Name: Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj metodę oceny utleniania komórkowego w określonych przedziałach subkomórkowych przy użyciu wrażliwego na redoks białka GFP. Technika umożliwia nieinwazyjną ilościową analizę stanu redoks w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Konstrukt i rekombinowany adenowirus do ekspresji specyficznego dla cytozolu roGFP w komórkach zostały wygenerowane odpowiednio w laboratorium Paula T. Schumackera, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University i ViraQuest Inc. Badanie to było wspierane przez grant Centrum Badań nad Reakcją Gospodarza na Terapię Nowotworów P20GM109005 za pośrednictwem NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor's Awards AWD00053484. Główny ośrodek cytometrii przepływowej był częściowo wspierany przez Centrum Patogenezy Drobnoustrojów i Odpowiedzi Zapalnych Gospodarza P20GM103625 grantu za pośrednictwem COBRE NIGMS. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH. ATA było wspierane przez stypendium 2214-A Tureckiej Rady Badań Naukowych i Technologicznych (TUBITAK).

UWAGA: Niniejszy protokół został zoptymalizowany dla komórek MDA-MB-231 przy konfluencji 70%–80%. W przypadku innych linii komórkowych należy ponownie zoptymalizować liczbę komórek oraz wielokrotność infekcji (MOI).
1. Przygotowanie komórek (dzień 1)
<ol>
	<li>Hodować linię komórkową MDA-MB-231 w kolbach o powierzchni 75 cm2 w 10 mL zmodyfikowanej pożywki Eagle'a Dulbecco (DMEM) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze 37 °C w uwilgotnionej atmosferze z 5% CO2. 
	UWAGA: DMEM uzupełniony o 10% FBS, temperatura 37 °C oraz uwilgotniona atmosfera z 5% CO2 są stosowane podczas wszystkich inkubacji związanych z adhezją i traktowaniem w całym protokole.</li>
	<li>Przygotować komórki MDA-MB-231 do eksperymentu.
	<ol>
		<li>Odssać pożywkę z kolby, odkleić komórki za pomocą 2 mL 0,25% roztworu trypsyny-EDTA przez 2 min, a następnie zneutralizować aktywność trypsyny za pomocą 6 mL pożywki kompletnej (DMEM z 10% FBS). Wirować komórki przy 150 x g przez 5 min. Odssać supernatant i zawiesić komórki w 5 mL pożywki kompletnej.</li>
		<li>Zmieszać równą objętość zawiesiny komórkowej i 0,4% błękitu trypanu. Pobrać 10 µL tej mieszaniny i policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. 
		UWAGA: Do liczenia komórek można również użyć licznika Coulter lub hemocytometru.</li>
		<li>Przesiać komórki do płytki 6-dołkowej do analiz cytometrycznych, wysiewając 150 0 komórek w 1 mL pożywki na dołek. Odczekać 16 h do czasu adhezji komórek.</li>
		<li>Przesiać komórki do szkiełka przedmiotowego z 4-komorową komorą do obrazowania fluorescencyjnego, wysiewając 25 00 komórek w 0,5 mL pożywki na dołek. Odczekać 16 h do czasu adhezji komórek. 
		UWAGA: Oprócz dołków traktowanych wysiać dołki kontrolne. Jeden z dołków kontrolnych wykorzystać do określenia liczby komórek (opcjonalnie: jeśli okres adhezji komórek jest krótszy niż czas podwojenia, można przyjąć, że liczba komórek jest taka sama jak gęstość wysiewu), a drugi jako kontrolę niezakażoną (0 MOI).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transdukcja adenowirusowa roGFP (dzień 2 i 3)
OSTRZEŻENIE: Adenowirusy mogą wywoływać choroby. Podczas transdukcji komórek należy używać końcówek z filtrem oraz dekontaminować końcówki, pipety Pasteura i probówki do mikrowirówki roztworem 10% wybielacza.
UWAGA: Niniejszy protokół został zademonstrowany z użyciem roGFP specyficznego dla cytozolu, jednak ten sam protokół można zastosować do innych przedziałów komórkowych (np. mitochondriów lub przestrzeni międzybłoniowej mitochondriów).
<ol>
	<li>Wygeneruj krzywą zależności odpowiedzi od dawki dla MOI, aby uzyskać najwyższą wydajność transdukcji, obliczając objętość adenowirusa (ml) wymaganą dla każdej wartości MOI dla linii komórkowej MDA-MB-231 (Tabela 1): 
	<img alt="Równanie miareczkowania wirusa: \(x \, \text{ml} = \text{MOI} \times \text{liczba komórek} \times \frac{1 \, \text{ml}}{\text{PFU}}\)." src="/files/ftp_upload/61229/61229equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	UWAGA: Funkcjonalny miano każdej partii zapasu adenowirusa, wyrażone w jednostkach tworzących placki (PFU) na ml, jest dostarczane przez producenta. Optymalna wielokrotność infekcji (MOI) dla transdukcji różni się w zależności od rodzaju komórek. Dla większości komórek ssaków optymalny zakres MOI wynosi od 10 do 30. W zależności od odpowiedzi komórkowej wartości MOI powinny zostać przeliczone (np. zakres MOI należy zmniejszyć, jeśli komórki wykazują odpowiedź cytotoksyczną, lub zwiększyć, jeśli komórki wykazują niską wydajność transdukcji).</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie 1:100 z roztworu 6 x 1010 roztwór adenowirusowego roGFP o stężeniu PFU/ml z dodatkiem pożywki do hodowli komórkowych (DMEM z 10% FBS) w celu zapewnienia precyzyjnego pipetowania.</li>
	<li>Odmierz pipetą i dodaj 0,0125 ml (12.5 µL), 0,025 ml (25 µL), 0,05 ml (50 µL) rozcieńczenia adenowirusowego roGFP do każdej studzienki płytki 6-dołkowej w celu transdukcji 150 0 komórek z odpowiednio 50, 10 i 20 MOI do analizy cytometrycznej (Tabela 1).</li>
	<li>Odmiar pipetą i dodać 0,042 ml (4.2 µL) rozcieńczenia adenowirusowego roGFP w studzienkach szkiełka 4-komorowego w celu transdukcji 25 00 komórek przy MOI 10 do obrazowania fluorescencyjnego (Tabela 1). 
	UWAGA: W dołkach należy zastosować minimalną ilość medium, aby zapewnić najwyższy stopień interakcji między adenowirusowym konstruktem roGFP a komórkami. W zależności od linii komórkowej może być konieczne zmniejszenie zawartości surowicy w medium hodowlanym, ponieważ wysokie stężenie surowicy może negatywnie wpływać na wydajność transdukcji w niektórych typach komórek.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 16–24 h w warunkach utrzymania hodowli. Następnego dnia (dzień 3.) wymienić pożywkę na pożywkę do hodowli komórkowej (DMEM z 10% FBS), aby umożliwić regenerację komórek przez kolejne 24 h. Przejrzeć komórki pod mikroskopem w celu oceny ich morfologii; komórki mogą wykazuje ekspresję roGFP nawet w przypadku wystąpienia zmian morfologicznych. 
	UWAGA: W 3. dniu komórki powinny zacząć wykazywać ekspresję roGFP; w związku z tym wydajność transdukcji można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (filtry z ex. 48/em. 525). Aby uzyskać spójne wyniki analizy, należy zwracać uwagę na zmiany morfologiczne obserwowane pod mikroskopem fazokontrastowym i dokumentować je, a także oceniać morfologię podczas weryfikacji wydajności transdukcji.</li>
	<li>Stwórz krzywą odpowiedź-dawka, wykorzystując próbki o MOI 50, 10 i 20 przygotowane w kroku 2.3 oraz wyniki ich wydajności transdukcji uzyskane z analizy cytometrycznej (kroki 3.1 i 4.1). Oceń optymalną wydajność transdukcji wraz z dokumentacją zmian morfologicznych (krok 2.5) oraz krzywą odpowiedź-dawka dla MOI. 
	UWAGA: Chociaż przy MOI wynoszącym 10 i 20 roGFP wykazuje ponad 98% populacji komórek (patrz: reprezentatywne wyniki), w grupie z MOI 20 zaobserwowano istotne zmiany w morfologii komórek MDA-MB-231. W związku z tym ustalono, że najskuteczniejszą wartością MOI dla komórek MDA-MB-231 jest 100 MOI.</li>
	<li>Po wybraniu optymalnej wielokrotności infekcji (w tym przypadku MOI wynoszącej 10) dla linii komórkowej MDA-MB-231, należy przeprowadzić eksperyment z materiałami testowymi (10 µM H2O2 oraz jego nośnik (0,1% wody dejonizowanej).
	<ol>
		<li>Przygotować i zasiać komórki zgodnie z sekcją 1. Korzystając z objętości transdukcji adenowirusowej dla 10 MOI obliczonej w kroku 2.1, powtórzyć kroki 2.2–2.4 w celu przeprowadzenia transdukcji komórek adenowirusami przy 100 MOI. Następnie inkubować płytkę i szkiełka z komorą zgodnie z krokiem 2.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oznaczenie równowagi CyS/CySS
<ol>
	<li>Cytometria przepływowa (dzień 4)
	<ol>
		<li>W 4. dniu inkubować komórki z kroku 2.7.1 z 10 µM H2O2 przez 1 h. 
		UWAGA: W niniejszym protokole jako substancja testowa zastosowano 10 µM H2O2, a jako kontrolę nośnika 0,1% wodę dejonizowaną. Jako kontrole pozytywne można tutaj zastosować inne utleniacze.</li>
		<li>Odessać pożywkę z płytki 6-dołkowej, zastąpić ją 750 µL 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i odczekać 2 min do odklejenia się komórek. Inaktywować trypsynę, dodając 2 mL pożywki kompletnej (DMEM z 10% FBS), a następnie przenieść zawiesinę do stożkowych probówek 15 mL.</li>
		<li>Wirować probówki przy 150 x g przez 5 min w temperaturze 4ºC. Odrzucić nadsącz i resuspendować komórki w 50 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).</li>
		<li>Powtórzyć krok 3.1.3</li>
		<li>Przefiltrować zawiesiny komórkowe do probówek kompatybilnych z cytometrem przepływowym, używając sita o oczkach 40 µm. Przechowywać probówki w lodzie, w ciemności i postępować zgodnie z krokiem 4.1 w celu analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie mikroskopowe (dzień 4)
	<ol>
		<li>W 4. dniu poddać komórki działaniu 10 µM H2O2, wykonać zdjęcia natychmiast (punkt czasowy 0) oraz 1 h po traktowaniu, a następnie postępować zgodnie z krokiem 4.2 w celu analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Ilościowe oznaczanie metodą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu do akwizycji próbek skonfiguruj metodę cytometrii przepływowej dla 3 różnych analiz (patrz Tabela Materiałów): rozproszenie przednie (FCS) na osi x i rozproszenie boczne (SSC) na osi y w celu oceny wielkości i złożoności komórek (SSC może służyć do wstępnej identyfikacji komórek martwych i żywych); filtr pasmowy ex. 48 nm/em. 525 nm (izotiocyjanian fluoresceiny [FITC]) na osi x i SSC na osi y do oceny CyS-roGFP; filtr pasmowy ex. 405 nm/em. 525 nm (Brilliant Violet 510 [BV510]) na osi x i SSC na osi y do oceny CySS-roGFP.</li>
		<li>Wykonaj pomiar kontroli 0 MOI i zwizualizuj komórki w oprogramowaniu do akwizycji próbek. Powtórz ten krok dla pozostałych próbek (grupy 50, 10, 200 MOI, a następnie komórki traktowane 10 µM H2O2 oraz komórki traktowane nośnikiem). Zapisz pliki do analizy danych.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do analizy danych (patrz Tabela Materiałów) i otwórz plik próbki 0 MOI. Wyznacz populację komórek budzącą zainteresowanie (Brama 1). Przy użyciu niezainfekowanych komórek kontrolnych (0 MOI) ustaw następujące bramy, aby zminimalizować fluorescencję tła dla filtrów pasmowych ex. 48 nm/em. 525 nm (Brama 2) oraz ex. 405 nm/em. 525 nm (Brama 3).</li>
		<li>Otwórz pliki próbek 50, 10 i 200 MOI w oprogramowaniu do analizy danych, aby ocenić krzywą dawka-odpowiedź. Przeanalizuj średnie intensywności fluorescencji w Bramach 2 i 3 dla każdej próbki. Powtórz ten krok dla próbek testowych (komórek traktowanych 10 µM H2O2 oraz komórek traktowanych nośnikiem).</li>
		<li>Oblicz stosunek średniej intensywności fluorescencji formy utlenionej do zredukowanej roGFP, korzystając z poniższego równania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Równanie stosunku fluorescencji, utlenione/zredukowane formy roGFP, długości fal emisji/podbudzenia." src="/files/ftp_upload/61229/61229equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">
<ol start="2">
	<li>Ocena obrazów
	<ol>
		<li>Należy użyć mikroskopu wyposażonego w filtry fluorescencyjne dla CyS-roGFP i CySS-roGFP (odpowiednio filtry ex. 48 nm/em. 525 nm oraz ex. 405 nm/em. 525 nm).</li>
		<li>W każdym dołku szkiełka komorowego należy wybrać 4 losowe obszary do wykonania zdjęć, używając obiektywu 4x w celu wizualizacji większych obszarów. 
		UWAGA: Do wyświetlania obrazów można również użyć obiektywu 20x.</li>
		<li>Otwórz obraz w oprogramowaniu ImageJ11. Zastosuj polecenia Analyze | Measure dla każdego obrazu i użyj równania z punktu 4.1.5, aby ilościowo ocenić dane. 
		UWAGA: Ilościowa ocena obrazów jest ratiometryczna, dlatego protokół nie obejmuje odejmowania tła. Jednakże, aby móc porównywać obrazy, jasność, kontrast i nasycenie muszą być takie same dla każdego zdjęcia. Istotność statystyczną oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) oraz testu post hoc Tukeya.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+A+concept+in+redox+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li>
<li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signalling%22%5BJournal%5D)">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li>
<li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress%3A+Harms+and+Benefits+for+Human+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763(2017).</li>
<li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol%2Fdisulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li>
<li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li>
<li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li>
<li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902(2014).</li>
<li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li>
<li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li>
<li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li>
<li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li>
<li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging%3A+One+step+closer+to+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li>
<li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li>
<li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li>
<li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Równowaga tiolowo-dwusiarczkowa w organizmie odzwierciedla stan redoks komórek. Żywe organizmy zawierają glutation, cysteinę, tiole białkowe i tiole o niskiej masie cząsteczkowej, z których wszystkie są pod wpływem poziomu utlenienia i odzwierciedlają status redoks komórek4. Zmodyfikowane roGFP umożliwiają niezakłócające oznaczanie ilościowe równowagi tiol/dwusiarczek za pomocą ich reszt CyS7. Właściwość ratiometryczna roGFP zapewnia wiarygodne pomiary redoks dla komórek ss...

Stres oksydacyjny został zdefiniowany w 1985 roku przez Helmuta Siesa jako "zaburzenie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej na korzyść tego pierwszego"1, a mnóstwo badań zostało przeprowadzonych w celu uzyskania specyficznego dla choroby, odżywiania i starzenia się statusu redoks organizmów1,2,3. Od tego czasu zrozumienie stresu oksydacyjnego stało się szersze. Testowanie hipotez stosowania przeciwutleniaczy przeciwko chorobom i/lub starzeniu się wykazało, że stres oksydacyjny nie tylko powoduje szkody, ale także pełni inne role w komórkach. Ponadto naukowcy wykazali, że wolne rodniki odgrywają ważną rolę w transdukcji sygnału2. Wszystkie te badania wzmacniają znaczenie określania zmian w stosunku redukcja-utlenianie (redoks) makrocząsteczek. Aktywność enzymów, przeciwutleniacze i/lub utleniacze oraz produkty utleniania można oceniać różnymi metodami. Wśród nich metody określające utlenianie tiolu są prawdopodobnie najczęściej stosowane, ponieważ informują o równowadze między przeciwutleniaczami i prooksydantami w komórkach, a także w organizmach4. W szczególności proporcje między glutationem (GSH)/dwusiarczkiem glutationu (GSSG) i/lub cysteiną (CyS)/cystyną (CySS) są wykorzystywane jako biomarkery do monitorowania statusu redoks organizmów2.
Metody używane do sprawdzania równowagi między prooksydantami a przeciwutleniaczami opierają się głównie na poziomach zredukowanych/utlenionych białek lub małych cząsteczek w komórkach. Western blot i spektrometria mas są używane do szerokiej oceny proporcji zredukowanych/utlenionych makrocząsteczek (białka, lipidów itp.), a stosunki GSH/GSSG można ocenić za pomocą spektrofotometrii5. Wspólną cechą tych metod jest fizyczne zaburzenie systemu przez lizę komórek i/lub homogenizację tkanek. Analizy te stają się również wyzwaniem, gdy konieczne jest zmierzenie stopnia utlenienia różnych przedziałów komórkowych. Wszystkie te perturbacje powodują artefakty w środowisku testowym.
Białka fluorescencyjne wrażliwe na redoks otworzyły korzystną erę do oceny równowagi redoks bez powodowania zakłóceń w komórkach6. Mogą celować w różne przedziały wewnątrzkomórkowe, umożliwiając ilościowe określenie działań specyficznych dla przedziałów (np. oznaczanie stanu redoks mitochondriów i cytozolu) w celu zbadania przesłuchów między organellami komórkowymi. Żółte białka fluorescencyjne (YFP), zielone białka fluorescencyjne (GFP) i białka HyPeR zostały ocenione przez Meyera i współpracowników6. Wśród tych białek GFP wrażliwy na redoks (roGFP) jest wyjątkowy ze względu na różne fluorescencyjne odczyty jego reszt CyS (np. 488 nm/em. 525 nm) i CySS (np. 405 nm/525 nm), co pozwala na analizę ratiometryczną, w przeciwieństwie do innych białek wrażliwych na redoks, takich jak YFP7,8. Dane wyjściowe ratiometryczne są cenne, ponieważ równoważą różnice między poziomami ekspresji, czułością wykrywania i fotowybielaniem8. Subkomórkowe przedziały komórek (cytozol, mitochondria, jądro) lub różne organizmy (bakterie, a także komórki ssaków) mogą być celem poprzez modyfikację roGFP7,9,10.
roGFP testy są przeprowadzane przy użyciu technik obrazowania fluorescencyjnego, szczególnie do eksperymentów z wizualizacją w czasie rzeczywistym. Analizy cytometryczne roGFP są również możliwe w przypadku eksperymentów z wcześniej określonymi punktami czasowymi. Niniejszy artykuł opisuje zarówno zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej, jak i cytometrii przepływowej do przeprowadzenia ratiometrycznej oceny statusu redoks w komórkach ssaków z nadekspresją roGFP (ukierunkowaną na cytozol) poprzez transdukcję adenowirusową.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco firmy Life Sciences</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko 4-dołkowe</td> do hodowli komórkowych <td>Thermo Scientific</td><td>154526</td><td>Materiał do wysiewu komórek do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Probówki 5 ml z nasadką sitka do komórek</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Jednokomórkowa rurka zawiesinowa do analizy cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>Materiał do wysiewu komórek do analizy cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>MidSci</td><td>C15B</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>75 cm2 wentylowane kolby do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>4306414</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Adenowirusowy specyficzny dla cytozolu roGFP</td><td>ViraQuest</td><td>VQAd roGFP roGFP</td><td>konstrukcja uprzejmie dostarczona przez Dr. Schumaker</td></tr><tr><td>Klasa II, Szafka</td> <td>na kaptur bezpieczeństwa typu A2Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td>Hodowla komórek</td></tr><tr><td>Countess Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>Zliczanie komórek</td></tr><tr><td>Szkiełka komorowe licznika komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Liczenie komórek</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco firmy Life Sciences</td><td>11995-065</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Hodowla</td></tr> <tr><td>komórkowaKońcówki do pipet z filtrem, sterylne, 20 i mikro; l</td><td>Fisherbrand</td><td>02-717-161</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Filtrowane końcówki do pipet, sterylne, 1000 i mikro; </td><td>l Fisherbrand</td><td>02-717-166</td> Cytometr przepływowy <td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>LSRFortessa</td><td>Instrument wyposażony w filtry pasmowoprzepustowe FITC i BV510 do analiz cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zaawansowana grupa mikroskopii (AMG)</td> <td>Evos FL</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>Kontrola</td></tr> <tr>pozytywna<td>Light Cube, Custom</td><td>Life Sciences</td><td>CUB0037</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne komórek wykazujących ekspresję roGFP (ex 405 nm)</td></tr><tr><td>Lekka kostka, GFP</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEP4651</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne komórek wykazujących ekspresję roGFP (ex 488 nm)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Amerykańska kolekcja kultur tkankowych</td><td>HTB-26</td><td>Linia komórkowa ludzkiego nabłonkowego raka piersi</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 2 ml</td><td>Grenier Bio-One</td><td>623201</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco firmy Life Sciences</td><td>10010-023</td><td>Kontrola pipet do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>Hood Mate Model 360</td> Pipeta serologiczna <td>do hodowli komórkowych</td></tr>, <tr><td>1 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11B</td> Pipeta serologiczna <td>do hodowli komórkowych</td></tr>, <tr><td>5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td>Pipeta serologiczna do hodowli komórkowych</td></tr>, <tr><td>10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td>Inkubator do hodowli tkankowych do hodowli</td></tr><tr><td>komórkowych</td><td>Termo Scientific</td><td>HERACell 150i</td><td>Inkubator CO2 do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Trypan niebieski barwnik 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Liczenie komórek</td></tr></tbody></table>

ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Pomiar wewnątrzkomórkowego bilansu oksydacji/redukcji daje wgląd w fizjologiczny i/lub patofizjologiczny stan redoks organizmu. Tiole są szczególnie ważne dla oświetlenia statusu redoks komórek poprzez ich zredukowane proporcje ditiolu i utlenionego dwusiarczku. Zmodyfikowane białka fluorescencyjne zawierające cysteinę otwierają nową erę dla bioczujników czułych na redoks. Jedno z nich, białko zielonej fluorescencji wrażliwe na redoks (roGFP), może być łatwo wprowadzone do komórek z transdukcją adenowirusową, umożliwiając ocenę statusu redoks przedziałów subkomórkowych bez zakłócania procesów komórkowych. Zredukowane cysteiny i utlenione cystyny roGFP mają maksima wzbudzenia odpowiednio przy 488 nm i 405 nm przy emisji przy 525 nm. Ocena proporcji tych zredukowanych i utlenionych form pozwala na wygodne obliczenie równowagi redoks w komórce. W artykule dotyczącym tej metody unieśmiertelnione ludzkie potrójnie ujemne komórki raka piersi (MDA-MB-231) wykorzystano do oceny statusu redoks w żywej komórce. Kroki protokołu obejmują transdukcję linii komórkowej MDA-MB-231 z adenowirusem w celu ekspresji cytozolowego roGFP, leczenieH2O2oraz ocenę stosunku cysteiny i cystyny zarówno za pomocą cytometrii przepływowej, jak i mikroskopii fluorescencyjnej.

Stan redoks CyS/CySS można łatwo ocenić za pomocą transdukowanych białek roGFP. Sonda fluorescencyjna pozwala na ilościowe określenie stosunku form zredukowanej do utlenionej (odpowiednio długości fal wzbudzenia 48 nm i 405 nm). Dane fluorescencyjne można uzyskać zarówno za pomocą cytometrii przepływowej, jak i mikroskopii.
Dużą liczbę komórek można w sposób powtarzalny i wygodny pozyskać za pomocą cytometrii przepływowej. Analiza składa się z 3 głównych etapów: 1) wybranie interesującej popul...

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Obecne oceny protokołu w tekstyliach, zmiany stanu redoks w sposób specyficzny dla przedziału wewnątrzkomórkowego. Nasz protokół umożliwia lepsze zrozumienie i monitorowanie wszystkich fizjologicznych lub patofizjologicznych mechanizmów stresu oksydacyjnego. Technika ta umożliwia niezakłócającą kwantyfikację stosunku kafelkowych siarczków oka w nienaruszonych komórkach przy użyciu wskaźnika metrycznego w celu zrównoważenia różnic między poziomami ekspresji sygnału, wybielaniem zdjęć i czułością wykrywania.Protokół ten można zastosować do różnych organizmów, w tym bakterii w roślinach. W pierwszym dniu eksperymentu należy traktować komórki z linii komórkowej zlewającego się raka piersi przez dwie minuty, z dwoma mililitrami 0,2,5% tripów w EDTA. Kiedy komórki zaczną się odłączać, zatrzymaj reakcję sześcioma mililitrami kompletnej pożywki i osadź komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżej, kompletnej pożywki, policzyć komórki i rozcieńczyć je do 1,5 razy 10 do piątych komórek na jeden mililitr kompletnego podłoża. Następnie wysiewaj 1,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr komórek na studzienkę na płytce 6-dołkowej i inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez noc. Lub dodaj brak transdukcji GFP rzędu wirusa.Następnego ranka dodaj 12,5, 25 i 50 mikrolitrów od jednego do 100 rozcieńczonego sześć razy 10 do 10 jednostek tworzących płytkę nazębną na mililitr dodaj, bez erozji wirusowej, roztworu GFP, w pełnym podłożu. Dodaj to do odpowiednich studzienek lub płytki 6-dołkowej, aby przeprowadzić transdukcję komórek z odpowiednio 50, 100 i 200 wielokrotnościami infekcji. Gdy wszystkie studzienki próbki zostaną przetransdukowane wirusem, należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowej na 16 do 24 godzin.Następnego dnia zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i zastąp supernatant pożywką, bez wirusa, aby umożliwić komórkom regenerację przez dodatkowe 24 godziny. Aby określić optymalną wydajność transdukcji, należy ocenić intensywność fluorescencji i morfologię komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Pamiętaj, aby wykonać wszystkie procedury, które mogą spowodować infekcję aerozolami lub rozpryskami, w komorze bezpieczeństwa biologicznego z certyfikatem bezpieczeństwa biologicznego drugiego poziomu.Aby ocenić status redoks komórek, następnego ranka inkubuj komórki i odpowiednie studzienki 6-dołkowej płytki z 10 mikromolowymi nadtlenkami wodoru przez jedną godzinę, a następnie odłącz komórki za pomocą 750 mikrolitrów 0,2 5% kroplówek EDTA na studzienkę, jak pokazano. Zatrzymaj reakcję za pomocą dwóch mililitrów kompletnego podłoża na studzienkę i wyciągnij supernatanty dla każdego stanu w indywidualnych 15-mililitrowych stożkowych probówkach. Osadzaj komórki przez wirowanie i przemyj granulki w 500 mikrolitrach PBS na studzienkę przez dwukrotne odwirowanie.Po drugim płukaniu przefiltrować zawiesiny komórek przez 40-metrowe siatki do probówek kompatybilnych z cytometrią przepływową na lodzie, chronionych przed światłem. W oprogramowaniu cytometru przepływowego uruchom zerową wielokrotność próbki kontrolnej infekcji. Następnie przeanalizuj nadtlenek wodoru i nieleczone komórki.Umożliwi to obliczenie średniego stosunku intensywności fluorescencji między utlenionymi a zredukowanymi formami GFP w rzędzie, przy użyciu wzoru wskazanego we wskazanym wzorze. Pokazano strategię bramkowania w celu wyboru dużej liczby komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa może być również wykorzystana do wyznaczenia krzywej odpowiedzi na dawkę dla analizy GFP w wierszu i najbardziej efektywnej wielokrotności danych wejściowych infekcji.Zgodnie z wielokrotnością infekcji, krzywą dawka-odpowiedź w tej reprezentatywnej analizie, wielokrotność infekcji 200 dawała najwyższą ekspresję GFP na drodze, ale morfologia komórek została zmieniona, co sugeruje cytotoksyczność. W związku z tym za optymalną wydajność transdukcji uznano wielokrotność infekcji wynoszącą 100. W tej analizie stanu redoks uzyskano utlenione i zredukowane średnie intensywności fluorescencji GFP z analizy cytometrii przepływowej dla nośnika i czterech 10 mikromolowych kontroli dodatniej nadtlenku wodoru.Nałożone histogramy reprezentują przesunięcia liczby komórek w 10 mikromolowych grupach nadtlenku wodoru i nośnika lub zredukowanej i utlenionej erozji GFP. Obliczenie stosunku między GFP utlenionym a zredukowanym rzędem dla tej analizy wykazało, że 10-mikromolowy nadtlenek wodoru spowodował trzykrotny wzrost utlenienia GFP rzędu w porównaniu z obróbką podłożem. Dokładna liczba komórek jest ważna dla obliczeń MRI i odtwarzalności.Aby uzyskać powtarzalne wyniki, badacze powinni dokładnie wymieszać roztwory przeciwwirusowe, aby uzyskać jednorodne zawiesiny. Protokół ten pozwala naukowcom badać szybkie zmiany redoks jako integralną część szerokiego zakresu normalnych procesów komórkowych i postępu choroby w czasie rzeczywistym.

assessment-cellular-oxidation-using-subcellular-compartment-specific

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje technikę wizualizacji stresu oksydacyjnego w hodowanych organoidach. Praca ta pomaga w zrozumieniu poziomu stresu oksydacyjnego spowodowanego akumulacją ROS w różnych typach komórek obecnych w organoidzie po leczeniu różnymi modulatorami ROS.

Test obrazowania za pomocą sondy fluorescencyjnej: technika wizualizacji stresu oksydacyjnego w reaktywnych formach tlenu Hodowane komórki organoidów jelitowych poddane działaniu induktora

Opisujemy użycie dwóch ratiometrycznych, genetycznie kodowanych biosensorów, które są oparte na GFP, do monitorowania mitochondrialnego stanu redoks i poziomów ATP w rozdzielczości subkomórkowej w żywych komórkach drożdży.

Biosensory ratiometryczne, które mierzą mitochondrialny stan redoks i ATP w żywych komórkach drożdży

Konfokalna mikroskopia skaningowa jest stosowana do obrazowania pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych w perfundowanych mięśniach serca lub szkieletowych u żywych zwierząt. Monitorowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych procesów mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego, umożliwia ocenę funkcji mitochondriów w fizjologicznie istotnym kontekście i podczas patologicznych perturbacji.

Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Tutaj przedstawiamy protokół pomiaru stresu oksydacyjnego u żywych zarodków danio pręgowanego. Procedura ta umożliwia wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) zarówno w całych tkankach zarodka, jak i w populacjach pojedynczych komórek. W ramach tego protokołu zostaną przeprowadzone zarówno analizy jakościowe, jak i ilościowe.

Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

Ten artykuł przedstawia proces pracy mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, jak również potencjału i morfologii błony mitochondrialnej - wspólnie określanych jako morfofunkcja mitochondriów - w żywych komórkach przylegających przy użyciu przenikających komórkę fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny dioctanu, ester acetylowy (CM-H2DCFDA) i ester metylowy tetrametylodaminy (TMRM).

Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H2O2) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H2O2 podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Obecny protokół opisuje metodę wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w jelitowych organoidach mysich za pomocą obrazowania jakościowego i cytometrii ilościowej. Prace te mogą być potencjalnie rozszerzone na inne sondy fluorescencyjne w celu zbadania wpływu wybranych związków na ROS.

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Poznaj metodę oceny utleniania komórkowego w określonych przedziałach subkomórkowych przy użyciu wrażliwego na redoks białka GFP. Technika umożliwia nieinwazyjną ilościową analizę stanu redoks w żywych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Przeglądaj więcej filmów