Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T
16 kwietnia 2015
Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji. Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.
Ogólnym celem poniższej procedury jest polaryzacja naiwnych limfocytów T CD czterech dodatnich limfocytów T wyizolowanych z węzłów chłonnych myszy i śledziony w odrębne podzbiory pomocnicze T. In vitro osiąga się to poprzez wstępne przetwarzanie śledziony i węzłów chłonnych pobranych od dorosłych myszy typu dzikiego. W drugim etapie populacja komórek CD 4 dodatnich jest wzbogacana przez separację kulek magnetycznych, a następnie dalej sortowana przez ich naiwną ekspresję markera limfocytów T.
W ostatnim etapie komórki są traktowane czynnikami aktywującymi receptor limfocytów T i cytokinami polaryzującymi, aby indukować ich różnicowanie w różne linie pomocnicze T. Ostatecznie cytometria przepływowa. Elis A i PCR w czasie rzeczywistym są wykorzystywane do oceny skuteczności różnicowania limfocytów T pomocniczych.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie limfocytów T pomocniczych, takie jak to, w jaki sposób ekspresja określonych cząsteczek lub leczenie określonymi lekami wpływa na charakter odpowiedzi limfocytów T. Zacznij od przypięcia kończyn pięcio- do 10-tygodniowej czarnej myszy sześcioletniej C 57 do deski sekcyjnej, a następnie przetnij skórę wzdłuż od odbytu do podbródka, uważając, aby nie przebić leżącej pod spodem tkanki otrzewnej. Następnie rozrzyj skórę i użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić węzeł chłonny, a drugiej, aby oddzielić tkankę z każdego z miejsc wskazanych na obrazie.
Po pobraniu każdego węzła chłonnego umieść go w naczyniu zbiorczym zawierającym PBS uzupełniony 1% FBS lub PBS plus, a następnie ostrożnie otwórz otrzewną i usuń śledzionę. Umieść również śledzionę w naczyniu zbiorczym i przenieś naczynie do wiadra z lodem, aby wzbogacić płytę CD w cztery dodatnie komórki. Podziel węzły chłonne w śledzionie na dwie oddzielne 60-milimetrowe naczynia zawierające trzy mililitry PBS plus każda za pomocą sterylnych kleszczy.
Następnie umieść kwadrat sterylnej siatki nylonowej na śledzionie i użyj kciuka od strony tłoka strzykawki, aby delikatnie rozbić je o siatkę, aż prawie cała tkanka znajdzie się w zawiesinie. Przetrzyj zawiesinę kilka razy w górę iw dół, aby rozbić pozostałe rozpuszczalne grudki, a następnie umieść nowy kawałek nylonowej siatki nad otworem stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Przefiltruj zawiesinę do rurki, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia.
Teraz powtórz dysocjację mechaniczną dla węzłów chłonnych i napełnij obie probówki przefiltrowanych komórek PBS plus. Następnie odwróć rurki kilka razy i odwiruj komórki. Ponownie zawiesić osad węzłów chłonnych w dwóch mililitrach PBS.
Dodaj jeden mililitr lodowatego roztworu CK na mysz do osadu komórek śledziony. Po minucie zatrzymaj lizę czerwonych krwinek za pomocą 10 mililitrów PBS plus. Odwróć rurkę i ponownie odwiruj komórki.
Następnie ponownie zawieś osad śledziony w 10 dodatkowych mililitrach PBS plus, dodaj komórki węzłów chłonnych i odwiruj zawiesinę komórek w puli. Tym razem ponownie zawiesić granulkę w 15 mikrolitrach CD, czterech kulkach magnetycznych rozcieńczonych w 85 mikrolitrach PBS plus na mysz przez 15 do 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie rozcieńczyć komórki w 10 mililitrach PBS plus.
Przefiltruj zawiesinę przez nylonowe sitko do nowej 15-mililitrowej rurki i odwiruj komórki. Ponownie odkręć pastylkę w 100 mikrolitrach PBS plus na mysz i pozytywnie wybierz na płytę CD cztery dodatnie ogniwa za pomocą wyboru kulek magnetycznych zgodnie z instrukcjami producenta. Po uzyskaniu CD czterech dodatnich, dodatnich frakcji komórek, umyj komórki w 10 mililitrach PBS plus, aby posortować CD cztery dodatnie frakcje komórek T.
Następnie oznacz komórki odpowiednimi przeciwciałami fluorescencyjnymi przez 15 do 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności po umyciu. Przefiltruj oznakowane komórki, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i przenieś je do rurki faksowej na lodzie i chroń ją przed światłem, posortuj populację CD 4 dodatnich, CD 25 ujemnych CD 62 L, dodatnich CD 44 ujemnych na pełne podłoże RPMI. Gdy wszystkie komórki zostaną zebrane.
Umyj naiwne limfocyty T w świeżym, kompletnym podłożu. Następnie ponownie zawieś osad i zakończ RPMI, policz naiwne limfocyty T i dostosuj stężenie do jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr, aby wywołać różnicowanie podzbioru T in vitro. Następnie umyj każdą studzienkę płytek do hodowli komórkowych uprzednio pokrytych anty CD three i anty CD 28 w jednym mililitrze sterylnego PBS wolnego od FBS i płytki.
Komórki ostatecznie uzupełniają pożywkę hodowlaną odpowiednimi cytokinami i przeciwciałami blokującymi, jak opisano w tabeli, i inkubują komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez cztery do pięciu dni po czterech do pięciu dniach w hodowli. Można przeprowadzić wewnątrzkomórkowe barwienie cytokiny czterech dodatnich limfocytów T CD z różnicowanych in vitro hodowli TH jeden, TH dwóch indukowalnych treg i TH 17. Aby potwierdzić, że każdy podzbiór limfocytów T wykazuje oczekiwany profil cytokin.
Rzeczywiście, po 24-godzinnej restymulacji anty CD three EIS, A pokazuje, że podzbiory wykazują również odpowiednią zewnątrzkomórkową produkcję białek cytokin o ekspresji wewnątrzkomórkowej. PCR w czasie rzeczywistym dla czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii dodatkowo weryfikuje odpowiednie profile czynników transkrypcyjnych zróżnicowanych in vitro podzbiorów czterech dodatnich limfocytów T CD. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i przetwarzać lustrzane komórki węzłów chłonnych i śledziony, aby uzyskać naiwne CD cztery dodatnie limfocyty pomocnicze T.
Co więcej, będziesz w stanie różnicować te limfocyty T w komórki TH jeden, TH dwa TH 17 lub komórki ireg.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę polaryzacji naiwnych limfocytów T CD4+ w odrębne subpopulacje limfocytów T pomocniczych z wykorzystaniem technik in vitro. Proces ten obejmuje izolację komórek z węzłów chłonnych i śledziony myszy, wzbogacenie populacji limfocytów T CD4+ oraz poddanie ich działaniu specyficznych stymulacji i cytokin.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Neuronauka
Wprowadzenie
- Naïve CD4 + T cells mogą różnicować się w różne podgrupy efektorowe.
- Proces różnicowania jest wpływany przez czynniki środowiskowe podczas aktywacji.
- Metody in vitro umożliwiają kontrolowane badanie polaryzacji limfocytów T.
- Cytometria przepływowa i PCR są wykorzystywane do oceny wydajności różnicowania.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnej metody polaryzacji naiwnych limfocytów T CD4+.
- Zbadanie wpływu stymulacji receptorów limfocytów T oraz cytokin na różnicowanie.
- Stworzenie ram badawczych dla analizy linii limfocytów T pomocniczych.
Zastosowane metody
- Izolacja naiwnych limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych i śledzion mouse.
- Separacja za pomocą kulek magnetycznych w celu wzbogacenia populacji limfocytów T CD4+.
- Sortowanie w oparciu o ekspresję markerów naiwnych limfocytów T.
- Traktowanie czynnikami aktywującymi receptor limfocytów T i cytokinami polaryzującymi.
Główne wyniki
- Skuteczna polaryzacja naiwnych limfocytów T CD4+ w odrębne subpopulacje limfocytów T pomocniczych.
- Cytometria przepływowa oraz PCR w czasie rzeczywistym potwierdziły efektywność różnicowania.
- Wykazano wpływ specyficznych cytokin na przeznaczenie limfocytów T.
- Przedstawiono spostrzeżenia dotyczące biologii limfocytów T oraz potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
Wnioski
- Metoda ta skutecznie polaryzuje naiwne komórki T CD4+ in vitro.
- Wyniki pogłębiają zrozumienie mechanizmów różnicowania komórek T.
- Potencjalne znaczenie dla immunoterapii i opracowywania szczepionek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie i różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4+ myszy umożliwia mechanistyczną analizę szlaków sygnałowych cytokin, które sterują determinacją podtypów limfocytów T pomocniczych. Podejście to wspiera walidację celów w procesie odkrywania leków immunomodulujących poprzez powiązanie zaburzeń molekularnych z funkcjonalnymi fenotypami odpornościowymi. Metoda ta zapewnia skalowalny, powtarzalny system ograniczania ryzyka w przypadku leków biologicznych lub małocząsteczkowych przeznaczonych do modulacji odporności adaptacyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących wpływu konkretnych cząsteczek lub leków na kierunek różnicowania się limfocytów T.
- Wartość operacyjna: Zapewnia kontrolowany system in vitro do izolacji zmiennych wpływających na determinację linii Th1, Th2, Th17 lub Treg.
- Wartość prognostyczna: Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez powiązanie modulacji celu z wynikami w postaci cytokin i czynników transkrypcyjnych specyficznych dla danej linii.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie zróżnicowanych subpopulacji limfocytów T pomocniczych z mierzalnymi poziomami cytokin i czynników transkrypcyjnych.
- Powtarzalność: Standaryzowany schemat izolacji i polaryzacji umożliwia spójny screening związków w różnych eksperymentach.
- Skalowalność: Wzbogacanie za pomocą kulek magnetycznych oraz sortowanie FACS pozwalają na przetworzenie liczby komórek wystarczającej dla wielodołkowych formatów analiz.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje patologie limfocytów T pomocniczych napędzane przez cytokiny, istotne w chorobach autoimmunologicznych, zapalnych i zakaźnych.
- Ciągłość translacyjna: Zróżnicowane subpopulacje mogą być restymulowane i analizowane pod kątem funkcjonalnej produkcji cytokin, co pozwala na powiązanie wyników in vitro z walidacją ex vivo.
- Zgodność z biomarkerami: Czynniki transkrypcyjne specyficzne dla danej linii (np. T-bet, GATA3, RORγt, FoxP3) służą jako mechanistyczne biomarkery oddziaływania z celem.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po przedkliniczne badania mechanistyczne, umożliwiając iteracyjne projektowanie immunomodulatorów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizę sygnalizacji TCR oraz wpływu środowiska cytokinowego na decyzje dotyczące losów limfocytów T.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowane, spolaryzowane populacje limfocytów T do oceny wpływu związków na różnicowanie podzbiorów.
- Analityka: Cytometria przepływowa i PCR w czasie rzeczywistym zapewniają ilościowe, wieloparametryczne odczyty dotyczące zaangażowania w linię komórkową i skuteczności sygnalizacji.
- Badania translacyjne: Umożliwia ocenę funkcjonalności zróżnicowanych podzbiorów poprzez ponowną stymulację cytokinami, co wspiera walidację przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Podstawowy schemat izolacji i różnicowania może zostać dostosowany do wielu klas celów i warunków cytokinowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Wgląd w mechanizmy wpływu celu na specyfikację linii komórek T pomocniczych oraz polaryzację immunologiczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzowana izolacja komórek, różnicowanie i odczyty analityczne zwiększają powtarzalność testu.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez powiązanie modulacji celu z funkcjonalnymi efektami immunologicznymi na wczesnym etapie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację kandydatów immunomodulujących w oparciu o predykcyjne profile różnicowania limfocytów T.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przetwarzaniu tkanek mysich, separacji za pomocą kulek magnetycznych oraz sortowaniu komórek metodą FACS.
- Zależne od sterylnej infrastruktury do hodowli komórkowych, odczynników cytokinowych oraz sprzętu do cytometrii przepływowej lub qPCR.
- Wymaga standaryzacji pomiędzy operatorami w celu zapewnienia spójności izolacji naiwnych limfocytów T oraz polaryzacji podgrup.
- Adaptacja do alternatywnych szczepów myszy lub modeli chorobowych może wymagać optymalizacji warunków stosowania cytokin.
- Ograniczenia obejmują zmienność między dawcami oraz konieczność potwierdzenia, że wyniki in vitro odzwierciedlają biologię in vivo.
