Badanie szybkiej dynamiki dopaminy za pomocą cyklicznej woltamperometrii Fast Scan podczas doustnej dawki degustacyjnej u obudzonych szczurów
12 sierpnia 2015
Gwałtowne wahania dopaminy zewnątrzkomórkowej (DA) pośredniczą zarówno w przetwarzaniu nagrody, jak i w motywowanym zachowaniu u ssaków. Manuskrypt ten opisuje połączone zastosowanie szybkiej woltamperometrii cyklicznej (FSCV) i doustnej dawki degustacyjnej w celu określenia, w jaki sposób degustatory zmieniają szybkie uwalnianie dopaminy u obudzonych, swobodnie poruszających się szczurów.
Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie subsekundowej odpowiedzi dopaminy na gęsty smak jamy ustnej. Osiąga się to poprzez stworzenie najpierw cewników doustnych, elektrod referencyjnych i elektrod z włókna węglowego potrzebnych do zabiegów chirurgicznych, a następnie rejestrację za pomocą szybkiej telemetrii cyklicznej V. Drugim krokiem jest chirurgiczne wszczepienie cewników doustnych, elektrody wewnątrzczaszkowej i kaniuli prowadzącej elektrody z włókna węglowego.
Tydzień później mikroelektroda z włókna węglowego może zostać opuszczona do jądra półleżącego, aby zarejestrować zmiany w zewnątrzkomórkowym uwalnianiu dopaminy w odpowiedzi na wewnątrzustne dostarczanie smaków. Ostatnim krokiem po nagraniu jest kalibracja elektrody i zastosowanie analizy składowych zasady do wyizolowania danych zawierających informacje o dopaminie. Ostatecznie, połączone wykorzystanie wewnątrzustnego smaku i dostarczania oraz telemetrii cyklicznego vol szybkiego skanowania służy do pokazania zmian w subsekundowych odpowiedziach dopaminy na taten.
Istnieją dwie główne zalety tej połączonej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami. Po pierwsze, szybka fotometria IC ma wysoką rozdzielczość czasową, a po drugie, wewnątrzustne dostarczanie taten minimalizuje ruch, który szczur musi wykonać, aby uzyskać tatin i pozwala nam lepiej wyizolować odpowiedzi dopaminy na tatinę. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy z wytwarzaniem cewnika doustnego.
Jednak skonstruowanie dobrego i płatnego cewnika doustnego zapewni dokładne dopasowanie cewnika między policzek a górne zęby trzonowe i zwiększy prawdopodobieństwo udanego eksperymentu. Aby przygotować elektrodę rejestrującą, najpierw należy zassać włókno węglowe T six 50 o średnicy siedmiu mikronów do kapilary ze szkła krzemianowego Bora o średnicy wewnętrznej 0,4 milimetra. Następnie umieść kapilę w pionowym biegunie elektrody, najpierw pociągnij za pomocą grzałki ustawionej na 55.0 i magnes wyłącz, a następnie wyreguluj w razie potrzeby.
Po przeciągnięciu pipety pod mikroskop odetnij odsłonięte włókno węglowe tak, aby wystawało od 75 do 100 mikronów poza szkło. Włókno w szkle musi być szczelnie zamknięte, w przeciwnym razie wyrzuć preparat. Następnie zdejmij izolację z połowy trzycalowego drutu o średnicy 30 mm, nałóż koszulkę termokurczliwą, aby przymocować elektrodę do mikromanipulatora.
Następnie nałóż cienką warstwę srebrnej farby na drut, gdy farba jest jeszcze mokra. Włóż drut do otwartego końca elektrody i przymocuj go do znajdującego się w nim włókna węglowego. Sprawdź ten kontakt pod mikroskopem.
Weź elektrodę do mikromanipulatora i zabezpiecz ją folią termokurczliwą. Umieść przygotowaną elektrodę z włókna węglowego w IPA na co najmniej 10 minut, aby oczyścić powierzchnię elektrody i zwiększyć późniejszą wrażliwość na dopaminę. Po wyjęciu elektrody z IPA należy spłukać włókno węglowe wodą z kranu, aby usunąć IPA.
Następnie przygotuj elektrodę referencyjną z 13-milimetrowego srebrnego drutu z sześciomilimetrową srebrną siatką chlorku srebra o średnicy 0,4 milimetra, odetnij nieokratkową część drutu i ją do złotego kołka. Następnie nałóż żywicę epoksydową na lut. Następnie zanurz część siatki w kwasie kopolimerowym pięć razy.
Pozostaw do wyschnięcia na 30 minut na powietrzu między zanurzeniami po ostatnim zanurzeniu. Pozostaw do wyschnięcia na noc na powietrzu. Następnego dnia.
Piecz siatkową część drutu w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby najpierw wykonać cewnik doustny. Rurka z polietylenu 100 na sześciocentymetrowe segmenty.
Następnie wykonaj mały płaski krążek na jednym z segmentów rurki, topiąc koniec i dociskając go do płaskiej, chłodnej powierzchni pośrodku krążka. Użyj igły o rozmiarze 18, aby utworzyć otwór. Przymocuj drugi koniec segmentu rurki do końca igły o rozmiarze 18.
Następnie za pomocą dziurkacza powstaje kilka kawałków politetrafluoroetylenu o średnicy sześciu milimetrów i grubości 3,18 milimetra. Następnie w środku tych krążków utwórz otwór, zamieniając w ten sposób tarcze w podkładki. Przytnij podkładkę w kształcie trapezu, aby pomóc je zagnieździć podczas implantacji zębów trzonowych.
Aby ukończyć cewnik, wciśnij igłę przymocowaną do rurki PE całkowicie przez podkładkę i wsuń podkładkę równo z rurką. Wykonanie poniższego protokołu zajmuje około 75 minut. Zacznij od szczura przygotowanego do operacji i otwórz jego pysk za pomocą bawełnianego wacika.
Następnie wciśnij igłę na kaniuli w tkankę między policzkiem a pierwszym górnym zębem trzonowym, tak aby igła wychodziła tuż za uszami i przyśrodkowo do uszu. Następnie przesuń kaniulę w górę i przymocuj podkładkę do zębów trzonowych, aby ustabilizować cewnik na odsłoniętej igle. Wsuń podkładkę i dokręć ją do nacięcia.
Zamocuj tę podkładkę na miejscu. Przytnij rurkę tak, aby od dwóch do czterech centymetrów pozostało odsłoniętych nad głową szczura. Następnie, stosując tę samą technikę, umieść cewnik po drugiej stronie jamy ustnej.
Następnie umieść szczura w stereotaktycznej ramie i wywierć trzy otwory na kaniule i elektrody, aby dokonać nagrań w pozycji rdzenia jądra półleżącego. Kaniula prowadząca 1,2 milimetra z przodu i 1,4 milimetra. Torema boczna.
Opuść aparat kaniuli, aż plastikowa podstawa zrówna się z czaszką. Umieść elektrodę odniesienia w półkuli przeciwlegle do kaniuli prowadzącej. Obniż odniesienie o około dwa milimetry poniżej opony twardej.
Następnie umieść elektrodę stymulującą, 5,2 milimetra z tyłu i 1,0 milimetra bocznej toremy. Aby celować w brzuszny obszar nakrywki. Opuść elektrodę stymulującą 8,0 milimetrów poniżej opony twardej.
Następnie zabezpiecz elementy i cementem i zapewnij opiekę pooperacyjną. Przed przeprowadzeniem eksperymentu zawsze sprawdzaj drożność kaniuli ustnej, podając 200 mikrolitrów wody i obserwuj, czy szczur smakuje wodę, oczyść miejsce nagrywania, wyjmując atrapę kaniuli, dodając do niej dwie krople 50% heparyny, a następnie delikatnie zmieniając jej położenie. Manekin nie może znajdować się w odległości mniejszej niż dwa milimetry od miejsca nagrania.
Teraz przymocuj i ustabilizuj stopień głowy do stymulatora wszczepionego w VTA, a następnie opuść elektrodę rejestrującą do rdzenia jądra półleżącego. Teraz postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, utwórz zestaw danych treningowych. Zawsze odczekaj co najmniej dwie minuty, ale do czterech do pięciu minut między stymulacjami, aby umożliwić ponowne ładowanie pęcherzyków I musi.
Najważniejszym krokiem w eksperymencie jest uzyskanie wysokiej jakości elektrody. Jeśli tło ma charakterystyczny zaokrąglony kształt na fazie narastania, dobrą elektrodą jest. Jeśli zaokrąglony kształt jest mały lub ściśle pasuje do zastosowanego kształtu fali, wypróbuj inną elektrodę.
Jeśli tło znajduje się dokładnie w miejscu, w którym zostało przesunięte, zastosuj przesunięcie przesunięcia do zastosowanego kształtu fali w kierunku dodatnim w krokach co 0,1 wolta. Po wygenerowaniu zestawu treningowego w miejscu nagrywania, zbieraj dane, podając 200 mikrolitrowych bolusów taten co jedną do trzech minut przez 25 infuzji. Następnie odczekaj co najmniej 30 minut i w ten sam sposób zaparz następny smak.
FSCV w połączeniu z implantacją cewnika wewnątrzustnego wykorzystano do zbadania, w jaki sposób sacharoza i AIT taten moduluje fazowe uwalnianie dopaminy w rdzeniu jądra półleżącego przed infuzją taten stymulacja elektryczna wskazywana przez czerwony pasek VTA spowodowała znaczny wzrost fazowego uwalniania dopaminy w rdzeniu jądra półleżącego po uzyskaniu zestawu treningowego 6,5-sekundowe wlewy 200 mikrolitrów sacharozy wskazane przez czerwony pasek wytwarzany na wysokości w prąd wskazywany przez białą strzałkę. Nastąpiło to przy potencjale utleniania dopaminy, który jest oznaczony białą linią przerywaną, przekształcającą dane w wykres stężenia w funkcji czasu. Po PCA sprawdzono, że zwiększony prąd w odpowiedzi na smak jest wynikiem wzrostu stężenia dopaminy.
Kolejny mentol tatin został podany podczas zapisów FSCV w jądrze półleżącym rdzeniu zaobserwowano również zwiększone stężenie dopaminy po infuzji mentolu Po opanowaniu połączoną operację wewnątrzustną i kaniulacyjną można wykonać w ciągu 75 minut. Technika ta może być łączona z innymi formami zachowania, takimi jak konkurencyjne i awersyjne warunkowanie Pawłowa i operowe, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące subsekundowej sygnalizacji dopaminy podczas tych procesów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada, jak substancje smakowe wpływają na szybkie uwalnianie dopaminy u czujnych, swobodnie poruszających się szczurów. Za pomocą szybkiego skanowania woltomierzy cyklicznego (FSCV) badania mają na celu zmierzenie odpowiedzi dopaminy na stymulatory smakowe w czasie krótszym niż sekunda.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Nauki behawioralne
- Elektrofizjologia
Tło
- Dopamina odgrywa kluczową rolę w przetwarzaniu gratyfikacji i zachowaniu motywowanym.
- Rozumienie dynamiki dopaminy może dać wgląd w reakcje behawioralne na stymulatory.
- Szybkie skanowanie woltomierzy cyklicznego umożliwia mierzenie uwalniania neuroprzekaźników w czasie rzeczywistym.
- Substancje smakowe mogą służyć jako skuteczne stymulatory do badania uwalniania dopaminy.
Cel badania
- Zmierzenie szybkiej odpowiedzi dopaminy na substancje smakowe.
- Zbadanie związku między stymulacją smakową a uwalnianiem dopaminy.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik do precyzyjnego pomiaru dynamiki neuroprzekaźników.
Stosowane metody
- Stworzenie cewników doustnych i elektrod do rejestracji.
- Chirurgiczne wszczepienie elektrod i cewników prowadzących.
- Rejestracja uwalniania dopaminy w jądrze łączy.
- Kalibracja elektrod i analiza danych przy użyciu analizy głównych składowych.
Główne wyniki
- Udane zmierzenie odpowiedzi dopaminy w czasie krótszym niż sekunda na substancje smakowe w jamie ustnej.
- Wykazane zmiany w wzorach uwalniania dopaminy w odpowiedzi na stymulatory smakowe.
- Zastosowane wgląd w dynamikę dopaminy związaną z przetwarzaniem gratyfikacji.
- Zweryfikowano użycie FSCV u czujnych, swobodnie poruszających się szczurów do badania uwalniania dopaminy.
Wnioski
- Badanie podkreśla wpływ substancji smakowych na dynamikę dopaminy.
- FSCV jest skuteczną metodą mierzenia uwalniania neuroprzekaźników w czasie rzeczywistym.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia neurochemicznej podstawy gratyfikacji i motywacji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables direct measurement of subsecond dopamine dynamics in response to oral tastants, bypassing confounding reward-directed behaviors. It provides a mechanistic de-risking tool for target validation in reward-related pathways by isolating primary stimulus responses from motor or learning confounds. The approach supports predictive confidence in early discovery by quantifying phasic dopamine release as a translational biomarker for oral reinforcement mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring dopamine release specifically tied to primary tastant stimulation, reducing mechanistic ambiguity in reward pathway interrogation.
- Operational Value: Enables functional target validation through real-time, subsecond neurotransmitter readouts in awake animals, supporting biological de-risking of targets involved in oral reinforcement.
- Predictive Value: Generates quantitative, time-locked dopamine concentration data that can inform lead identification and portfolio triage for compounds targeting gustatory reward pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (nucleus accumbens in awake rats) for downstream compound screening by establishing a reproducible platform for detecting rapid dopamine fluctuations.
- Quantitative Output: Produces concentration-versus-time profiles via FSCV and PCA, enabling standardized, scalable measurement of stimulus-evoked dopamine release for assay optimization.
- Screening Relevance: Supports reliable compound evaluation by isolating dopamine responses to oral stimuli from movement or learning-related artifacts, improving signal-to-noise in preclinical taste-reward assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase dopamine dynamics to preclinical validation by using disease-relevant oral stimuli (e.g., sucrose, menthol) that model human gustatory reward processing.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed dopamine changes are directly tastant-driven, reducing false positives in target engagement studies and supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Biomarker Alignment: Positions phasic dopamine release as a potential translational biomarker for oral reinforcement, aligning with clinical endpoints in feeding behavior and addiction research.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly for targets modulating oral reward and motivation, by providing early-phase mechanistic readouts that precede behavioral efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring dopamine release in nucleus accumbens core in response to defined oral stimuli, enabling de-risking of targets in mesolimbic pathways.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized electrode implantation and calibration protocols, ensuring reproducible dopamine measurements across compound testing sessions.
- Analytics: Employs principal component analysis to isolate dopamine-specific signals from background noise, generating quantitative readouts that allow cross-condition comparison of stimulus-evoked release.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by using intraoral infusion to model human taste stimulation, linking acute dopamine responses to longer-term reinforcement learning processes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical and recording platform applicable across multiple tastants, compounds, or genetic models, reducing redundant validation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by isolating primary dopaminergic responses to oral stimuli, reducing ambiguity in reward pathway modulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined electrode preparation, surgical implantation, and calibration steps, enabling cross-lab consistency.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering early, mechanism-based readouts on target engagement in reward circuits, reducing late-stage biological risk in neuropsychiatric drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds affecting oral reward pathways through quantitative, temporally resolved dopamine data that supports mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery, electrode fabrication, and fast scan cyclic voltammetry to ensure signal quality and animal welfare.
- Depends on specialized instrumentation including potentiostats, carbon fiber electrodes, reference electrodes, and microfluidic infusion systems for intraoral delivery.
- Necessitates cross-team standardization between surgical, electrophysiology, and data analysis teams to maintain electrode fidelity and signal interpretability.
- Involves adaptation considerations when extending to different brain regions, tastant types, or disease models, with validation needed for each new condition.
- Practical limitations include the technical challenge of oral catheter fabrication and the need for post-surgical recovery periods, which may affect throughput in high-volume screening campaigns.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:56
Fabricating the Electrodes
4:14
Fabricating Oral Catheters
7:16
Taking Voltametric Recordings in Awake, Freely Moving Rats
5:24
Combined Intraoral Surgery and Intracranial Cannulation Surgery
8:52
Results: Tastant Stimulated Dopamine Release Measured in the NAc
10:11
Conclusion
