Badanie szybkiej dynamiki dopaminy za pomocą cyklicznej woltamperometrii Fast Scan podczas doustnej dawki degustacyjnej u obudzonych szczurów

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie subsekundowej odpowiedzi dopaminy na gęsty smak jamy ustnej. Osiąga się to poprzez stworzenie najpierw cewników doustnych, elektrod referencyjnych i elektrod z włókna węglowego potrzebnych do zabiegów chirurgicznych, a następnie rejestrację za pomocą szybkiej telemetrii cyklicznej V. Drugim krokiem jest chirurgiczne wszczepienie cewników doustnych, elektrody wewnątrzczaszkowej i kaniuli prowadzącej elektrody z włókna węglowego.

Tydzień później mikroelektroda z włókna węglowego może zostać opuszczona do jądra półleżącego, aby zarejestrować zmiany w zewnątrzkomórkowym uwalnianiu dopaminy w odpowiedzi na wewnątrzustne dostarczanie smaków. Ostatnim krokiem po nagraniu jest kalibracja elektrody i zastosowanie analizy składowych zasady do wyizolowania danych zawierających informacje o dopaminie. Ostatecznie, połączone wykorzystanie wewnątrzustnego smaku i dostarczania oraz telemetrii cyklicznego vol szybkiego skanowania służy do pokazania zmian w subsekundowych odpowiedziach dopaminy na taten.

Istnieją dwie główne zalety tej połączonej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami. Po pierwsze, szybka fotometria IC ma wysoką rozdzielczość czasową, a po drugie, wewnątrzustne dostarczanie taten minimalizuje ruch, który szczur musi wykonać, aby uzyskać tatin i pozwala nam lepiej wyizolować odpowiedzi dopaminy na tatinę. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy z wytwarzaniem cewnika doustnego.

Jednak skonstruowanie dobrego i płatnego cewnika doustnego zapewni dokładne dopasowanie cewnika między policzek a górne zęby trzonowe i zwiększy prawdopodobieństwo udanego eksperymentu. Aby przygotować elektrodę rejestrującą, najpierw należy zassać włókno węglowe T six 50 o średnicy siedmiu mikronów do kapilary ze szkła krzemianowego Bora o średnicy wewnętrznej 0,4 milimetra. Następnie umieść kapilę w pionowym biegunie elektrody, najpierw pociągnij za pomocą grzałki ustawionej na 55.0 i magnes wyłącz, a następnie wyreguluj w razie potrzeby.

Po przeciągnięciu pipety pod mikroskop odetnij odsłonięte włókno węglowe tak, aby wystawało od 75 do 100 mikronów poza szkło. Włókno w szkle musi być szczelnie zamknięte, w przeciwnym razie wyrzuć preparat. Następnie zdejmij izolację z połowy trzycalowego drutu o średnicy 30 mm, nałóż koszulkę termokurczliwą, aby przymocować elektrodę do mikromanipulatora.

Następnie nałóż cienką warstwę srebrnej farby na drut, gdy farba jest jeszcze mokra. Włóż drut do otwartego końca elektrody i przymocuj go do znajdującego się w nim włókna węglowego. Sprawdź ten kontakt pod mikroskopem.

Weź elektrodę do mikromanipulatora i zabezpiecz ją folią termokurczliwą. Umieść przygotowaną elektrodę z włókna węglowego w IPA na co najmniej 10 minut, aby oczyścić powierzchnię elektrody i zwiększyć późniejszą wrażliwość na dopaminę. Po wyjęciu elektrody z IPA należy spłukać włókno węglowe wodą z kranu, aby usunąć IPA.

Następnie przygotuj elektrodę referencyjną z 13-milimetrowego srebrnego drutu z sześciomilimetrową srebrną siatką chlorku srebra o średnicy 0,4 milimetra, odetnij nieokratkową część drutu i ją do złotego kołka. Następnie nałóż żywicę epoksydową na lut. Następnie zanurz część siatki w kwasie kopolimerowym pięć razy.

Pozostaw do wyschnięcia na 30 minut na powietrzu między zanurzeniami po ostatnim zanurzeniu. Pozostaw do wyschnięcia na noc na powietrzu. Następnego dnia.

Piecz siatkową część drutu w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby najpierw wykonać cewnik doustny. Rurka z polietylenu 100 na sześciocentymetrowe segmenty.

Następnie wykonaj mały płaski krążek na jednym z segmentów rurki, topiąc koniec i dociskając go do płaskiej, chłodnej powierzchni pośrodku krążka. Użyj igły o rozmiarze 18, aby utworzyć otwór. Przymocuj drugi koniec segmentu rurki do końca igły o rozmiarze 18.

Następnie za pomocą dziurkacza powstaje kilka kawałków politetrafluoroetylenu o średnicy sześciu milimetrów i grubości 3,18 milimetra. Następnie w środku tych krążków utwórz otwór, zamieniając w ten sposób tarcze w podkładki. Przytnij podkładkę w kształcie trapezu, aby pomóc je zagnieździć podczas implantacji zębów trzonowych.

Aby ukończyć cewnik, wciśnij igłę przymocowaną do rurki PE całkowicie przez podkładkę i wsuń podkładkę równo z rurką. Wykonanie poniższego protokołu zajmuje około 75 minut. Zacznij od szczura przygotowanego do operacji i otwórz jego pysk za pomocą bawełnianego wacika.

Następnie wciśnij igłę na kaniuli w tkankę między policzkiem a pierwszym górnym zębem trzonowym, tak aby igła wychodziła tuż za uszami i przyśrodkowo do uszu. Następnie przesuń kaniulę w górę i przymocuj podkładkę do zębów trzonowych, aby ustabilizować cewnik na odsłoniętej igle. Wsuń podkładkę i dokręć ją do nacięcia.

Zamocuj tę podkładkę na miejscu. Przytnij rurkę tak, aby od dwóch do czterech centymetrów pozostało odsłoniętych nad głową szczura. Następnie, stosując tę samą technikę, umieść cewnik po drugiej stronie jamy ustnej.

Następnie umieść szczura w stereotaktycznej ramie i wywierć trzy otwory na kaniule i elektrody, aby dokonać nagrań w pozycji rdzenia jądra półleżącego. Kaniula prowadząca 1,2 milimetra z przodu i 1,4 milimetra. Torema boczna.

Opuść aparat kaniuli, aż plastikowa podstawa zrówna się z czaszką. Umieść elektrodę odniesienia w półkuli przeciwlegle do kaniuli prowadzącej. Obniż odniesienie o około dwa milimetry poniżej opony twardej.

Następnie umieść elektrodę stymulującą, 5,2 milimetra z tyłu i 1,0 milimetra bocznej toremy. Aby celować w brzuszny obszar nakrywki. Opuść elektrodę stymulującą 8,0 milimetrów poniżej opony twardej.

Następnie zabezpiecz elementy i cementem i zapewnij opiekę pooperacyjną. Przed przeprowadzeniem eksperymentu zawsze sprawdzaj drożność kaniuli ustnej, podając 200 mikrolitrów wody i obserwuj, czy szczur smakuje wodę, oczyść miejsce nagrywania, wyjmując atrapę kaniuli, dodając do niej dwie krople 50% heparyny, a następnie delikatnie zmieniając jej położenie. Manekin nie może znajdować się w odległości mniejszej niż dwa milimetry od miejsca nagrania.

Teraz przymocuj i ustabilizuj stopień głowy do stymulatora wszczepionego w VTA, a następnie opuść elektrodę rejestrującą do rdzenia jądra półleżącego. Teraz postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, utwórz zestaw danych treningowych. Zawsze odczekaj co najmniej dwie minuty, ale do czterech do pięciu minut między stymulacjami, aby umożliwić ponowne ładowanie pęcherzyków I musi.

Najważniejszym krokiem w eksperymencie jest uzyskanie wysokiej jakości elektrody. Jeśli tło ma charakterystyczny zaokrąglony kształt na fazie narastania, dobrą elektrodą jest. Jeśli zaokrąglony kształt jest mały lub ściśle pasuje do zastosowanego kształtu fali, wypróbuj inną elektrodę.

Jeśli tło znajduje się dokładnie w miejscu, w którym zostało przesunięte, zastosuj przesunięcie przesunięcia do zastosowanego kształtu fali w kierunku dodatnim w krokach co 0,1 wolta. Po wygenerowaniu zestawu treningowego w miejscu nagrywania, zbieraj dane, podając 200 mikrolitrowych bolusów taten co jedną do trzech minut przez 25 infuzji. Następnie odczekaj co najmniej 30 minut i w ten sam sposób zaparz następny smak.

FSCV w połączeniu z implantacją cewnika wewnątrzustnego wykorzystano do zbadania, w jaki sposób sacharoza i AIT taten moduluje fazowe uwalnianie dopaminy w rdzeniu jądra półleżącego przed infuzją taten stymulacja elektryczna wskazywana przez czerwony pasek VTA spowodowała znaczny wzrost fazowego uwalniania dopaminy w rdzeniu jądra półleżącego po uzyskaniu zestawu treningowego 6,5-sekundowe wlewy 200 mikrolitrów sacharozy wskazane przez czerwony pasek wytwarzany na wysokości w prąd wskazywany przez białą strzałkę. Nastąpiło to przy potencjale utleniania dopaminy, który jest oznaczony białą linią przerywaną, przekształcającą dane w wykres stężenia w funkcji czasu. Po PCA sprawdzono, że zwiększony prąd w odpowiedzi na smak jest wynikiem wzrostu stężenia dopaminy.

Kolejny mentol tatin został podany podczas zapisów FSCV w jądrze półleżącym rdzeniu zaobserwowano również zwiększone stężenie dopaminy po infuzji mentolu Po opanowaniu połączoną operację wewnątrzustną i kaniulacyjną można wykonać w ciągu 75 minut. Technika ta może być łączona z innymi formami zachowania, takimi jak konkurencyjne i awersyjne warunkowanie Pawłowa i operowe, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące subsekundowej sygnalizacji dopaminy podczas tych procesów.