Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 ⁺ w patogenne komórki Th17 u myszy

Naszym celem badawczym jest ukierunkowane różnicowanie komórek TH17 i zamierzamy zbadać prostą metodę retrodeflacji komórek TH17, która służy jako tradycyjny warunek dla eksperymentów retro związanych z niektórymi chorobami związanymi z komórkami TH17. W wielu badaniach wspomniano o metodach zimowej indukcji komórek TH17, a ostatnie badania koncentrowały się na inhibitorach małocząsteczkowych i innych liniach STEM. Jednak obraz, w którym indukcja prawie wszystkich badań nie była stabilna powyżej 50%Wiele nowych technik zostało zastosowanych do badania przesiewowego i wydzielania śliny komórek TH17, takich jak cytometria przepływowa, sortowanie komórek TH17 i sortowanie kulek magnetycznych dla komórek TH17, Więc kluczowym punktem jest to, że znaleźliśmy prostą metodę indukowania różnicowania komórek TH17 poprzez dodawanie różnych stężeń STA do pożywki i jej różnicowania czystość może być bliska 90%W naszym laboratorium badamy zmiany w mikrośrodowisku immunologicznym, w modelach chorób insertowych, w tym zmiany w komórkach odpornościowych i korektę nierównowagi immunologicznej i tak dalej.

Na początek umieść uśpioną mysz w pozycji leżącej na czystej ławce. Przetnij wzdłuż linii środkowej brzucha myszy i oddziel struktury brzucha warstwa po warstwie. Za pomocą pęsety delikatnie otwórz większe pośladki i brzuch.

Następnie delikatnie wyciągnij śledzionę z więzadłem śledziony i tępo oddziel ją od otaczających tkanek i więzadeł Aby uzyskać nienaruszoną śledzionę, umieść filtr komórkowy o grubości 70 mikronów w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 100 milimetrów. Dodać śledzionę do sitka komórkowego i rozdrobnić ją tłokiem strzykawki. Dodaj od pięciu do ośmiu mililitrów jednorodnego płynu do płukania, aby przepchnąć komórki śledziony przez filtr do naczynia hodowlanego.

Odwirować filtrat o sile 450 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad za pomocą rozcieńczalnika do próbek dostarczonego z zestawem do separacji limfocytów. Po zliczeniu komórek na hemocytometrze dostosuj stężenie komórek do dwa razy 10 do mocy ośmiu komórek na mililitr.

Do probówki wirówkowej weź taką samą ilość roztworu do separacji limfocytów, jak zawiesinę pojedynczej komórki tkanki. Ostrożnie odpipetować zawiesinę jednokomórkową na powierzchnię roztworu do separacji limfocytów i odwirować w temperaturze 800 G przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu obserwuj cztery warstwy w probówce od góry do dołu.

Za pomocą pipety ostrożnie wciągnij pierścieniową mlecznobiałą warstwę limfocytów do innej probówki. Dodaj 10 mililitrów roztworu czyszczącego do probówki, aby wymieszać komórki. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 250 G przez cztery pięć minut.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki RPMI 1640 w celu zliczenia komórek. Na początek przygotuj zawiesinę jednokomórkową śledziony myszy z jednym razy 10 do mocy ośmiu komórek na mililitr. W objętości od 0,1 do dwóch mililitrów dodaj 50 mikrolitrów surowicy szczurzej do próbki.

Przenieść próbkę do pięciomililitrowej probówki z okrągłym dnem z polistyrenu. Dodać 50 mikrolitrów koktajlu izolacyjnego do próbki. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 7,5 minuty w temperaturze pokojowej.

Teraz dodaj 50 mikrolitrów na mililitr koktajlu zubożającego. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 2,5 minuty. W międzyczasie wywiruj kulki magnetyczne, aby zapewnić równomierną dyspersję.

Dodaj 75 mikrolitrów kulek magnetycznych do próbki. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 2,5 minuty. Uzupełnij próbkę pożywką RPMI 1640 do końcowej objętości 2,5 mililitra i kilkakrotnie wymieszaj.

Następnie umieść rurkę w magnesie na 2,5 minuty. Podnieś magnes i odwróć go rurką jednym ciągłym ruchem. Wlanie wzbogaconej zawiesiny komórkowej do nowej probówki.

Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej dla naiwnych limfocytów T CD4 + przed i po izolacji. Po bramkowaniu przenieś zawiesinę komórek do nowej probówki wirówkowej.

Odwirować przy 400 G przez pięć minut i odrzucić supernatant. Zawiesić granulat w 200 do 500 mikrolitrach pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS. Na każdy mililitr hodowli komórkowej dodaj dwa mikrolitry koktajlu aktywacji leukocytów i wymieszaj.

Hoduj komórki w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności nasyconej przez cztery do sześciu godzin. Aby rozpocząć, wyjmij PBS z wstępnie zakodowanej płytki 24-dołkowej. Ponownie zawiesić wzbogacone mysie limfocyty T CD4 + śledziony w pożywce do hodowli komórek TH17 i dozować do różnych studzienek 24-dołkowej płytki wstępnie zakodowanej anty CD3.

Dodać pożywkę do hodowli komórek TH0, klasyczną niepatogenną pożywkę hodowlaną TH17 i klasyczną patogenną pożywkę hodowlaną TH17 w celu kontrastu do pozostałych dołków płytki. Dodaj jeden mikrolitr roztworu mrówek CD 28 do każdej studzienki. Hoduj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni.

W drugim dniu zastąp połowę pożywki supernatantowej do hodowli komórkowych świeżą pożywką. Obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym w piątym dniu. Zbierz supernatanty komórkowe z każdej grupy i zakonserwuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Naiwne limfocyty T CD4 + hodowano z pożywką TH0 i pożywką różnicującą TH17 przez pięć dni, w wyniku czego limfocyty T wykazywały wzrost klastrów w obu pożywkach. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że 90% naiwnych limfocytów T CD4+ pomyślnie różnicowało się w patogenne komórki TH17 pod wpływem stymulacji nowej pożywki do hodowli komórek TH17.