Produkcja bioaktywnego, opartego na PCL "samodopasowanego" rusztowania polimerowego z pamięcią kształtu

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wytworzenie rusztowania z polimeru z pamięcią kształtu (SMP), które jest zdolne do samoczynnego dopasowania się do nieregularnego ubytku w obrębie twarzoczaszki, aby promować osteointegrację i gojenie tkanek kostnych. Osiąga się to poprzez uprzednie utworzenie spiekanego szablonu solnego przy użyciu odlewania z rozpuszczalnika i fotochemicznego utwardzania diakrylanu polikaprolaktonu. Na szablonie solnym formowane jest rusztowanie o wysokim stopniu wzajemnie połączonej porowatości, niezbędnej dla przewodnictwa kostnego.

W drugim kroku rusztowanie jest powlekane polidopaminą, która zapewnia bioaktywność. Następnie rusztowanie jest traktowane ciepłym roztworem soli fizjologicznej, co umożliwia jego dopasowanie metodą prasową do nieregularnego modelu. Otrzymane wyniki defektów wykazują samopodpasowanie, słabą spójność wewnętrzną oraz bioaktywność na podstawie wyników dopasowania prasowego, obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej oraz tworzenia hydroksyapatytu in vitro.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak autoszczepienie, jest to, że uzyskane dopasowanie kształtu krytycznie wspiera osteointegrację i gojenie kości. Procedurę tę demonstruje Lindsey Nail, doktorantka prowadząca badania w moim laboratorium. Aby rozpocząć przygotowanie rusztowania, najpierw przesiej chlorek sodu przez sito o oczkach 425 micron i przenieś 1,8 grama substancji do trzech litrowej szklanej fiolki; następnie powoli dodaj do fiolki 146 miligramów wody dejonizowanej, mieszając za pomocą metalnej szpatułki.

Po każdym dodaniu zakręć fiolkę, owiń ją chusteczką i umieść pionowo w probówce do wirowania. Wirowaj probówkę przez 15 minut, a następnie odkręć zakrętkę i pozostaw roztwór do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Po zsyntezowaniu P-C-L-D-A zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przygotuj w szklanej fiolce roztwór maceracyjny zawierający 150 mg P-C-L-D-A na mililitr chlorometanu, zakręć fiolkę, owiń ją folią i mieszaj w wstrząsarze wortex przez jedną minutę.

Następnie przygotuj roztwór inicjatora światła zawierający 115 mg DMP w 1 ml 1-winyl-2-pyrolidonu w szklanej probówce. Ponownie zakręć probówkę, owiń ją folią i mieszaj na wortexie przez jedną minutę. Pipetą dodaj roztwór inicjatora światła do roztworu macerującego, aby uzyskać mieszaninę o stężeniu 15% objętościowo, a następnie mieszaj probówkę na wortexie przez jedną minutę.

Następnie owiń folią fiolkę zawierającą rusztowanie solne i dodaj mieszaninę maceracyjną z fotoinicjatorem, aż sól zostanie całkowicie pokryta. Zamknij fiolkę zakrętką, owiń ją chusteczką i umieść pionowo w probówce do wirowania. Wiruj probówkę przez 10 minut.

Następnie należy usunąć folię, odkręcić nakrętkę z fiolki i naświetlać roztwór światłem ultrafioletowym przez trzy minuty. Po tym czasie należy pozostawić roztwór do wyschnięcia na powietrzu przez noc, a następnie naciąć i przełamać szkło, aby usunąć górną część fiolki za pomocą pęsety. Przenieść rusztowanie do roztworu wody i etanolu w stosunku jeden do jednego na cztery dni, wymieniając roztwór codziennie.

Na koniec wyjmij rusztowanie SMP i pozostaw do wysuszenia na powietrzu przez noc. Aby nałożyć powłokę z polidopaminy, należy najpierw włożyć igłę o rozmiarze 20 G do połowy wysokości rusztowania SMP, a następnie owinąć drutem nasadę igły. Zanurz rusztowanie w 200 mililitrach mieszanego roztworu dopaminy, utrzymując nasadę igły nad roztworem poprzez przymocowanie drutu do krawędzi zlewki.

Następnie należy włożyć strzykawkę do piasty igły i odciągnąć tłok, aby usunąć powietrze z rusztowania. Po całkowitym odpowietrzeniu pozostawić rusztowanie zanurzone przez 16 godzin. Wyjąć rusztowanie z roztworu i usunąć igłę.

Następnie opłucz rusztowanie wodą dejonizowaną i susz je w suszarce próżniowej w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Umieść rusztowanie w suszarce w temperaturze 85 °C na jedną godzinę. Na koniec wyjmij rusztowanie i poczekaj, aż ostygnie do temperatury pokojowej.

Najpierw przygotuj model defektu, wykonując w arkuszu sztywnego tworzywa o grubości 5 mm nieregularny otwór o średnicy średnio około 6 mm. Następnie zanurz rusztowanie SMP w zlewce z wodą dejonizowaną o temperaturze około 60 °C na dwie minuty. Sprawdź, czy rusztowanie wyraźnie zmiękło, manipulując jego kształtem za pomocą pęsety.

Usuń zmiękczone rusztowanie z wody za pomocą pęsety i dociśnij je ręcznie do modelu defektu. Pozostaw rusztowanie do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie wyjmij je z modelu defektu. Zaobserwuj nową utrwaloną formę tymczasową, aby ocenić pory, przełączalność oraz rozmiar.

Najpierw, używając pęsety, zanurz rusztowanie SMP w ciekłym azocie na jedną minutę. Następnie przełam rusztowanie w poprzek, używając czystej żyletki. W kolejnym kroku zamocuj jedną z połówek rusztowania na stoliku dla próbek, tak aby przełamana powierzchnia była skierowana do góry.

Używając taśmy węglowej, napylaj rusztowanie stopem złota i platyny, aż do uzyskania grubości warstwy około 4 nm. Umieść próbkę w SEM, a następnie wykonaj zdjęcie przy napięciu przyspieszającym od 10 do 15 kV. W celu oceny bioaktywności in vitro.

Najpierw należy przeciąć cylindryczne rusztowanie SMP na pół w poprzek okrągłej krawędzi, używając czystego ostrza. Jedną połowę rusztowania należy umieścić w probówce zawierającej 30 ml symulowanego płynu ustrojowego, a następnie po 14 dniach umieścić probówkę w stacjonarnej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie należy wyjąć rusztowanie z probówki i pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu przez 24 godziny.

Następnie przymocuj rusztowanie ciętą powierzchnią do góry do stolika mikroskopu elektronowego, używając taśmy węglowej. Następnie napyl nowy rusztowanie stopem złota i platyny do grubości około czterech nanometrów. Podobnie jak wcześniej, umieść próbkę w SEM i wykonaj zdjęcie przy napięciu przyspieszającym od 10 do 15 kilowoltów.

Rusztowanie SMP staje się plastyczne po podgrzaniu do 60 °C i może zostać dopasowane do modelu defektu. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej rusztowanie SMP zostaje usunięte i zachowuje swój nowy, utrwalony kształt tymczasowy. Na mikrografii z elektronowego mikroskopu skaningowego niepowlekanego rusztowania SMP widoczna jest struktura porów oraz wysoce połączona morfologia.

Bioaktywność rusztowania SMP powlekanego polidopaminą jest udowodniona poprzez tworzenie się hydroksyapatytu w porach, co przedstawiono na mikrografii z elektronowego mikroskopu skaningowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować bioaktywne, dopasowujące się samoistnie rusztowanie z polimeru z pamięcią kształtu, stosując proces obejmujący odlewanie z rozpuszczalnika nad cząstkami szablonu solnego, wymywanie tych cząstek oraz naniesienie powłoki z polidopaminy.