Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie nowoczesnych technik optogenetycznych do fotostymulacji docelowych szlaków neuronalnych w preparatach plastrów in vitro. Osiąga się to poprzez pierwszą ekspresję pręcika kanałowego Dossin w interesujących nas liniach komórek neuronalnych. Drugim etapem procedury jest przygotowanie ostrych plastrów odpowiednich struktur mózgu, które mają być badane.

Następnym krokiem jest zarejestrowanie odpowiedzi neuronów w preparacie plastrowym w odpowiedzi na fotostymulację kanału, pręcika Dossin wyrażającego włókna. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie rozkładu opsyny kanałowej wyrażającej neurony i włókna. Ostatecznie podejście to umożliwia ocenę topografii funkcjonalnej i właściwości synaptycznych obwodów nerwowych za pomocą skaningu laserowego fotostymulacji optogenetycznie ukierunkowanych komponentów neuronalnych.

Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami stymulacji elektrycznej jest możliwość specyficznego celowania i stymulowania określonych typów komórek nerwowych oraz badania ich projekcji na duże odległości in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki systemowej, takie jak funkcjonalna organizacja złożonych gniazd wojennych. Przygotuj strzykawkę i igłę do wstrzyknięcia roztworu wirusa, który zawiera cztery mikrogramy na mililitr poli w celu zwiększenia transfekcji.

Następnie wstrzyknąć pod ciśnieniem 200 nanolitrów roztworu za pomocą pompy strzykawkowej, dwa do trzech tygodni później nastąpi odpowiednia ekspresja plastra Dossina pręta kanałowego. Przygotowanie należy wykonać tak szybko, jak to możliwe Po usunięciu wstrzykniętego mózgu wykonaj blok mózgu w pożądanej orientacji za pomocą czystej żyletki. Następnie przymocuj zablokowaną powierzchnię mózgu do etapu cięcia za pomocą kleju błyskawicznego.

Następnie przenieś scenę do chłodzonej komory cięcia vibram w zamrażarce i wlej lodowaty płyn CSF do komory cięcia. Pokrój sekcje mózgu za pomocą viome na sekcje o grubości od czterech do 500 mikronów. Przenieś wycinki mózgu do natlenionej komory przetrzymywania i pozwól im inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę przed przystąpieniem do eksperymentu.

Kiedy będziesz gotowy do rozpoczęcia eksperymentu, przenieś wycinek mózgu na etap elektrofizjologicznego urządzenia rejestrującego. Nagraj neuron przy użyciu standardowych technik zaciskania łat na całe komórki. Na krótko ustawić pipetę rejestrującą przy neuronie, wywierając na nią dodatni nacisk.

Po nawiązaniu kontaktu z ogniwem zwolnij ciśnienie i zastosuj ssanie, aby utworzyć giga uszczelkę. Następnie zastosuj krótkie ssanie, aby przerwać membranę dla konfiguracji całego ogniwa i wykonaj nagrania w trybach cęgów napięciowych lub prądowych. Skaner laserowy można obsługiwać za pomocą oprogramowania do akwizycji danych o falach pływowych lub EFA.

Oprogramowanie musi być skalibrowane do fotodiody przed użyciem, aby kontrolować moc lasera. Na jego drodze umieszczane jest koło o zmiennej gęstości neutralnej. Obracanie koła dostosowuje moc lasera poprzez pomiar w tylnej płaszczyźnie ogniskowej.

Moc jest zwykle ustawiona na od 25 do D miliwatów. Parametr impulsu migawki kontroluje długość i czas stymulacji w oprogramowaniu. Obraz obszaru, który ma być stymulowany, można wykonać za pomocą funkcji przechwytywania wideo.

Następnie ustaw siatkę stymulacji, taką jak siatka 16 na 16 z odstępami 80 mikronów. Następnie nałóż siatkę na uzyskany obraz i dostosuj współrzędne XY oraz stopień przesunięcia, aby zoptymalizować orientację i rozpocząć stymulację. Aktywuj funkcję mapy.

Dane są zachowywane i mogą być analizowane za pomocą programu do analizy offline w przypadku fal pływowych lub mogą być analizowane za pomocą programu do analizy map w oprogramowaniu EFAs. Po zakończeniu zapisów fizjologicznych na wycinku, można udokumentować wzorzec ekspresji opsyny kanału oznaczonej tagiem YFP. Najpierw utrwal plasterek przez noc w 4% PFA w 0,01 molowym PBS w czterech stopniach Celsjusza.

Następnego dnia przenieś plasterek do 30% sacharozy 4% roztworu PFA w celu ochrony kriogenicznej przez noc. Następnego dnia pokrój 50 mikronów plastra na kriostacie. Opłucz plastry w PBS i zamontuj je do obrazowania za pomocą pożywki zapobiegającej blaknięciu w mikroskopie konfokalnym.

Po znalezieniu obszaru zainteresowania w świetle białym użyj długości fali wzbudzającej 514 nanometrów i długości fali emisyjnej 527 nanometrów. Aby zobrazować konstrukt wirusowy YFPA, który napędza ekspresję pręta kanałowego Dobsona, EYFP. W pobudzających neuronach glutaminergicznym wstrzyknięto do pierwszorzędowej kory wzrokowej myszy BSY.

Ekspresję wirusa stwierdzono w ścieżkach między pierwotną i drugorzędową korą wzrokową oraz we włóknach korowo-wzgórzowych całego węzła LGN z nagraniem z neuronu w wtórnej korze wzrokowej oznaczonym gwiazdą i PSC. Po skanowaniu laserowym fotostymulacja kanału, pręcik Dossin wyraża włókna w dolnych warstwach V dwóch projekcji korowo-wzgórzowych z warstwy szóstej pierwotnej kory somatosensorycznej. Jądro brzuszne tylne badano przy użyciu podejścia CRE LAX w celu ekspresji dozyny pręcika kanału w neuronach wzgórzowych warstwy szóstej, a w ich projekcjach zgodnie z oczekiwaniami transfekcja przez stadowy konstrukt V do transgenicznej myszy CRE spowodowała ekspresję dozyny pręcika kanałowego w docelowych neuronach warstwy szóstej i ich włóknach rozciągających się do warstwy czwartej.

Pręcik kanałowy Dobsona, ekspresja EYFP została również odnotowana we włóknach rzutujących na zapisy fizjologiczne VP z neuronu VP. Użycie klamry z całą komórką ujawniło, że e PSC mogą być wywoływane po fotostymulacji w pobliżu zarejestrowanego neuronu, który jest oznaczony gwiazdą. Analiza offline przedstawia średnią amplitudę odpowiedzi na stymulację foto w VP Wycięte 50-mikronowe wycinki neuronów wzgórzowych warstwy szóstej kory mózgowej eksprymujące kanał Rodin EYFP ujawniły drobny wzór znakowanych włókien przechodzących z warstwy szóstej do warstwy czwartej, gdzie kończyły się i szeroko

Ponadto zaobserwowano włókna korowo-wzgórzowe wchodzące w istotę białą i przechodzące w kierunku wzgórza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować nowoczesne techniki optogenetyczne do fotostymulacji docelowych szlaków neuronalnych w preparatach in vitro. Nie zapominaj, że praca z laserami może być bardzo niebezpieczna, gdy wykonujesz kroki kalibracji związane z tą procedurą.

Nosić okulary ochronne.