Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym
December 27th, 2013
Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.
Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie nowoczesnych technik optogenetycznych do fotostymulacji docelowych szlaków neuronalnych w preparatach plastrów in vitro. Osiąga się to poprzez pierwszą ekspresję pręcika kanałowego Dossin w interesujących nas liniach komórek neuronalnych. Drugim etapem procedury jest przygotowanie ostrych plastrów odpowiednich struktur mózgu, które mają być badane.
Następnym krokiem jest zarejestrowanie odpowiedzi neuronów w preparacie plastrowym w odpowiedzi na fotostymulację kanału, pręcika Dossin wyrażającego włókna. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie rozkładu opsyny kanałowej wyrażającej neurony i włókna. Ostatecznie podejście to umożliwia ocenę topografii funkcjonalnej i właściwości synaptycznych obwodów nerwowych za pomocą skaningu laserowego fotostymulacji optogenetycznie ukierunkowanych komponentów neuronalnych.
Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami stymulacji elektrycznej jest możliwość specyficznego celowania i stymulowania określonych typów komórek nerwowych oraz badania ich projekcji na duże odległości in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki systemowej, takie jak funkcjonalna organizacja złożonych gniazd wojennych. Przygotuj strzykawkę i igłę do wstrzyknięcia roztworu wirusa, który zawiera cztery mikrogramy na mililitr poli w celu zwiększenia transfekcji.
Następnie wstrzyknąć pod ciśnieniem 200 nanolitrów roztworu za pomocą pompy strzykawkowej, dwa do trzech tygodni później nastąpi odpowiednia ekspresja plastra Dossina pręta kanałowego. Przygotowanie należy wykonać tak szybko, jak to możliwe Po usunięciu wstrzykniętego mózgu wykonaj blok mózgu w pożądanej orientacji za pomocą czystej żyletki. Następnie przymocuj zablokowaną powierzchnię mózgu do etapu cięcia za pomocą kleju błyskawicznego.
Następnie przenieś scenę do chłodzonej komory cięcia vibram w zamrażarce i wlej lodowaty płyn CSF do komory cięcia. Pokrój sekcje mózgu za pomocą viome na sekcje o grubości od czterech do 500 mikronów. Przenieś wycinki mózgu do natlenionej komory przetrzymywania i pozwól im inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę przed przystąpieniem do eksperymentu.
Kiedy będziesz gotowy do rozpoczęcia eksperymentu, przenieś wycinek mózgu na etap elektrofizjologicznego urządzenia rejestrującego. Nagraj neuron przy użyciu standardowych technik zaciskania łat na całe komórki. Na krótko ustawić pipetę rejestrującą przy neuronie, wywierając na nią dodatni nacisk.
Po nawiązaniu kontaktu z ogniwem zwolnij ciśnienie i zastosuj ssanie, aby utworzyć giga uszczelkę. Następnie zastosuj krótkie ssanie, aby przerwać membranę dla konfiguracji całego ogniwa i wykonaj nagrania w trybach cęgów napięciowych lub prądowych. Skaner laserowy można obsługiwać za pomocą oprogramowania do akwizycji danych o falach pływowych lub EFA.
Oprogramowanie musi być skalibrowane do fotodiody przed użyciem, aby kontrolować moc lasera. Na jego drodze umieszczane jest koło o zmiennej gęstości neutralnej. Obracanie koła dostosowuje moc lasera poprzez pomiar w tylnej płaszczyźnie ogniskowej.
Moc jest zwykle ustawiona na od 25 do D miliwatów. Parametr impulsu migawki kontroluje długość i czas stymulacji w oprogramowaniu. Obraz obszaru, który ma być stymulowany, można wykonać za pomocą funkcji przechwytywania wideo.
Następnie ustaw siatkę stymulacji, taką jak siatka 16 na 16 z odstępami 80 mikronów. Następnie nałóż siatkę na uzyskany obraz i dostosuj współrzędne XY oraz stopień przesunięcia, aby zoptymalizować orientację i rozpocząć stymulację. Aktywuj funkcję mapy.
Dane są zachowywane i mogą być analizowane za pomocą programu do analizy offline w przypadku fal pływowych lub mogą być analizowane za pomocą programu do analizy map w oprogramowaniu EFAs. Po zakończeniu zapisów fizjologicznych na wycinku, można udokumentować wzorzec ekspresji opsyny kanału oznaczonej tagiem YFP. Najpierw utrwal plasterek przez noc w 4% PFA w 0,01 molowym PBS w czterech stopniach Celsjusza.
Następnego dnia przenieś plasterek do 30% sacharozy 4% roztworu PFA w celu ochrony kriogenicznej przez noc. Następnego dnia pokrój 50 mikronów plastra na kriostacie. Opłucz plastry w PBS i zamontuj je do obrazowania za pomocą pożywki zapobiegającej blaknięciu w mikroskopie konfokalnym.
Po znalezieniu obszaru zainteresowania w świetle białym użyj długości fali wzbudzającej 514 nanometrów i długości fali emisyjnej 527 nanometrów. Aby zobrazować konstrukt wirusowy YFPA, który napędza ekspresję pręta kanałowego Dobsona, EYFP. W pobudzających neuronach glutaminergicznym wstrzyknięto do pierwszorzędowej kory wzrokowej myszy BSY.
Ekspresję wirusa stwierdzono w ścieżkach między pierwotną i drugorzędową korą wzrokową oraz we włóknach korowo-wzgórzowych całego węzła LGN z nagraniem z neuronu w wtórnej korze wzrokowej oznaczonym gwiazdą i PSC. Po skanowaniu laserowym fotostymulacja kanału, pręcik Dossin wyraża włókna w dolnych warstwach V dwóch projekcji korowo-wzgórzowych z warstwy szóstej pierwotnej kory somatosensorycznej. Jądro brzuszne tylne badano przy użyciu podejścia CRE LAX w celu ekspresji dozyny pręcika kanału w neuronach wzgórzowych warstwy szóstej, a w ich projekcjach zgodnie z oczekiwaniami transfekcja przez stadowy konstrukt V do transgenicznej myszy CRE spowodowała ekspresję dozyny pręcika kanałowego w docelowych neuronach warstwy szóstej i ich włóknach rozciągających się do warstwy czwartej.
Pręcik kanałowy Dobsona, ekspresja EYFP została również odnotowana we włóknach rzutujących na zapisy fizjologiczne VP z neuronu VP. Użycie klamry z całą komórką ujawniło, że e PSC mogą być wywoływane po fotostymulacji w pobliżu zarejestrowanego neuronu, który jest oznaczony gwiazdą. Analiza offline przedstawia średnią amplitudę odpowiedzi na stymulację foto w VP Wycięte 50-mikronowe wycinki neuronów wzgórzowych warstwy szóstej kory mózgowej eksprymujące kanał Rodin EYFP ujawniły drobny wzór znakowanych włókien przechodzących z warstwy szóstej do warstwy czwartej, gdzie kończyły się i szeroko
przylegały.Ponadto zaobserwowano włókna korowo-wzgórzowe wchodzące w istotę białą i przechodzące w kierunku wzgórza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować nowoczesne techniki optogenetyczne do fotostymulacji docelowych szlaków neuronalnych w preparatach in vitro. Nie zapominaj, że praca z laserami może być bardzo niebezpieczna, gdy wykonujesz kroki kalibracji związane z tą procedurą.
Nosić okulary ochronne.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę charakteryzacji obwodów przednich mózgu z wykorzystaniem optogenetyki do fotostymulacji populacji neuronów in vitro. Technika ta pozwala na ocenę topografii funkcjonalnej i właściwości synaptycznych obwodów nerwowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Optogenetyka
- Elektrofizjologia
Tło
- Optogenetyka umożliwia precyzyjną kontrolę aktywności neuronów.
- Przygotowanie przekrojów in vitro jest używane do badania obwodów mózgowych.
- Channelrhodopsina jest kluczowym narzędziem do fotostymulacji.
- Ta metoda dostarcza informacji na temat organizacji obwodów nerwowych.
Cel badania
- Zastosowanie technik optogenetycznych do ukierunkowanej stymulacji neuronów.
- Badanie właściwości synaptycznych określonych ścieżek neuronowych.
- Zgłębienie zrozumienia organizacji funkcjonalnej mózgu.
Zastosowane metody
- Ekspresja channelrhodopsiny w liniach komórkowych neuronów.
- Przygotowanie ostrych przekrojów mózgu do eksperymentu.
- Rejestrowanie elektrofizjologiczne za pomocą techniki patch clamp na całej komórce.
- Fotostymulacja skaningowa laserem do aktywacji określonych populacji neuronów.
Główne wyniki
- Udana fotostymulacja włókien ekspresujących channelrhodopsinę.
- Zdokumentowane reakcje synaptyczne w ukierunkowanych neuronach.
- Wizualizacja ścieżek neuronowych i ich projekcji.
- Wgląd w funkcjonalne połączenia obwodów przednich mózgu.
Wnioski
- Metoda dostarcza potężnego narzędzia do badania obwodów nerwowych.
- Optogenetyka umożliwia selektywne ukierunkowanie na określone typy neuronów.
- To podejście może odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurologii systemowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Laser-scanning photostimulation of optogenetically targeted forebrain circuits enables precise interrogation of neuronal connectivity and synaptic function in complex brain regions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by allowing targeted hypothesis testing of circuit-level mechanisms. The method supports portfolio decisions by clarifying functional organization and de-risking biological targets in neuropsychiatric and neurodegenerative research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables targeted interrogation of neuronal pathways to clarify circuit-level mechanisms.
- Supports functional target validation by isolating specific cell types and projections.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses for CNS disorders.
- Provides data to triage targets based on synaptic and connectivity profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain slice systems for downstream electrophysiological assays.
- Standardizes stimulation and recording conditions for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable mapping of synaptic responses across defined neuronal populations.
- Supports reliable evaluation of compound effects on circuit function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional circuit mapping with disease-relevant brain regions and pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of neural targets.
- De-risks translational advancement by linking synaptic properties to in vivo function.
- Supports biomarker development through quantifiable electrophysiological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven mapping of neuronal circuits, supporting both target validation and assay development for CNS portfolios.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling selective stimulation and recording from defined neuronal populations.
- Screening: Provides reproducible, quantitative electrophysiological outputs for compound screening in validated slice systems.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of synaptic responses and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Links in vitro circuit function to disease-relevant models and potential biomarkers.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for mapping diverse brain circuits and evaluating multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes optogenetic stimulation and electrophysiological recording for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying circuit-level mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, viral transfection, and electrophysiology.
- Needs specialized instrumentation for laser-scanning, patch clamp, and confocal imaging.
- Demands cross-team standardization of stimulation and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or transgenic models.
- Safety protocols for laser use and viral handling are essential.
