lub w innych warunkach odpowiednich dla danego typu komórek) przez co najmniej 24 h, aby umożliwić adhezję komórek.</li>
	<li>Hodować komórki w pożywkach wzrostowych w odpowiednich płytkach 96-dołkowych do czasu osiągnięcia 70-80% konfluencji (24h dla komórek PC12 i rMC1, 48h dla mieszanych komórek siatkówki).</li>
</ol>
3. Dodawanie stresora w postaci glutaminianu do komórek
<ol>
	<li>Przygotować roztwory stresora w postaci wodnego monosodu kwasu L-glutaminowego w stężeniach od 0 do 10mM w odpowiednich pełnych pożywkach wzrostowych.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z komórek i delikatnie przemyć komórki 3 razy PBS (PC12) lub HBSS (rMC1 i mieszane komórki siatkówki). Po przemyciu dodać pożywkę zawierającą glutaminian do całkowitej objętości 100 µl/dołek.</li>
</ol>
4. Pierwsze dawki naświetlania
<ol>
	<li>Niezwłocznie po dodaniu glutaminianu lub wybranego czynnika stresowego poddać komórki działaniu światła o pożądanej długości fali i natężeniu, umieszczając je pod przygotowanym aparatem do naświetlania. Należy dostosować moc kwantową wiązki światła, korzystając z ustalonych kombinacji filtrów neutralnych, w zależności od stosowanej długości fali. 
	Uwaga: W obecnych eksperymentach komórki naświetlano przez 3 min, utrzymując temperaturę poprzez umieszczenie płytek 96-dołkowych na podkładce grzewczej o temperaturze 37oC. Czas naświetlania można zmieniać zgodnie z potrzebami.
	<ol>
		<li>Pod komórkami należy umieścić matową czarną kartkę, aby zapobiec odbijaniu światła do sąsiednich dołków w płytce 96-dołkowej przeznaczonych dla innych parametrów traktowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku potrzeby dłuższego czasu naświetlania należy dodać 25mM buforu Hepes w celu utrzymania pH pożywki hodowlanej lub najlepiej umieścić aparat i płytki z próbkami w inkubatorze z regulowaną koncentracją CO2 na poziomie 5% CO2 lub w warunkach optymalnych dla danego typu komórek.</li>
	<li>Po zakończeniu naświetlania komórki należy umieścić na płaskiej powierzchni i inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2 (lub w innych warunkach optymalnych dla danego typu komórek) przez 24h. 
	Uwaga: Zgodnie z potrzebami można podać dodatkowe dawki R/NIR-LT w opisany powyżej sposób.</li>
</ol>
5. Ostateczna dawka naświetlania i detekcja ROS
<ol>
	<li>Przed przeprowadzeniem ostatniej rundy naświetlania należy przygotować odczynniki do detekcji ROS. Przygotować bufor cytrynianowy 50mM (pH 6,0), Triton X100 oraz roztwór roboczy odczynnika do detekcji H2O2 (w stosunku 1:2:97: roztwór stokowy odczynnika do detekcji 10mM H2O2; peroksydaza chrzanowa 10 U/ml; cytrynian sodu 50mM (pH 6,0)). Przygotować DCFH-DA w końcowym stężeniu 100µM w odpowiednim medium. 
	Uwaga: odczynnik DCFH-DA dla komórek PC12 znajduje się w medium RPMI, a odczynnik DCFH-DA dla komórek rMC1 w medium DMEM. Należy pamiętać, że dostępne komercyjnie odczynniki detekcyjne wykazują różną czułość na konkretne rodzaje ROS, dlatego odczynniki należy dobrać starannie, aby uzyskać informacje pożądane dla danej aplikacji.</li>
	<li>Poddać komórki naświetlaniu zgodnie z opisem w krokach 4.1-4.1.2. Upewnić się, że komórki są traktowane pożądanymi fluencjami / długościami fali światła.</li>
	<li>Niezwłocznie po naświetlaniu usunąć medium zawierające glutaminian i dwukrotnie przemyć odpowiednim roztworem buforowym (dla komórek PC12 stosuje się PBS, a dla komórek rMC1 HBSS). Przeprowadzić analizy ROS na komórkach w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Analiza H2O2: do każdego dołka dodać 45 µl buforu cytrynianowego 50mM (pH 6,0) oraz 5 µl Triton X100. Delikatnie wymieszać komórki na wytrząsarce orbitalnej przez 30 s i inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 15 min. Dodać 50 µl roboczego roztworu detekcyjnego H2O2 i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika płytek przy długości fali pobudzenia 530nm i długości fali emisji 480nm.</li>
		<li>Analiza DCF: do każdego dołka dodać 100 µl roztworu DCFH-DA o stężeniu 100 µM i inkubować przez 30 min w 37°C i 5% CO2. Usunąć medium zawierające 100 µM DCFH-DA i dwukrotnie przemyć odpowiednim roztworem buforowym (jak opisano powyżej). Do każdego dołka dodać 90 µl roztworu buforowego i 10 µl Triton X100, a następnie delikatnie wymieszać na wytrząsarce orbitalnej przez 30 s przed 15-minutową inkubacją w 37°C. Zmierzyć fluorescencję pochodzącą z DCF za pomocą czytnika płytek przy długości fali pobudzenia 480nm i długości fali emisji 530nm.</li>
		<li>Wyrazić wartości ROS w stosunku do stężenia białka w komórkach pozostałych w dołkach, wykorzystując kolorymetryczny zestaw do ilościowego oznaczenia stężenia białka zgodnie z instrukcją producenta, z odniesieniem do krzywej wzorcowej w celu obliczenia ilości białka w mg.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+reactive+oxygen+species+an+evolution+in+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function.</a> Circulation research. 97, 302-304 (2005).</li>
<li>Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).</li>
<li>Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKowaltowski%2C+AJ+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22">Free Radical Biology and Medicine</a>. 47, 333-343 (2009).</li>
<li>Coyle, J. T., Puttfarcken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+glutamate%2C+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders.</a> Science. 262, 689-695 (1993).</li>
<li>Doble, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+excitotoxicity+in+neurodegenerative+disease%3A+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+therapeutics%22%5BJournal%5D)">The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy.</a> Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).</li>
<li>Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+therapies+for+acute+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Antioxidant therapies for acute spinal cord injury.</a> Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+spinal+cord+injury+and+antioxidant-based+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention.</a> Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).</li>
<li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red%2Fnear-infrared+irradiation+therapy+for+treatment+of+central+nervous+system+injuries+and+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders.</a> Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).</li>
<li>Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((670-nm+light+treatment+reduces+complement+propagation+following+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration.</a> J Neuroinflammation. 9, 257(2012).</li>
<li>Eells, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+photobiomodulation+for+methanol-induced+retinal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).</li>
<li>Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+670+nm+light+up+regulates+cytochrome+C+oxidase+expression+and+reduces+inflammation+in+an+age-related+macular+degeneration+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model.</a> PloS one. 8, e57828(2013).</li>
<li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+surgery+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).</li>
<li>Liang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobiomodulation+partially+rescues+visual+cortical+neurons+from+cyanide-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis.</a> Neuroscience. 139, 639-649 (2006).</li>
<li>Zivin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+safety+of+transcranial+laser+therapy+for+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke.</a> Stroke. 40, 1359-1364 (2009).</li>
<li>Lapchak, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+near-infrared+laser+therapy+applied+to+promote+clinical+recovery+in+acute+and+chronic+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+medical+devices%22%5BJournal%5D)">Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases.</a> Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuts+and+bolts+of+low-level+laser+%28light%29+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy.</a> Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Level+Laser+Therapy+for+Closed-Head+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice%3A+Effect+of+Different+Wavelengths%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+surgery+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths.</a> Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).</li>
<li>Hashmi, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+low-level+laser+therapy+in+neurorehabilitation%5BTitle%5D)+AND+%22PM%26R%22%5BJournal%5D)">Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation.</a> PM&R. 2, S292-S305 (2010).</li>
<li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein-IIA+promotes+neurite+growth+via+the+megalin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor.</a> Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).</li>
<li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+light+reduces+oxidative+stress+and+preserves+function+in+CNS+tissue+vulnerable+to+secondary+degeneration+following+partial+transection+of+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve.</a> Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).</li>
<li>Ando, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+laser+therapy+for+spinal+cord+injury+in+rats%3A+effects+of+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical%22%5BJournal%5D)">Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization.</a> Journal of biomedical. 18, 098002(2013).</li>
<li>Lanzafame, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocity+of+exposure+time+and+irradiance+on+energy+density+during+photoradiation+on+wound+healing+in+a+murine+pressure+ulcer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+surgery+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model.</a> Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).</li>
<li>Castano, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+laser+therapy+for+zymosan+induced+arthritis+in+rats%3A+Importance+of+illumination+time%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+surgery+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time.</a> Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Udało nam się zaadaptować precyzyjny i skalibrowany system dostarczania światła, aby zapewnić mechanizm do badania optymalizacji R/NIR-LT in vitro. Za pomocą tego systemu można dokładnie i efektywnie manipulować parametrami długości fali i intensywności R/NIR-LT. Ustaliliśmy, że leczenie komórkami światłem nie prowadziło do śmierci komórek, chociaż ROS nie były zmniejszone przy dostarczanych długościach fal i dawkach w testowanych typach komórek. Maksymalne natężenia osiągane przez obecny system przy 670 nm (20,...

Reaktywne formy tlenu (ROS) są wymagane dla szeregu szlaków transdukcji sygnału i normalnych reakcji metabolizmu komórkowego, w tym neuroprotekcji 1. Jednakże, gdy endogenny mechanizm antyoksydacyjny nie jest w stanie kontrolować produkcji ROS, komórki mogą ulegać stresowi oksydacyjnemu 2,3. Uważa się, że po uszkodzeniu OUN związany z tym wzrost obecności ROS i stresu oksydacyjnego odgrywa istotną rolę w postępie uszkodzenia 4,5. Pomimo ogromnej liczby strategii tłumienia stresu oksydacyjnego, które zostały ocenione, obecnie nie ma w pełni skutecznych, klinicznie istotnych strategii przeciwutleniających do tłumienia produkcji ROS i związanego z nią stresu oksydacyjnego w zastosowaniach klinicznych po neurotraumie 6. Dlatego też tłumienie stresu oksydacyjnego pozostaje ważnym celem interwencji terapeutycznej 7.
Poprawa po R/NIR-LT została zgłoszona w szerokim zakresie urazów i chorób, w tym zmniejszenie rozmiaru zawału serca, powikłania nerkowe i wątrobowe podczas cukrzycy, zwyrodnienie siatkówki, uszkodzenie OUN i udar 8, być może poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego. Ze szczególnym uwzględnieniem uszkodzenia OUN, badania przedkliniczne skuteczności światła 670 nm wykazały dobre efekty w modelach zwyrodnienia siatkówki 9-11, uszkodzenia rdzenia kręgowego 12, śmierci neuronów 13. Przeprowadzono badania kliniczne dotyczące zwyrodnienia plamki żółtej związanego z suchym wiekiem i są obecnie w toku dla udaru mózgu 14, jednak wyniki tych badań nie wydają się obiecujące, być może z powodu niezastosowania skutecznych parametrów leczenia 15. W związku z tym R/NIR-LT nie został powszechnie przyjęty jako część normalnej praktyki klinicznej w neurotraumatyce, mimo że jest łatwym do przeprowadzenia, nieinwazyjnym i stosunkowo niedrogim leczeniem. Do przeszkód w translacji klinicznej należy brak jasno zrozumiałego mechanizmu działania i brak ustandaryzowanego, skutecznego protokołu leczenia 16,17. Aktualna literatura dotycząca terapii światłem ujawnia liczne różnice w parametrach leczenia w odniesieniu do źródeł napromieniowania (LED lub laser), długości fali (np. 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904 nm), dawki całkowitej (dżule napromieniowania / jednostka powierzchni), czasu trwania (czas ekspozycji), czasu (przed lub po zniewadze), częstotliwości leczenia i sposobu dostarczania (pulsacyjne lub ciągłe) 8. Zmienność parametrów leczenia między badaniami utrudnia porównanie i przyczyniła się do sceptycyzmu co do skuteczności 16.
Dlatego optymalizacja R/NIR-LT jest wyraźnie wymagana, z systemami hodowli komórkowych zdolnymi do zapewnienia wysokoprzepustowego mechanizmu przesiewowego niezbędnego do porównania wielu zmiennych. Istnieje jednak niewiele dostępnych na rynku systemów oświetleniowych, które mogą zapewnić wystarczającą elastyczność i kontrolę nad długością fali i intensywnością, aby przeprowadzić takie eksperymenty optymalizacyjne. Dostępne na rynku urządzenia LED na ogół nie są w stanie dostarczyć wielu długości fal lub intensywności, co powoduje, że badacze wykorzystują wiele urządzeń LED różnych producentów, które mogą różnić się nie tylko intensywnością, ale także widmem długości fali emitowanego światła. Rozwiązaliśmy ten problem, stosując szerokopasmowe ksenonowe źródło światła filtrowane przez wąskopasmowe filtry interferencyjne, generując w ten sposób szereg długości fal i fluencji światła, umożliwiając ścisłą, dokładną kontrolę parametrów R/NIR-LT.
Ważne jest, aby zauważyć, że terapeutyczna dawka leczenia jest definiowana przez liczbę fotonów oddziałujących z fotoakceptorem (chromoforem), który w przypadku R/NIR-LT jest postulowany jako oksydaza cytochromu c (COX) 18. Dostarczana energia fotonów zmienia się wraz z długością fali; Oznacza to, że równe dawki energii na różnych długościach fal będą składać się z różnej liczby fotonów. W związku z tym światło emitowane przez urządzenie zostało skalibrowane tak, aby emitować równą liczbę fotonów dla każdej z wybranych długości fal, które miały być badane. Opracowaliśmy system, który może być używany do dostarczania R/NIR-LT o różnych długościach fal i natężeniach do komórek in vitro i wykazaliśmy zdolność do pomiaru wpływu dostarczonego R/NIR-LT na produkcję ROS w komórkach poddanych stresowi glutaminianem.

<table><tbody><tr><td>Wewnątrzkomórkowy zestaw testowy ROS OxiSelect (zielona fluorescencja)</td><td>Cell Biolabs</td><td>STA-342</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>odczynnika Amplex UltraRed</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>300-watowa ksenonowa lampa łukowa</td><td>Newport Corporation</td><td>6258</td><td>Bardzo intensywne źródło światła, nie patrz bezpośrednio w lampę. Upewnij się, że lampa jest wystarczająco chłodzona, gdy jest włączona</td></tr><tr><td>USB4000-FL Spektrometr fluorescencyjny</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CC-3-UV Korektor cosinusowy do zbierania emisji</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200&mu; Średnica m Światłowód kwarcowy</td> Ocean <td>Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platforma spektroskopowa SpectraSuite</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2300 Wielomodowy czytnik płytek EnSpire</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Ostra toksyczność, podczas obsługi należy nosić rękawice.</td></tr><tr><td>Hydrat soli monosodowej kwasu L-glutaminowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>142-47-2 (bezwodny)</td><td></td></tr><tr><td>Komórki rdzenia nadnerczy szczura (PC12)</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Głoska bezdźwięczna</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, certyfikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie z USA</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Ciepły do 37 stopni; C w kąpieli wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>Serum dla koni, pochodzenie z Nowej Zelandii</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Ciepłe do 37 & stopni; C w kąpieli wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Ciepły do 37 stopni C w łaźni wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>100 mM Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Ciepły do 37 & stopni; C w łaźni wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Ciepły do 37 & stopni; C w łaźni wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>100X MEM Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Ciepły do 37 stopni C w kąpieli wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>Komórki Retinal Muller (rMC1)</td><td>Uniwersytet Kalifornijski, San Diego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Ciepłe do 37 & stopni; C w kąpieli wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>75 cm2 Kolby</td><td>BD Biosciences</td><td>B4-BE-353136</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25988-63-0</td><td>Aliquot i przechowywać w temperaturze -20 °; C</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-134</td><td>Rozgrzany do 37 & stopni; C w łaźni wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td>Ogrzany do 37 & stopni; C w kąpieli wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein, Natural</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>Aliquot i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>1X Neurobaseal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Ciepły do 37 & deg; C w łaźni wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>165U Papain</td><td>Worthington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W326305</td> Corning 96-dołkowe <td></td></tr><tr><td>płytki, przezroczyste dno, czarne</td><td>Corning</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Costar Clear Polistyren 96-dołkowe płytki nieobrobione; Dobry kształt: Okrągły; Sterylny.</td><td>Costar</td><td>07-200-103</td><td></td></tr><tr><td>Huśtawka Rocker</td><td>Standardowe urządzenie</td><td></td><td></td>laboratoryjne</tr><tr><td>Wirówka</td><td>Standardowy zestaw</td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Bibuła filtracyjna o neutralnej gęstości (0,3)</td><td>Filtr pasmowo-przepustowy THORLABS</td> 442 nm THORLABS <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>FL441.6-10</td><td></td></tr><tr><td>550 nm Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>THORLABS</td><td>FB550-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy 670 nm</td><td>THORLABS</td><td>FB670-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy 810 nm</td><td>THORLABS</td><td>FB810-10e</td><td></td></tr><tr><td>Niezamontowany i Oslash; Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości 25 mm (0,1)</td><td>THORLABS</td><td>NE01B</td><td></td></tr><tr><td>niezamontowane i Oslash; Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości 25 mm (0,2)</td><td>THORLABS</td><td>NE02B</td><td></td></tr><tr><td>niezamontowane i Oslash; Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości 25 mm (0,3)</td><td>THORLABS</td><td>NE03B</td><td></td></tr><tr><td>niezamontowane i Oslash; Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości 25 mm (0,5)</td><td>THORLABS</td><td>NE05B</td><td></td></tr><tr><td>Niezamontowane i Oslash; 25 mm Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości (0,6)</td><td>THORLABS</td><td>NE06B</td><td></td></tr><tr><td>Niezamontowane & Oslash; 25 mm Filtry absorpcyjne o neutralnej gęstości (1.0)</td><td>THORLABS</td><td>NE10B</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda oceny wpływu zakresu długości fal i natężeń terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Terapia światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni (R/NIR-LT), dostarczana za pomocą lasera lub diody elektroluminescencyjnej (LED), poprawia funkcjonalne i morfologiczne wyniki w szeregu urazów ośrodkowego układu nerwowego in vivo, prawdopodobnie poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego. Wykazano jednak, że wpływ R/NIR-LT na stres oksydacyjny różni się w zależności od długości fali lub intensywności napromieniowania. Brakuje badań porównujących parametry leczenia ze względu na brak dostępnych na rynku urządzeń, które dostarczają różne długości fal lub intensywności, odpowiednie do wysokoprzepustowych badań optymalizacyjnych in vitro. Protokół ten opisuje technikę dostarczania światła o różnych długościach fal i intensywnościach w celu optymalizacji dawek terapeutycznych wymaganych dla danego modelu urazu. Postawiliśmy hipotezę, że metoda dostarczania światła, w której parametry długości fali i natężenia mogą być łatwo zmieniane, może ułatwić określenie optymalnej dawki R/NIR-LT do redukcji reaktywnych form tlenu (ROS) in vitro.
Niespójne światło ksenonowe zostało przefiltrowane przez wąskopasmowe filtry interferencyjne, aby dostarczyć różne długości fal (centralne długości fal 440, 550, 670 i 810nm) i fluencje (8,5 x 10-3 do 3,8 x 10-1 J/cm2) światła do hodowanych komórek. Strumień świetlny z aparatu został skalibrowany tak, aby emitować terapeutycznie istotne, równe ilościowe dawki światła na każdej długości fali. Formy reaktywne wykryto w komórkach poddanych działaniu glutaminianu poddanych działaniu światła, przy użyciu barwników fluorescencyjnych wrażliwych na DCFH-DA iH2O2. 
Udało nam się dostarczyć światło o różnych fizjologicznie i terapeutycznie istotnych długościach fal i intensywnościach, do hodowanych komórek wystawionych na działanie glutaminianu jako modelu uszkodzenia OUN. Podczas gdy fluencje R/NIR-LT zastosowane w niniejszym badaniu nie wywierały wpływu na ROS generowane przez hodowane komórki, metoda dostarczania światła ma zastosowanie do innych systemów, w tym izolowanych mitochondriów lub bardziej fizjologicznie istotnych organotypowych modeli hodowli warstwowych i może być wykorzystana do oceny wpływu na szereg pomiarów wyników metabolizmu oksydacyjnego.

Wyjście światła o długości fali 670 nm zostało skalibrowane przy użyciu filtrów neutralnych, aby naświetlać komórki zakresem fluencji obejmującym dawkę światła 670 nm, którą wcześniej wykazano jako korzystną in vivo (0,3 J/cm2) 20. Wraz ze wzrostem liczby filtrów neutralnych przed źródłem światła, natężenie (W/m2) spadało, co pozwalało na przenikanie mniejszej ilości światła do obszaru docelowego. Tabela 1 przedstawia dane kalibracyjne światła 670 nm generowanego przez źródło świ...

Niekoherentne światło ksenonowe było przepuszczane przez wąskopasmowe filtry interferencyjne i neutralne gęstości, aby dostarczyć światło o różnej długości fali i intensywności do hodowanych komórek. Protokół ten został wykorzystany do oceny wpływu terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na produkcję form reaktywnych in vitro: nie zaobserwowano żadnych efektów przy użyciu badanych parametrów.

Metoda oceny wpływu zakresu długości fal i natężeń terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest ocena wpływu zakresu długości fal i intensywności terapii czerwonym światłem w bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro. W tym celu opracowaliśmy nowatorską metodę dostarczania światła, w której możemy manipulować długością fali i intensywnością dostarczanego światła. Montujemy ksenonowe lub szerokopasmowe źródło światła w obudowie na metalowej podstawie, a następnie przed światłem umieszczamy soczewkę powlekającą, filtr wody i otwór wejściowy.Kolejnym krokiem procedury jest skierowanie światła generowanego z szerokopasmowego źródła światła przez wejście, aperturę i płynny światłowód oraz przez drugą soczewkę powłokową. Następnie montowane są filtry o szerokości pasma i neutralnej gęstości, aby uzyskać pożądaną długość fali i intensywność światła. Należy pamiętać, że filtry umożliwiają przejście wąskiego zakresu długości fal określanego jako pasmo fal.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami terapii światłem w bliskiej podczerwieni, takimi jak diody LED lub lasery, jest to, że umożliwia precyzyjną i skalibrowaną manipulację parametrami długości fali i intensywności. To z kolei pozwala nam zoptymalizować dostarczanie św

method-for-assessment-effects-range-wavelengths-intensities-rednear

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje technikę wizualizacji stresu oksydacyjnego w hodowanych organoidach. Praca ta pomaga w zrozumieniu poziomu stresu oksydacyjnego spowodowanego akumulacją ROS w różnych typach komórek obecnych w organoidzie po leczeniu różnymi modulatorami ROS.

Test obrazowania za pomocą sondy fluorescencyjnej: technika wizualizacji stresu oksydacyjnego w reaktywnych formach tlenu Hodowane komórki organoidów jelitowych poddane działaniu induktora

Ten film demonstruje test substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego (TBARS) do oceny stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych.

Test substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym w celu oceny stresu oksydacyjnego w surowicy ludzkiej

Ten film demonstruje test punktowy dostosowany do oceny reakcji szczepów bakteryjnych na stres oksydacyjny. Niektóre szczepy wytwarzają pyomelaninę, pigment przeciwutleniający. I odwrotnie, szczepy poddane działaniu czynnika testowego, prowadzące do zmniejszenia produkcji pyomelaniny, wykazują zwiększoną podatność na stres oksydacyjny, co skutkuje zmniejszoną żywotnością komórek w porównaniu ze szczepami wytwarzającymi pyomelaninę.

Test punktowy do oceny reakcji na stres oksydacyjny w szczepach bakteryjnych

Prezentujemy metodę rozproszonej spektroskopii optycznej (DOS), która dostarcza ilościowych biomarkerów optycznych reakcji skóry na promieniowanie. Opisujemy projekt oprzyrządowania DOS, algorytmy ekstrakcji parametrów optycznych i procedury postępowania ze zwierzętami wymagane do uzyskania reprezentatywnych danych z przedklinicznego mysiego modelu rumienia wywołanego promieniowaniem.

Dyfuzyjna spektroskopia optyczna do ilościowej oceny ostrej toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem jonizującym przy użyciu modelu mysiego

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Opisujemy nieinwazyjny protokół obrazowania in vivo, który jest uproszczony i opłacalny, wykorzystując L-012, chemiluminescencyjny analog luminolu, do wizualizacji i ilościowego określenia reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych w mysim modelu rany wycinającej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie reaktywnych form tlenu w mysim modelu rany

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Kwantyfikacja zarówno utlenionych, jak i zredukowanych form glutationu (odpowiednio GSSG i GSH) została osiągnięta dzięki zastosowaniu aldehydu ortoftaldehydu (OPA). OPA staje się wysoce fluorescencyjny po sprzęgnięciu z GSH, ale nie jest w stanie sprzęgnąć GSSG, dopóki nie zostanie zredukowany. W tym miejscu opisujemy test wieloparametryczny do ilościowego określenia obu przy użyciu kwantyfikacji białka w celu normalizacji.

Szybkie oznaczanie ilościowe utlenionych i zredukowanych form glutationu przy użyciu orto-ftaldehydu w hodowanych komórkach ssaków in vitro

Poznaj metodę oceny wpływu terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro przy użyciu źródła światła ksenonowego z filtrami interferencyjnymi. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę długości fali i natężenia.

Metoda oceny wpływu zakresu długości fal i natężeń terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Metoda oceny wpływu zakresu długości fal i natężeń terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro

Przeglądaj więcej filmów