Name: Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 + w patogenne komórki Th17 u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę różnicowania naiwnych limfocytów T CD4+ w patogenne komórki Th17 z wydajnością 90% przy użyciu cytometrii przepływowej. Protokół ten umożliwia badania nad chorobami autoimmunologicznymi u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (No.2022YFC2304604), National Natural Science Foundation of China (No.81971812), National Natural Science Foundation of China (No.82272235), Science Foundation of the Commission of Health of Jiangsu Province (No. ZDB2020009), Kluczowy projekt badawczy, rozwojowy (rozwój społeczny) w prowincji Jiangsu (nr BE2021734), Krajowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Ministerstwa Nauki i Technologii (nr 2020YFC083700), Kluczowe Laboratorium Medycyny Intensywnej Terapii w prowincji Jiangsu (BM2020004), Kluczowy projekt Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81930058), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (82171717), Fundusze Badań Podstawowych Uniwersytetów Centralnych (2242022K4007), oraz projekt ogólny Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20211170).

Th17 Cell Differentiation from Naive CD4+ T-Cells Using Flow Cytometry

<ol><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 cells.</a> Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Bhaumik, S., Basu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+dynamics+of+Th17+differentiation+and+its+developmental+plasticity+in+the+intestinal+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular dynamics of Th17 differentiation and its developmental plasticity in the intestinal immune response.</a> Front Immunol. 8, 254(2017).</li>
<li>Bettelli, E., Korn, T., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+effector+functions+of+T%28H%2917+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction and effector functions of T(H)17 cells.</a> Nature. 453 (7198), 1051-1057 (2008).</li>
<li>Korn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+initiates+an+alternative+pathway+to+induce+proinflammatory+T%28H%2917+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IL-21 initiates an alternative pathway to induce proinflammatory T(H)17 cells.</a> Nature. 448 (7152), 484-487 (2007).</li>
<li>Bettelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).</li>
<li>Yang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+helper+17+lineage+differentiation+is+programmed+by+orphan+nuclear+receptors+ROR+alpha+and+ROR+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha and ROR gamma.</a> Immunity. 28 (1), 29-39 (2008).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+T%28H%2917+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>McGeachy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin+23+receptor+is+essential+for+the+terminal+differentiation+of+interleukin+17-producing+effector+T+helper+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The interleukin 23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo.</a> Nat Immunol. 10 (3), 314-324 (2009).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2+superfamily+cytokine+Activin-A+is+induced+during+autoimmune+neuroinflammation+and+drives+pathogenic+Th17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation.</a> Immunity. 54 (2), 308-323 (2021).</li>
<li>Ramesh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+human+Th17+cells+selectively+express+P-glycoprotein+and+are+refractory+to+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory human Th17 cells selectively express P-glycoprotein and are refractory to glucocorticoids.</a> J Exp Med. 211 (1), 89-104 (2014).</li>
<li>Basdeo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex-Th17+%28nonclassical+Th1%29+cells+are+functionally+distinct+from+classical+Th1+and+Th17+cells+and+are+not+constrained+by+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ex-Th17 (nonclassical Th1) cells are functionally distinct from classical Th1 and Th17 cells and are not constrained by regulatory T cells.</a> J Immunol. 198 (6), 2249-2259 (2017).</li>
<li>Cua, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-23+rather+than+interleukin-12+is+the+critical+cytokine+for+autoimmune+inflammation+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain.</a> Nature. 421 (6924), 744-748 (2003).</li>
<li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+IL-23+receptor+gfp+reporter+mice+reveal+distinct+populations+of+IL-17-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells.</a> J Immunol. 182 (10), 5904-5908 (2009).</li>
<li>Jäger, A., Dardalhon, V., Sobel, R. A., Bettelli, E., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1%2C+Th17%2C+and+Th9+effector+cells+induce+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+with+different+pathological+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1, Th17, and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different pathological phenotypes.</a> J Immunol. 183 (11), 7169-7177 (2009).</li>
<li>Lee, Y., Collins, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+targets+and+triggers+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Unexpected targets and triggers of autoimmunity.</a> J Clin Immunol. 34, Suppl 1 (0 1) S56-S60 (2014).</li>
<li>Chang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+non-coding+aequences+CNS6+and+CNS9+control+cytokine-induced+Rorc+transcription+during+T+helper+17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The conserved non-coding aequences CNS6 and CNS9 control cytokine-induced Rorc transcription during T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 53 (3), 614-626 (2020).</li>
<li>Bunte, K., Beikler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cells+and+the+IL-23%2FIL-17+axis+in+the+pathogenesis+of+periodontitis+and+immune-mediated+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Th17 cells and the IL-23/IL-17 axis in the pathogenesis of periodontitis and immune-mediated inflammatory diseases.</a> Int J Mol Sci. 20 (14), 3394(2019).</li>
<li>Zhao, Y., Liu, Z., Qin, L., Wang, T., Bai, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+mechanisms+of+Th17+differentiation+and+the+Yin-Yang+of+Th17+cells+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Insights into the mechanisms of Th17 differentiation and the Yin-Yang of Th17 cells in human diseases.</a> Mol Immunol. 134, 109-117 (2021).</li>
<li>Berghmans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+orchestrates+the+number+and+function+of+Th17+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ orchestrates the number and function of Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Interferon Cytokine Res. 31 (7), 575-587 (2011).</li>
<li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+Th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic Th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Du, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+hormone+releasing+hormone+signaling+promotes+Th17+cell+differentiation+and+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Growth hormone releasing hormone signaling promotes Th17 cell differentiation and autoimmune inflammation.</a> Nat Commun. 14 (1), 3298(2023).</li>
<li>Ernst, D. N., Weigle, W. O., Noonan, D. J., McQuitty, D. N., Hobbs, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age-associated+increase+in+IFN-gamma+synthesis+by+mouse+CD8%2B+T+cells+correlates+with+shifts+in+the+frequencies+of+cell+subsets+defined+by+membrane+CD44%2C+CD45RB%2C+3G11%2C+and+MEL-14+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The age-associated increase in IFN-gamma synthesis by mouse CD8+ T cells correlates with shifts in the frequencies of cell subsets defined by membrane CD44, CD45RB, 3G11, and MEL-14 expression.</a> J Immunol. 151 (2), 575-587 (1993).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+an+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
<li>El-Hindi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-specific+CerS4+depletion+prolonged+inflammation+and+enhanced+tumor+burden+in+the+AOM%2FDSS-induced+CAC+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">T-cell-specific CerS4 depletion prolonged inflammation and enhanced tumor burden in the AOM/DSS-induced CAC model.</a> Int J Mol Sci. 23 (3), 1866(2022).</li>
<li>Cooney, L. A., Towery, K., Endres, J., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+resistance+to+regulation+by+IL-4+during+Th17+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and resistance to regulation by IL-4 during Th17 maturation.</a> J Immunol. 187 (9), 4440-4450 (2011).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+interleukin-2-based+fusion+molecule%2C+HCW9302%2C+differentially+promotes+regulatory+T+cell+expansion+to+treat+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel interleukin-2-based fusion molecule, HCW9302, differentially promotes regulatory T cell expansion to treat atherosclerosis in mice.</a> Front Immunol. 14, 1114802(2023).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

Procedura ta zaoferowała produktywny sposób na zwiększenie liczby naiwnych limfocytów T CD4 + T śledziony myszy do produkcji in vitro patogennych komórek Th17. Chociaż używamy więcej cytokin niż inne zgłoszone pożywki do hodowli komórek Th17, jesteśmy zaangażowani w optymalizację warunków wzrostu patogennych komórek Th17. Rozważamy dalszą optymalizację naszego protokołu różnicowania indukowanego.
W tym przypadku po prostu użyliśmy cytometrii przepływowej i qPCR do zbadania produkcji charakterystycznych cytokin. Z kilkoma niewielkimi modyfikacjami, podejście to może być również stosowane do innych testów funkcjonalnych, takich jak proliferacja komórek.
Użyliśmy wyprodukowanego w Chinach zestawu do izolacji limfocytów do izolacji limfocytów śledziony myszy, ponieważ jest on skuteczny i oszczędza czas. Rozwiązania do separacji limfocytów oparte na innych markach mogą również osiągnąć cel separacji limfocytów śledziony myszy na różnych etapach. Inną metodą jest bezpośrednia liza czerwonych krwinek uzyskanej zawiesiny komórek śledziony; Odkryliśmy jednak, że czerwone krwinki śledziony często nie mogą być poddawane lizie w tym samym czasie.
Podczas wykonywania tego protokołu mogą wystąpić pewne problemy. Po pierwsze, liczba naiwnych limfocytów T CD4 + uzyskanych przez sortowanie magnetyczne kulek może być bardzo niska (krok 3 protokołu). Można to przypisać niewystarczającemu procesowi miażdżenia narządów. Ważne jest, aby upewnić się, że narząd jest odpowiednio homogenizowany. Zwiększenie częstotliwości płukania podczas procesu homogenizacji poprawi wskaźnik odzysku. Aby uzyskać większą liczbę naiwnych limfocytów T CD4 + śledziony, sugerujemy użycie młodszych myszy (w wieku 6-10 tygodni). Dostępne są różne metody oddzielania limfocytów śledziony, a wydajność może się różnić w zależności od użytego płynu separacyjnego. Zaleca się stosowanie uniwersalnie certyfikowanego płynu separacyjnego i próbę ekstrakcji warstwy limfocytów w jak największym stopniu.
Po drugie, proporcja limfocytów T CD4 + w cytometrii przepływowej może wynosić <80% (krok protokołu 5). Jedną z możliwych przyczyn tego problemu może być niedokładna liczba splenocytów, co skutkuje liczbą komórek większą niż w przypadku dodatkowego koktajlu przeciwciał i kulek magnetycznych. Aby zwiększyć skuteczność naiwnego oczyszczania limfocytów T CD4+ , liczenie komórek musi być precyzyjne. Dodatkowo można użyć o 10% więcej koktajlu przeciwciał i kulek magnetycznych w stosunku do tego, co zaleca ten protokół. Wreszcie, cytometrię przepływową można wykonać natychmiast po posortowaniu naiwnych limfocytów T CD4 + .
Po trzecie, podczas hodowli może nie powstać wiele skupisk limfocytów T, a większość komórek mogła umrzeć podczas różnicowania limfocytów T (krok 4 protokołu). Potencjalną przyczyną tego problemu może być niedokładne określenie liczby komórek dla naiwnych limfocytów T CD4 + przed wysiewem, co skutkuje niską gęstością komórek. Zaleca się przyjęcie dokładniejszej metody liczenia, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek około 4 × 105 komórek/ml na każdą studzienkę w płytce 48-dołkowej. Inną możliwą przyczyną mogą być problemy techniczne z inkubatorem CO2 , takie jak nieprawidłowa temperatura lub stężenie CO2 . Wreszcie, nadmierna siła podczas zmiany pożywki do hodowli komórkowej może potencjalnie spowodować śmierć komórki.
Po czwarte, względne poziomy ekspresji genów cytokin sygnatury mogą być niskie (krok 7 protokołu). Aby zapewnić autentyczność wyekstrahowanego RNA, zaleca się stosowanie stężenia wykrywającego nanokropelki większego niż 100 ng/ml. Potencjalną przyczyną spadku stężenia może być niezdrowy charakter hodowanych komórek, np. duża część pobranych komórek jest martwa lub w trakcie śmierci. Aby uzyskać prawdziwe stężenie RNA, konieczne jest rozwiązanie sytuacji, która może prowadzić do słabego wzrostu podczas hodowli komórek. Alternatywnym powodem tego problemu może być zbyt niska końcowa liczba komórek osiągnięta podczas ekstrakcji RNA, prawdopodobnie z powodu niezamierzonej utraty komórek podczas usuwania supernatantu. Korzystne może okazać się zastosowanie zaawansowanych technik ekstrakcji RNA, takich jak jednoetapowe zestawy do ekstrakcji RNA. Idealny stosunek OD260/OD280, mierzony za pomocą Nanodrop, powinien mieścić się w zakresie 1,9-2,1. W przypadku zbyt niskiego współczynnika możliwe staje się zanieczyszczenie białkami. Zwiększenie częstotliwości mycia wolnych od RNaz może pomóc w złagodzeniu tego problemu. I odwrotnie, nietypowo niski stosunek implikuje potencjalną degradację RNA. Aby przeciwdziałać temu problemowi, zaleca się stosowanie wody wolnej od RNaz i użycie probówek o pojemności 1,5 ml do celów dekontaminacji RNazy.
Podsumowując, obecny protokół opisuje zastosowanie nowej pożywki do hodowli komórkowych w celu bezpośredniego indukowania naiwnych limfocytów T CD4 + do różnicowania się w patogenne komórki Th17 in vitro. W porównaniu z separacją bezpośrednią nie ma wątpliwości, że ta metoda jest bardziej bezpośrednia, niedroga i bardziej wydajna. Konfiguracja pożywki jest również bardzo prosta, dzięki czemu zbudowane komórki Th17 mogą być bardziej intuicyjnie wykorzystywane do kolejnych eksperymentów, stanowiąc bardzo dobry model komórkowy do badania wielu chorób.

Po opuszczeniu grasicy, naiwne limfocyty T CD4+ przechodzą przez wtórne narządy limfoidalne. Komórki prezentujące antygen, które przekazują homologiczne antygeny do naiwnych limfocytów T CD4 +, aktywują je, rozpoczynając serię programów różnicowania, które ostatecznie prowadzą do produkcji wysoce wyspecjalizowanych linii komórek T pomocniczych (Th)1. Produkcja interleukiny 17 (IL-17) charakteryzuje komórki Th17, subpopulację prozapalnych komórek Th2. Komórki Th17 odgrywają rolę w obronie gospodarza przed patogenami zewnątrzkomórkowymi oraz w patogenezie wielu chorób autoimmunologicznych, takich jak autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka i stwardnienie rozsiane. Sygnały z receptorów limfocytów T i cytokin IL-6 oraz transformującego czynnika wzrostu-β (TGF-β) indukują różnicowanie naiwnych limfocytów T w komórki Th17 poprzez fosforylację przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT)33. STAT3 jest dodatkowo wzmacniany w pętli dodatniego sprzężenia zwrotnego poprzez sygnalizację, w której pośredniczą IL-23 i IL-214,5. Fosforylacja STAT3 może indukować ekspresję czynników transkrypcyjnych RORγt i RORα, które działają jako główne przełączniki regulujące profil cytokin IL-17A, IL-17F, IL-21 i IL-22 w komórkach Th176. Doniesiono jednak, że komórki Th17 indukowane przez IL-6 i TGF-β są niewystarczające do wywołania chorób autoimmunologicznych, które wymagają kostymulacji przez IL-23 lub oddzielnej kostymulacji IL-6, IL-1β i IL-23 przy braku TGF-β7,8.
Th17 podzbiory, które nie mogą skutecznie wywołać eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), są czasami określane jako niepatogenne Th17, podczas gdy podzbiory Th17, które mogą indukować EAE, są znane jako patogenne Th179. Obecne badania wykazały, że chociaż patogenny Th17 i niepatogenny Th17 współwyrażają podstawowy czynnik transkrypcyjny RORγt, istnieją duże różnice w zdolności do wytwarzania IL-17A oraz właściwościach prozapalnych i przeciwzapalnych10. Oprócz wysokiej ekspresji RORγt, CCR6, STAT4 i RUNX4, które są powszechnymi charakterystycznymi czynnikami transkrypcyjnymi Th17, patogenne komórki Th17 wykazują również dodatkowe cechy ekspresji sygnału genowego związane z chorobą, takie jak TBX21, IFN-γ i CXCR3, które mają cechy podzbiorów komórek Th1. Patogenne komórki Th17 mogą wydzielać wysoki poziom czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), IFN-γ, TNF-α i innych cytokin11,12. Fenotyp niepatogennych komórek Th17 jest niestabilny i tylko pod wpływem stymulacji CD3 i cytokiny IL-2 niektóre z tych komórek mogą różnicować się w patogenne komórki Th17. Dlatego w powszechnych klinicznych modelach chorób, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane i zespół ostrej niewydolności oddechowej, patogenne komórki Th17 wywierają przede wszystkim działanie patogenne.
Patogenne i niepatogenne komórki Th17 mogą różnicować się in vitro pod wpływem różnych cytokin. W ostatnich latach w kilku badaniach zaproponowano metody indukowania różnicowania komórek Th17 przy użyciu różnych typów i stężeń cytokin. Komórki Th17 są stymulowane przez kombinację IL-6, IL-1β i IL-2313,14,15,16. Udowodniono, że IL-6 i TGF-β, dwie cytokiny niezbędne do różnicowania komórek Th17, synergistycznie regulują ekspresję różnicowania komórek RORγt i Th17 poprzez interakcję z dwiema różnymi konserwatywnymi niekodującymi sekwencjami DNA w locusRorc class="xref">17. Stabilna faza patogennych komórek Th17 jest utrzymywana głównie przez IL-2318,19. IL-23 wiąże się ze swoim receptorem i aktywuje szlak sygnałowy JAK-STAT20, powodując w ten sposób fosforylację Jak2 i Tyk2 oraz promując fosforylację STAT1, STAT3, STAT4 i STAT5. IL-4 i IFN-γ są negatywnymi regulatorami tego szlaku. Jednak badania wykazały, że IL-1β może pozytywnie regulować transkrypcję Rorα i Rorγt poprzez szlak mTOR w celu utrzymania stabilności fenotypu komórek Th1721.
Ze względu na niejednorodność licznych badań, wybraliśmy protokoły indukcji dla patogennych i niepatogennych komórek Th17 z najnowszych badań jako kontrole22. Wyniki wskazują, że przy założeniu, że wszystko odbywa się zgodnie z tym protokołem, po 5 dniach hodowli pod warunkiem wytworzenia patogennego Th17, ponad 90% komórek, które przeżyły, może być patogennymi komórkami Th17.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat anty-myszy CD62L, BV650, klon MEL-14, rozcieńczenie 1:200</td><td>BD</td><td>Cat# 564108; RRID: AB_2738597</td><td></td></tr><tr><td>Szczur monoklonalny anty-CD4, FITC, klon RM4-5, rozcieńczenie 1:200</td><td>BioLegend</td><td>Cat#100509; RRID: AB_312712</td><td></td></tr><tr><td>Szczur monoklonalny anty-IL-17A, PE, klon TC11-18H10.1, rozcieńczenie 1:200</td><td>BioLegend</td><td>Cat#506903; RRID: AB_ 315463</td><td></td></tr><tr><td>Szczur monoklonalny anty mysz/człowiek CD44, APC, klon IM&, rozcieńczenie 1:200</td><td>BioLegend</td><td>Cat#103012; RRID: AB_312963</td><td></td></tr><tr><td>Szczurzy monoklonalny anty-ROR&gamma; T, APC, klon B2D, rozcieńczenie 1:200</td><td>Invitrogen</td><td>Cat#17-6981-80; RRID: AB_2573253</td><td></td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało monoklonalne FOXP3, PE, klon FJK-16s, rozcieńczenie 1:200</td><td>Invitrogen</td><td>Cat#12-5773-82; RRID: AB_465936</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3 SAFIRE oczyszczone</td><td>bioklejnoty</td><td>Cat#05112-25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD28 SAFIRE oczyszczone</td><td>bioklejnoty</td><td>Cat#10312-25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IFN gamma</td><td>biogems</td><td>Cat#80822-25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IL-4</td><td>biogems</td><td>Kot#81112-25</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Xilong scientific</td><td>Kot#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>Cat#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat#130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>gibco</td><td>Cat#35050079</td><td></td></tr><tr><td>Mysz rIL-1 beta</td><td>Sino</td><td>Biologiczny Kot#50101-MNAE</td><td></td></tr><tr><td>Mysz rIL-6</td><td>Sino Biological Cat</td><td>#50136-MNAE</td><td></td></tr><tr><td>Mysz rIL-23</td><td>Sino Biological</td><td>Cat#CT028-M08H</td><td></td></tr><tr><td>Mysz TGF beta 1</td><td>Sino Biological</td><td>Cat#50698-M08H</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Procell</td><td>Cat#PB180327</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-2</td><td>peprotech</td><td>Cat#212-12</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 z L-glutaminą</td><td>Gibco</td><td>Cat#11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>Cat#15070063</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#M6250-100ML</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Krytyczne testy komercyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw roztworu do separacji limfocytów narządów zwierzęcych</td><td>Tbdscience</td><td>Cat#TBD0018SOP</td><td>Zawiera płyn do separacji limfocytów w tkance śledziony zwierzęcej, rozcieńczalnik do próbek tkanek (nr kat. 2010C1119), roztwór do czyszczenia próbki (nr kat. 2010X1118), roztwór do mycia próbek (nr kat. TBTDM-W), płyn do płukania homogenatu tkankowego (F2013TBD)</td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)</td><td>Vazyme</td><td>Cat#Q341-02</td><td>https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.</td></tr><tr><td>Utrwalanie/przepuszczalność Koncentrat</td><td>invitrogen</td><td>Cat#00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalanie / Permeabilization Diluent</td><td>invitrogen</td><td>Cat#00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye EF506</td><td>invitrogen</td><td>Cat#65-0866</td><td></td></tr><tr><td>HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)</td><td>Vazyme</td><td>Cat#R223-01</td><td>https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.</td></tr><tr><td>Koktajl aktywacji leukocytów</td><td>BD</td><td>Cat#550583</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-17A (interleukina 17A) Zestaw ELISA</td><td>Elabscience&reg;</td><td>Nr kat.#E-EL-M0047</td><td></td></tr><tr><td>Na&iuml; ve CD4+ zestaw do izolacji limfocytów T, mysi</td><td>STEMCELL</td><td>Cat#19765</td><td>Zestaw EasySep zawiera koktajl izolacji limfocytów T CD4 + myszy [nr kat. 19852C.1], koktajl zubożający limfocyty T pamięci myszy [nr kat. 18766C], streptawidyna RapidSphered 50001 [nr kat. 50001], normalna surowica szczura [nr kat. 13551]); Przechowywać surowicę szczura tylko w temperaturze -20 & Deg; C; inne składniki należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C.</td></tr><tr><td>Bufor permeabilizacyjny</td><td>invitrogen</td><td>Cat#00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>SPARKeasy Cell RNA Kit</td><td>Sparkjade</td><td>Cat#AC0205-B</td><td>https://www.sparkjade.com/product/detail?id=85</td></tr><tr><td>Modele eksperymentalne: Organizmy/szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz: C57BL/6</td><td>Gempharmatech</td><td>Cat#000013</td><td></td></tr><tr><td> Oligonukleotydy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Il17a Startery TaqMan z sondą</td><td>rybobio</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Il17f Startery TaqMan z sondą</td><td>rybobio</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Il23r Startery TaqMan z sondą</td><td>rybobio</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Rora TaqMan startery z sondą</td><td>rybobio</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-aktyna Startery TaqMan z sondą</td><td>rybobio</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Oprogramowanie i algorytmy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora</td><td>Cytek</td><td>https://spectrum.cytekbio.com/</td><td></td></tr> <tr><td>FlowJo v10.8.1</td><td>Drzewo Gwiazda</td><td>https://www.flowjo.com</td><td></td></tr><tr><td>pryzmat GraphPad 9</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>https://www.graphpad-prism.cn</td><td></td></tr><tr><td>Inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL strzykawka</td><td>Kindly</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki wirówkowe</td><td>Eppendorf</td><td>Cat#MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Probówki okrągłodenne</td><td>Corning</td><td>Cat#352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówki wirówkowe</td><td>NEST</td><td>Cat#601052</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka do hodowli tkankowej (spłaszczone dno)</td><td>Corning</td><td>Kat#3548</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe</td><td>NEST</td><td>Cat#602052</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Sitko do komórek</td><td>Biosharp</td><td>Cat#BS-70-XBS</td> 96-dołkowe <td></td></tr><tr><td>płytki qPCR bez osłonki</td><td>VIOX scientific</td><td>Cat#V4801-M</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>Cat#430167</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher</td><td>HEPA Class100</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora</td><td>Cytek</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki preparacyjne</td><td>RWD</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>AlphaCell</td><td>Cat#J633201</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Roche</td><td>LightCycler96</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta chirurgiczna</td><td>RWD</td><td>F12005-10</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000 Touch</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów t cd4 + w patogenne komórki th17 u myszy

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

Techniki różnicowania limfocytów T in vitro są niezbędne zarówno do funkcjonalnych, jak i mechanistycznych badań limfocytów T CD4+. Patogenne komórki Th17 zostały w ostatnim czasie powiązane z wieloma chorobami, w tym stwardnieniem rozsianym (SM), reumatoidalnym zapaleniem stawów, zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), posocznicą i innymi zaburzeniami autoimmunologicznymi. Jednak obecnie znane protokoły różnicowania in vitro mają trudności z osiągnięciem wysokiej czystości patogennych komórek Th17, przy skuteczności indukcji często poniżej 50%, co jest kluczowym wyzwaniem w eksperymentach in vitro. W tym protokole proponujemy ulepszony protokół hodowli i różnicowania in vitro dla patogennych komórek Th17, który służy do bezpośredniego różnicowania naiwnych limfocytów T CD4 + wyizolowanych ze śledziony myszy w patogenne komórki Th17. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące izolacji splenocytów, oczyszczania naiwnych limfocytów T CD4 + i różnicowania patogennych komórek Th17. Dzięki temu protokołowi możemy osiągnąć czystość różnicowania na poziomie około 90% dla patogennych komórek Th17, co spełnia podstawowe potrzeby wielu eksperymentów komórkowych.

Nasz protokół opracowano w oparciu o wcześniejsze badania dotyczące różnicowania patogennych komórek Th17. Pierwszym krokiem eksperymentu jest ocena czystości naiwnych limfocytów T CD4+ izolowanych z śledziony za pomocą sortowania magnetycznego, co stanowi podstawę sukcesu naszego późniejszego różnicowania patogennych komórek Th17. Czystość naiwnych limfocytów T CD4+ określano przy użyciu markerów powierzchniowych CD62L23 oraz CD4424, natomiast FOXP325 wykorzystano jako marker komórek Treg. Stwierdzono, że zawartość komórek Treg uległa znacznemu zmniejszeniu po sortowaniu, a czystość naiwnych limfocytów T CD4+ mogła osiągnąć co najmniej 95% (Rycina 1). Aby porównać różnicowanie patogennych komórek Th17, naiwne limfocyty T CD4+ hodowano w medium Th0 (Tabela 1) oraz w medium do różnicowania Th17 (Tabela 1) przez łącznie 5 dni. Zaobserwowano, że limfocyty T wykazywały wzrost w skupiskach w obu mediach, Th0 i Th17 (Rycina 2).
Następnie komórki zostały utrwalone, permeabilizowane i znakowane przeciwciałami przeciwko kilku cytokinom w zróżnicowanych limfocytach T CD4+ z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Analizowano IL17A26 oraz RORγT27 jako charakterystyczne cytokiny dla różnicowania komórek Th17; stwierdzono, że 90% naiwnych limfocytów T CD4+ zróżnicowało się pomyślnie w patogenne komórki Th17 pod wpływem stymulacji nową pożywką do hodowli komórek Th17 (Rysunek 3). Rysunek 5 przedstawia sygnaturowe geny komórek Th17 wykryte metodą PCR, co potwierdziło stabilną ekspresję w uzyskanych w procesie różnicowania patogennych komórkach Th17.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; analiza CD4-FITC, Foxp3-PE; wyniki przed i po izolacji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66718/66718fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Strategia bramkowania dla analizy charakterystycznych cytokin u myszy C57BL/6J przed i po izolacji naiwnych limfocytów T CD4+.Skróty: FSC-H = wysokość piku rozproszenia przedniego; SSC-H = wysokość piku rozproszenia bocznego; FSC-A = pole piku rozproszenia przedniego; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PE = fikoerytryna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66718/66718fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopu porównujący hodowle komórkowe A i B w skali 50 μm w celu analizy morfologii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66718/66718fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy naiwnych limfocytów T CD4+ myszy hodowanych przez 5 dni w warunkach patogennych Th17 oraz Th0. (A) komórki Th0; (B) patogenne komórki Th17. Paski skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66718/66718fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; analiza hodowli komórek Th0 do Th17; markery CD4-FITC, IL-17A-PE, RORγ T-APC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66718/66718fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza cytometrią przepływową po różnicowaniu indukowanym przez pożywkę do hodowli komórek Th0 oraz pożywkę do hodowli komórek Th17. Skróty: FSC-H = wysokość piku rozpraszania w przód; SSC-H = wysokość piku rozpraszania bocznego; FSC-A = pole piku rozpraszania w przód; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PE = fikoerytryna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66718/66718fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy poziomu IL-17 w komórkach Th0, Th17-Non, Th17-path, Th17-new; zaznaczono istotność statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66718/66718fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Zawartość IL-17A w supernatancie pożywki hodowlanej komórek Th0 oraz pożywki hodowlanej komórek Th17 po indukcji różnicowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66718/66718fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie ekspresji genów, cztery wykresy, Th0 vs Th17; poziomy mRNA Il17a, Il17f, Rora, Il23r." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66718/66718fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki poziomów ekspresji charakterystycznych cytokin w zróżnicowanych komórkach T CD4+ myszy C57BL/6J. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66718/66718fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3"></td>
			<td colspan="3"> Pożywka do hodowli patogennych komórek Th17</td>
			<td colspan="3">pożywka do hodowli komórek Th0</td>
			<td colspan="3">Klasyczna pożywka do hodowli niepatogennych komórek Th17</td>
			<td colspan="3">Klasyczna pożywka do hodowli patogennych komórek Th17.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Odczynnik</td>
			<td colspan="2">Stężenie końcowe </td>
			<td>Ilość</td>
			<td colspan="2">Stężenie końcowe </td>
			<td>Ilość</td>
			<td colspan="2">Stężenie końcowe </td>
			<td>Ilość</td>
			<td colspan="2">Stężenie końcowe </td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Penicylina-streptomycyna (100x)</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Płódwołowa surowica bydlęca</td>
			<td colspan="2">10%</td>
			<td>5 ml</td>
			<td colspan="2">10%</td>
			<td>5 mL</td>
			<td colspan="2">10%</td>
			<td>5 ml</td>
			<td colspan="2">10%</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">$\beta$-merkaptoetanol</td>
			<td colspan="2">50 μM</td>
			<td>50 μL</td>
			<td colspan="2">50 μM</td>
			<td>50 μL</td>
			<td colspan="2">50 μM</td>
			<td>50 μL</td>
			<td colspan="2">50 μM</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">suplement GlutaMAXTM (100x)</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1x</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Roztwór pirogronianu sodu (100x)</td>
			<td colspan="2">1 mM</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1 mM</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1 mM</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">1 mM</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Przeciwciało przeciwko IFN gamma mysiej (1 mg/ml)</td>
			<td colspan="2">5 µg/mL</td>
			<td>250 μL</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">10 µg/mL</td>
			<td>500 μL</td>
			<td colspan="2">10 µg/mL</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Przeciwciało przeciwko IL-4 mysiej (2 mg/ml)</td>
			<td colspan="2">5 µg/mL</td>
			<td>125 μL</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">5 µg/mL</td>
			<td>250 μL</td>
			<td colspan="2">10 µg/mL</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">mysia rIL-1 beta (20 µg)</td>
			<td colspan="2">20 ng/mL</td>
			<td>ND</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">mysia rIL-6 (20 µg)</td>
			<td colspan="2">20 ng/ml</td>
			<td>ND</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">50 ng/ml</td>
			<td>ND</td>
			<td colspan="2">50 ng/mL</td>
			<td>N/D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">mysia rIL-23 (50 µg)</td>
			<td colspan="2">50 ng/mL</td>
			<td>NA</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">10 ng/mL</td>
			<td>ND</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">mysi TGF beta (100 µg)</td>
			<td colspan="2">3 ng/ml</td>
			<td>ND</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">1 ng/ml</td>
			<td>ND</td>
			<td colspan="2">1 ng/ml</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3"> mysia IL-2 (5 µg)</td>
			<td colspan="2">20 ng/mL</td>
			<td>Brak danych</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">RPMI 1640</td>
			<td colspan="2">Brak danych</td>
			<td>Do 50 ml</td>
			<td colspan="2">ND </td>
			<td>Do 50 ml</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">ND</td>
			<td>Do 50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Suma</td>
			<td colspan="2">ND</td>
			<td>50 ml</td>
			<td colspan="2">ND</td>
			<td>50 ml</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">ND</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Pożywki do hodowli docelowych patogennych komórek Th17, komórek Th0 oraz klasycznych niepatogennych i patogennych komórek Th17.

Ten protokół opisuje różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4+ w patogenne komórki Th17 in vitro. W szczególności, w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrowej cytometrii przepływowej, można uzyskać 90% czystość patogennych komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu tej metody różnicowania.

Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 + w patogenne komórki Th17 u myszy

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

Naszym celem badawczym jest ukierunkowane różnicowanie komórek TH17 i zamierzamy zbadać prostą metodę retrodeflacji komórek TH17, która służy jako tradycyjny warunek dla eksperymentów retro związanych z niektórymi chorobami związanymi z komórkami TH17. W wielu badaniach wspomniano o metodach zimowej indukcji komórek TH17, a ostatnie badania koncentrowały się na inhibitorach małocząsteczkowych i innych liniach STEM. Jednak obraz, w którym indukcja prawie wszystkich badań nie była stabilna powyżej 50%Wiele nowych technik zostało zastosowanych do badania przesiewowego i wydzielania śliny komórek TH17, takich jak cytometria przepływowa, sortowanie komórek TH17 i sortowanie kulek magnetycznych dla komórek TH17, Więc kluczowym punktem jest to, że znaleźliśmy prostą metodę indukowania różnicowania komórek TH17 poprzez dodawanie różnych stężeń STA do pożywki i jej różnicowania czystość może być bliska 90%W naszym laboratorium badamy zmiany w mikrośrodowisku immunologicznym, w modelach chorób insertowych, w tym zmiany w komórkach odpornościowych i korektę nierównowagi immunologicznej i tak dalej.Na początek umieść uśpioną mysz w pozycji leżącej na czystej ławce. Przetnij wzdłuż linii środkowej brzucha myszy i oddziel struktury brzucha warstwa po warstwie. Za pomocą pęsety delikatnie otwórz większe pośladki i brzuch.Następnie delikatnie wyciągnij śledzionę z więzadłem śledziony i tępo oddziel ją od otaczających tkanek i więzadeł Aby uzyskać nienaruszoną śledzionę, umieść filtr komórkowy o grubości 70 mikronów w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 100 milimetrów. Dodać śledzionę do sitka komórkowego i rozdrobnić ją tłokiem strzykawki. Dodaj od pięciu do ośmiu mililitrów jednorodnego płynu do płukania, aby przepchnąć komórki śledziony przez filtr do naczynia hodowlanego.Odwirować filtrat o sile 450 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad za pomocą rozcieńczalnika do próbek dostarczonego z zestawem do separacji limfocytów. Po zliczeniu komórek na hemocytometrze dostosuj stężenie komórek do dwa razy 10 do mocy ośmiu komórek na mililitr.Do probówki wirówkowej weź taką samą ilość roztworu do separacji limfocytów, jak zawiesinę pojedynczej komórki tkanki. Ostrożnie odpipetować zawiesinę jednokomórkową na powierzchnię roztworu do separacji limfocytów i odwirować w temperaturze 800 G przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu obserwuj cztery warstwy w probówce od góry do dołu.Za pomocą pipety ostrożnie wciągnij pierścieniową mlecznobiałą warstwę limfocytów do innej probówki. Dodaj 10 mililitrów roztworu czyszczącego do probówki, aby wymieszać komórki. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 250 G przez cztery pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki RPMI 1640 w celu zliczenia komórek. Na początek przygotuj zawiesinę jednokomórkową śledziony myszy z jednym razy 10 do mocy ośmiu komórek na mililitr. W objętości od 0,1 do dwóch mililitrów dodaj 50 mikrolitrów surowicy szczurzej do próbki.Przenieść próbkę do pięciomililitrowej probówki z okrągłym dnem z polistyrenu. Dodać 50 mikrolitrów koktajlu izolacyjnego do próbki. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 7,5 minuty w temperaturze pokojowej.Teraz dodaj 50 mikrolitrów na mililitr koktajlu zubożającego. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 2,5 minuty. W międzyczasie wywiruj kulki magnetyczne, aby zapewnić równomierną dyspersję.Dodaj 75 mikrolitrów kulek magnetycznych do próbki. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 2,5 minuty. Uzupełnij próbkę pożywką RPMI 1640 do końcowej objętości 2,5 mililitra i kilkakrotnie wymieszaj.Następnie umieść rurkę w magnesie na 2,5 minuty. Podnieś magnes i odwróć go rurką jednym ciągłym ruchem. Wlanie wzbogaconej zawiesiny komórkowej do nowej probówki.Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej dla naiwnych limfocytów T CD4 + przed i po izolacji. Po bramkowaniu przenieś zawiesinę komórek do nowej probówki wirówkowej.Odwirować przy 400 G przez pięć minut i odrzucić supernatant. Zawiesić granulat w 200 do 500 mikrolitrach pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS. Na każdy mililitr hodowli komórkowej dodaj dwa mikrolitry koktajlu aktywacji leukocytów i wymieszaj.Hoduj komórki w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności nasyconej przez cztery do sześciu godzin. Aby rozpocząć, wyjmij PBS z wstępnie zakodowanej płytki 24-dołkowej. Ponownie zawiesić wzbogacone mysie limfocyty T CD4 + śledziony w pożywce do hodowli komórek TH17 i dozować do różnych studzienek 24-dołkowej płytki wstępnie zakodowanej anty CD3.Dodać pożywkę do hodowli komórek TH0, klasyczną niepatogenną pożywkę hodowlaną TH17 i klasyczną patogenną pożywkę hodowlaną TH17 w celu kontrastu do pozostałych dołków płytki. Dodaj jeden mikrolitr roztworu mrówek CD 28 do każdej studzienki. Hoduj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni.W drugim dniu zastąp połowę pożywki supernatantowej do hodowli komórkowych świeżą pożywką. Obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym w piątym dniu. Zbierz supernatanty komórkowe z każdej grupy i zakonserwuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Naiwne limfocyty T CD4 + hodowano z pożywką TH0 i pożywką różnicującą TH17 przez pięć dni, w wyniku czego limfocyty T wykazywały wzrost klastrów w obu pożywkach. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że 90% naiwnych limfocytów T CD4+ pomyślnie różnicowało się w patogenne komórki TH17 pod wpływem stymulacji nowej pożywki do hodowli komórek TH17.

in-vitro-differentiation-naive-cd4-t-cells-into-pathogenic-th17-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Tutaj prezentujemy protokół różnicowania mysich komórek T pomocniczych (THGM) granulocytów, makrofagów, czynników stymulujących tworzenie kolonii od naiwnych limfocytów T CD4+, w tym izolację naiwnych limfocytów T CD4+, różnicowanie THGM i analizę zróżnicowanych komórek THGM. Metoda ta może być stosowana do badań nad regulacją i funkcją komórek THGM.

In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (THGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF)

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Opisujemy metodę modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą transgenu przy użyciu niewirusowego systemu transpozonu piggyBac. Limfocyty T zmodyfikowane z wykorzystaniem systemu transpozonu piggyBac wykazują stabilną ekspresję transgenu.

Modyfikacja pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonalnego piggyBac

Zapewniamy powtarzalną metodę wywoływania cukrzycy typu 1 (T1D) u myszy w ciągu dwóch tygodni poprzez adopcyjny transfer pierwotnych limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu wysp trzustkowych.

Przyspieszona indukcja cukrzycy typu 1 u myszy przez adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4 +

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Poznaj metodę różnicowania naiwnych limfocytów T CD4+ w patogenne komórki Th17 z wydajnością 90% przy użyciu cytometrii przepływowej. Protokół ten umożliwia badania nad chorobami autoimmunologicznymi u myszy.

Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 ⁺ w patogenne komórki Th17 u myszy

Przeglądaj więcej filmów