Bezpośrednia wizualizacja mysiego grzbietowego jądra ślimaka w celu optogenetycznej stymulacji drogi słuchowej

Ogólnym celem tej procedury jest chirurgiczny dostęp do jądra ślimakowego w modelu mysim, aby umożliwić eksperymenty oparte na optogenetyce. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie myszy do kraniotomii i cofnięcie skóry, tkanek miękkich i mięśni pokrywających boczną skórę głowy. W drugim kroku wykonuje się kraniotomię na lewej kości międzyciemieniowej, około dwóch milimetrów od linii szwu lambda.

Obszar ten pokrywa jądro ślimaka. Następnie, za pomocą pięciofrancuskiej rurki ssącej, zaaspiruj boczną najbardziej boczną część lewego móżdżku leżącą nad DCN. Wynik pokazuje niezakłócony widok DCN.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami wspomagającymi, takimi jak sterowanie stereotaktyczne, jest zarówno uzyskanie bezpośredniej wizualizacji jądra ślimaka, jak i umieszczenie symulatora nerwicy, takiego jak źródło światła lub matryca elektrod na powierzchni pnia mózgu. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania zarówno z zakresu optogenetyki, jak i słuchu. Żadna proteza, taka jak transfer genów, nie umożliwia stymulacji słuchowego pnia mózgu światłem z wystarczającą rozdzielczością twarzy i skroniowej.

Po znieczuleniu myszy ketaminą i ksylazyną po podaniu dootrzewnowym, sprawdź odruch wycofania palca u nogi i monitoruj jego tętno i częstość oddechów, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie. Następnie nałóż maść weterynaryjną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie ogol włosy leżące nad skórą głowy, aby zapewnić niezakłócony dostęp do pola operacyjnego.

Następnie umieść mysz w uchwycie stereotaktycznym dla małych zwierząt. Wyreguluj zacisk pyska tak, aby był wystarczająco luźny, aby umożliwić odpowiednie oddychanie, ale wystarczająco ciasny, aby całkowicie unieruchomić głowę myszy. Pod mikroskopem wykonaj pionowe nacięcie przez skórę, zaczynając od linii środkowej bezpośrednio między małżowiną uszną i rozciągając się do rozpieszczonej części potylicy.

Następnie przesuń skórę na boki. Usuń mięśnie leżące nad lewą kością ciemieniową, międzyciemieniową i potyliczną czaszki za pomocą skalpela lub nożyczek do tęczówki. W międzyczasie zminimalizuj krwawienie, delikatnie uciskając aplikatorem z bawełnianą końcówką przez 10 do 15 sekund.

Następnie zidentyfikuj linie szwów strzałkowych i lambda. Za pomocą pary klejnotów Ron. Wykonaj kraniotomię na lewej kości międzyciemieniowej około dwóch milimetrów przystaw do linii szwu lambda.

Region ten pokrywa DCN po kraniotomii. Należy obserwować cienką warstwę opony twardej, która pokrywa móżdżek, ostrożnie ją usunąć za pomocą ostrza skalpela. Usuń zakrzepłą krew za pomocą bawełnianych końcówek lub delikatnie wlej sól fizjologiczną na móżdżek, aby usunąć krew.

Następnie użyj pięciofrancuskiej rurki ssącej, aby zassać boczną część lewego móżdżku, nakładając go na DCN, aby pomóc. W aspiracji ustaw płaszczyznę ogniskową mikroskopu na oczekiwanej głębokości jądra ślimaka, aby poprawić wizualizację i zapewnić ostry obraz. Usuń około jednej czwartej do jednej trzeciej lewego móżdżku.

Głównym punktem orientacyjnym przylegającym do DCN jest AM górnego półkolistego kanału. Po aspiracji pojawi się dalsze krwawienie, nagromadzenie płynu mózgowo-rdzeniowego i przemieszczenie móżdżku na DCN, szybko wkroplić sól fizjologiczną do kraniotomii, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Użyj kombinacji delikatnego wklepywania z punktem dentystycznym i ssaniem, aby oczyścić ścieżkę do bezpośredniej wizualizacji DCN.

Po tym, jak DCN jest wyraźnie widoczny i wolny od leżącej na nim krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego, wykonaj mikrowstrzyknięcie wektora pod ciśnieniem za pomocą pięciomikrolitrowej gazoszczelnej strzykawki Hamiltona. Użyj igły o rozmiarze 34 z płytkim skosem, aby zminimalizować uraz i zlokalizować objętość wstrzyknięcia w DCN. Następnie powoli wprowadzaj igłę za pomocą mikromanipulatora, aż końcówka przestanie być widoczna pod powierzchnią DCN.

Zacznij wstrzykiwać 1,5 mikrolitra wektora. Po wykonaniu tej czynności powoli wyjmij igłę, a następnie ponownie przybliż skórę i pozwól myszy dojść do siebie zgodnie ze standardową procedurą odzyskiwania. Po dwóch do czterech tygodniach gojenia i inkubacji transferu genów za pośrednictwem wirusa, należy ponownie znieczulić mysz, której wstrzyknięto wektor, a następnie usunąć tkankę bliznowatą w miejscu kraniotomii.

Następnie zidentyfikuj kombinację pozostałej tkanki móżdżku i blizny pokrywającej DCN. Użyj pięciu francuskich ssań, aby zassać leżący nad nim móżdżek i tkankę bliznowatą. Podążając za aspiracją.

Szybko nałóż sól fizjologiczną do kraniotomii. Aby zapobiec ululacji krwi, użyj kombinacji delikatnego wklepywania i ssania w punkt dentystyczny, aby oczyścić drogę do bezpośredniej wizualizacji DCN. DCN jest teraz dostępny dla eksperymentów fizjologicznych opartych na optogenetyce, pokazanych tutaj jest umieszczenie światłowodu laserowego bezpośrednio na powierzchni DCN, co pozwala na optyczną stymulację serii impulsów niebieskiego światła DCNA zainfekowanej opsyną na powierzchni zainfekowanego DCN, co skutkuje optycznie sterowaną odpowiedzią słuchową pnia mózgu.

Za pomocą mikromanipulatora światłowód sprzężony z laserem emitowanym światłem niebieskim jest umieszczany bezpośrednio na powierzchni jądra ślimaka i włączany. Tutaj możemy zidentyfikować pulsacyjne niebieskie światło na powierzchni jądra ślimakowego. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak elektryczna symulacja jądra, co pozwala nam bezpośrednio porównać nie tylko akustycznie wywołane, ale także elektrycznie wywołane reakcje neuronalne z tymi wywołanymi przez symulację optyczną.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i wykonać kraniotomię i aspirację móżdżku, a ostatecznym celem jest bezpośrednia wizualizacja i dostęp do jądra ślimakowego.