Metoda oceny wpływu zakresu długości fal i natężeń terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro

Ogólnym celem poniższej procedury jest ocena wpływu zakresu długości fal i intensywności terapii czerwonym światłem w bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro. W tym celu opracowaliśmy nowatorską metodę dostarczania światła, w której możemy manipulować długością fali i intensywnością dostarczanego światła. Montujemy ksenonowe lub szerokopasmowe źródło światła w obudowie na metalowej podstawie, a następnie przed światłem umieszczamy soczewkę powlekającą, filtr wody i otwór wejściowy.

Kolejnym krokiem procedury jest skierowanie światła generowanego z szerokopasmowego źródła światła przez wejście, aperturę i płynny światłowód oraz przez drugą soczewkę powłokową. Następnie montowane są filtry o szerokości pasma i neutralnej gęstości, aby uzyskać pożądaną długość fali i intensywność światła. Należy pamiętać, że filtry umożliwiają przejście wąskiego zakresu długości fal określanego jako pasmo fal.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami terapii światłem w bliskiej podczerwieni, takimi jak diody LED lub lasery, jest to, że umożliwia precyzyjną i skalibrowaną manipulację parametrami długości fali i intensywności. To z kolei pozwala nam zoptymalizować dostarczanie światła w celu uzyskania najlepszych wyników biologicznych, które obecne badanie zaaplikowuje, podobnie jak w przypadku rozłączonych komórek. Ponadto może być również stosowany do innych układów, takich jak organotypowe, modele neurourazów.

Podczas pracy z dowolnym jasnym szerokopasmowym źródłem światła upewnij się, że nie patrzysz bezpośrednio w źródło światła, ponieważ może to spowodować trwałe uszkodzenie wzroku. Aby przygotować aparat dostarczający światło, należy podłączyć szerokopasmowe źródło światła, takie jak lampa ksenonowa lub wolframowa, do odpowiedniego źródła zasilania. Umieść soczewkę zbierającą przed źródłem światła, aby wytworzyć skupioną wiązkę światła.

Przepuść światło przez ciekły filtr ciepła, aby usunąć większość ciepła z wiązki światła. Umieść soczewkę zbierającą przed źródłem światła, aby wytworzyć skupioną wiązkę światła. Przepuść światło przez ciekły filtr ciepła, aby usunąć większość ciepła z wiązki światła.

W zależności od zastosowania, skupij zebraną wiązkę na polu wejściowym płynnego światłowodu, aby zapewnić bardziej elastyczne dostarczanie światła. Na drugim końcu płynnego światłowodu umieść drugą soczewkę powlekającą, a następnie uchwyt na filtry interferencyjne i filtry o neutralnej gęstości. Taki układ powinien wytwarzać równomiernie oświetloną plamę światła o pożądanym zakresie fal i intensywności.

Odległość między końcem światłowodu a płaszczyzną próbki może wymagać zmian w zależności od obszaru, który ma być oświetlony. Ważne jest, aby pamiętać, że zgodnie z prawem odwrotności kwadratu, wraz ze wzrostem odległości od końca światłowodu, natężenie światła będzie się zmniejszać w niniejszym badaniu. Odległość ta wynosi 14 centymetrów, co skutkuje wytwarzaniem przekroju poprzecznego wiązki, która równomiernie oświetla obszar dołka trzy na trzy na trzy na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.

Upewnij się, że światło rozproszone z lampy i związanych z nią elementów optycznych nie jest w stanie dotrzeć do innych próbek, na przykład za pomocą czarnego kartonu. Po zbudowaniu urządzenia włącz chłodnicę wody dla filtra ciepła cieczy i upewnij się, że następuje wymiana wody przez płaszcz filtra. Włącz lampę źródło zasilania i poczekaj co najmniej pięć minut na szerokopasmowe źródło światła.

Aby ustabilizować, wybierz wąskopasmowy filtr interferencyjny, aby wygenerować żądany zakres fal oświetlenia. Zmierzyć światło wytwarzane przez lampę na płaszczyźnie, na której ma być umieszczona próbka. Podczas zabiegu.

Światło jest mierzone za pomocą skalibrowanej sondy natężenia promieniowania podłączonej do odpowiedniego widma. Radiometer. Użyj filtrów o neutralnej gęstości, aby dostosować intensywność światła, aż do uzyskania pożądanej mocy wyjściowej. W niniejszym badaniu natężenie światła przepuszczanego przez każdy filtr interferencyjny jest dostosowywane tak, aby zapewnić równą jakość wyjściową w każdym z czterech pasm fal leczenia.

Opisana czerwona metoda dostarczania terapii światłem w bliskiej podczerwieni może być stosowana do dowolnego typu komórki lub systemu modelu in vitro. Tutaj pokazujemy naszą technikę dostarczania światła do komórek za pomocą guza chromochłonnego lub komórek PC 12. Na przykład komórki hodowlane w pożywkach wzrostowych.

W 96 dobrze tace pokryte poliolem lizyną, aż będą zlewać się w 70 do 80%. Przygotuj pożądane stężenie glutaminianu lub alternatywnego stresora w pożywce hodowlanej o pełnym wzroście. Tutaj używamy 10-milimolowego glutaminianu.

Usuń pożywkę z komórek i delikatnie przemyj je trzykrotnie solą fizjologiczną z buforem fosforanowym. Po umyciu dodaj pożywkę zawierającą glutaminian do całkowitej objętości stu mikrolitrów na stu mikrolitrów na stu dołk. Natychmiast po dodaniu glutaminianu lub wybranego stresora, wystaw komórki na działanie światła o pożądanych długościach fal i intensywności, umieszczając płytkę hodowlaną pod przygotowanym aparatem dostarczającym światło.

Pamiętaj, aby zmienić jakość wyjściową wiązki światła przy użyciu ustalonych kombinacji filtrów o neutralnej gęstości. W zależności od podawanej długości fali. Po zakończeniu obróbki światłem umieść komórki na równej powierzchni i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach regulowanych dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.

Można również zastosować dodatkowe dawki terapii czerwonym światłem bliskiej podczerwieni. Przed wykonaniem ostatniej rundy obróbki światłem należy przygotować odczynniki, które będą używane do wykrywania reaktywnych form tlenu jako wskaźnika stresu oksydacyjnego. Tutaj używamy wskazanych diet, które fluoryzują, gdy reagują z szeregiem reaktywnych gatunków, w tym dilu, octanem fluoresceiny D, podajemy leczenie światłem do komórek, jak opisano w kroku czwartym, upewniamy się, że komórki są leczone pożądaną grypą i długościami fal światła.

Natychmiast po lekkim traktowaniu usuń pożywkę zawierającą glutaminian i przemyj dwukrotnie PBS. Kontynuuj testy z wykorzystaniem barwników wskaźnikowych, które fluoryzują, gdy reagują z reaktywnymi formami zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierzyć fluorescencję generowaną przez barwniki wskaźnikowe za pomocą czytnika płytek ustawionego na odpowiednie ustawienia wzbudzenia i emisji.

Użyj koloru zestawu metrycznego, aby określić ilościowo stężenie białka w studzienkach zgodnie z instrukcjami producenta. Wyraź wyniki fluorescencji w stosunku do stężenia białka dla każdej pojedynczej studzienki, a następnie przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania statystycznego. Rozwój tej techniki toruje drogę naukowcom badającym wpływ wielu długości fal i intensywności terapii czerwonym światłem w bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny.

Technika ta może być stosowana w wielu systemach modelowych, w tym w rozłączonych komórkach lub kulturach organotypowych.