Name: Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę oceny metylacji DNA genu KCNJ10 w astrocytach i jej korelację z aktywnością transkrypcyjną. Wykorzystaj analizę MS.HRMA oraz test lucyferazowy do badania zmian epigenetycznych w komórkach nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez R01NS075062-01A1. Sortowanie FACS wykonywane w zakładzie UAB Comprehensive Flow Cytometry Core (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr Scott Philips z UAB Neurobiology Core facility i dr Susan Nozell z UAB CDIB pomagali w technicznych aspektach testu lucyferazy.

Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania na Uniwersytecie Alabamy w Birmingham zatwierdził wykorzystanie zwierząt.
1. Uzyskiwanie RNA i DNA ze wzbogaconej populacji astrocytarnej za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych (FACS) astrocytów z całej tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Uspokoić zwierzę CO2 przez 1 minutę, a następnie szybko odciąć głowę. Wypreparuj korę zgodnie z opisem w Albuquerque i wsp., 26; Nie ma potrzeby usuwania opon mózgowych. 
	Uwaga: Transgeniczne szczury wykazujące ekspresję eGFP pod promotorem S100β (marker astrocytów) zostały wygenerowane przez Itakurę i wsp.27 i wykorzystywane do sortowania astrocytów metodą FACS.</li>
	<li>Przygotuj homogenat całego mózgu za pomocą zestawu do dysocjacji papainy w warunkach niesterylnych zgodnie z protokołem producenta. Aktywuj papainę termicznie w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 10 minut. Uwaga: Roztwór papainy jest dostarczany przez producenta i zawiera L-cysteinę i EDTA (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wytnij lub przetnij otwór w górnej części stożkowej rurki o pojemności 50 ml, aby umożliwić wprowadzenie rurki przenoszącej 95% O2:5% CO2 do zamkniętej stożkowej rurki (Rysunek 1A). Umieść wypreparowaną korę w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 mm zawierającym pożywkę dysocjacyjną (MEM uzupełnioną 20 mM glukozą i penicyliną/streptomycyną (500 U/ml) i zrównoważoną do 95% O2:5% CO2) i użyj czystej żyletki, aby zmielić tkankę na 1 x 1 mm2 kawałki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść tkankę za pomocą 10 ml pipetmana ręcznego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej roztwór papainy. Pozwól, aby tkanka osiadła na dnie pipety transferowej przed rozładowaniem, aby zminimalizować ilość przenoszonych mediów dysocjacyjnych. Utrzymuj roztwór papainy w równowadze do 95% O2:5% CO2 poprzez powierzchniową wymianę gazową przez czas inkubacji. Nie bulgoczący roztwór papainy. Inkubować tkankę przez 20 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji w roztworze papainy należy rozcierać tkankę 10 razy za pomocą pipety do przenoszenia o pojemności 10 ml z małą prędkością. Odwirować mętną zawiesinę komórkową o sile 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Zrównoważyć roztwór inhibitora DNazy/albuminy (dostarczony przez producenta) poprzez powierzchniową wymianę gazową i ponownie zawiesić granulowane komórki w 3 ml roztworu inhibitora DNazy/albuminy. Przygotuj komercyjny nieciągły gradient gęstości zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować nieciągły gradient gęstości przy 1 000 x g przez 6 minut. Wyizolować zdysocjowane komórki z dna probówki, odsysając dolną osadkę za pomocą pipety.</li>
	<li>Ponownie zawiesić zdysocjowane komórki w 2-3 ml DPBS z 0,02% albuminą surowicy bydlęcej i 1 mg/ml DNazy lub preferowaną buforowaną pożywką hodowlaną HEPES. Przepuść przez filtr 40 μm przed FACS (rysunek 2A). Trzymaj komórki na lodzie do czasu sortowania.
	<ol>
		<li>Wykonaj FACS28.</li>
		<li>Granulki w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. 
		Uwaga: Granulowane astrocyty można wykorzystać natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja RNA i DNA przy użyciu preferowanej metody izolacji 2930. Ocena stężenia i jakości RNA i DNA za pomocą spektrofotometru i bioanalizatora 31. 
	Uwaga: W kolejnych krokach wykorzystuj tylko wysokiej jakości RNA i DNA, odpowiednio 260/280 = 2,0-2,2 i 1,8-1,9. Analiza bioanalizatora jest niezbędna do oceny degradacji RNA lub fragmentacji DNA. RNA lub DNA mogą być wykorzystane natychmiast lub przechowywane odpowiednio w temperaturze -80 °C lub -20 °C do kolejnych badań.</li>
</ol>
2. Ocena statusu metylacji DNA genu za pomocą wrażliwej na metylację analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości (MS-HRMA)
<ol>
	<li>Wprowadź sekwencję genów będących przedmiotem zainteresowania do preferowanego oprogramowania do mapowania metylacji online, aby zidentyfikować dowolne wyspy CpG w genie będącym przedmiotem zainteresowania 32.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery przeciwko sekwencjiDNA 33 przekształconej w wodorosiarczyn i amplifikuj przy użyciu preferowanej polimerazy DNA zgodnie z protokołem producenta. Sprawdź amplifikowany rozmiar produktu, uruchamiając 1% żel DNA z agarozy pod napięciem 100 V przez 45 minut. Podkłady należy przechowywać w stężeniu podstawowym 20 μM w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wodorosiarczyn przekształca 500-1,000 ng DNA z każdej próbki i metylowane wzorce DNA w zakresie od 0 do 100% od tego samego gatunku zwierząt 34. Eluować próbki do uzyskania stężenia 20 ng/μl. Sprawdź stężenie DNA przekształconego w wodorosiarczyn za pomocą spektrofotometru 31.</li>
	<li>Ustawić 20 μl reakcji do amplifikacji MS-HRM przy użyciu preferowanej polimerazy DNA i starterów przy stężeniu 5 μM zgodnie z tabelami 1 i 2. Uruchom wszystkie próbki, w tym DNA FACS i wzorce metylowe, w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>W zależności od oprogramowania analitycznego należy ustawić parametry przed i po uruchomieniu i zatrzymaniu wokół przejść krzywej topnienia. Ustaw parametry rozpoczęcia wstępnego topienia i zatrzymania wstępnego topienia tak, aby różnica między nimi wynosiła 0,2 – 0,5 °C. Ustaw podobnie początek po stopieniu i koniec po topieniu. Wyodrębnić dane dotyczące różnicy temperatur szczytowych dla każdej próbki.</li>
	<li>Korzystając z procentowych wzorców metylowych (wartość y) i odpowiadających im średnich różnic temperatury szczytowej (wartość x), wygeneruj równanie regresji liniowej (rysunek 3A-B, tabela 3-4). Użyj tego równania regresji liniowej, aby oszacować stan metylacji nieznanych próbek 35.</li>
</ol>
3. Ocena aktywności hipermetylowanego promotora za pomocą testu lucyferazy
<ol>
	<li>Zidentyfikuj wyspy CpG docelowego genu (Krok 2.1). PCR amplifikuje obszary zainteresowania 36 i klonuje przed genem reporterowym lucyferazy lucyferazy lucyferazy luc2 Firefly w celu wytworzenia plazmidów CpG-island-luc2 37.</li>
	<li>Linearyzuj 30 μg plazmidu CpG-island-luc2 poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym 38. Zweryfikuj miejsca pod kątem skrótu ograniczeń i unikaj podwójnych cięć za pomocą preferowanego oprogramowania do cięcia 38. Enzymy inaktywowane termicznie w odpowiedniej temperaturze i czasie po trawieniu zgodnie z protokołem producenta. Minimalna utrata DNA następuje na etapie linearyzacji.</li>
	<li>Metylowane plazmidy należy zlinearyzować przy użyciu metylazy CpG (M.Sssl) O/N w temperaturze 30 °C lub pozostawić bez obróbki zgodnie z protokołem producenta, z wyjątkiem następujących regulacji.</li>
	<li>Wykonaj 50 μl reakcji.</li>
	<li>Użyj 5 jednostek metylazy CpG do metylacji 700 ng zlinearyzowanego plazmidu.</li>
	<li>Uruchom reakcje O/N przez 13-19 godzin.</li>
	<li>Po reakcji metylazy CpG należy przeprowadzić oczyszczanie DNA za pomocą standardowego, dostępnego na rynku zestawu do czyszczenia membrany z żelu krzemionkowego zgodnie z protokołem producenta. Znaczne straty DNA występują w wyniku reakcji metylazy CpG, utrata 30-60%.</li>
	<li>Sprawdź metylację plazmidów za pomocą trawienia restrykcyjnego Hpa II.</li>
	<li>Pobrać 1 μg metylowanego lub niemetylowanego DNA i poddać trawieniu restrykcyjnemu za pomocą Hpa II przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Użyć 5-10 jednostek Hpa II na każdy μg DNA. Po wytrawieniu Hpa II należy przeprowadzić oczyszczanie DNA za pomocą preferowanego, dostępnego na rynku zestawu do czyszczenia membrany z żelem krzemionkowym. Uruchom zarówno metylowane, jak i niemetylowane plazmidy CpG na 1% żelu DNA z agarozy w buforze TAE lub TBE pod napięciem 100 V przez 45 minut w celu wizualizacji (Figura 4B).</li>
	<li>Poddaj zarówno metylowane, jak i niemetylowane plazmidy podwójnemu trawieniu z odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, aby uwolnić pełnowymiarowe fragmenty luc 2 (wektor) i wyspy CpG (wstaw) 38. Przeprowadzić podwójne trawienie O/N w odpowiedniej temperaturze i inaktywować termicznie enzymy po mineralizacji zgodnie z protokołem producenta. Minimalna utrata stężenia DNA występuje podczas trawienia z podwójnym ograniczeniem.</li>
	<li>Uruchom podwójnie strawione plazmidy na 1% żelu agarozowym DNA pod napięciem 100 V przez 1 godzinę, aby umożliwić oddzielenie wektora i insertu (Figura 4C). Ostrożność. Nosząc ochronną osłonę twarzy UV, umieść żel DNA na czarnym świetle stołu, aby uwidocznić opaski. W zależności od rozmiaru, wyciętą metylowaną i niemetylowaną wkładkę oraz niemetylowany wektor za pomocą czystego ostrza chirurgicznego.</li>
	<li>Żelowy ekstrakt DNA przy użyciu nasyconego fenolu, pH 6,6. Krótko zważ żel DNA zawierający wektor lub wkładkę. Użyj 100 μl fenolu na 0,1 grama żelu DNA. Homogenizuj żel DNA w fenolu za pomocą homogenizatora szklanego.</li>
	<li>Dodać chloroform (używając 1/5 objętości fenolu) i wstrząsać próbkami przez 20 sekund. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty. Wirować przez 15 minut z maksymalną prędkością (16,1 x 1 000 x g) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór wodny i dodać 0,1 razy objętość 3 M octanu sodu i 2,5 razy objętość etanolu. Próbki inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -80 °C. Po inkubacji usunąć etanol i ponownie zawiesić DNA w 30 μl preferowanego buforu. Znaczna utrata DNA następuje po wyizolowaniu insercji i wektorów, utrata 30-50%.</li>
	<li>Religacja metylowanych i niemetylowanych insertów do niemetylowanego wektora przy użyciu ligazy DNA T4 38. Użyj stosunku wektora 1:4 do wstawienia dla reakcji ligacji. Ustaw reakcję zgodnie z instrukcjami producenta. Do reakcji użyć całkowitej objętości 50 μl i inkubować O/N w temperaturze -20 °C lub na lodzie z pokrywką nad wiadrem na lód.</li>
	<li>Po podwiązaniu należy przeprowadzić czyszczenie DNA za pomocą preferowanego, dostępnego na rynku zestawu do czyszczenia membrany z żelu krzemionkowego. Znaczna utrata DNA następuje po reakcji ligacji, około 30-50% utraty DNA. Sprawdź ponowną ligację, uruchamiając 1% żel DNA z agarozy pod napięciem 100 V przez 45 minut i oceń stężenie ponownie zligowanych plazmidów (ryc. 4D).</li>
	<li>Transfekcja metylowanych lub niemetylowanych plazmidów do komórek D54 przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z protokołem producenta. Wysiewaj komórki D54 na 12-dołkowej płytce w 0,14 x 106 komórek/dołek.</li>
	<li>Po 24 godzinach transfekcja komórek z równymi stężeniami (1) niemetylowanego plazmidu CpG-luc2 + Renilli lub innego wektora lucyferazy kontrolnej lub (2) metylowanego plazmidu CpG-luc2 + Renilli lub innego kontrolnego wektora lucyferazy.</li>
	<li>Pozwól komórkom na transfekcję przez 24 godziny przed wykonaniem podwójnego testu lucyferazy. Wykonaj test zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj odczyty za pomocą luminometru. Przeczytaj każdą studzienkę w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Obliczać stosunek aktywności lucyferazy świetlika do aktywności lucyferazy Renilla lub innej kontrolnej aktywności lucyferazy. Normalizuj metylowany Firefly: kontroluj aktywność lucyferazy do niemetylowanego Firefly: kontroluj aktywność lucyferazy, dzieląc aktywność metylowanej lucyferazy przez niemetylowaną aktywność lucyferazy</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Protokół ten opisuje izolację wzbogaconej populacji astrocytów za pomocą FACS, a także różnorodne techniki, które pozwalają zarówno na badania korelacyjne, jak i przyczynowe między metylacją DNA a ekspresją genów. Techniki te, stosowane w izolacji lub w połączeniu, są szczególnie przydatne dla laboratoriów, które pracują z tkankami o wysokiej heterogeniczności komórkowej lub są zainteresowane statusem metylacji DNA określonego genu lub regionu genu w porównaniu z globalnymi zmianami metylacji DNA. Jednym ze stosunkowo wy...

Epigenetyka to nauka o modyfikacjach chemicznych, które mogą wpływać na aktywność transkrypcyjną genomu. Zasadniczo, bez zmiany sekwencji DNA, modyfikacje epigenetyczne, takie jak metylacja DNA, acetylacja histonów i metylacja histonów, są wystarczające do odwracalnej zmiany wzorców ekspresji genów 1. Metylacja DNA, silny regulator ekspresji genów, jest najlepiej scharakteryzowaną modyfikacją epigenetyczną. Metylacja DNA to kowalencyjne przyłączenie grup metylowych do pozycji C5 cytozyny, zwykle cytozyny dinukleotydu cytozynowo-guaninowego, znanego również jako miejsce CpG. Obszary, które zawierają duże zagęszczenie miejsc CpG, są znane jako wyspy CpG (CGI). CGI są często związane z transkrypcyjnymi miejscami startowymi (TSS) i promotorami genów 1-3. Tak więc, podczas gdy zmiany metylacji DNA w CGI nie zawsze towarzyszą zmianom w ekspresji lub funkcji komórki, zmiany w metylacji DNA w CGI mogą wywierać silną regulację aktywności transkrypcyjnej 2. 
Historycznie rzecz biorąc, zaobserwowano, że metylacja DNA jest niezbędna w embriogenezie, imprintingu i rozwoju, z niewielkimi zmianami w poziomach metylacji DNA występującymi w komórkach postmitotycznych (z wyjątkiem zmian w genach związanych z rakiem) 4,5. Jednak dziedzina neuroepigenetyki podkreśliła ważną, nierozwojową rolę metylacji DNA. W szczególności epigenetyka kognitywna na nowo zdefiniowała metylację DNA jako wysoce plastyczny mechanizm integralnie pośredniczący zarówno w aktywacji transkrypcji, jak i represji genów niezbędnych w procesie uczenia się i zapamiętywania6. Oprócz epigenetyki poznawczej, badania modelujące uraz niedokrwienny i ból neuropatyczny charakteryzują metylację DNA jako labilny mechanizm, który szybko reaguje na różne uszkodzenia OUN 7-9. Jeśli chodzi o astrocyty, kilka linii dowodów sugeruje, że metylacja DNA odgrywa ważną rolę w astroglejogenezie. Fan i wsp. odkryli, że warunkowe KO DNMT1 w nerwowych komórkach progenitorowych (NPC) spowodowało przedwczesny rozwój astrocytów zgodnych z globalnym stanem hipometylacji 10. Dodatkowo, Perisic i wsp., stwierdzili, że zróżnicowane poziomy metylacji DNA promotora GLT-1 pośredniczyły w zróżnicowanych poziomach ekspresji transportera glutaminianu w korze i móżdżku, podkreślając rolę metylacji DNA w ustalaniu specyficznych dla regionu mózgu wzorców ekspresji genów astrocytarnych 11. Ogólnie rzecz biorąc, liczne badania podkreślają dynamiczną i labilną naturę metylacji DNA w OUN, ponieważ wykazano, że środowisko, leki i urazy zmieniają metylację DNA, a często także ekspresję genów 4,9. Podsumowując, te badania neuroepigenetyczne wskazują na metylację DNA jako wykonalny cel terapeutyczny, który może złagodzić różne patologie OUN.
W miarę jak dziedzina epigenetyki poszerza swoje zrozumienie roli metylacji DNA w rozwoju neurologicznym i chorobach, wyzwaniem związanym z przeniesieniem metylacji DNA w kierunku celu terapeutycznego jest przeprowadzenie nie tylko badań korelacyjnych, ale i przyczynowych, które definiują konkretne cele i miejsca genów. Ponadto badanie zmian w metylacji DNA specyficznych dla regionu mózgu i typu komórki pozostaje ciągłym i wartym uwagi czasem wyzwaniem, unikalnym w dziedzinie neuroepigenetyki. Protokół ten wykorzystuje różne techniki, w tym sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) astrocytów, wrażliwą na metylację analizę stopu w wysokiej rozdzielczości (MS-HRM) oraz test lucyferazy metylacji w celu zbadania stanu metylacji DNA KCNJ10, genu kodującego Kir4.1. Kir4.1 to specyficzny dla gleju kanał potasowy, który wykazuje zarówno specyficzne dla regionu mózgu, jak i komórki, wzorce ekspresji w OUN 12-16. Ekspresja Kir4.1 wzrasta przechodząc z regionów OUN rostralnych do ogonowych, przy czym najwyższa ekspresja występuje w rdzeniu kręgowym 15. Chociaż kanał ulega ekspresji w komórkach wyściółki, oligodendrocytach i ich komórkach prekursorowych, Kir4.1 ulega ekspresji głównie w astrocytach i uważa się, że jest niezbędny do utrzymania homeostatycznego poziomu potasu, a także wspierania wychwytu glutaminianu poprzez ustawienie astrocytarnego potencjału błony spoczynkowej na hiperspolaryzowany -80mV 12,16-19. Co ważne, ekspresja Kir4.1 jest niestatyczna zarówno podczas rozwoju, jak i po wielu formach uszkodzenia OUN 20-25. Chcieliśmy zbadać epigenetyczną regulację tego kanału, szczególnie w astrocytach podczas rozwoju. Zastosowane techniki oferują specyficzne dla genu i ukierunkowane analizy miejsc CpG, które dostarczają dowodów przyczynowych na rolę metylacji DNA w regulacji ekspresji genu KCNJ10. Techniki te można zastosować do innych genów.

<table><tbody><tr><td>System dysocjacji papainy</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Primer</td><td>Oprogramowanie online Applied Biosystems</td><td></td><td>do lokalizacji CpG Islands</td></tr><tr><td>EZ DNA Zestaw do metylacji Zymo</td><td>Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Wstępnie zmieszany wzorzec kalibracji szczurów</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premix</td><td></td></tr><tr><td>Metylaza CpG (M.Sssl)</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAszybka ekstrakcja żelu&nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>Używany do ekstrakcji żelu i oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nóż NEB</td><td>New England BioLabs</td><td>online</td><td>weryfikuj miejsca trawienia ograniczeń</td></tr><tr><td>Podwójny system testów reporterowych lucyferazy</td> Wektor <td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2, wektor renilla pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 Luminometr</td><td>Turner Designs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX i Plus Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, nasycony pH 6,6/6,9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spektroftometr</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie High Resolution Melt (HRM) v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie AB SDS v2.3</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB High Resolution Melting Przewodnik wprowadzający&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT Szybkie</td><td>technologie</td><td></td><td></td> eksploatacji systemu w czasie rzeczywistym</tr></tbody></table>

korelacja zmian metylacji dna specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego kcnj10 (kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Metylacja DNA służy do regulacji ekspresji genów poprzez kowalencyjne przyłączanie grupy metylowej do pozycji C5 cytozyny w dinukleotydzie cytozynowo-guaninowym cytozyny. Podczas gdy metylacja DNA zapewnia długotrwałe i stabilne zmiany w ekspresji genów, wzorce i poziomy metylacji DNA również podlegają zmianom w zależności od różnych sygnałów i bodźców. W związku z tym metylacja DNA działa jako potężny i dynamiczny regulator ekspresji genów. Badania neuroepigenetyki ujawniły różnorodność stanów fizjologicznych i patologicznych, które są związane zarówno z globalnymi, jak i specyficznymi dla genów zmianami w metylacji DNA. W szczególności uderzające korelacje między zmianami w ekspresji genów a metylacją DNA istnieją w zaburzeniach neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych, podczas plastyczności synaps i po uszkodzeniu OUN. Jednak w miarę jak dziedzina neuroepigenetyki nadal poszerza swoją wiedzę na temat roli metylacji DNA w fizjologii OUN, niezbędne jest określenie związków przyczynowych w odniesieniu do zmian w ekspresji genów i metylacji DNA. Co więcej, w odniesieniu do szerszej dziedziny neurobiologii, obecność ogromnych różnic specyficznych dla regionów i komórek wymaga technik, które rozwiązują te różnice podczas badania transkryptomu, proteomu i epigenomu. Tutaj opisujemy sortowanie astrocytów korowych metodą FACS, które pozwala na późniejsze badanie zarówno transkrypcji RNA, jak i metylacji DNA. Ponadto szczegółowo opisujemy technikę badania metylacji DNA, czułą na metylację analizę stopienia w wysokiej rozdzielczości (MS-HRMA), a także test promotora lucyferazy. Dzięki zastosowaniu tych połączonych technik można nie tylko zbadać zmiany korelacyjne między metylacją DNA a ekspresją genów, ale także bezpośrednio ocenić, czy zmiany w statusie metylacji DNA w danym regionie genu są wystarczające, aby wpłynąć na aktywność transkrypcyjną.

Wzbogaconą populację astrocytów uzyskano poprzez sortowanie FACS zwierząt transgenicznych eGFP-S100β 27. Ze względu na spadek jakości komórek i cząsteczek molekularnych izolowanych od zwierząt starszych niż 50. dzień po urodzeniu (p50), zwierzęta w wieku p0-p40 są optymalne do takich eksperymentów. Do doświadczeń wykorzystano tkankę korową. Korę mózgową od dwóch do sześciu zwierząt łączono w jedną próbkę. FACS przeprowadzono w jednostce UAB Comprehensive Flow Cytometry Core. Sortowanie wykonano na urządzeniu B...

Metylacja DNA jest w stanie utrzymać stabilny poziom ekspresji genów, a także pozwala na dynamiczne zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na różne bodźce. Szczegółowo opisujemy techniki, które pozwalają na badanie specyficznych dla genów zmian w metylacji DNA i wpływu tych zmian na ekspresję genów.

Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena stanu metylacji DNA genu KCNJ 10 w wzbogaconej populacji astrocytów oraz skorelowanie zmian metylacji DNA w obrębie promotora z opcjonalną aktywnością transkrypcyjną. Cel ten jest realizowany poprzez wstępne wyizolowanie wzbogaconej populacji astrocytów korowych z całego mózgu gryzonia za pomocą sortowania FACS, a następnie izolację DNA z tej wzbogaconej populacji astrocytów. Następnie stan metylacji DNA genu KCNJ 10 jest oceniany z wykorzystaniem analizy wysokorozdzielczego topnienia wrażliwej na metylację lub MS.HRMA.Na koniec, promotor KCNJ 10 jest hipermetylowany, a test lucyferazowy jest wykorzystywany do skorelowania zmian w metylacji DNA promotora z aktywnością transkrypcyjną. Ostatecznie MS-HRMA oraz test lucyferazowy służą do pomiaru stanu metylacji DNA KCNJ 10 i skorelowania zmian w metylacji promotora z aktywnością transkrypcyjną genu, co zostanie zaprezentowane podczas demonstracji procedury. Badania przeprowadził stażysta postdoctoral z mojego laboratorium; wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health, a wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na University of Alabama w Birmingham.Wszystkie bufory i odczynniki przygotowano zgodnie z protokołem tekstowym. Po wypreparowaniu kory z głowy uśpionego zwierzęcia, zgodnie z protokołem tekstowym, należy wyciąć lub wywiercić otwór w górnej części probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, aby umożliwić wprowadzenie do niej drenów. Następnie do probówki należy dodać roztwór papainy.Umieść wypreparowaną korę w 10 milimetrowej szalce hodowlanej zawierającej medium do dysocjacji równoważone z 95% O2 i 5% CO2, a następnie za pomocą czystego ostrza żyletek posiekaj tkankę na fragmenty o wymiarach 1x1 milimetr kwadratowy. Za pomocą pipety 10 mililitrowej przenieś tkankę do probówki 50 mililitrowej zawierającej roztwór papainy. Przed wypuszczeniem zawartości pozwól tkance opaść na dno pipety transferowej.Aby zminimalizować ilość przeniesionego medium do dysocjacji bez napowietrzania roztworu pepsyny, zastosuj stały przepływ 95%O2 i 5%CO2 poprzez wymianę gazową z powierzchnią podczas inkubacji w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut. Po inkubacji użyj pipety transferowej o pojemności 10 ml, aby powoli potrząsnąć tkanką 10 razy, a następnie odwiruj zmutną zawiesinę komórkową przy 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przerównoważ roztwór inhibitora albuminy DNA poprzez wymianę gazową z powierzchnią i resuspenduj osad komórkowy w trzech mililitrach tego roztworu.Następnie przygotuj komercyjny nieciągły gradient gęstości zgodnie z instrukcjami producenta. Wirować nieciągły gradient gęstości przy 70 G przez sześć minut. Następnie wyizoluj dysocjowane komórki z dna probówki, odsysając medium za pomocą pipety.Należy użyć od dwóch do trzech mililitrów DPBS z 0,02% albuminy surowicy bydlęcej i jednego miligrama na mililitr DNA lub preferowanego medium. Aby ponownie zawiesić zdysocjowane komórki, należy je resuspenderować. Przed przeprowadzeniem sortowania FACS oraz ekstrakcji DNA lub RNA zgodnie z protokołem tekstowym, komórki należy przepuścić przez filtr 40 µm.Po zaprojektowaniu starterów przeciwko sekwencji DNA przekonwertowanej pirosiarczynem i amplifikacji DNA zgodnie z protokołem tekstowym, przekonwertuj pirosiarczynem od 500 do 1000 nanogramów DNA z każdej próbki oraz standardy zmetylowanego DNA w zakresie od 0% do 100% z tego samego gatunku zwierząt, używając preferowanej polimerazy DNA i starterów o stężeniu 5 µM. Przygotuj reakcje o objętości 20 µL do amplifikacji Ms HRM. Zgodnie z tą tabelą, przeprowadź analizę wszystkich próbek, w tym kontroli DNA i standardów zmetylowanych, w trzech powtórzeniach; w zależności od ustawień oprogramowania analitycznego, określ parametry startu i stopu (pre i post) wokół przejść krzywej topnienia.Ustaw parametry startu i końca wstępnego topnienia (premelt). Różnica między nimi powinna wynosić od 0,2 do 0,5 °C. W podobny sposób ustaw start i koniec topnienia końcowego (post-melt), a następnie wyodrębnij dane dotyczące różnicy temperatur szczytowych dla każdej próbki, korzystając ze standardów procentowego zmetylowania i odpowiadających im różnic temperatur szczytowych.Wyznacz równanie regresji liniowej. Wykorzystaj to równanie regresji liniowej do oszacowania stanu metylacji nieznanych próbek po zidentyfikowaniu interesujących wysp CpG oraz powieleniu i sklonowaniu wyspy CpG do plazmidu zgodnie z protokołem tekstowym. Użyj preferowanego oprogramowania do analizy enzymów restrykcyjnych w celu zweryfikowania miejsc cięcia, aby uniknąć podwójnych nacięć, a następnie zlinearyzuj 30 µg plazmidu po strawieniu próbki odpowiednimi enzymami.Inaktywuj termicznie enzymy w odpowiedniej temperaturze i czasie w reakcjach o objętości 50 µL. Do metylacji użyj pięciu jednostek CPG methylate. 700 µg linearyzowanych plazmidów w temperaturze 30 °C przez 13 do 19 godzin.Po oczyszczeniu DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przeprowadzić trawienie restrykcyjne HPA II próbek 1 µg zmetylowanego DNA, inkubując je w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po oczyszczeniu DNA próbki należy poddać elektroforezie w 1% żelu agarozowego przy napięciu 100 V przez 45 minut w celu wizualizacji. Następnie zmetylowane i niezmetylowane plazmidy poddaje się podwójnemu trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi przez noc, aby uwolnić pełnowymiarowy wektor Luke 2 oraz fragmenty wysp CpG.Po trawieniu przeprowadź termiczną inaktywację enzymów. Próbki poddane podwójnemu trawieniu rozdziel na 1% żelu agarozowym DNA przy napięciu 100 V przez jedną godzinę, aby oddzielić wektor od insertu. Następnie, stosując ochronę przed światłem UV, umieść żel w transiluminatorze i za pomocą czystych skalpeli wytnij zmetylowane oraz niezmetylowane inserty. Po wyekstrahowaniu DNA z żelu zgodnie z protokołem tekstowym, użyj T4 DNA ligazy oraz stosunku wektora do insertu wynoszącego 1:4, aby ligować zmetylowane i niezmetylowane inserty do niezmetylowanego wektora. Po ligacji inkubuj próbki w temperaturze -20 °C lub na lodzie przez noc.Oczyść DNA i zweryfikuj ponowną ligację, przeprowadzając elektroforezę próbek na żelu agarozowym 1% DNA, a następnie określ stężenie religowanego plazmidu. Wysiej komórki CD 54 na płytkę 12-dołkową w zagęszczeniu 140 000 komórek na dołek. Po 24 godzinach użyj komercyjnego odczynnika do transfekcji, aby transfekować komórki równymi stężeniami albo niezmetylowanego plazmidu CPG loop two wraz z RAN vanilla lub innym kontrolnym wektorem lucyferazy, albo zmetylowanego plazmidu CPG loop two wraz z ELLA lub innym kontrolnym wektorem lucyferazy. Pozostaw komórki na 24 godziny w celu przeprowadzenia transfekcji przed wykonaniem testu lucyferazy.Zgodnie z instrukcjami producenta, należy użyć lumnometru do odczytu każdej studni w trzech powtórzeniach. Oblicz stosunek aktywności lucyferazy świetlika do reniliowej lub innej kontroli aktywności lucyferazy.Znormalizuj aktywność zmetylowanej lucyferazy kontrolnej świetlika względem aktywności niezmetylowanej lucyferazy kontrolnej świetlika, dzieląc aktywność zmetylowaną przez aktywność lucyferazy niezmetylowanej. Jak tutaj zademonstrowano, wzbogaconą populację astrocytów uzyskano poprzez sortowanie FACS zwierząt transgenicznych E-G-F-P-S 100 beta. Populację bramkowaną wyznaczono na podstawie rozproszenia przedniego i bocznego, a populację żywych komórek określono przy użyciu bromku jako wskaźnika martwych komórek; przedstawione tutaj bramkowania są reprezentatywnymi obrazami astrocytów pozytywnych pod kątem EGFP po dysocjacji, ale przed sortowaniem, a także po sortowaniu. Rysunek ten przedstawia wyizolowaną populację komórek pozytywnych pod kątem EGFP, która wykazała 40-krotny wzrost poziomu mRNA dla specyficznego markera astrocytów.A LDH jeden L jeden. Ponadto, mimo wspólnej ekspresji S 100 beta oraz NG dwa w dodatnich OPC i astrocytach, zaobserwowano czterokrotny spadek poziomu mRNA NG dwa, markera dla komórek prekursorowych oligodendrocytów, co wskazuje na izolację wzbogaconej populacji komórek astrocytarnych. Tabela ta zawiera dane dotyczące całkowitej ilości RNA i DNA wyizolowanych od zwierząt w różnym wieku i w różnej liczbie i służy jako punkt odniesienia dla oczekiwanej wydajności cząsteczek molekularnych po przeprowadzeniu procedur.Na koniec, w celu oceny aktywności transkrypcyjnej hipermetylowanych regionów badanego genu po przeniesieniu zmetylowanego insertu do niezmetylowanego wektora, zastosowano podwójny test lucyferazowy. Do weryfikacji stanu metylacji plazmidu użyto enzymu Hpa II, który trawi wyłącznie niezmetylowane DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować i wzbogacać populację astrocytów przy użyciu FACS, a także jak mierzyć metylację DNA genu i korelować zmiany w metylacji DNA promotora z aktywnością transkrypcyjną, stosując odpowiednio analizę wysokorozdzielczego topnienia wrażliwą na metylację (HRM) oraz test lucyferazowy.

correlating-gene-specific-dna-methylation-changes-with-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytowego KCNJ10 (Kir4.1)

Przedstawiono usprawniony schemat badania metylacji DNA oraz zmian w ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Począwszy od separacji matczynej noworodków myszy i izolacji poszczególnych tkanek mózgowych, prezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wycinków tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia następującej po niej sekwencjonowania z konwersją bisulfitową oraz analizy RT-PCR.

Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Właściwości i funkcje wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ astrocytów w prążkowiu pozostają niew pełni zbadane. Opisujemy metody ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia w astrocytach prążkowia przy użyciu wirusów związanych z adenowirusami serotypu 2/5 (AAV2/5), a także procedury wiarygodnego obrazowania sygnałów Ca2 + w astrocytach prążkowia in situ.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ w astrocytach prążkowia od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Celem tego raportu jest opisanie protokołu do solidnego immunohistochemicznego wykrywania markerów epigenetycznych, 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Astrocyty jednolicie układają korę mózgową, co utrudnia analizę ich złożonej morfologii na poziomie komórkowym. Dostarczony tutaj protokół wykorzystuje wielokolorowe znakowanie oparte na elektroporacji in utero w celu wyodrębnienia astrocytów korowych i przeanalizowania ich objętości i morfologii za pomocą przyjaznego dla użytkownika potoku analizy obrazu.

Elektroporacja in utero wieloadresowalnych markerów kolorystycznych integrujących genom (MAGIC) w celu indywidualizacji astrocytów korowych myszy

W tym artykule przedstawiono protokół korzystania z DeepSpaceDB, dynamicznej, interaktywnej bazy danych do transkryptomiki przestrzennej, oferującej przepływy pracy analizy i przykłady do badania organizacji tkanek i ekspresji genów związanych z chorobą.

Eksploracja zbiorów danych transkryptomiki przestrzennej przy użyciu bazy danych DeepSpaceDB

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Poznaj metodę oceny metylacji DNA genu KCNJ10 w astrocytach i jej korelację z aktywnością transkrypcyjną. Wykorzystaj analizę MS.HRMA oraz test lucyferazowy do badania zmian epigenetycznych w komórkach nerwowych.

Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1)

Przeglądaj więcej filmów