Name: Bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji drogi słuchowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniej wizualizacji grzbietowego jądra ślimaka u myszy w celu optogenetycznej stymulacji drogi słuchowej. Technika umożliwia precyzyjny dostęp chirurgiczny do jądra ślimaka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie: Ta praca była wspierana przez grant Fundacji Bertarelli (D.J.L), grant MED-EL (D.J.L) oraz DC01089 National Institutes of Health Grants (M.C.B.).

UWAGA: Wszystkie procedury eksperymentalne są wykonywane zgodnie z Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Massachusetts Eye and Ear Infirmary i Harvard Medical School, które są zgodne z krajowymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami, w tym z Polityką Publicznej Służby Zdrowia dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, Przewodnikiem ILAR oraz Ustawą o dobrostanie zwierząt. Procedury eksperymentalne wymienione poniżej szczegółowo opisują narażenie lewego DCN. Używaj sterylnych narzędzi podczas wykonywania operacji przetrwania.
1. Pierwotna kraniotomia i odsłonięcie grzbietowego jądra ślimaka
<ol>
	<li>znieczulenie
	<ol>
		<li>Znieczulić mysz w wieku 8–12 tygodni o masie ciała 18–24 g ksylazyną w dawce 20 mg/kg i ketaminą w dawce 100 mg/kg dootrzewnowej. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, monitorując tętno, częstość oddechów, a także odruch wycofania się z palca u nogi. Umieść maść weterynaryjną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Po odpowiednim znieczuleniu należy ogolić włosy leżące nad skórą głowy, aby zapewnić niezakłócony dostęp do pola operacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozycjonowanie chirurgiczne
	<ol>
		<li>Umieść mysz bezpiecznie w uchwycie stereotaktycznym dla małych zwierząt, przytrzymywanym na miejscu przez zacisk pyska.</li>
		<li>Upewnij się, że zacisk pyska jest wystarczająco luźny, aby umożliwić odpowiednie oddychanie, ale wystarczająco ciasny, aby całkowicie unieruchomić głowę myszy. Jeśli głowa myszy jest luźna, zwierzę prawdopodobnie wypadnie z uchwytu głowy podczas części zabiegu kraniotomii.</li>
		<li>Elektrody implantu słuchowego pnia mózgu należy umieścić w standardowy sposób, co pozwala na monitorowanie tętna. Częstość oddechów powinna być monitorowana za pomocą wizualizacji. Należy pamiętać, że normalne tętno i częstość oddechów będą się różnić w zależności od wieku myszy.</li>
		<li>Umieszcza się termometr, a eutermię zapewnia się poprzez umieszczenie na homeotermicznym kocu grzewczym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nacięcie skóry i odsłonięcie kości międzyciemieniowej i potylicznej czaszki
	<ol>
		<li>Pod mikroskopem wykonaj pionowe nacięcie przez skórę, zaczynając od linii środkowej, bezpośrednio między małżowiną uszną i rozciągając się do ogonowej części potylicy. Po nacięciu skóry w linii środkowej przemieszcz skórę na boki. Wizualizuj mięśnie pokrywające lewą tylną część czaszki.</li>
		<li>Usuń mięsień pokrywający lewe kości ciemieniowe, międzyciemieniowe i potyliczne czaszki poprzez rozczłonkowanie przyczepów mięśniowych do odpowiednich kości za pomocą skalpela lub nożyczek do tęczówki. Obserwuj niewielki stopień krwawienia wzdłuż przeciętych krawędzi mięśni. Zminimalizuj to poprzez delikatny nacisk aplikatorem z bawełnianą końcówką przez 10-15 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kraniotomia pokrywająca jądro ślimakowe
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj odpowiednie linie szwów, w tym linie szwów strzałkowych i lambda (Rysunek 1, lewy panel).</li>
		<li>Za pomocą rongeurs wykonaj kraniotomię nad kością międzyciemieniową, na lewo od linii środkowej, ~2 mm ogonowo do linii szwu lambda. Ten region leży nad DCN.</li>
		<li>Po kraniotomii obserwuj cienką warstwę opony twardej, która pokrywa móżdżek. Za pomocą ostrza skalpela usuń oponę twardą. (Rysunek 1, Panel środkowy). 
		UWAGA: Usunięcie opony twardej może spowodować niewielki stopień krwawienia. Ten proces użycia ostrza skalpela do usunięcia opony twardej ma na celu zmniejszenie ilości utraty krwi podczas aspiracji móżdżku, która gromadzi się na powierzchni pnia mózgu i uniemożliwia identyfikację DCN. Całkowita objętość krwi myszy wynosi ~1,5 ml nie powinna przekraczać > niż 15%. Jeśli krwawienie przekroczy tę ilość, mysz powinna otrzymać suplementację płynów. </li>
		<li>Usuń zakrzepłą krew pokrywającą móżdżek za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Opcjonalnie delikatnie wlej sól fizjologiczną za pomocą punktu dentystycznego na móżdżek, aby usunąć krew z krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>aspiracja móżdżku
	<ol>
		<li>Używając ssania francuskiego 5, odessaj najbardziej boczną część lewego móżdżku leżącą nad DCN, aż DCN stanie się wizualny (ryc. 1, prawy panel). Usuń około 1/4 do 1/3 lewego móżdżku. Głównym punktem orientacyjnym przylegającym do DCN jest bańka kanału półkolistego górnego. 
		UWAGA: Aspiracja móżdżku jest kluczowym krokiem protokołu. Ukierunkowana aspiracja móżdżku jest najskuteczniejsza do wykonania, jeśli nastąpi jednorazowo, a nie przy wielu przejściach ssania, ponieważ spowoduje to krwawienie. Aby pomóc w aspiracji, ustaw płaszczyznę ogniskową mikroskopu na oczekiwanej głębokości CN, która będzie nieco dystalna do powierzchni móżdżku. Ustawienie płaszczyzny ogniskowej na CN poprawi wizualizację i zapewni ostry obraz.</li>
		<li>Po aspiracji spodziewane jest dalsze krwawienie, nagromadzenie płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i przemieszczenie móżdżku na DCN. Szybko wkropl 0,5 ml sterylnej soli fizjologicznej do kraniotomii, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Połączenie delikatnego wklepywania z punktem dentystycznym i ssaniem może być następnie wykorzystane do oczyszczenia ścieżki do bezpośredniej wizualizacji DCN. Nie dotykaj bezpośrednio powierzchni DCN.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja ciśnieniowa do transferu genów za pośrednictwem wirusa i chirurgicznej rekonwalescencji
<ol>
	<li>Po tym, jak DCN jest wolny od krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego i jest wyraźnie widoczny, należy wykonać mikroiniekcje ciśnieniowe do DCN za pomocą 10 μl strzykawki Hamiltona przez okres 2 minut.</li>
	<li>Wprowadzić igłę za pomocą mikromanipulatora, aż końcówka przestanie być widoczna pod powierzchnią DCN.</li>
	<li>Aby uzyskać optymalną wydajność, użyj igły o rozmiarze 33 lub 34 (użyj gazoszczelnej strzykawki z igłą o rozmiarze 34) z płytkim skosem, takim jak 45°, aby zminimalizować uraz i zlokalizować objętość wstrzyknięcia w DCN, który jest cienką i płytką strukturą pnia mózgu (<300 μm grubości). 
	UWAGA: Można stosować inne instrumenty do mikroiniekcji. Idealnie byłoby, gdyby przyrząd do iniekcji był elastyczny, aby umożliwić lekkie zgięcie, w razie potrzeby, aby bezpośrednio celować w DCN. Ponadto, ponieważ mysz porusza się nieznacznie przez cały zabieg z powodu oddychania, instrument powinien być wystarczająco wytrzymały, aby wytrzymać niewielkie ruchy.</li>
</ol>
3. Rekonwalescencja chirurgiczna
<ol>
	<li>Natychmiast po wstrzyknięciu należy ponownie wykonać zbliżenie skóry i pozwolić myszy dojść do siebie zgodnie ze standardową procedurą odzyskiwania. Pozostały móżdżek i tkanka bliznowata wypełnią ubytek spowodowany aspiracją móżdżku. Stale monitoruj zwierzęta, aż do odzyskania wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Monitoruj tętno, częstość oddechów, a także zdolność do karmienia. 
	UWAGA: Żadne zwierzę, które przeszło operację, nie wraca do klatki z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.</li>
	<li>Jeśli mysz zacznie chodzić w kółko po operacji (<5% przypadków), zwykle 2-4 godziny po zamknięciu nacięcia skóry, natychmiast poświęć mysz, ponieważ prawdopodobnie miałaby trudności z karmieniem. Ten efekt uboczny jest prawdopodobnie spowodowany aspiracją móżdżku. Zwierzę powinno być monitorowane pod kątem bólu pooperacyjnego i należy podać odpowiednie środki odurzające, aby zapewnić zwierzęciu komfort w oparciu o standardy instytucjonalne. Antybiotyki mogą być konieczne, jeśli istnieją dowody na infekcję.</li>
</ol>
4. Wtórna kraniotomia i ekspozycja jądra ślimakowego
<ol>
	<li>Po 2-4 tygodniach gojenia i inkubacji transferu genów za pośrednictwem wirusa, ponownie znieczulij wcześniej wstrzykniętą mysz i powtórz krok 1.1-1.5 Optymalny czas inkubacji różni się w zależności od rodzaju przenoszonego genu.</li>
	<li>Usuń tkankę bliznowatą w miejscu kraniotomii za pomocą pęsety, skalpela i rongeurs.</li>
	<li>Po wizualizacji kraniotomii zidentyfikuj kombinację pozostałej tkanki móżdżku i blizny pokrywającej DCN. Użyj 5-stopniowego ssania francuskiego, aby odessać leżącą nad móżdżkiem / tkankę bliznowatą (podobnie jak w poprzedniej aspiracji móżdżku).</li>
	<li>Po aspiracji spodziewaj się dalszego krwawienia, nagromadzenia płynu mózgowo-rdzeniowego i pozostałych fragmentów móżdżku. Szybko wprowadź sól fizjologiczną do kraniotomii, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Użyj kombinacji delikatnego wklepywania i ssania w miejscu dentystycznym, aby oczyścić ścieżkę do bezpośredniej wizualizacji DCN.</li>
	<li>Obserwuj powierzchnię DCN. Wykonuj eksperymenty fizjologiczne oparte na optogenetyce, ponieważ DCN jest teraz dostępny. Wprowadź bodziec świetlny, na przykład za pomocą światłowodu (ryc. 2), aby przeprowadzić eksperyment oparty na optogenetyce.</li>
</ol>
5. Histologia
<ol>
	<li>Po zakończeniu eksperymentów poddaj mysz eutanazji za pomocą przedawkowania ketaminy. Ukrwić mysz zwykłą solą fizjologiczną, a następnie 4% paraformaldehydem.</li>
	<li>Usuń pień mózgu z czaszki i kontynuuj leczenie przez 2 godziny. Krioprotekcja pnia mózgu w 30% sacharozie przez 24-48 godzin. Przekrój pnia mózgu za pomocą standardowego kriostatu przy użyciu skrawków 60 μm.</li>
</ol>

<ol><li>Lalwani, A., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy.</a> Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).</li>
<li>Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+issues+in+cochlear+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Current issues in cochlear gene transfer.</a> Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).</li>
<li>Jero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+delivery+through+an+intact+round+window+membrane+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).</li>
<li>Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+microinjection+and+its+effects+upon+auditory+function+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).</li>
<li>Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vivo+gene+therapy+for+hearing+disorders%3A+introduction+of+adeno-associated+virus+into+the+cochlea+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig.</a> Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).</li>
<li>Wareing, M., Lalwani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy%3A+current+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy: current perspectives.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+expression+in+the+guinea+pig+cochlea+mediated+by+a+lentivirus-derived+gene+transfer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector.</a> Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+dopaminergic+modulation+of+the+multiple+phases+of+reward-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior.</a> J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+mimicry+of+the+transient+activation+of+dopamine+neurons+by+natural+reward+is+sufficient+for+operant+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement.</a> PloS One. 7 (4), e33612(2012).</li>
<li>Britt, J., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogations+of+the+neural+circuits+underlying+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).</li>
<li>Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+c1+and+retrotrapezoid+nucleus+neurons+causes+sleep+state-dependent+cardiorespiratory+stimulation+and+arousal+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats.</a> Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).</li>
<li>Carter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).</li>
<li>Darrow, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+central+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of central auditory neurons.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).</li>
<li>Shimano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+AAV-mediated+expression+of+channelrhodopsin-2+and+halorhodopsin+in+brainstem+neurons+mediating+auditory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling.</a> Brain Res. 1511, 138-152 (2013).</li>
<li>Doucet, J., Ryugo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+ventral+cochlear+nucleus+to+the+dorsal+cochlear+nucleus+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats.</a> J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).</li>
<li>Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commissural+axons+of+the+mouse+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Commissural axons of the mouse cochlear nucleus.</a> J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).</li>
<li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+responses+to+electric+and+infrared+neural+stimulation+of+the+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus.</a> Hear Res. 310, 69-75 (2014).</li>
<li>Taberner, A. M., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+properties+of+single+auditory+nerve+fibers+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse.</a> J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).</li>
<li>Rolls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+disruption+of+sleep+continuity+impairs+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).</li>
<li>Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttraining+optogenetic+manipulations+of+basolateral+amygdala+activity+modulate+consolidation+of+inhibitory+avoidance+memory+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).</li>
<li>Stortkuhl, K., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smell+of+Blue+Light%3A+A+New+Approach+toward+Understanding+an+Olfactory+Neuronal+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network.</a> Front Neurosci. 5 (72), (2011).</li>
<li>Hira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+optogenetic+stimulation+for+functional+mapping+of+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex.</a> J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).</li>
<li>Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+light-based+mapping+of+motor+cortex+by+photoactivation+of+channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).</li>
<li>Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano technikę bezpośredniej wizualizacji DCN w modelu mysim do manipulacji centralnym układem słuchowym. Zarysowane podejście do bezpośredniej wizualizacji zapewnia znaczące zalety w porównaniu z główną alternatywą, jaką są podejścia stereotaktyczne. Przede wszystkim bezpośrednia wizualizacja DCN pozwala na natychmiastowe potwierdzenie lokalizacji pnia mózgu, podczas gdy podejścia stereotaktyczne nie pozwalają na bezpośrednią wizualizację. W eksperymentach, które wymagają wydłużonych okresów inkubacji, jak ...

Transfer genów za pośrednictwem wirusa w celu odwrócenia utraty słuchu w dużej mierze skupiał się na obwodowym układzie słuchowym. 1 Ukierunkowawszy się na ślimak, badacze zbadali wiele dróg dostarczania, w tym infuzję minipompy osmotycznej2, piankę żelową®nasączoną kompleksem wektorowo-transgenową 2 lub gąbkę żelatynową3, bezpośrednie mikroiniekcję4; liczne wektory transferu genów, w tym wektory wirusowe związane z adenowirusem5,6, wektory lentiwirusowe7 i liposomy kationowe2; oraz rozprzestrzenianie się wektorów transferu genów poza tkankę docelową2. Ostatnio wirus związany z adenowirusem (AAV)-1 został wprowadzony do ślimaka w celu leczenia głuchoty u myszy z powodu utraty pęcherzykowego transportera glutaminianu-3. 8 Ponadto niedawno opisano zastosowanie optogenetyki w obwodowym układzie słuchowym. 9
Niewiele badań dotyczyło transferu genów do centralnego układu słuchowego. Grzbietowe jądro ślimakowe (DCN) pnia mózgu zawiera neurony drugiego rzędu ścieżki słuchowej. Podczas gdy techniki transferu genów w jądrze ślimakowym (CN) mogą być wykorzystywane do wielu badań, transfer genów opsyn, białek wrażliwych na światło, do DCN może być również wykorzystany do umożliwienia technik eksperymentalnych opartych na optogenetyce. Po dostarczeniu opsyny, takiej jak rodopsyna kanałowa-2 (ChR2), za pośrednictwem wirusa, neurony DCN stają się wrażliwe na bodźce świetlne. Optogenetyczny transfer genów był wcześniej próbowany w kilku regionach pnia mózgu, w tym w jądrze retrotrapezoidalnym szczura, miejscu sinawym myszy, wzgórku górnym małpy i brzusznym obszarze nakrywki myszy. 10-14
Ostatnio, badacze badali zastosowanie optogenetyki w DCN. 15,16 DCN to miejsce, w którym umieszcza się implanty słuchowe pnia mózgu u ludzi, co czyni go atrakcyjną częścią układu słuchowego do badań translacyjnych nad neuroprotezami słuchowymi. Jednak biorąc pod uwagę lokalizację DCN, ekspozycja chirurgiczna jest trudna. Technika opisana w niniejszym dokumencie zapewnia protokół maksymalnej ekspozycji DCN poprzez podejście tylnego dołu, aby umożliwić transfer genów wektora wirusowego i eksperymenty oparte na optogenetyce w modelu mysim. W poprzednich badaniach stosowano stereotaktyczne mikrowstrzyknięcie do DCN z rodopsyną kanałową-2. 16 Iniekcje stereotaktyczne są jednak potencjalnie mniej dokładne niż zastrzyki wykonane przez bezpośrednią wizualizację, zwłaszcza w jądrze tak małym i głębokim wzdłuż pnia mózgu, jak DCN. Transgeniczne myszy wykazujące ekspresję białek specyficznych tkankowo w CN są również atrakcyjną opcją i eliminują potrzebę transferu genów. Nasz protokół ekspozycji na DCN działałby również u myszy transgenicznych, ponieważ DCN musiałby być bezpośrednio wystawiony na stymulację optyczną. Ta technika chirurgicznego narażenia DCN została zaadaptowana z poprzednich protokołów obejmujących zapisy z nerwu słuchowego i jądra ślimaka w modelach myszy i szczurów. 15,17-20
Ogólnym celem protokołu jest zapewnienie bezpośredniej ekspozycji na CN, aby umożliwić techniki transferu genów. Mówiąc dokładniej, podejście to jest kompatybilne zarówno z chirurgią ostrą, jak i z chirurgią przetrwania, a przygotowanie można powtórzyć u tego samego zwierzęcia w celu przeprowadzenia kolejnych badań neurofizjologicznych. Bezpośrednia ekspozycja protokołu DCN ma implikacje dla eksperymentów opartych na transferze genów za pośrednictwem optogenetyki i wirusa w innych jądrach pnia mózgu.

<table><tbody><tr><td>Uchwyt stereotaktyczny</td><td>Stoelting</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Koc homeotermiczny</td><td>Harvard</td><td>507214</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela #11</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>5 Francuskie ssanie</td><td>Symetria Punkty chirurgiczne</td><td>2777914</td><td></td></tr><tr><td>dentystyczne</td><td>Henry Schein</td><td>100-8170</td><td></td></tr><tr><td>Bone rongeur</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; l Strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>Miernik 34, igła</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td>207434</tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>16021-14</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji drogi słuchowej

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Badanie nad wykorzystaniem transferu genów za pośrednictwem wirusa w celu zatrzymania lub odwrócenia utraty słuchu zostało w dużej mierze zdegradowane do peryferyjnego układu słuchowego. Niewiele badań dotyczyło transferu genów do centralnego układu słuchowego. Grzbietowe jądro ślimakowe (DCN) pnia mózgu, które zawiera neurony drugiego rzędu ścieżki słuchowej, jest potencjalnym miejscem transferu genów. W tym protokole zademonstrowano technikę bezpośredniego i maksymalnego narażenia mysiego DCN za pomocą dostępu do tylnego dołu. Takie podejście pozwala na operację ostrą lub przeżycie. Po bezpośredniej wizualizacji DCN możliwe jest przeprowadzenie wielu eksperymentów, w tym wstrzyknięcia opsyn do jądra ślimaka, a następnie stymulacji za pomocą światłowodu sprzężonego z laserem światła niebieskiego. Inne eksperymenty neurofizjologiczne, takie jak stymulacja elektryczna i śledzenie iniekcji neuronalnych, są również wykonalne. Możliwy do osiągnięcia poziom wizualizacji i czas trwania stymulacji sprawiają, że podejście to można zastosować w szerokim zakresie eksperymentów.

Częściowa aspiracja móżdżku umożliwia dostęp do jądra ślimakowego
Po usunięciu skóry i mięśni pokrywających czaszkę, punkty orientacyjne powierzchni czaszki, takie jak linie szwów wieńcowego i lambdowego, wskazują przybliżoną lokalizację kraniotomii. Po wykonaniu kraniotomii kleszczykami kostnymi widoczny jest móżdżek. Ostrożna aspiracja niewielkiej części móżdżku pozwala na uwidocznienie CN, w który następnie można wstrzyknąć substancję (Rycina 1).
<p class="jove...

Celem tego protokołu jest nakreślenie podejścia chirurgicznego, które zapewni bezpośredni dostęp do grzbietowego jądra ślimaka w modelu mysim.

Bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji drogi słuchowej

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Ogólnym celem tej procedury jest chirurgiczny dostęp do jądra ślimakowego w modelu mysim w celu umożliwienia przeprowadzenia eksperymentów opartych na optogenetyce. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie myszy do kraniotomii oraz boczny odsunięcie skóry, tkanek miękkich i mięśni pokrywających skórę głowy. W drugim kroku wykonuje się kraniotomię w lewej części kości ciemieniowej, około dwóch milimetrów bocznie od linii szwu lambda.Obszar ten znajduje się nad jądrem ślimakowym. Następnie, używając rurki ssącej o rozmiarze 5 French, odessaj najbardziej boczny fragment lewego móżdżku nadkrywający DCN. W wyniku tego zabiegu uzyskano niezakłócony widok na DCN.Główne zalety tej techniki w porównaniu z metodami wspomagającymi, takimi jak naprowadzanie stereotaktyczne, polegają na możliwości bezpośredniej wizualizacji jąder ślimakowych oraz umieszczenia stymulatora neuronów, takiego jak źródło światła lub macierz elektrod, na powierzchni pnia mózgu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny optogenetyki oraz słuchu. Żadna proteza, w przeciwieństwie do transferu genów, nie pozwala na stymulację pnia mózgu słuchowego światłem z wystarczającą rozdzielczością przestrzenną i czasową.Po znieczuleniu myszy ketaminą i ksylazyną podanymi drogą doszpikową, należy sprawdzić odruch wycofania łapy po uciśnięciu palca oraz monitorować częstość akcji serca i oddechów, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie. Następnie należy nanieść maść weterynaryjną na oba oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu. W kolejnym kroku należy ogolić sierść z powierzchni czaszki, aby zapewnić niezakłócony dostęp do miejsca operacyjnego.Następnie umieść mysz w stereotaktycznym uchwycie dla małych zwierząt. Dostosuj zacisk pyszczka tak, aby był on wystarczająco luźny, by umożliwić prawidłowe oddychanie, ale jednocześnie na tyle ciasny, aby całkowicie unieruchomić głowę myszy. Pod mikroskopem wykonaj pionowe nacięcie skóry, zaczynając od linii środkowej bezpośrednio między małżowinami usznymi i prowadząc je w stronę bocznej części potylicy.Następnie odsunąć skórę bocznie. Usunąć mięśnie pokrywające lewą kość ciemieniową, obszar międzyciemieniowy oraz kość potyliczną czaszki za pomocą skalpela lub nożyc irydologicznych. W międzyczasie zminimalizować krwawienie, przykładając delikatny nacisk za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem przez 10 do 15 sekund.Następnie należy zidentyfikować linie szwów strzałkowego i lambda. Za pomocą kleszczy Ron jewels wykonaj kraniotomię w lewej kości ciemieniowej, około dwóch milimetrów od linii szwu lambda.Obszar ten znajduje się nad DCN po kraniotomii. Należy uważnie zlokalizować cienką warstwę opony twardej pokrywającej móżdżek, a następnie usunąć ją za pomocą ostrza skalpela. Ściętą krew należy usunąć za pomocą patyczków bawełnianych lub delikatnie okroplić móżdżek solą fizjologiczną, aby oczyścić go z krwi.Następnie użyj rurki ssącej o rozmiarze 5 French, aby odessać najbardziej boczny fragment lewego móżdżku, znajdujący się nad DCN, w celu ułatwienia dostępu. Podczas aspiracji ustaw płaszczyznę ogniskowania mikroskopu na spodziewanej głębokości jądra ślimakowego, aby poprawić wizualizację i zapewnić ostry obraz. Usuń około jednej czwartej do jednej trzeciej lewego móżdżku.Głównym punktem orientacyjnym sąsiadującym z DCN jest AM górnego kanału półkolistego. Po aspiracji wystąpi dalsze krwawienie, gromadzenie się płynu mózgowo-rdzeniowego oraz przemieszczenie móżdżku na DCN; należy szybko wstrzyknąć sól fizjologiczną do otworu trepanacyjnego, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Należy zastosować kombinację delikatnego przykładania zgłębnika stomatologicznego i ssania, aby udrożnić drogę do bezpośredniej wizualizacji DCN.Gdy jądro zstępujące (DCN) będzie wyraźnie widoczne i wolne od nadkładającej krwi oraz płynu mózgowo-rdzeniowego, należy wykonać mikrowtrysk wektora pod ciśnieniem za pomocą szczelnej strzykawki Hamiltona o pojemności 5 µL. Należy użyć igły o rozmiarze 34 G z płytkim szlifem, aby zminimalizować uraz mechaniczny i zlokalizować objętość wstrzykniętej substancji w obrębie DCN. Następnie należy powoli wprowadzać igłę za pomocą mikromanipulatora, aż jej końcówka przestanie być widoczna na powierzchni DCN.Rozpocznij wstrzykiwanie 1,5 µl wektora. Po zakończeniu tej czynności powoli wycofaj igłę, a następnie zbliż do siebie brzegi skóry i pozwól myszy dojść do siebie zgodnie ze standardową procedurą rekonwalescencji. Po dwóch do czterech tygodniach gojenia i inkubacji w celu wirusowego transferu genów, ponownie zpodaj myszy z wstrzykniętym wektorem znieczulenie, a następnie usuń tkankę bliznowatą znad miejsca kraniotomii.Następnie należy zidentyfikować obszar pozostałego móżdżku i tkanki bliznowatej pokrywającej DCN. Do aspiracji nadległego móżdżku i tkanki bliznowatej należy użyć ssaka o rozmiarze 5 French. Po aspiracji.Szybko wprowadź sól fizjologiczną do otworu trepanacyjnego. Aby zapobiec gromadzeniu się krwi, zastosuj kombinację delikatnego przykładania punktowego oraz ssania, aby oczyścić drogę do bezpośredniej wizualizacji DCN. DCN jest teraz dostępny do eksperymentów fizjologicznych opartych na optogenetyce. Przedstawione tutaj jest umieszczenie włókna laserowego bezpośrednio na powierzchni DCN, co pozwala na stymulację optyczną zainfekowanych opsyną neuronów DCNA. Seria impulsów niebieskiego światła na powierzchni zainfekowanego DCN skutkuje optycznie wywołaną odpowiedzią pnia mózgu na bodźce słuchowe.Przy użyciu mikromanipulatora światłowód sprzężony z laserem emitującym niebieskie światło zostaje umieszczony bezpośrednio na powierzchni jądra ślimakowego, a następnie włączony. W tym miejscu można zidentyfikować impulsowe niebieskie światło na powierzchni jądra ślimakowego. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak elektryczna stymulacja jądra, co pozwala na bezpośrednie porównanie odpowiedzi neuronalnych wywołanych nie tylko akustycznie, ale także elektrycznie, z odpowiedziami wywołanymi stymulacją optyczną.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat przygotowania i przeprowadzenia kraniotomii oraz aspiracji móżdżku, których nadrzędnym celem jest bezpośrednia wizualizacja i dostęp do jądra ślimakowego.

direct-visualization-murine-dorsal-cochlear-nucleus-for-optogenetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Bezpośrednia wizualizacja grzbietowego jądra słuchowego myszy w celu optogenetycznej stymulacji drogi słuchowej

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Źródło: Kozin, E. D., et.al. Bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji szlaku słuchowego. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje transfer genów za pośrednictwem wirusa do grzbietowego jądra ślimakowego myszy (DCN) w celu umożliwienia stymulacji słuchowej wywołanej światłem. Wektor wirusowy kodujący opsynę, światłoczuły kanał jonowy, jest wstrzykiwany do DCN po kraniotomii i aspiracji móżdżku w celu uzyskania bezpośredniego dostępu. Ekspresja...

Transfer genów za pośrednictwem wirusa do grzbietowego jądra ślimaka myszy w celu stymulacji słuchowej wywołanej światłem

Ten film pokazuje proces przygotowywania wycinków mózgu w kształcie klina w warunkach laboratoryjnych. Za pomocą wibratomu wytwarzany jest plasterek w kształcie klina z mózgu myszy o różnej grubości. Ten wycinek zawiera korzeń nerwu słuchowego umieszczony na grubszym końcu, podczas gdy neurony związane ze słuchem znajdują się na cieńszym końcu.

Przygotowanie klinowych wycinków mózgu do wizualizacji neuronów słuchowych

Ten film demonstruje protokół stymulacji korzenia nerwu słuchowego i rejestrowania prądów postsynaptycznych w przyśrodkowych neuronach olivocochlear w wycinkach klina mózgu myszy.

Stymulacja korzeni nerwów słuchowych i nagrania prądu postsynaptycznego w klinie mózgu myszy

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Tutaj opisujemy naszą strategię uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych pojedynczych nagrań jednostkowych ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Neurony wyrażające ChR2 są identyfikowane na podstawie ich reakcji na niebieskie światło. Metoda wykorzystuje standardowy zewnątrzkomórkowy sprzęt rejestrujący i służy jako niedroga alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania.

Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

Implanty ślimakowe (CI) umożliwiają słyszenie poprzez bezpośrednią stymulację elektryczną nerwu słuchowego. Jednak słaba rozdzielczość częstotliwości i intensywności ogranicza jakość słyszenia w przypadku implantów ślimakowych. W tym miejscu opisujemy optogenetyczną stymulację nerwu słuchowego u myszy jako alternatywną strategię badań słuchowych i rozwoju przyszłych implantów ślimakowych.

Optogenetyczna stymulacja nerwu słuchowego

Integracja różnych wejść synaptycznych do neuronów jest najlepiej mierzona w preparacie, który zachowuje wszystkie jądra presynaptyczne dla naturalnego wyczucia czasu i plastyczności obwodów, ale wycinki mózgu zazwyczaj zrywają wiele połączeń. Opracowaliśmy zmodyfikowany wycinek mózgu, aby naśladować aktywność obwodów in vivo, zachowując jednocześnie możliwość eksperymentowania in vitro.

Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo

Obecny protokół opisuje, jak korzystać z bezprzewodowej optogenetyki w połączeniu z szybką wideografią w jednym zadaniu typu "sięgnij do uchwytu" w celu scharakteryzowania obwodów neuronowych zaangażowanych w realizację umiejętnego zachowania motorycznego u swobodnie poruszających się myszy.

In vivo (in vivo) Bezprzewodowa kontrola optogenetyczna wykwalifikowanych zachowań motorycznych

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Poznaj metodę bezpośredniej wizualizacji grzbietowego jądra ślimaka u myszy w celu optogenetycznej stymulacji drogi słuchowej. Technika umożliwia precyzyjny dostęp chirurgiczny do jądra ślimaka.

Bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji drogi słuchowej

Przeglądaj więcej filmów