Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1)

Ogólnym celem tej procedury jest ocena stanu metylacji DNA KCNJ 10 we wzbogaconej populacji astrocytów i skorelowanie zmian metylacji DNA promotora z opcjonalną aktywnością transkrypcyjną. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie wzbogaconej populacji astrocytów korowych z całego mózgu gryzoni za pomocą sortowania faktów, a następnie wyizolowanie DNA ze wzbogaconej populacji astrocytów. Następnie stan metylacji DNA KC J 10 ocenia się za pomocą wrażliwej na metylację analizy stopienia o wysokiej rozdzielczości lub MS. Prawo do spraw ludzkich.

Wreszcie, promotor KC J 10 jest hipermetylowany, a test lucyferów jest wykorzystywany do skorelowania zmian w metylacji DNA promotora z aktywnością transkrypcyjną. Ostatecznie MS. HRMA i test lucyferazy są wykorzystywane do pomiaru statusu metylacji DNA KCNJ 10 i korelowania zmian w metylacji promotora i aktywności transkrypcyjnej genu Demonstracja procedury zostanie pokazana. Doktor habilitowany z mojego laboratorium, Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health, Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Alabamy w Birmingham, zatwierdzonym do użytku zwierząt.

Wszystkie i odczynniki zostały przygotowane zgodnie z protokołem tekstowym. Po wypreparowaniu kory mózgowej z głowy zwierzęcia poddanego eutanazji, zgodnie z protokołem tekstowym, wytnij lub przetnij otwór w górnej części stożkowej rurki o średnicy 50 mililitrów, aby umożliwić wprowadzenie rurki do rurki. Następnie dodaj roztwór papiny do probówki.

Umieść wypreparowaną korę w 10-milimetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym pożywkę dysocjacyjną zrównoważoną z 95% O2 do 5% CO2 i użyj czystej żyletki, aby zmielić tkankę na jeden na milimetr kwadratowy kawałki. Za pomocą 10-mililitrowej pipety mężczyźni przenoszą tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej roztwór pepanu. Poczekaj, aż tkanka osiądzie na dnie pipety transferowej przed rozładowaniem.

Aby zminimalizować ilość przenoszonego medium dysocjacyjnego bez bulgotania roztworu pepanu, należy zastosować stały przepływ 95% O2 do 5% CO2 przez powierzchniową wymianę gazową podczas inkubacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji użyć 10-mililitrowej pipety transferowej, aby powoli przetrzeć tkankę 10 razy, odwirować mętną zawiesinę komórkową o sile 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zrównoważyć roztwór inhibitora albuminy DNA poprzez powierzchniową wymianę gazową i ponownie zawiesić granulowane komórki w trzech mililitrach roztworu.

Następnie przygotuj komercyjny nieciągły gradient gęstości zgodnie z instrukcjami producenta. Obracać nieciągły gradient gęstości przy 70 G przez sześć minut. Następnie wyizoluj zdysocjowane komórki od dna probówki za pomocą pipety do odessania pożywki.

Użyj od dwóch do trzech mililitrów DPBS z 0,02% albuminą surowicy bydlęcej i jednym miligramem na mililitr DNA lub preferowanej pożywki. Aby ponownie użyć zdysocjowanych komórek. Przepuść komórki przez filtr 40 mikrogramów przed przeprowadzeniem sortowania faktów i ekstrakcji DNA lub RNA zgodnie z protokołem tekstowym.

Po zaprojektowaniu starterów przeciwko sekwencji DNA przekształconej w bi-siarczyn i amplifikacji DNA zgodnie z protokołem tekstowym przez siarczyny, przekonwertuj od 500 do 1000 nanogramów DNA z każdej próbki i metylowanych standardów DNA w zakresie od zera do 100% od tego samego gatunku zwierząt przy użyciu preferowanej polimerazy DNA i pięciu starterów mikromolowych. Ustaw 20 mikrolitrów reakcji do amplifikacji Ms HRM. Zgodnie z tą tabelą, wszystkie próbki, w tym faks, DNA i wzorce metylowe, należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach w zależności od zestawu oprogramowania analitycznego, parametrów przed i po uruchomieniu i zatrzymaniu wokół przejść krzywej topnienia.

Ustaw parametry stopienia wstępnego, rozpoczęcia i zatrzymania stopienia wstępnego. Tak więc różnica między nimi wynosi od 0,2 do 0,5 stopnia Celsjusza. Ustaw podobnie po stopieniu, rozpocznij i zatrzymaj i wyodrębnij dane o różnicy temperatur szczytowych dla każdej próbki przy użyciu procentowych wzorców metylowych i odpowiadających im różnic temperatur szczytowych.

Wygeneruj równanie regresji liniowej. Użyj tego równania regresji liniowej, aby oszacować stan metylacji nieznanych próbek po zidentyfikowaniu interesujących wysp CPG oraz amplifikacji i klonowaniu plazmidu CPG island Luke two zgodnie z protokołem tekstowym. Użyj preferowanego oprogramowania do cięcia do weryfikacji miejsc pod kątem trawienia restrykcyjnego, aby uniknąć podwójnych cięć i linearyzacji 30 mikrogramów plazmidu po strawieniu próbki za pomocą odpowiednich enzymów.

Podgrzej enzymy inaktywowane w odpowiedniej temperaturze i czasie trwania w reakcjach o objętości 50 mikrolitrów. Do metylacji użyj pięciu jednostek metanolanu CPG. 700 mikrogramów zlinearyzowanych plazmidów w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 13 do 19 godzin.

Po oczyszczeniu DNA, jak opisano w protokole tekstowym, przeprowadzić trawienie HPA z dwoma ograniczeniami na jednej mikrogramach próbki metylowanego DNA przez inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Po oczyszczeniu DNA próbki należy umieścić na 1%agros, żelu DNA o napięciu 100 woltów przez 45 minut w celu wizualizacji. Następnie badanie, metylowane i niemetylowane plazmidy do podwójnego trawienia z odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi przez noc, aby uwolnić pełną długość wektora Luke'a i fragmenty wyspy CPG.

Ciepło dezaktywuje enzymy po trawieniu. Uruchom podwójnie strawione próbki na 1% żelu agros o napięciu 100 woltów przez jedną godzinę, aby oddzielić wektor i wstaw, a następnie podczas noszenia ochrony przed światłem UV, umieścić żel na czarnym świetle i za pomocą czystych ostrzy chirurgicznych, wyciąć metylowane i niemetylowane wkładki po ekstrakcji żelu DNA zgodnie z protokołem tekstowym, użyj ligazy DNA T cztery i stosunku wektora do czterech do wstawki, aby zdegradować metylowane i niemetylowane wstawki do niemetylowanego wektora. Inkubować w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub na lodzie przez noc po podwiązaniu.

Oczyść DNA i zweryfikuj ponowną ligację, przeprowadzając próbki na żelu 1% DNA aros i oceń stężenie ponownie zligowanych komórek plazmidowych CD 54 na 12-dołkowej płytce przy 140 000 komórek na dołek. 24 godziny później. Użyj komercyjnego odczynnika do transfekcji do transfekcji komórek o równych stężeniach niemetylowanej pętli CPG, dwóch plazmidów plus RAN, wanilii lub innego kontrolnego wektora ferous lub metylowanego c pg, Luke'a, dwóch plazmidów plus ELLA lub innego wektora lucyferów kontrolnych: Pozwól komórkom na transfekcję przez 24 godziny przed wykonaniem testu lucyferów.

Zgodnie z instrukcjami producenta użyj luminometru, aby odczytać każdą studzienkę w trzech egzemplarzach. Oblicz stosunek aktywności lucyferów świetlików do run, wanilii lub innej kontroli. Aktywność Lucyferów.

Normalizuj aktywność lucyferazy kontrolnej metylowanej świetlika do aktywności lucyferazy kontrolnej niemetylowanej, dzieląc aktywność metylowaną przez aktywność lucyferazy metylowanej. Jak wykazano tutaj, wzbogaconą populację astrocytów pozyskano poprzez faksowe sortowanie transgenicznych zwierząt transgenicznych E-G-F-P-S 100. Populacja bramkowana była ukierunkowana na rozproszenie do przodu i na boki, a populację żywych komórek określono za pomocą wskaźnika martwych komórek bromkowych i bramkowania pokazanych tutaj są reprezentatywne obrazy astrocytów EGFP dodatnich po dysocjacji, ale przed sortowaniem, a także po sortowaniu, rysunek ten pokazuje izolowaną populację komórek EGFP, która wykazała 40-krotny wzrost mRNA dla markera specyficznego dla astrocytów.

LDH, jeden L, jeden. Ponadto, pomimo wspólnej ekspresji S 100 beta i NG dwóch dodatnich OPC i astrocytów, zaobserwowano czterokrotne zmniejszenie NG two mRNA, markera dla komórek prekursorowych oligodendrocytów, co wskazuje na izolację wzbogaconej populacji komórek astrocytowych. Poniższa tabela zawiera listę całkowitego RNA i DNA, wyizolowanych z różnych grup wiekowych i liczby zwierząt, i jest wymieniona jako odniesienie dla oczekiwanej wydajności cząsteczek molekularnych zgodnie z faktami.

Wreszcie, test podwójnych lucyferów został wykorzystany do oceny aktywności transkrypcyjnej hipermetylowanych regionów genu będącego przedmiotem zainteresowania po przeniesieniu metylowanej wstawki do wektora niemetylowanego. Do weryfikacji statusu metylacji plazmidu użyto HPA dwa, który trawi tylko niemetylowane DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować wzbogaconą populację astrocytów przy użyciu faktów, a także jak zmierzyć metylację DNA genu i skorelować zmiany w metylacji DNA promotora z aktywnością transkrypcyjną za pomocą wrażliwej na metylację analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości i testu lucyferazy.