Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Obecne oceny protokołu w tekstyliach, zmiany stanu redoks w sposób specyficzny dla przedziału wewnątrzkomórkowego. Nasz protokół umożliwia lepsze zrozumienie i monitorowanie wszystkich fizjologicznych lub patofizjologicznych mechanizmów stresu oksydacyjnego. Technika ta umożliwia niezakłócającą kwantyfikację stosunku kafelkowych siarczków oka w nienaruszonych komórkach przy użyciu wskaźnika metrycznego w celu zrównoważenia różnic między poziomami ekspresji sygnału, wybielaniem zdjęć i czułością wykrywania.

Protokół ten można zastosować do różnych organizmów, w tym bakterii w roślinach. W pierwszym dniu eksperymentu należy traktować komórki z linii komórkowej zlewającego się raka piersi przez dwie minuty, z dwoma mililitrami 0,2,5% tripów w EDTA. Kiedy komórki zaczną się odłączać, zatrzymaj reakcję sześcioma mililitrami kompletnej pożywki i osadź komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżej, kompletnej pożywki, policzyć komórki i rozcieńczyć je do 1,5 razy 10 do piątych komórek na jeden mililitr kompletnego podłoża. Następnie wysiewaj 1,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr komórek na studzienkę na płytce 6-dołkowej i inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez noc. Lub dodaj brak transdukcji GFP rzędu wirusa.

Następnego ranka dodaj 12,5, 25 i 50 mikrolitrów od jednego do 100 rozcieńczonego sześć razy 10 do 10 jednostek tworzących płytkę nazębną na mililitr dodaj, bez erozji wirusowej, roztworu GFP, w pełnym podłożu. Dodaj to do odpowiednich studzienek lub płytki 6-dołkowej, aby przeprowadzić transdukcję komórek z odpowiednio 50, 100 i 200 wielokrotnościami infekcji. Gdy wszystkie studzienki próbki zostaną przetransdukowane wirusem, należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowej na 16 do 24 godzin.

Następnego dnia zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i zastąp supernatant pożywką, bez wirusa, aby umożliwić komórkom regenerację przez dodatkowe 24 godziny. Aby określić optymalną wydajność transdukcji, należy ocenić intensywność fluorescencji i morfologię komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Pamiętaj, aby wykonać wszystkie procedury, które mogą spowodować infekcję aerozolami lub rozpryskami, w komorze bezpieczeństwa biologicznego z certyfikatem bezpieczeństwa biologicznego drugiego poziomu.

Aby ocenić status redoks komórek, następnego ranka inkubuj komórki i odpowiednie studzienki 6-dołkowej płytki z 10 mikromolowymi nadtlenkami wodoru przez jedną godzinę, a następnie odłącz komórki za pomocą 750 mikrolitrów 0,2 5% kroplówek EDTA na studzienkę, jak pokazano. Zatrzymaj reakcję za pomocą dwóch mililitrów kompletnego podłoża na studzienkę i wyciągnij supernatanty dla każdego stanu w indywidualnych 15-mililitrowych stożkowych probówkach. Osadzaj komórki przez wirowanie i przemyj granulki w 500 mikrolitrach PBS na studzienkę przez dwukrotne odwirowanie.

Po drugim płukaniu przefiltrować zawiesiny komórek przez 40-metrowe siatki do probówek kompatybilnych z cytometrią przepływową na lodzie, chronionych przed światłem. W oprogramowaniu cytometru przepływowego uruchom zerową wielokrotność próbki kontrolnej infekcji. Następnie przeanalizuj nadtlenek wodoru i nieleczone komórki.

Umożliwi to obliczenie średniego stosunku intensywności fluorescencji między utlenionymi a zredukowanymi formami GFP w rzędzie, przy użyciu wzoru wskazanego we wskazanym wzorze. Pokazano strategię bramkowania w celu wyboru dużej liczby komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa może być również wykorzystana do wyznaczenia krzywej odpowiedzi na dawkę dla analizy GFP w wierszu i najbardziej efektywnej wielokrotności danych wejściowych infekcji.

Zgodnie z wielokrotnością infekcji, krzywą dawka-odpowiedź w tej reprezentatywnej analizie, wielokrotność infekcji 200 dawała najwyższą ekspresję GFP na drodze, ale morfologia komórek została zmieniona, co sugeruje cytotoksyczność. W związku z tym za optymalną wydajność transdukcji uznano wielokrotność infekcji wynoszącą 100. W tej analizie stanu redoks uzyskano utlenione i zredukowane średnie intensywności fluorescencji GFP z analizy cytometrii przepływowej dla nośnika i czterech 10 mikromolowych kontroli dodatniej nadtlenku wodoru.

Nałożone histogramy reprezentują przesunięcia liczby komórek w 10 mikromolowych grupach nadtlenku wodoru i nośnika lub zredukowanej i utlenionej erozji GFP. Obliczenie stosunku między GFP utlenionym a zredukowanym rzędem dla tej analizy wykazało, że 10-mikromolowy nadtlenek wodoru spowodował trzykrotny wzrost utlenienia GFP rzędu w porównaniu z obróbką podłożem. Dokładna liczba komórek jest ważna dla obliczeń MRI i odtwarzalności.

Aby uzyskać powtarzalne wyniki, badacze powinni dokładnie wymieszać roztwory przeciwwirusowe, aby uzyskać jednorodne zawiesiny. Protokół ten pozwala naukowcom badać szybkie zmiany redoks jako integralną część szerokiego zakresu normalnych procesów komórkowych i postępu choroby w czasie rzeczywistym.