Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Ogólnym celem poniższej procedury jest polaryzacja naiwnych limfocytów T CD czterech dodatnich limfocytów T wyizolowanych z węzłów chłonnych myszy i śledziony w odrębne podzbiory pomocnicze T. In vitro osiąga się to poprzez wstępne przetwarzanie śledziony i węzłów chłonnych pobranych od dorosłych myszy typu dzikiego. W drugim etapie populacja komórek CD 4 dodatnich jest wzbogacana przez separację kulek magnetycznych, a następnie dalej sortowana przez ich naiwną ekspresję markera limfocytów T.

W ostatnim etapie komórki są traktowane czynnikami aktywującymi receptor limfocytów T i cytokinami polaryzującymi, aby indukować ich różnicowanie w różne linie pomocnicze T. Ostatecznie cytometria przepływowa. Elis A i PCR w czasie rzeczywistym są wykorzystywane do oceny skuteczności różnicowania limfocytów T pomocniczych.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie limfocytów T pomocniczych, takie jak to, w jaki sposób ekspresja określonych cząsteczek lub leczenie określonymi lekami wpływa na charakter odpowiedzi limfocytów T. Zacznij od przypięcia kończyn pięcio- do 10-tygodniowej czarnej myszy sześcioletniej C 57 do deski sekcyjnej, a następnie przetnij skórę wzdłuż od odbytu do podbródka, uważając, aby nie przebić leżącej pod spodem tkanki otrzewnej. Następnie rozrzyj skórę i użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić węzeł chłonny, a drugiej, aby oddzielić tkankę z każdego z miejsc wskazanych na obrazie.

Po pobraniu każdego węzła chłonnego umieść go w naczyniu zbiorczym zawierającym PBS uzupełniony 1% FBS lub PBS plus, a następnie ostrożnie otwórz otrzewną i usuń śledzionę. Umieść również śledzionę w naczyniu zbiorczym i przenieś naczynie do wiadra z lodem, aby wzbogacić płytę CD w cztery dodatnie komórki. Podziel węzły chłonne w śledzionie na dwie oddzielne 60-milimetrowe naczynia zawierające trzy mililitry PBS plus każda za pomocą sterylnych kleszczy.

Następnie umieść kwadrat sterylnej siatki nylonowej na śledzionie i użyj kciuka od strony tłoka strzykawki, aby delikatnie rozbić je o siatkę, aż prawie cała tkanka znajdzie się w zawiesinie. Przetrzyj zawiesinę kilka razy w górę iw dół, aby rozbić pozostałe rozpuszczalne grudki, a następnie umieść nowy kawałek nylonowej siatki nad otworem stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Przefiltruj zawiesinę do rurki, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia.

Teraz powtórz dysocjację mechaniczną dla węzłów chłonnych i napełnij obie probówki przefiltrowanych komórek PBS plus. Następnie odwróć rurki kilka razy i odwiruj komórki. Ponownie zawiesić osad węzłów chłonnych w dwóch mililitrach PBS.

Dodaj jeden mililitr lodowatego roztworu CK na mysz do osadu komórek śledziony. Po minucie zatrzymaj lizę czerwonych krwinek za pomocą 10 mililitrów PBS plus. Odwróć rurkę i ponownie odwiruj komórki.

Następnie ponownie zawieś osad śledziony w 10 dodatkowych mililitrach PBS plus, dodaj komórki węzłów chłonnych i odwiruj zawiesinę komórek w puli. Tym razem ponownie zawiesić granulkę w 15 mikrolitrach CD, czterech kulkach magnetycznych rozcieńczonych w 85 mikrolitrach PBS plus na mysz przez 15 do 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie rozcieńczyć komórki w 10 mililitrach PBS plus.

Przefiltruj zawiesinę przez nylonowe sitko do nowej 15-mililitrowej rurki i odwiruj komórki. Ponownie odkręć pastylkę w 100 mikrolitrach PBS plus na mysz i pozytywnie wybierz na płytę CD cztery dodatnie ogniwa za pomocą wyboru kulek magnetycznych zgodnie z instrukcjami producenta. Po uzyskaniu CD czterech dodatnich, dodatnich frakcji komórek, umyj komórki w 10 mililitrach PBS plus, aby posortować CD cztery dodatnie frakcje komórek T.

Następnie oznacz komórki odpowiednimi przeciwciałami fluorescencyjnymi przez 15 do 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności po umyciu. Przefiltruj oznakowane komórki, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i przenieś je do rurki faksowej na lodzie i chroń ją przed światłem, posortuj populację CD 4 dodatnich, CD 25 ujemnych CD 62 L, dodatnich CD 44 ujemnych na pełne podłoże RPMI. Gdy wszystkie komórki zostaną zebrane.

Umyj naiwne limfocyty T w świeżym, kompletnym podłożu. Następnie ponownie zawieś osad i zakończ RPMI, policz naiwne limfocyty T i dostosuj stężenie do jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr, aby wywołać różnicowanie podzbioru T in vitro. Następnie umyj każdą studzienkę płytek do hodowli komórkowych uprzednio pokrytych anty CD three i anty CD 28 w jednym mililitrze sterylnego PBS wolnego od FBS i płytki.

Komórki ostatecznie uzupełniają pożywkę hodowlaną odpowiednimi cytokinami i przeciwciałami blokującymi, jak opisano w tabeli, i inkubują komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez cztery do pięciu dni po czterech do pięciu dniach w hodowli. Można przeprowadzić wewnątrzkomórkowe barwienie cytokiny czterech dodatnich limfocytów T CD z różnicowanych in vitro hodowli TH jeden, TH dwóch indukowalnych treg i TH 17. Aby potwierdzić, że każdy podzbiór limfocytów T wykazuje oczekiwany profil cytokin.

Rzeczywiście, po 24-godzinnej restymulacji anty CD three EIS, A pokazuje, że podzbiory wykazują również odpowiednią zewnątrzkomórkową produkcję białek cytokin o ekspresji wewnątrzkomórkowej. PCR w czasie rzeczywistym dla czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii dodatkowo weryfikuje odpowiednie profile czynników transkrypcyjnych zróżnicowanych in vitro podzbiorów czterech dodatnich limfocytów T CD. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i przetwarzać lustrzane komórki węzłów chłonnych i śledziony, aby uzyskać naiwne CD cztery dodatnie limfocyty pomocnicze T.

Co więcej, będziesz w stanie różnicować te limfocyty T w komórki TH jeden, TH dwa TH 17 lub komórki ireg.