Name: Dyfuzyjna spektroskopia optyczna do ilościowej oceny ostrej toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem jonizującym przy użyciu modelu mysiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Poznaj dyfuzyjną spektroskopię optyczną do ilościowej oceny ostrej toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem jonizującym w modelu mysim. Ta metoda dostarcza obiektywnych biomarkerów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty badawcze przyznane SKL przez Abbott, CARO (Kanadyjskie Stowarzyszenie Radiologów), Uro-Oncologic Radiation Awards oraz Fundację Alana E. Tiffina. EK był wspierany przez Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship, Scace Graduate Fellowship in Prostate Cancer Research oraz Paul Starita Graduate Student Fellowship.

Poniższe metody są zgodne z wytycznymi Komitetu Etyki Opieki nad Zwierzętami Sunnybrook Research Institute.
1. System spektroskopii odbicia rozproszonego
<ol>
	<li>Zbierz widma odbicia rozproszonego, wykorzystując ręczną sondę światłowodową oraz przenośny system akwizycji spektroskopowej, który został opisany wcześniej (Kim et al. 2010) i jest krótko przedstawiony na Rysunku 1 (oraz w powiązanych podpisach) dla zachowania kompletności1,2.</li>
</ol>
2. Przygotowanie modelu mysiego ostrego popromiennego uszkodzenia skóry
<ol>
	<li>Zamów 6-tygodniowe myszy (najlepiej bezwłose, takie jak atymiczne lub SKH-1) i pozwól im na aklimatyzację w zwierzęciu przez tydzień przed rozpoczęciem eksperymentów. Przeznacz co najmniej 3 myszy do grupy kontrolnej nienaświetlanej i 5 myszy do grupy naświetlanej.</li>
	<li>Przed pomiarami bazowymi DOS i naświetlaniem oznakuj myszy za pomocą dziurkacza do uszu lub trwałych oznaczeń markerem na ogonie. Jeśli myszy nie są bezwłose, usuń sierść z obszaru o wymiarach 2 cm na 2 cm na skórze boku, jednak może to spowodować podrażnienie skóry.</li>
</ol>
3. Pozyskiwanie danych w dyfuzyjnej spektroskopii optycznej
<ol>
	<li>Włącz zasilanie elektroniki.</li>
	<li>W przypadku skóry myszy ustaw parametry sygnału w oprogramowaniu akwizycyjnym, wpisując 25 msec dla czasu zbierania danych, 25 dla średniej sygnałów oraz 1 dla szerokości filtra boxcar. Parametry te zapewniają odpowiednią równowagę między czasem akwizycji a stosunkiem sygnału do szumu.</li>
	<li>Używając dedykowanego oprogramowania akwizycyjnego, automatycznie zarejestruj odczyt tła Rbg (wyłączona dioda LED) oraz odbicie rozproszone dla dwóch odległości między źródłem a detektorem, Rmeas (260 μm, 520 μm), klikając przycisk „Acquire”. Całkowity czas akwizycji wynosi ~ 2 sec.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do pomiarów wyłącz wszystkie fluorescencyjne oświetlenie pomieszczenia, naciskając przełącznik światła. 
	UWAGA: Fluorescencyjne oświetlenie pomieszczenia zakłóca wykrywany sygnał (światła te generują zmienną w czasie intensywność światła, co utrudnia ich odjęcie jako sygnału tła). Choć można stosować żarówki wolframowe, należy trzymać je w odległości od sondy DOS, aby uniknąć wysokiego poziomu tła (i słabego stosunku sygnału do szumu).</li>
</ol>
4. Znieczulenie zwierząt i pomiary bazowe DOS
<ol>
	<li>Przygotować aparat do znieczulenia, upewniając się, że wszystkie połączenia są szczelne, a poziom płynnego izofluranu jest odpowiedni. Należy użyć komory do indukcji znieczulenia z dołączoną rurką i maską nosową, którą można przymocować taśmą do wysterylizowanej, miękko wyściełanej powierzchni znajdującej się w zasięgu sondy DOS.</li>
	<li>Znieczulać myszy po jednej klatce w komorze indukcyjnej, stosując 4% izofluranu przez 30 s. Następnie obniżyć stężenie izofluranu do 2% przez kolejne 2 min. Zweryfikować stan znieczulenia myszy, obserwując brak reakcji na uciśnięcie palca kończyny tylnej.</li>
	<li>Szybko przenieść jedną mysz na wysterylizowany obszar badania DOS, ułożyć ją na boku, zamocować pysk w masce nosowej i otworzyć dopływ znieczulenia (2% izofluranu) do rurki maski. 
	UWAGA: Jeśli procedura trwa dłużej niż 1 - 2 min, należy nałożyć na oczy maść weterynaryjną, aby zapobiec ich wysuszeniu.</li>
	<li>Przed wykonaniem pomiarów skóry myszy wysterylizować sondę, przecierając ją 70% etanolem. Nie sterylizować skóry.</li>
	<li>Delikatnie przyłożyć sondę do skóry na boku ciała, dbając o to, aby nie doprowadzić do rozproszenia miejscowego unaczynienia. Trzymać sondę w ręce przez cały czas trwania pomiaru.</li>
	<li>Pozyskać dane o odbiciu światła, badając obszar skóry na boku o wymiarach około 2 cm na 2 cm (obszar naświetlany), postępując zgodnie z układem 5 kropkek na kostce do gry. Zachować ten sam wzór badania, obszar, nacisk sondy oraz stronę ciała (lewą lub prawą) dla wszystkich kolejnych pomiarów. 
	UWAGA: Pełny skan trwa około 60 s. Nacisk sondy powinien być na tyle niewielki, aby uzyskać skan bez rozpraszania miejscowego unaczynienia.</li>
	<li>Przenieść mysz do klatki wybudzeniowej, a następnie przenieść kolejną mysz na obszar badania DOS. Powtarzać kroki 4.2 - 4.6, aż do zmierzenia wszystkich myszy. Nie pozostawiać zwierzęcia bez nadzoru do momentu odzyskania przez nie wystarczającej świadomości, aby mogło utrzymać pozycję grzbietową.</li>
</ol>
5. Naświetlanie zwierząt
UWAGA: Niniejszy protokół wymaga użycia irradiatora, a przygotowanie zwierząt może wymagać dostosowania do specyfikacji urządzenia do napromieniowania. Podczas napromieniowania wiązka promieniowania powinna być skierowana wyłącznie na niewielki obszar skóry boku. Irradiator powinien znajdować się w pomieszczeniu sterylnym, a podczas przenoszenia myszy z powrotem do sterylnej klatki należy przestrzegać odpowiednich procedur sterylizacji klatek.
<ol>
	<li>Przygotować aparat do znieczulania (zgodnie z krokami 4.1 - 4.2) i znieczulać myszy pojedynczo w komorze indukcyjnej przed przygotowaniem ich do napromieniowania.</li>
	<li>Wyjąć mysz z komory indukcyjnej, delikatnie uszczypnąć skórę na boku i przykleić taśmę powyżej oraz poniżej rozciągniętej skóry, tworząc płat.</li>
	<li>Umieścić mysz na podeście z pleksiglasu i przykryć ciało specjalnym ołowianym szablonem (sprawdzoną konstrukcją jest prostokątne pudełko z otwartym dnem i co najmniej jednym otwartym końcem, z bocznym okienkiem umożliwiającym wyprowadzenie skóry z boku). Przeciągnąć płat skóry przez okienko szablonu i delikatnie przykleić go taśmą do podestu. 
	UWAGA: Specjalny ołowiany szablon jest wystarczająco mały, aby unieruchomić mysz. Jeśli szablon nie unieruchamia myszy całkowicie, należy zastosować dodatkowe stabilizatory i/lub podać ketaminę (80 - 100 mg/kg) oraz ksylazynę (10 - 12,5 mg/kg) w zastrzyku doszpikowym, aby utrzymać unieruchomienie myszy przez cały proces napromieniowania.</li>
	<li>Włożyć podest z pleksiglasu wraz z szablonem i myszą do irradiatora. Ustalić parametry (odległość skóry od źródła promieni rentgenowskich, napięcie, czas i natężenie prądu) i podać żądaną dawkę (np. 11 cm od źródła promieni rentgenowskich 160 kVp przez 2,5 min przy 6,3 mA). 
	UWAGA: Należy zachować OSTROŻNOŚĆ przy obsłudze źródła promieni rentgenowskich, postępując zgodnie z wytycznymi użytkowania urządzenia, aby uniknąć oparzeń i uszkodzeń DNA. 
	UWAGA: U myszy nagoatymicznych w odpowiedzi na 35 Gy rozwija się złuszczanie wilgotne około 14 dni po napromieniowaniu, natomiast przy 17 Gy występuje jedynie niewielkie złuszczanie plamiste.</li>
	<li>Wyjąć aparat i mysz z irradiatora, usunąć osłonę, odkleić taśmę i umieścić zwierzę w indywidualnej klatce rekonwalescencyjnej. Przenieść mysz do zwykłej klatki zbiorowej po wybudzeniu z narkozy. Powtórzyć kroki 5.2 - 5.4 dla wszystkich myszy oraz przeprowadzić operację pozorowaną (sham) na myszach kontrolnych.</li>
	<li>Po napromieniowaniu utrzymywać zwierzęta w standardowych warunkach. W przypadku wystąpienia nieprawidłowych zachowań (np. zgarbiona postawa, która może sygnalizować ból), skonsultować się z weterynarzem w celu zdiagnozowania problemu. Łagodzenie bólu może obejmować podanie 0,1 mg/kg buprenorfiny podskórnie lub zgodnie z zaleceniami weterynarza. Jeśli utrata masy ciała przekroczy 20% normalnej masy ciała, należy umieścić zwierzę osobno w jego własnej klatce i zapewnić pokarm wysokoodżywczy.</li>
</ol>
6. Kolejne pomiary DOS
<ol>
	<li>Monitorować i mierzyć intensywność reakcji skóry, stosując ilościową technikę DOS. Inspekcja wizualna zmian skórnych oraz wcześniejsze prace sugerują, że znaczne zmiany parametrów DOS (w stosunku do poziomu bazowego) można oczekiwać około 6–12 dni po napromieniowaniu3,4. Jednakże, ponieważ istotne zmiany mogą wystąpić wcześniej lub później w zależności od modelu, przydatne do zbadania mogą być inne punkty czasowe pomiarów.</li>
	<li>Przygotować sprzęt DOS i przeprowadzić kalibrację zgodnie z opisem w sekcji 3. Przygotować aparat do znieczulenia i wykonać pomiary DOS zgodnie z opisem w sekcji 4.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie po akwizycji
UWAGA: Wszystkie etapy w następnej sekcji są wykonywane przy użyciu niestandardowego programu stworzonego w wysokowydajnym środowisku programistycznym. Aby umożliwić przetwarzanie wsadowe, zastosowano ustandaryzowane konwencje nazewnictwa dla każdego pliku z akwizycją widma. Wszystkie etapy są przedstawione na Rysunku 2.
<ol>
	<li>Odejmij linię bazową (poziom szumu) od wszystkich zmierzonych widm, w tym od odczytu tła.</li>
	<li>Odejmij od widma pomiarowego, Rmeas, odczyt tła, Rbg (wyłączona dioda LED), uzyskany w kroku 3.3. 
	UWAGA: W dalszej części artykułu przyjmuje się, że wszystkie widma są skorygowane o poziom szumu i tło i są określane jako Rcorr.</li>
	<li>Przelicz Rcorr na odbicie bezwzględne, Rabs, zgodnie z opisem w referencjach 1,2 w sekcji 1.
	<ol>
		<li>Wykonaj pomiary odbicia względnego, Rrel, w fantomach Intralipid-20% (Fresenius Kabi, Szwecja) z rosnącymi 3% frakcjami alikwotowymi do 48% (t.j. 3%, 6%, 9%, ..., 48%) i stwórz wykres zależności Rrel od stężenia Intralipidu.</li>
		<li>Wygeneruj bezwzględny wykres zależności Rabs od μs', wykorzystując równanie dyfuzji dla odbicia.14</li>
		<li>Dopasuj szczyty obu krzywych i dostosuj oś x dla Rrel do osi x dla Rabs.</li>
		<li>Dla danej długości fali i odległości źródło-detektor przeskaluj oś y, korzystając z wzoru: 
		<img alt="Równanie na współczynnik skalowania w analizie danych eksperymentalnych; formuła procesu normalizacji." src="/files/ftp_upload/53573/53573eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
		UWAGA: W następnej sekcji wszelkie dopasowania pomiarów będą odnosić się do Rabs.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Dopasowanie danych widmowych
UWAGA: Następująca sekcja opisuje teorię i algorytm dopasowania wykorzystywane do wyznaczania parametrów funkcjonalnych skóry myszy. W kwestii zastosowanej teorii należy odnieść się do następujących artykułów14-18 oraz zawartych w nich bibliografii. Przyjmuje się, że wszystkie równania zostały zaprogramowane w zaawansowanym środowisku oprogramowania naukowego (zawierającym wstępnie zaprogramowane moduły), powszechnie stosowanym w laboratoriach fizycznych lub inżynieryjnych.
<ol>
	<li>Zaimplementuj funkcję opisującą widmo absorpcji skóry, μa(λ), jako sumę odpowiednich poszczególnych chromoforów w interesującym zakresie widmowym, korzystając z równania: 
	<img alt="Równanie absorpcji hemoglobiny dla analizy właściwości optycznych; istotne dla badań spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/53573/53573eq4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
	Gdzie Hb oznacza całkowite stężenie hemoglobiny (g/L), a StO2 jest bezwymiarowym nasyceniem tlenem w zakresie od 0 do 1.</li>
	<li>Pobierz widma hemoglobiny utlenowanej, <img alt="Wzór współczynnika statycznego, μa, absorpcja Hb, symbol λ, wynik analizy widmowej." src="/files/ftp_upload/53573/53573eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">, oraz odtlenowanej, <img alt="Równanie współczynnika absorpcji dla hemoglobiny odtlenowanej, reprezentacja symboliczna w spektroskopii." src="/files/ftp_upload/53573/53573eq6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> (przechowywane jako pliki tekstowe) z internetowej kolekcji Prahl19.</li>
	<li>Zaimplementuj funkcję opisującą widmo rozpraszania skóry, <img alt="Równanie współczynnika rozpraszania μs'(λ)=A(λ/λo)^-k, analiza właściwości optycznych." src="/files/ftp_upload/53573/53573eq7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">, stosując zależność potęgową, gdzie A (cm-1) jest wartością μs' przy λo = 1 nm, a k jest zależnym od ośrodka współczynnikiem potęgowym16.</li>
	<li>Zaimplementuj funkcję matematyczną dla modelu forward odzwierciedlenia rozproszonego na podstawie równań z referencji 14, włączając równania widmowe z kroków 8.2 - 8.3 do funkcji modelu forward (tj. R(r, μa(λ), μs'(λ)) = R(r, Hb, StO2, A, k). 
	UWAGA: Chociaż istnieje wiele modeli, równanie teorii dyfuzji w stanie ustalonym zapewnia prosty i dokładny opis rozkładu światła w tkance.</li>
	<li>Zaimplementuj funkcję, która oblicza kwadrat różnicy między widmami odzwierciedlenia z modelu forward z sekcji 8.4 a zmierzonymi widmami odzwierciedlenia.</li>
	<li>Iteracyjnie zmieniaj wartości Hb, StO2, A oraz k , aż funkcja różnicy najmniejszych kwadratów z sekcji 8.5 osiągnie minimalną wartość. Do automatycznego wykonania tego kroku można użyć funkcji lsqcurvefit w programie MatLab.</li>
	<li>Powtórz kroki 8.5 - 8.6, aby uzyskać parametry DOS (Hb, StO2, A oraz k) dla wszystkich zmierzonych zestawów danych odzwierciedlenia.</li>
	<li>Przedstaw na wykresie względną zmianę parametru DOS względem odpowiadającego mu unikalnego pomiaru bazowego, wykorzystując średnią z zestawu 3 - 5 znormalizowanych pomiarów punktowych sondy dla każdej myszy. Wykresy te należy utworzyć za pomocą komendy plot w programie MatLab.</li>
</ol>
9. Okres oceny wizualnej zapalenia skóry popromiennego
<ol>
	<li>Monitoruj i oceniaj intensywność reakcji skóry za pomocą jakościowej skali ocen (patrz: skala ocen według Douglasa i Fowlera20) co 48 h po napromieniowaniu (zmiany można obserwować również od 3 do 24 h po napromieniowaniu). Idealnym rozwiązaniem jest udział dwóch niezależnych obserwatorów (metoda ślepej próby). Wykonywanie fotografii za pomocą aparatu ręcznego i skali odniesienia (t.j. linijki) może pomóc w ocenie.</li>
	<li>UWAGA: Ocena stanu skóry co dwa dni po napromieniowaniu może pomóc w określeniu optymalnego czasu pomiaru DOS dla danego modelu. Częstsza ocena może dostarczyć istotnych danych, w zależności od modelu i pytania badawczego.</li>
	<li>Wyznacz medianę dla każdej grupy w każdym punkcie czasowym. Porównaj grupy w konkretnych punktach czasowych lub mediany całkowitych pól pod każdą z krzywych.</li>
	<li>Po obserwacji myszy do pożądanego stopnia gojenia skóry (np. 4 tygodnie), utylizuj myszy odpowiednią (zatwierdzoną) metodą.</li>
</ol>

<ol><li>Hall, E. J., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+EJ+%22Radiobiology+for+the+Radiologist%22">Radiobiology for the Radiologist</a>. , J.B. Lippincott Company. Philadelphia. (2011).</li>
<li>Ryan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+Radiation%3A+The+Good%2C+the+Bad%2C+and+the+Ugly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Ionizing Radiation: The Good, the Bad, and the Ugly.</a> J Invest Dermatol. 132, 985-993 (2012).</li>
<li>Chin, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+for+early+detection+of+oxygenation+and+perfusion+changes+in+irradiated+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging for early detection of oxygenation and perfusion changes in irradiated skin.</a> J Biomed Opt. 17 (2), (2012).</li>
<li>Chin, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+perfusion+and+oxygenation+changes+in+radiation+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plast.+Reconstr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Skin perfusion and oxygenation changes in radiation fibrosis.</a> Plast. Reconstr. Surg. 131 (4), 707-716 (2013).</li>
<li>Yohan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+radiation+induced+skin+toxicities+in+nude+mice+using+optical+biomarkers+measured+from+diffuse+optical+reflectance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of radiation induced skin toxicities in nude mice using optical biomarkers measured from diffuse optical reflectance spectroscopy.</a> Biomed. Opt. Express. 5 (5), 1309-1320 (2014).</li>
<li>Korpela, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculotide%2C+an+Angiopoietin-1+mimetic+reduces+acute+skin+ionizing+radiation+damage+in+a+preclinical+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vasculotide, an Angiopoietin-1 mimetic reduces acute skin ionizing radiation damage in a preclinical mouse model.</a> BMC Cancer. 14, 614(2014).</li>
<li>Stamatas, G. N., Kollias, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+documentation+of+cutaneous+inflammation+using+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo documentation of cutaneous inflammation using spectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12 (5), 051603(2007).</li>
<li>Turesson, I., Nyman, J., Holmberg, E., Oden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+acute+and+late+skin+reactions+in+radiotherapy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Oncol.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for acute and late skin reactions in radiotherapy patients.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 36, 1065-1075 (1995).</li>
<li>Rizza, L., D'Agostino, A., Girlando, A., Puglia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+topical+agents+on+radiation-induced+skin+disease+by+reflectance+spectrophotometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of topical agents on radiation-induced skin disease by reflectance spectrophotometry.</a> J. Pharm. Pharmacol. 62 (6), 779-785 (2010).</li>
<li>Wells, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+aqueous+or+sucralfate+cream+affect+the+severity+of+erythematous+radiation+skin+reactions%3F+A+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Does aqueous or sucralfate cream affect the severity of erythematous radiation skin reactions? A randomised controlled trial.</a> Radiother. Oncol. 73 (2), 153-162 (2004).</li>
<li>Denham, J. W., Hauer-Jensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radiotherapeutic+injury-a+complex+%27wound%27%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The radiotherapeutic injury-a complex 'wound'.</a> Radiother. Oncol. 63 (2), 129-145 (2002).</li>
<li>Kim, A., Roy, M., Dadani, F., Wilson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fiberoptic+reflectance+probe+with+multiple+source-collector+separations+to+increase+the+dynamic+range+of+derived+tissue+optical+absorption+and+scattering+coefficients%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A fiberoptic reflectance probe with multiple source-collector separations to increase the dynamic range of derived tissue optical absorption and scattering coefficients.</a> Opt. Express. 18, 5580-5594 (2010).</li>
<li>Kim, A., Khurana, M., Moriyama, Y., Wilson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+in+vivo+fluorescence+decoupled+from+the+effects+of+tissue+optical+properties+using+fiber-optic+spectroscopy+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Quantification of in vivo fluorescence decoupled from the effects of tissue optical properties using fiber-optic spectroscopy measurements.</a> J. Biomed. Opt. 15, 067006(2010).</li>
<li>Farrell, T. J., Patterson, M. S., Wilson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diffusion+theory+model+of+spatially+resolved%2C+steady-state+diffuse+reflectance+for+the+noninvasive+determination+of+tissue+optical+properties+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">A diffusion theory model of spatially resolved, steady-state diffuse reflectance for the noninvasive determination of tissue optical properties in vivo.</a> Med. Phys. 19 (4), 879-888 (1992).</li>
<li>Finlay, J. C., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+oxygen+saturations+in+phantoms+and+in+vivo+from+measurements+of+steady-state+diffuse+reflectance+at+a+single%2C+short+source-detector+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin oxygen saturations in phantoms and in vivo from measurements of steady-state diffuse reflectance at a single, short source-detector separation.</a> Med Phys. 31 (7), 1949-1959 (2004).</li>
<li>Mourant, J. R., Fusilier, T., Boyer, J., Johnson, T. M., Bigio, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictions+and+measurements+of+scattering+and+absorption+over+broad+wavelength+ranges+in+tissue+phantoms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Predictions and measurements of scattering and absorption over broad wavelength ranges in tissue phantoms.</a> Appl Opt. 36, 949-957 (1997).</li>
<li>Corlu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniqueness+and+wavelength+optimization+in+continuous-wave+multispectral+diffuse+optical+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Uniqueness and wavelength optimization in continuous-wave multispectral diffuse optical tomography.</a> Opt. Lett. 28, 2339-2341 (2003).</li>
<li>Chin, L., Lloyd, B., Whelan, W. M., Vitkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+point+radiance+spectroscopy+of+turbid+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Physics%22%5BJournal%5D)">Interstitial point radiance spectroscopy of turbid media.</a> J App Physics. 105, 102025(2009).</li>
<li>Prahl, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrahl%2C+S+%22Tabulated+Molar+Extinction+Coefficient+for+Hemoglobin+in+Water%22">Tabulated Molar Extinction Coefficient for Hemoglobin in Water</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/summary.html">http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/summary.html</a> (1998).</li>
<li>Douglas, B. G., Fowler, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+multiple+small+doses+of+X+rays+on+skin+reactions+in+the+mouse+and+a+basic+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of multiple small doses of X rays on skin reactions in the mouse and a basic interpretation.</a> Radiat. Res. 178 (2), AV125-AV138 (1976).</li>
<li>Williams, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+medical+countermeasures+to+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models for medical countermeasures to radiation exposure.</a> Radiat. Res. 173 (4), 557-578 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono podejście DOS do ilościowej oceny toksyczności popromiennej skóry przy użyciu biomarkerów optycznych. Systemy oceny wizualnej toksyczności skórnej wymagają specjalistycznego szkolenia, a nawet wtedy są podatne na zmienność i subiektywność między obserwatorami. System DOS i oprogramowanie analityczne są proste w obsłudze, wymagają minimalnego szkolenia i zwracają obiektywne parametry funkcjonalne do interpretacji zmian fizjologicznych w skórze. Ponadto, zamiast opisywać wygląd zmiany skórnej jako pojedynczy parametr, DOS dostarcza bogactwa informacji o kształcie spektralnym, właściwościach optycznych i parametrach funkcjonalnych / mikrostrukturalnych, które oferują dodatkowy stopień czułości i swoistości niedostępny w obecnych metodach oceny jakościowej. Sekcje 1 i 7 podkreślają główne etapy przetwarzania w celu uzyskania bezwzględnych danych spektralnych, które można wykorzystać do ilościowego dopasowania biomarkerów optycznych. Odejmowanie tła i linii bazowej jest niezbędne, aby umożliwić użytkownikowi wykonywanie pomiarów DOS w normalnych warunkach oświetleniowych. Sekcja 8 zawiera niezbędne modele i równania potrzebne do opisania myszy atymicznych przed i po napromieniowaniu rentgenowskim. W tym przypadku dobór odpowiednich absorberów ma kluczowe znaczenie dla dokładnego opisu mierzonych widm. Zaleca się, aby użytkownik dokładnie zapoznał się z literaturą kluczowych absorberów, które dominują w zakresie długości fal i tkanki będącej przedmiotem zainteresowania wykorzystanej w danym badaniu, przed skonstruowaniem optycznego modelu dopasowania biomarkera. Wreszcie, sekcje 3-5 opisują postępowanie z myszami atymicznymi podczas akwizycji DOS. Aby uniknąć zakłócenia miejscowego układu naczyniowego, użyj delikatnej siły, aby umieścić sondę DOS na powierzchni skóry myszy.
Chociaż jest to stosunkowo niedrogie w porównaniu z systemami kamer hiperspektralnych3,4, wyraźnym ograniczeniem opisywanego podejścia DOS jest użycie sondy punktowej do pomiaru rozproszonego współczynnika odbicia. Ta geometria odbicia wymaga delikatnego kontaktu ze skórą i może wprowadzać niepewność pomiaru poprzez rozpraszanie układu naczyniowego, jeśli nie stosuje się stałego nacisku sondy na skórę. Przyszłe projekty sondy DOS mogą zawierać czujnik ciśnienia, aby utrzymać spójne wyniki. Ponadto, podczas gdy zastosowanie bliskiej separacji między źródłem a detektorem (< 2-3 mm) pozwala na optyczne głębokości sondowania specyficzne dla powierzchni skóry, poprawa specyficzności wiąże się z utratą rozdzielczości przestrzennej w porównaniu z obrazowaniem hiperspektralnym 2D. Aby zminimalizować to ograniczenie, zastosowano 5-punktowy skan kwadrantowy, który rejestruje całkowitą objętość napromieniowania. Pomimo braku rozdzielczości przestrzennej, wcześniejsze prace na myszach5 wykazały zdolność biomarkerów optycznych uśrednionych na rzadkim obszarze do różnicowania nie tylko napromieniowanej i nienapromieniowanej skóry, ale także wpływu oszczędzających skórę leków interwencyjnych, takich jak Vasculotide6.
Należy zauważyć, że chociaż ogólny projekt systemu może być modyfikowany dla różnych modeli skóry, podstawowe widma bazowe i kształt rozpraszania mogą wymagać optymalizacji. W szczególności, podczas gdy oxy- i deoksy-Hb dobrze opisują atymiczny model myszy, zastosowanie tego samego modelu na ciemniejszej skórze może wymagać dodania melaniny w celu optymalnego dopasowania. Ponadto rozszerzenie pasma DOS na wyższe długości fal > 950 nm wymagałoby dodania wody, która dominuje na wyższych długościach fal. Co więcej, modele zwierzęce o różnych grubościach skóry mogą wymagać innej separacji między źródłem a detektorem, aby zoptymalizować czułość głębokości. Wreszcie, funkcja bezwłosa upraszcza algorytmy. Chociaż modele bezwłose mogą być optymalne dla niektórych pytań badawczych, będą wymagały usunięcia włosów przed pomiarami DOS, a podrażnienie skóry spowodowane tym procesem może wpłynąć na wyniki. W przypadku badań, w których kluczowa jest całkowita funkcja immunologiczna, immunokompetentna mysz bezwłosa (np. SKH-1) może służyć jako lepszy model ze względu na jej eutymiczny charakter.
Ważnymi kwestiami przy pomiarach sondą DOS są spójny RT i oszacowanie napromieniowanego obszaru. Wahania temperatury mogą wpływać na poziomy Hb i StO2 w tkankach. Pomiar grupy 3 nienapromieniowanych zwierząt w każdym czasie zbierania danych może służyć jako punkt odniesienia, do którego można znormalizować niezamierzone wahania wartości parametrów w środowisku. Dodatkowo, napromieniany obszar może być trudny do oszacowania (jeśli preparaty płatów skórnych nie były spójne), zanim uszkodzenie zacznie objawiać się wizualnie około 5 dnia (40 Gy). Jeśli używasz czarnego markera permanentnego do wykropkowania granic skóry wystawionej na promieniowanie, unikaj nadmiernego użycia atramentu, aby zapobiec rozmazywaniu atramentu, co może pogorszyć odczyty.
Dodatkową cechą systemu jest możliwość oddzielenia właściwości absorpcyjnych od rozpraszających. Podczas gdy alternatywne systemy obrazowania hiperspektralnego również zapewniają możliwość monitorowania tlenu Hb i stężenia Hb, geometria obrazowania hiperspektralnego w wolnej przestrzeni nie jest w stanie rozwiązać zmian rozpraszania. Ograniczenie to może skutkować niedokładnościami w zwracanych parametrach oxyHb, Hb i StO2 w przypadku wystąpienia istotnych zmian w rozpraszaniu z powodu rumienia (zaczerwienienia). Co więcej, monitorowanie zmian rozpraszania za pomocą DOS może dostarczyć dodatkowych biomarkerów optycznych do oceny rumienia. Jak pokazano na rysunku 6, wstępne wyniki Yohana i in. (2014) wskazują, że A i k wykazują trend czasowy po promieniowaniu jonizującym, który nie koreluje z trendami obserwowanymi za pomocą innych alternatywnych metod, takich jak wizualne systemy punktacji. Wskazuje to, że zmiany rozpraszania nie manifestują się w sposób wizualnie opisowy i mogą w rzeczywistości opisywać odrębny proces biologiczny. W związku z tym, w porównaniu z alternatywnymi metodami, DOS zapewnia wysoką rozdzielczość dla powierzchownych zmian rozpraszania, co jest drogą do badania nowych biomarkerów uszkodzeń skóry, które mogą być niezależne od zwykłych pomiarów opartych na Hb.
Chociaż nasz model wykorzystuje dużą pojedynczą dawkę promieniowania (zamiast wielu małych dawek frakcjonowanych, które są stosowane w warunkach klinicznych), naśladuje to patofizjologię ostrej radiotoksyczności ludzkiej skóry21. Przewiduje się, że wraz z dalszą optymalizacją, DOS może zapewnić ilościowe podejście do zautomatyzowanej i standaryzowanej oceny reakcji skórnych wywołanych promieniowaniem. Po opanowaniu tej techniki, przyszłe zastosowania mogą obejmować monitorowanie różnic między terapiami oszczędzającymi skórę (np. porównywanie poziomów oxyHb między kontrolnym a eksperymentalnym leczeniem radioprotekcji skóry lub wspomaganiem gojenia się ran). Chociaż system DOS idealnie nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków w modelach zwierzęcych, można go potencjalnie dostosować do środowiska klinicznego ze względu na łatwość obsługi i możliwość pomiaru w normalnych warunkach oświetleniowych. W takim przypadku konstrukcja sondy może wymagać niewielkich modyfikacji z nieco większymi separacjami optodowymi, aby uwzględnić zwiększoną grubość ludzkiej skóry. Kliniczny system DOS pozwoliłby na ocenę on-line terapii interwencyjnych, które mogłyby zminimalizować bolesne reakcje skórne oraz poprawić komfort pacjenta i przestrzeganie zaleceń lekarskich. W przyszłości interesujące może być rozszerzenie kwantyfikacji opartej na DOS na cechy przewlekłego uszkodzenia skóry wywołanego promieniowaniem (np . zwłóknienia).

Technologiczne ulepszenia w planowaniu i dostarczaniu radioterapii (RT) pozwalają teraz na dostarczanie wysoce konforemnych dawek terapeutycznych do obszaru guza, jednocześnie oszczędzając normalne otaczające struktury. Jednak ostra, a czasem ciężka toksyczność jest nieunikniona, gdy docelowa wysoka dawka znajduje się w bliskiej odległości od skóry. Jeśli jest wystarczająco poważne, wynikające z tego normalne uszkodzenie tkanek może negatywnie wpłynąć na wynik leczenia RT i jakość życia pacjenta1,2.
Pomimo szkodliwych konsekwencji, obecne leczenie popromiennego rumienia skóry pozostaje niespecyficzne, stosując kremy lub maści, które ignorują podstawowe mechanizmy biologiczne prowadzące do uszkodzeń. Podejścia te opierają się na minimalizowaniu objawów, a nie przyczyny. Co więcej, czas i podawanie terapii interwencyjnych jest skomplikowane ze względu na jakościowy i subiektywny charakter oceny popromiennych uszkodzeń skóry. Podczas gdy kilka uznanych organizacji (RTOG, EORTC) zapewnia wizualne zalecenia dotyczące klasyfikacji, instytucje różnią się pod względem wyboru preferowanej punktacji, co zaciemnia porównania normalnej toksyczności tkankowej dla celów metaanaliz. Co więcej, takie systemy klasyfikacji są prymitywne i podatne na zmienność między obserwatorami, tak że różnice w ciężkości obrażeń popromiennych mogą być niedostrzegalne w badaniach oceniających strategie redukcji toksyczności.
Zamiast wizualnie opisywać stopień rumienia w napromieniowanej skórze, alternatywnym podejściem jest mierzenie parametrów, które ilościowo opisują podstawowe zmiany fizjologiczne, które zachodzą w narządzie. Poziomy hemoglobiny we krwi (Hb), wysycenia tkanek tlenem (StO2) lub hemoglobiny tlenowej (oxyHb) zostały wykorzystane jako wskaźniki zastępcze dla rumienia wywołanego promieniowaniem u myszy3-6. Po napromieniowaniu całkowite poziomy Hb ulegają wahaniom, ale oxyHb lub StO2 ulegają charakterystycznemu wczesnemu gwałtownemu wzrostowi, po którym następuje spadek i kolejny, bardziej trwały wzrost3,6. Gdy substancje drażniące są stosowane w celu wywołania rumienia skóry, poziomy oksyHb w naczyniach krwionośnych bezpośrednio korelują z nasileniem miejscowego rumienia i stanu zapalnego7.
Dyfuzyjna spektroskopia optyczna (DOS) wykorzystuje światło bliskiej podczerwieni do dostarczania funkcjonalnych informacji na temat biochemicznych i mikrostrukturalnych składników ważnych składników tkanek. Ta ilościowa, nieinwazyjna technologia optyczna oferuje metodę pomiaru indukowanego cytokinami rozszerzenia naczyń krwionośnych w naczyniach krwionośnych, które występuje podczas rumienia za pomocą funkcjonalnych substytutów stężenia Hb i StO2. Ostatnie badania porównujące parametry mierzone przez DOS z kontrolowanymi metodami oceny klinicznej8-11 wskazują na potencjał tej techniki w pokonywaniu ograniczeń nieodłącznie związanych z obecnymi systemami oceniania.
Tutaj opisujemy wewnętrzny, przenośny system DOS, który wykorzystuje funkcjonalne surogaty do ilościowego wykrywania różnic w toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem w przedklinicznym modelu myszy5. Opisana platforma może stanowić sposób standaryzacji oceny rumienia o wysokiej czułości do wczesnego wykrywania i subtelnego różnicowania interwencyjnej odpowiedzi na leki. Co więcej, przy niewielkich dostosowaniach, oprzyrządowanie może ostatecznie zostać wykorzystane klinicznie do monitorowania przy łóżku pacjenta w czasie rzeczywistym.

<table><tbody><tr><td>Nagie myszy</td><td>np. Charles River</td><td>Athymic nude Crl:NU(NCr)-Foxn1nu, lub immunokompetentne nago Crl:SKH1-Hrhr</td><td></td></tr><tr><td>Grzejnik dla małych zwierząt&nbsp;</td><td>np. Faxitron X-Ray Corp.</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie zwierząt&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Jeśli używasz parownika izofluranu z komorą indukcyjną, potrzebujesz rurki i stożka nosowego.</td></tr><tr><td>Przyrząd ołowiany i stolik z pleksi</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Jeśli promiennik naraża całe ciało zwierzęcia na promieniowanie, należy użyć osłony ołowianej, aby odsłonić tylko płat skóry.</td></tr><tr><td>Taśma medyczna&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marker permanentny/dziurkacz</td><td></td><td></td><td></td>do uszu</tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc., Natick, MA</td><td></td><td>Ze statystykamiToolbox&nbsp;</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments, Vaudreuil-Dorian,</td> system <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>QB<td>DOS</td></tr><tr><td>Multiplekser optyczny</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Model MPM-2000</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Model S200</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła białego</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Model LS-1</td><td></td></tr><tr><td>Intralipid-20%</td><td>Kabi Pharmacia, Nowy Jork, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Norma odbicia</td><td>INO, Quebec City, QB</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dyfuzyjna spektroskopia optyczna do ilościowej oceny ostrej toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem jonizującym przy użyciu modelu mysiego

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Ostra toksyczność skórna spowodowana promieniowaniem jonizującym (IR) jest częstym skutkiem ubocznym kursów terapeutycznych radioterapii wiązką zewnętrzną (RT) i negatywnie wpływa na jakość życia pacjenta i długoterminowe przeżycie. Postępy w zrozumieniu szlaków biologicznych związanych z normalną toksycznością tkankową pozwoliły na opracowanie leków interwencyjnych, jednak obecne badania odpowiedzi są ograniczone ze względu na brak wskaźników ilościowych do oceny nasilenia reakcji skórnych. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na rozproszonej spektroskopii optycznej (DOS), które dostarcza ilościowych biomarkerów optycznych reakcji skóry na promieniowanie. Opisujemy projekt oprzyrządowania systemu DOS, a także algorytm inwersji do ekstrakcji parametrów optycznych. Wreszcie, aby wykazać przydatność kliniczną, przedstawiamy reprezentatywne dane z przedklinicznego mysiego modelu rumienia wywołanego promieniowaniem i porównujemy wyniki z powszechnie stosowaną oceną wizualną. Opisana metoda DOS oferuje obiektywną, wysokoprzepustową ocenę toksyczności skórnej poprzez odpowiedź funkcjonalną, którą można przełożyć na warunki kliniczne.

Technika odbicia DOS stanowi obiektywną alternatywę dla tradycyjnych jakościowych metod oceny toksyczności skóry indukowanej promieniowaniem. Wizualne zmiany w wyglądzie skóry po podaniu toksycznych dawek promieniowania objawiają się jako modyfikacje zarówno amplitudy, jak i kształtu mierzonych widm odbicia. Oba parametry są powiązane ze zmianami funkcjonalnymi w leżącej u podstaw mikrostrukturze komórkowej i fizjologicznym stanie tkanki. W tej sekcji omówiono reprezentatywne wyniki z wcześniej opublikowanej pracy Yohan et al. 20145.
Rysunek 3 (lewo) przedstawia reprezentatywne widma (cienkie niebieskie linie) zmierzone przy odstępie źródła 260 μm w atymicznym modelu mysim rumienia skóry 6 dni po naświetlaniu dawką 40 Gy. W porównaniu do stanu przed naświetlaniem (Rysunek 3, panel prawy), obserwuje się różnice w kształcie widma w zakresie ~ 550-650 nm, co prawdopodobnie wynika ze zwiększenia ilości hemoglobiny utlenowanej. Widoczny jest również niewielki wzrost absolutnego odbicia, który koreluje ze zwiększeniem mocy rozpraszania tkanki. Zaobserwowane widma w 6. dniu po naświetlaniu korelowały z wizualną oceną skóry na poziomie 0,75.
Ocena zmian odbiciowości po napromieniowaniu przy wybranych długościach fal nie wykorzystuje pełnego widma odbiciowości i niesie ze sobą potencjalny problem czułości na szum. Jednak dopasowanie pełnego widma pozwala na przekształcenie całego zestawu danych w intuicyjne biomarkery optyczne (Hb, StO2). Rysunek 3 przedstawia wynikowe dopasowania (ciągła zielona linia) do zmierzonych danych (cienka linią zaszumiona) przy użyciu równań przedstawionych w Sekcji 4. Obserwuje się doskonałą zgodność, co potwierdza, że wybór chromoforów bazowych i kształtu rozpraszania odpowiednio opisuje model skóry myszy.
Dzięki nieinwazyjnemu i samokalibrującemu charakterowi systemu DOS, pomiary można wygodnie przeprowadzać przez wiele dni w różnych warunkach oświetlenia. Rycina 4 przedstawia względne zmiany StO2 skóry w różnych punktach czasowych (6, 9, 12 dni) w grupie myszy napromieniowanych (n=8), natomiast Rycina 5 pokazuje odpowiadające im jakościowe oceny reakcji skóry. Obserwuje się progresywny wzrost StO2, który jest statystycznie istotny w porównaniu z wartościami sprzed napromieniowania we wszystkich 3 dniach (p &lt; 0,05). Trendy te odzwierciedlają wizualnie zaobserwowany wzrost nasilenia uszkodzeń skóry, który osiąga szczyt w 12. dniu (średnia ocena ~ 3), co wykazuje potencjał StO2 jako zamiennika dla wizualnej oceny punktowej (Rycina 5).
Należy zauważyć, że w przypadku grupy kontrolnej nienaświetlonej (n=3) nie zaobserwowano statystycznie istotnych zmian w żadnym z uzyskanych biomarkerów optycznych w ciągu 12 dni pomiarów (dane nie przedstawiono). Zmiany parametrów A i k można również monitorować w czasie (Rysunek 6), a wyniki te wskazują, że właściwości rozpraszania skóry zmieniają się w odpowiedzi na promieniowanie.
<img alt="Układ spektroskopii odbiciowej dyfuzyjnej ze schematem światłowodów i sprzętem do analizy tkanek." src="/files/ftp_upload/53573/53573fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Aparatura DOS. (A) Schemat geometrii pomiaru odbicia dyfuzyjnego. (B) Sonda światłowodowa: Sonda optyczna składa się z liniowej macierzy światłowodów o rdzeniu 200 μm, które są zgrupowane w metalowej igle 18 G i rozmieszczone w odstępach 260 μm. Dwa światłowody źródłowe są sprzężone z dwiema szerokopasmowymi diodami emitującymi światło, natomiast światłowód detekcyjny jest podłączony do spektrometru optycznego. Poprzez sekwencyjne włączanie każdego ze źródeł, spektrometr może rejestrować odbicie dyfuzyjne w odległościach 260 μm i 520 μm od każdego ze światłowodów źródłowych. (C) Kompletny system DOS, obejmujący laptop, podłączoną sondę światłowodową i moduł optyczny: Do sterowania sekwencyjnym zbieraniem widm używany jest zautomatyzowany program akwizycji danych. Elektronika znajduje się w module akwizycyjnym, który łączy się z sondą światłowodową za pomocą złączy SMA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy widm absorpcji przejściowej; analiza wzbudzenia optycznego w różnych warunkach." src="/files/ftp_upload/53573/53573fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przetwarzanie widmowe. Wszystkie skale osi x są podane w nm: (A) Surowe widma względne, linia bazowa to odczyt w zakresie około 900 – 1 000 nm, w przybliżeniu równy sygnałowi tła. (B) Względny odczyt tła. (C) Widma względne po odjęciu tła i linii bazowej. (D) Bezwzględnie skalibrowane widmo po przeskalowaniu przetworzonych widm pokazanych w (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres widm odbiciowych z dopasowaniem modelu i surowymi danymi; analiza danych optycznych, dopasowanie spektralne." src="/files/ftp_upload/53573/53573fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Typowe widma odbicia światła białego skóry myszy nienapromieniowanej (lewo) i napromieniowanej (prawo) 6 dni po napromieniowaniu. Zazwyczaj obserwowano doskonałą zgodność między pomiarem (szumny kolor niebieski) a dopasowaniem (ciągła linia zielona). Między dwiema grupami zauważono dwie kluczowe różnice: 1) ogólny wzrost bezwzględnego odbicia oraz 2) wyraźną zmianę kształtu widma w zakresie 550 - 600 nm. Za zgodą Yohan et al. 20145. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres porównawczy ΔStO2; ΔStO2 w zależności od nr myszy w czasie (dni 6, 9, 12); analiza efektu 40Gy PBS." src="/files/ftp_upload/53573/53573fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Zmiana frakcji natlenienia skóry myszy po napromieniowaniu dawką 40 Gy. Znormalizowana względem wartości bazowej średnia różnica między dwiema grupami (na mysz) jest istotna dla dnia 6 (pole 1), 9 (pole 2) i 12 (pole 3). Za zgodą Yohan et al. 20145. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wskaźniki rumienia skóry w funkcji dni po napromieniowaniu dawką 40 Gy; wykres liniowy; analiza efektu promieniowania." src="/files/ftp_upload/53573/53573fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Średnie jakościowe wskaźniki reakcji skóry (n=8) w funkcji dni po napromieniowaniu skóry myszy dawką 40 Gy. Adaptowano z Yohan et al. 20145. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównawczy wartości danych; ΔA, Δκ względem myszy; badanie efektów promieniowania; leczenie PBS 40Gy." src="/files/ftp_upload/53573/53573fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Względne zmiany A i k skóry myszy po napromieniowaniu dawką 40 Gy w dniach 6 (Pole 1), 9 (Pole 2) i 12 (Pole 3). Stwierdzono, że zmiana A (lewa strona) i k (prawa strona) w dniu 6 (Pole 1, lewa i prawa strona) była istotna (p &lt; 0.026). Za zgodą Yohan et al. 20145. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Prezentujemy metodę rozproszonej spektroskopii optycznej (DOS), która dostarcza ilościowych biomarkerów optycznych reakcji skóry na promieniowanie. Opisujemy projekt oprzyrządowania DOS, algorytmy ekstrakcji parametrów optycznych i procedury postępowania ze zwierzętami wymagane do uzyskania reprezentatywnych danych z przedklinicznego mysiego modelu rumienia wywołanego promieniowaniem.

Dyfuzyjna spektroskopia optyczna do ilościowej oceny ostrej toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem jonizującym przy użyciu modelu mysiego

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Ogólnym celem tej techniki dyfuzyjnej spektroskopii optycznej jest opracowanie ilościowego biomarkera do opisu ostrego rumienia wywołanego promieniowaniem. Metoda ta może być wykorzystywana w radioterapii jako biomarker predykcyjny do identyfikacji pacjentów z ryzykiem wystąpienia ciężkiej toksyczności skóry indukowanej promieniowaniem. Główną zaletą tej techniki jest zatem zapewnienie obiektywnego i systematycznego miernika do ilościowego określania toksyczności skóry po napromieniowaniu.Zaprezentuję technikę dyfuzyjnej spektroskopii optycznej, a Elina, badaczka z laboratorium Loo, będzie zajmować się myszami. Włącz urządzenia elektroniczne i poczekaj na uruchomienie systemu. Następnie wyłącz wszystkie światła fluorescencyjne w pomieszczeniu i ustaw lampy żarowe w pewnej odległości od urządzenia pomiarowego, aby zapewnić odpowiednie oświetlenie miejsca pracy.Następnie skonfiguruj instrument do pomiarów skóry mysiej. Ustaw parametry sygnału w następujący sposób. Ustaw czas zbierania danych na 25 milliseconds, liczbę uśrednień sygnału na 25 oraz szerokość filtra boxcar na jeden.Parametry te zapewniają rozsądny kompromis między czasem akwizycji a stosunkiem sygnału do szumu. Następnie, korzystając z zaprogramowanego specjalnie oprogramowania do akwizycji, automatycznie wykonaj pomiar tła przy wyłączonej diodzie LED. Następnie wykonaj pomiar odbicia rozproszonego dla dwóch różnych odległości między źródłem a detektorem.Wykonaj pierwszy pomiar przy 260 mikronach, a drugi przy 520 mikronach. Całkowity czas akwizycji powinien wynosić około dwóch sekund. Po znieczuleniu myszy przenieś ją do sterylizowanego obszaru badania DOS.Ustaw zwierzę na boku i zabezpiecz jego pysk w stożku nosowym dostarczającym 2%gazu izofluranu w celu utrzymania znieczulenia. Następnie wysterylizuj sondę 70%etanolem, ale nie podejmuj prób sterylizacji skóry. Delikatnie przyłóż wysterylizowaną sondę do skóry na boku.Nie naciskaj zbyt mocno, ponieważ nacisk sondy nie może doprowadzić do rozproszenia naczyń krwionośnych w tym obszarze. Trzymając sondę, pobierz dane o odbiciu z obszaru o boku dwóch centymetrów, który ma zostać poddany napromieniowaniu. Zbierz dane w układzie pięciu punktów, analogicznie do rozmieszczenia oczek na kostce do gry.Zachowaj ten sam wzór i nacisk sondy we wszystkich kolejnych pomiarach. Po wykonaniu pomiarów umieść mysz w klatce rekonwalescencyjnej. Podczas regeneracji myszy powtórz procedurę u kolejnego zwierzęcia.Niniejsza procedura została dostosowana do dostępnego naświetlacza. Należy ją zmodyfikować w razie potrzeby, aby naświetlić niewielki obszar skóry. Po znieczuleniu myszy należy delikatnie ująć skórę na jej boku i przytwierdzić rozciągniętą skórę taśmą, tworząc zakładkę.Następnie umieść mysz na platformie z pleksiglasu i przykryj jej ciało specjalnie dopasowanym ołowianym szablonem. Użyj skrzynki ołowianej, która jest dostępna z dwóch stron i posiada okno umożliwiające naświetlanie skóry. Następnie przeciągnij płat skóry przez okno szablonu i przyklej go taśmą do platformy.Jeśli mysz nie jest unieruchomiona w uchwycie, należy podać jej zastrzyk z anestetykiem. Następnie należy umieścić stół z uchwytem i myszą w irradiatorze. Obliczyć wymaganą dawkę napromieniowania.Na przykład źródło promieniowania rentgenowskiego o szczytowym napięciu 160 kV, umieszczone w odległości 11 cm, odpowiednio naświetliłoby skórę przy natężeniu prądu 6,3 mA przez 2,5 minuty. Następnie podaj obliczoną dawkę. Po podaniu dawki zwierzę należy przenieść do klatki rekonwalescencyjnej.Po wybudzeniu z narkozy, mysz należy przenieść z powrotem do wspólnej klatki. Myszy poddano napromieniowaniu i pomiarom zgodnie z opisem. Przed napromieniowaniem wykonano widmo bazowe z zachowaniem 260 mikronów odstępu od źródła w modelu skóry myszy atypowej.Gruba zielona linia przedstawia dopasowanie matematyczne do cienkiej niebieskiej linii. W porównaniu z pomiarami wykonanymi sześć dni po naświetlaniu dawką 40 gray, zaobserwowano różnice w kształcie widma pomiędzy 550 a 600 nanometrów, co prawdopodobnie wynika ze wzrostu poziomu hemoglobiny utlenowanej. Odnotowano również niewielki wzrost bezwzględnej odbiciowości, co może być skorelowane ze zwiększeniem mocy rozproszenia tkanki.Dopasowane dane dostarczają ilościowych biomarkerów optycznych, które można śledzić w funkcji czasu po napromieniowaniu. Na przykład pomiary wysycenia tkanek tlenem stopniowo wzrastały po naświetlaniu. Dane ilościowe te korelowały z wizualnym stopniem toksyczności skóry, który również sukcesywnie zwiększał się po napromieniowaniu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać dyfuzyjną spektroskopię optyczną do ilościowej oceny toksyczności skóry wywołanej promieniowaniem. Po opanowaniu tej techniki badanie może zostać przeprowadzone w dwie lub trzy minuty, pod warunkiem zachowania prawidłowej procedury. Podczas wykonywania tego zabiegu ważne jest, aby delikatnie dociskać sondę DOS, aby uniknąć rozproszenia naczyń krwionośnych.Technikę tę można wykorzystać w radioterapii jako sposób powiązania parametrów fizjologicznych w celu opisania odpowiedzi prawidłowej tkanki na promieniowanie.

diffuse-optical-spectroscopy-for-quantitative-assessment-acute

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. Ten film opisuje analizę skuteczności przeciwnowotworowej in vivo przy użyciu fotouczulacza zawierającego nanocząstki u myszy z nowotworem, w celu określenia potencjału fototoksycznego fotouczulacza.

Analiza skuteczności przeciwnowotworowej PDT in vivo: technika określania potencjału fototoksycznego fotouczulacza u myszy z nowotworem

Ten film opisuje metodę pomiaru wrażliwości na promieniowanie UV w humanizowanym modelu myszy - modelu myszy, który naśladuje ludzką skórę. Określamy minimalną dawkę rumieniową (MED) promieniowania UV, które może powodować rumień lub obrzęk skóry. Metoda może pomóc w ustaleniu skuteczności leków stosowanych w celu zmniejszenia wrażliwości na promieniowanie UV.

Test minimalnej dawki rumieniowej: metoda pomiaru wrażliwości na promieniowanie UV w modelach mysich

Melanina naskórkowa jest indukowana przez miejscowe stosowanie forskoliny w mysim modelu człowieka o jasnej karnacji, wrażliwego na promieniowanie UV.    Farmakologiczna manipulacja poziomami cAMP w skórze i ciemnienie naskórka silnie chronią przed stanem zapalnym o podłożu UV (oparzenia słoneczne), mierzonym za pomocą testu minimalnej dawki rumieniowej (MED).

Farmakologiczna indukcja melaniny naskórka i ochrona przed oparzeniami słonecznymi w humanizowanym modelu myszy

Przedstawione okno mysiej komory grzbietowego fałdu skórnego wizualizuje strefę ostrego, uporczywego niedokrwienia płata mięśniowo-skórnego. Przyżyciowa mikroskopia epifluorescencyjna pozwala na bezpośrednią i powtarzalną ocenę mikrokrążenia i ilościowe określenie hemodynamiki. Wyniki morfologiczne i hemodynamiczne można dodatkowo skorelować z analizami histologicznymi i molekularnymi.

Niedokrwienne uszkodzenie tkanki w grzbietowej komorze fałdu skórnego myszy: model płata skóry do badania ostrego uporczywego niedokrwienia

Przedstawiono protokół oceny zmian w poziomach uszkodzeń DNA i zdolności do naprawy DNA, które mogą być wywołane przez przewlekłe napromienianie in vivo niskimi dawkami limfocytów śledziony myszy, poprzez pomiar fosforylowanego histonu H2AX, markera pęknięć dwuniciowych DNA, za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma

Opisujemy metodę wykorzystującą ukierunkowane promieniowanie obwodowe do wywołania u myszy zachowania przypominającego zmęczenie. Wybrana, nieśmiertelna dawka napromieniania prowadzi do tygodniowego ograniczenia dobrowolnej aktywności związanej z bieganiem po kółkach.

Mysi model zmęczenia wywołanego promieniowaniem obwodowym

Protokół opisuje badanie ogólnoustrojowych i miejscowych skutków skórnych ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe B u myszy.

Badanie przewlekłej ekspozycji myszy na promieniowanie ultrafioletowe B

Opisujemy prosty test immunoenzymatyczny służący do pomiaru produkcji cytokin prozapalnych, takich jak IL-1 beta, u pacjentów prezentujących fenotypy autozapalne. Poprzez aktywację komórek w hodowlach krwi pełnej za pomocą wzorców molekularnych związanych z patogenami, a konkretnie lipopolisacharydu, wydzielanie cytokin można w wygodny sposób ocenić w nadsączach krwi pełnej.

Dokładny i prosty pomiar cytokiny prozapalnej IL-1&beta; z wykorzystaniem testu stymulacji krwi pełnej

Wykazaliśmy, że złośliwe zmiany barwnikowe o zwiększonej aktywności metabolicznej generują mierzalne ilości ciepła, a pomiar przejściowej odpowiedzi termicznej skóry na pobudzenie chłodzące pozwala na ilościową identyfikację czerniaka oraz innych nowotworów skóry (w przeciwieństwie do zniewów nieproliferacyjnych) we wczesnym stadium choroby.

Ilościowa wizualizacja i detekcja raka skóry z wykorzystaniem dynamicznej obrazowania termowizyjnego

Podczas rozwoju ssaków, rany skóry na wczesnym etapie ciąży goją się bez blizny. Tutaj szczegółowo opisujemy wiarygodny i powtarzalny model gojenia się ran bez blizn płodu w grzbietu skóry zarodków myszy E16.5 (bez blizn) i E18.5 (bliznowaciejących).

Model skóry płodu myszy z gojeniem ran bez blizn

Poznaj dyfuzyjną spektroskopię optyczną do ilościowej oceny ostrej toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem jonizującym w modelu mysim. Ta metoda dostarcza obiektywnych biomarkerów.

Dyfuzyjna spektroskopia optyczna do ilościowej oceny ostrej toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem jonizującym przy użyciu modelu mysiego (Wideo) | JoVE Journal

Dyfuzyjna spektroskopia optyczna do ilościowej oceny ostrej toksyczności skórnej wywołanej promieniowaniem jonizującym przy użyciu modelu mysiego

Przeglądaj więcej filmów