Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zastosowanie nowoczesnych technik optogenetycznych do fotostymulacji wybranych szlaków neuronalnych w preparatach skrawków in vitro. Jest to realizowane poprzez wstępną ekspresję kanału Channelrhodopsin w odpowiednich liniach komórek neuronalnych. Drugim etapem procedury jest przygotowanie ostrych skrawków odpowiednich struktur mózgu przeznaczonych do badania.

Kolejnym krokiem jest rejestracja odpowiedzi neuronów w preparacie plastronki w odpowiedzi na fotostymulację włókien wykazujących ekspresję opsyny kanałowej. Ostatnim etapem jest obrazowanie rozmieszczenia neuronów i włókien wykazujących ekspresję opsyny kanałowej. Ostatecznie podejście to umożliwia ocenę topografii funkcjonalnej i właściwości synaptycznych obwodów neuronalnych przy użyciu laserowego skanowania i fotostymulacji optogenetycznie ukierunkowanych komponentów neuronalnych.

Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami stymulacji elektrycznej są możliwość specyficznego celowania i stymulowania konkretnych typów komórek neuronalnych oraz badanie ich długodystansowych projekcji in vitro. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki systemowej, takie jak funkcjonalna organizacja złożonych obwodów. Należy przygotować strzykawkę i igłę do wstrzyknięcia roztworu wirusowego, który zawiera 4 µg/mL poli w celu zwiększenia wydajności transfekcji.

Następnie należy wstrzyknąć ciśnieniowo 200 nanolitrów roztworu za pomocą pompy strzykawkowej. Dwa do trzech tygodni później w preparatach przekrojów mózgu wystąpi odpowiednia ekspresja kanałów. Przygotowanie należy przeprowadzić jak najszybciej. Po wyjęciu wstrzykniętego mózgu, należy wyciąć blok tkanki w pożądanej orientacji, używając czystego ostrza do żyletki. Następnie powierzchnię bloku mózgu należy przymocować do stołu tnącego za pomocą kleju błyskawicznego.

Następnie przenieś preparat do schłodzonej w zamrażarce komory tnącej Vibram i wlej do niej lodowaty A CSF. Podziel mózg za pomocą vibrotomu na od czterech do pięciu plastrów o grubości 500 micron. Przenieś plastry mózgu do natlenionej komory holdingowej i inkubuj je w temperaturze 30 degrees Celsius przez co najmniej godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu.

Po przygotowaniu do rozpoczęcia eksperymentu, przenieś skibek mózgu na stoлик zestawu do rejestracji elektrofizjologicznej. Wykonaj rejestrację neuronu, stosując standardowe techniki patch clamp w konfiguracji whole cell. Krótko pozycjonuj pipetę rejestrującą przy neuronie, przykładając jednocześnie dodatnie ciśnienie do pipety.

Po nawiązaniu kontaktu z komórką należy zwolnić nacisk i zastosować ssanie w celu utworzenia giga-uszczelnienia (giga seal). Następnie należy zastosować krótkie ssanie, aby przerwać membranę dla konfiguracji whole-cell i przeprowadzić pomiary w trybach clamp napięciowy lub prądowy. Skaner laserowy należy obsługiwać za pomocą oprogramowania do akwizycji danych tidal wave lub EFAs.

Przed użyciem oprogramowanie musi zostać skalibrowane z fotodiodą w celu kontroli mocy lasera. Na drodze wiązki umieszcza się regulowane koło neutralnego filtra gęstości. Obracanie koła pozwala dostosować moc lasera poprzez pomiar w tylnej płaszczyźnie ogniskowej.

Moc jest zazwyczaj ustawiana w zakresie od 25 do D miliwatów. Parametr impulsu migawki kontroluje długość i czas stymulacji w oprogramowaniu. Obraz obszaru do stymulacji można utworzyć za pomocą funkcji przechwytywania wideo.

Następnie ustaw siatkę stymulacji, na przykład siatkę 16 na 16 z odstępami 80 mikronów. Następnie nałóż siatkę na pozyskany obraz i dostosuj współrzędne XY oraz stopień przesunięcia, aby zoptymalizować orientację przed rozpoczęciem stymulacji. Aktywuj funkcję mapowania.

Dane zostają zachowane i mogą być analizowane za pomocą programu do analizy offline w tidal wave lub za pomocą programu do analizy map w oprogramowaniu EFAs. Po zakończeniu rejestracji fizjologicznej na skrawku można udokumentować wzorzec ekspresji opsyny kanałowej znakowanej YFP. Najpierw utrwal skrawek przez noc w 4% PFA w 0,01 molar PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia przenieść przekrój do 30% sucrose 4% PFA w celu całonocnej krioprotekcji. Kolejnego dnia wykonać na kriostacie sekcje o grubości 50 micron z otrzymanego przekroju. Przepłukać sekcje w PBS, a następnie zamontować je do obrazowania z użyciem medium anty-fade w mikroskopie konfokalnym.

Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania w świetle białym, należy zastosować długość fali wzbudzenia 514 nanometr oraz długość fali emisji 527 nanometr. Służy to obrazowaniu konstruktu wirusowego YFPA, który steruje ekspresją kanału rod Dobson, EYFP. Konstrukt ten został wstrzyknięty do kory wzrokowej pierwotnej myszy BSY w pobudzających neuronach glutaminergicznych.

Ekspresja wirusowa została stwierdzona w szlakach między pierwotną a wtórną korą wzrokową oraz w włóknach korowo-wzgórzowych LGN; rejestracja whole cell patch clamp z neuronu w wtórnej korze wzrokowej, oznaczonego gwiazdką, wykazała ePSC. Po fotostymulacji laserowej kanału, włókna wykazujące ekspresję channel rhodopsin w głębszych warstwach V2, projekcje korowo-wzgórzowe z warstwy szóstej pierwotnej kory somatosensorycznej oraz jądro brzuszne tylne zostały zbadane z wykorzystaniem podejścia CRE LAX w celu ekspresji channel rhodopsin w neuronach korowo-wzgórzowych warstwy szóstej oraz w ich projekcjach; zgodnie z oczekiwaniami, transfekcja konstruktem AAV z Flocka u myszy transgenicznej CRE doprowadziła do ekspresji channel rhodopsin w docelowych neuronach warstwy szóstej oraz w ich włóknach rozciągających się do warstwy czwartej.

W przypadku nadekspresji ChR2-EYFP odnotowano obecność białka w włóknach rzutujących do VP podczas rejestracji fizjologicznych z neuronu VP. Zastosowanie techniki patch-clamp w konfiguracji whole-cell wykazało, że po fotostymulacji w pobliżu rejestrowanego neuronu (oznaczonego gwiazdką) można wywołać ePSC. Analiza offline przedstawia średnią amplitudę odpowiedzi na fotostymulację w VP. Przecięcie warstw 50 µm neuronów kortykotalamicznych warstwy szóstej wykazujących ekspresję ChR2-EYFP ujawniło subtelny wzór znakowanych włókien biegnących z warstwy szóstej do warstwy czwartej, gdzie kończyły się one i tworzyły rozległe rozgałęzienia.

Dodatkowo zaobserwowano włókna korowo-wzgórkowe wnikające do białej istoty i biegnące w kierunku wzgórza. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat zastosowania nowoczesnych technik optogenetycznych do fotostymulacji wybranych szlaków neuronalnych w preparatach skrawków in vitro. Proszę pamiętać, że praca z laserami może być niezwykle niebezpieczna podczas wykonywania kroków kalibracyjnych związanych z tą procedurą.

Stosuj środki ochrony wzroku.