Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC
28 marca 2025
Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.
Badanie to ma na celu opracowanie biometrycznych tkanek serca 3D przy użyciu rusztowania elektrycznego ze stopu i ludzkich komórek serca pochodzących z iPSC w celu poprawy modelowania chorób, testowania leków i zastosowań medycyny regeneracyjnej. Wywołane przez człowieka doniesienia o kardiomiocytach komórek macierzystych pozostają niedojrzałe, co ogranicza ich funkcjonalność. Ponadto trudno jest odtworzyć poważną złożoność wymaganą do modelowania tkanki serca w 3D.
Model ten lepiej naśladuje natywny mięsień sercowy, umożliwiając złożone interakcje 3D macierzy zewnątrzkomórkowej w celu modelowania chorób, testowania leków i zastosowań specyficznych dla pacjenta. Stanowi bardziej odpowiednią alternatywę dla kultur 2D i modeli zwierzęcych. Idąc dalej, nasze badania będą koncentrować się na badaniu modeli kardiomikologicznych, ulepszaniu protokołów dojrzewania tkanek 3D i opracowywaniu większych konstruktów do przedklinicznych terapii zawału mięśnia sercowego w dużych modelach zwierzęcych, takich jak świnie.
Aby rozpocząć, podłącz strzykawkę do rurki doprowadzającej azot pod ciśnieniem i wprowadź ją do komory grzewczej. Włącz sprzęt do elektroprzędzenia ze stopu i ustaw regulatory temperatury na 80 stopni Celsjusza dla komory i 65 stopni Celsjusza dla dyszy. Po 30 minutach przesuń płytę zbierającą, aż głowica drukująca znajdzie się na jednej krawędzi płyty lub w dowolnym żądanym miejscu.
Ręcznie wyreguluj odległość między komorą grzewczą a płytą kolektora do 10 milimetrów w płaszczyźnie z. Zamknij drzwi urządzenia, które automatycznie łączy się z zasilaniem polem elektrycznym. Ustaw napięcie na siedem kilowoltów w ciśnieniu azotu na dwa bary do wytłaczania przez końcówkę o rozmiarze 23.
Załaduj kod G projektu do oprogramowania, aby wydrukować rusztowania z geometrią wzoru kwadratowego. Dostosuj prędkość kolektora do 1080 milimetrów na minutę. Następnie naciśnij przycisk Cycle Start, aby rozpocząć drukowanie.
Po zakończeniu drukowania ostrożnie zdejmij rusztowanie z kolektora. Wytnij wydrukowaną siatkę za pomocą stempla o średnicy sześciu milimetrów, aby uzyskać końcowe rusztowania do produkcji tkanek. Traktuj rusztowania przez pięć minut plazmą tlenową.
Wysterylizuj siatki, zanurzając je w 70% etanolu na 30 minut. Umyj je obficie sterylną wodą destylowaną przez 30 minut, a następnie pozostaw do wyschnięcia. Po odłączeniu ludzkich kardiomiocytów iPSC należy ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do wytwarzania tkanek i policzyć komórki za pomocą komory Neubauera.
Podobnie, po odłączeniu ludzkich fibroblastów serca iPSC, ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do wytwarzania tkanek i policzyć komórki. Wymieszaj potrzebną całkowitą liczbę komórek w nowej probówce i odnoś się do zawartości jako Cell Mix. I wirować w temperaturze 300G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie ponownie zawiesić mieszaninę komórkową w wymaganej objętości pożywki do wytwarzania tkanek. Aby wytworzyć mieszankę hydrożelową, dodaj wymaganą objętość fibrynogenu do probówki w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszaj. Wysiewaj mieszankę hydrożelową na powierzchni politetrafluoroetylenu, aby zapobiec przywieraniu fibryny do płytki.
Odpipetuj połowę objętości tkanki, pozostawiając ją w postaci kropli. Umieść rusztowanie polikaprolaktonu lub PCL na każdej kropli i dodaj pozostałą objętość na rusztowanie. Teraz dodaj wymaganą ilość trombiny i szybko wymieszaj hydrożel, ostrożnie unikając pęcherzyków.
Inkubuj tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby zakończyć polimeryzację fibryny. Delikatnie podnieś każdą tkankę za krawędź za pomocą sterylnej pęsety i przenieś je na 12-dołkowe płytki zawierające pożywkę do generowania tkanek uzupełnioną aprotyniną. Inkubuj tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Następnego dnia odświeżyć pożywkę dwoma mililitrami pożywki do konserwacji tkanek, usuwając pozostałości KSR i Y-27. Wysiew mieszaniny ośmiu do dwóch ludzkich kardiomiocytów iPSC i ludzkich fibroblastów serca iPSC do hydrożeli fibrynowych powoduje równomierne rozmieszczenie komórek w porach rusztowania w ciągu jednej godziny po polimeryzacji. Konfokalne obrazy immunofluorescencyjne wykazały mieszany rozkład komórek w tkance 3D oddziałującej z rusztowaniem PCL, przy czym większość ludzkich kardiomiocytów iPSC wybarwionych na obecność aktyniny sarkomerycznej przemieszczonych z ludzkimi fibroblastami serca iPSC znakowanymi wimentyną.
Ludzkie kardiomiocyty iPSC wykazują dobrze zorganizowaną strukturę sarkomerową dzięki regularnie rozmieszczonemu sarkomerowemu białku aktyniny. Komórki zaczęły spontanicznie bić w drugim dniu ze średnią częstotliwością dudnień 30 uderzeń na minutę w siódmym dniu, wykazując ustabilizowany skurcz w całej siatce. Z czasem zaobserwowano stopniowy spadek, osiągając 17 uderzeń na minutę w 14 dniu.
Mimo to aktywność metaboliczna pozostała stabilna między siódmym a czternastym dniem, potwierdzając trwałą żywotność komórek. Wreszcie, analiza punktów śledzenia bijących tkanek wykazała prędkość skurczu 38 mikrometrów na sekundę i amplitudę skurczu 29 mikrometrów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę tworzenia trójwymiarowych tkanek mięśnia sercowego z wykorzystaniem zapisu elektroprzędzenia z topnienia (MEW) oraz ludzkich komórek kardiologicznych pochodzących z iPSC. Podejście to usprawnia modelowanie chorób i testowanie leków poprzez dokładniejsze odwzorowanie naturalnego mięśnia sercowego niż w przypadku metod tradycyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa serca
- Biologia komórek macierzystych
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Kardiomiocyty pochodzące z ludzkich iPSC często nie wykazują pełnej dojrzałości.
- Modelowanie złożonej tkanki serca w 3D jest wyzwaniem.
- Obecne modele nie odwzorowują w sposób wystarczający naturalnych warunków w mięśniu sercowym.
- Hodowle 2D oraz modele zwierzęce mają ograniczenia w zakresie adekwatności biologicznej.
Cel badania
- Opracowanie 3D modelu tkanki serca w celu usprawnienia modelowania chorób.
- Udoskonalenie metodologii testowania leków.
- Rozwój zastosowań w medycynie regeneracyjnej.
Zastosowane metody
- Zastosowanie zapisu elektroprzędzenia z topnienia (MEW) do tworzenia rusztowań.
- Połączenie rusztowań z polikaprolaktonu (PCL) i hydrożeli fibrynowych.
- Inkorporacja kardiomiocytów i fibroblastów pochodzących z hiPSC.
- Koncentracja na tworzeniu złożonej trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej.
Główne wyniki
- Metoda ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania.
- Tkanki 3D lepiej naśladują naturalne mięsień sercowy w porównaniu z hodowlami 2D.
- Zaobserwowano wzmocnione oddziaływania w macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Potencjalne zastosowania w przedklinicznych badaniach leków oraz modelowaniu chorób serca.
Wnioski
- Opracowany model stanowi znaczący postęp w inżynierii tkanki serca.
- Przyszłe badania skupią się na udoskonaleniu protokołów dojrzewania tkanki.
- Planowane jest opracowanie większych konstruktów do badań przedklinicznych na modelach dużych zwierząt.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zaawansowane trójwymiarowe modele tkanki mięśniowej serca człowieka, wytworzone za pomocą zapisu elektroprzędzenia z topnienia (MEW) oraz pochodzących z hiPSC komórek kardiologicznych, wypełniają krytyczne luki w predykcyjnym przesiewaniu leków i modelowaniu chorób. Platforma ta umożliwia bardziej fizjologicznie istotną ocenę funkcji serca oraz toksyczności, wspierając ciągłość translacyjną od wczesnej fazy odkrywania po ocenę przedkliniczną. Powtarzalność i skalowalność tego podejścia czynią je strategicznym zasobem dla badań nad bezpieczeństwem i skutecznością kardiologiczną w całym portfolio produktów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie ścieżek specyficznych dla serca w istotnym dla człowieka kontekście 3D.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie złożonych oddziaływań komórka–macierz oraz komórka–komórka.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez mierzalne wyniki kurczliwości i żywotności.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne rusztowanie dla wysokoprzepustowych analiz kardiologicznych.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych wyników, takich jak amplituda i częstotliwość skurczów oraz aktywność metaboliczna.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie minitkanek do przesiewania związków i badań porównawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność z biologią serca człowieka w kontekście chorób, co usprawnia odkrywanie biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkryć in vitro po walidację przedkliniczną w modelach dużych zwierząt.
- Ogranicza zależność od mniej predykcyjnych kultur 2D i modeli zwierzęcych w ocenie ryzyka kardiologicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda generowania tkanki 3D integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami mechanistycznymi a zaawansowanymi badaniami translacyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących celów kardiologicznych w fizjologicznie istotnym układzie.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wskaźniki kurczliwości i żywotności do oceny związków.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównywanie wyników funkcjonalnych w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do modeli przedklinicznych i fenotypów chorób ludzkich.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową, adaptacyjną platformę dla różnorodnych inicjatyw B+R w kardiologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w ocenach bezpieczeństwa i skuteczności kardiologicznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wytwarzanie tkanek i odczyty funkcjonalne w celu zapewnienia porównywalności międzybadawczej.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go i redukuje ryzyko kardiologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zasobów i wskazań kardiologicznych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, wytwarzaniu rusztowań oraz inżynierii tkankowej.
- Wymaga dostępu do aparatury MEW oraz zaawansowanego obrazowania do analizy funkcjonalnej.
- Wymaga standaryzacji projektowania rusztowań i protokołów pozyskiwania komórek pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych modeli chorób serca oraz skalowalność dla potrzeb wysokoprzepustowych.
- Ograniczenia obejmują obecny stopień dojrzałości kardiomiocytów pochodzących z hiPSC oraz rozmiar konstruktu.
