Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Badanie to ma na celu opracowanie biometrycznych tkanek serca 3D przy użyciu rusztowania elektrycznego ze stopu i ludzkich komórek serca pochodzących z iPSC w celu poprawy modelowania chorób, testowania leków i zastosowań medycyny regeneracyjnej. Wywołane przez człowieka doniesienia o kardiomiocytach komórek macierzystych pozostają niedojrzałe, co ogranicza ich funkcjonalność. Ponadto trudno jest odtworzyć poważną złożoność wymaganą do modelowania tkanki serca w 3D.

Model ten lepiej naśladuje natywny mięsień sercowy, umożliwiając złożone interakcje 3D macierzy zewnątrzkomórkowej w celu modelowania chorób, testowania leków i zastosowań specyficznych dla pacjenta. Stanowi bardziej odpowiednią alternatywę dla kultur 2D i modeli zwierzęcych. Idąc dalej, nasze badania będą koncentrować się na badaniu modeli kardiomikologicznych, ulepszaniu protokołów dojrzewania tkanek 3D i opracowywaniu większych konstruktów do przedklinicznych terapii zawału mięśnia sercowego w dużych modelach zwierzęcych, takich jak świnie.

Aby rozpocząć, podłącz strzykawkę do rurki doprowadzającej azot pod ciśnieniem i wprowadź ją do komory grzewczej. Włącz sprzęt do elektroprzędzenia ze stopu i ustaw regulatory temperatury na 80 stopni Celsjusza dla komory i 65 stopni Celsjusza dla dyszy. Po 30 minutach przesuń płytę zbierającą, aż głowica drukująca znajdzie się na jednej krawędzi płyty lub w dowolnym żądanym miejscu.

Ręcznie wyreguluj odległość między komorą grzewczą a płytą kolektora do 10 milimetrów w płaszczyźnie z. Zamknij drzwi urządzenia, które automatycznie łączy się z zasilaniem polem elektrycznym. Ustaw napięcie na siedem kilowoltów w ciśnieniu azotu na dwa bary do wytłaczania przez końcówkę o rozmiarze 23.

Załaduj kod G projektu do oprogramowania, aby wydrukować rusztowania z geometrią wzoru kwadratowego. Dostosuj prędkość kolektora do 1080 milimetrów na minutę. Następnie naciśnij przycisk Cycle Start, aby rozpocząć drukowanie.

Po zakończeniu drukowania ostrożnie zdejmij rusztowanie z kolektora. Wytnij wydrukowaną siatkę za pomocą stempla o średnicy sześciu milimetrów, aby uzyskać końcowe rusztowania do produkcji tkanek. Traktuj rusztowania przez pięć minut plazmą tlenową.

Wysterylizuj siatki, zanurzając je w 70% etanolu na 30 minut. Umyj je obficie sterylną wodą destylowaną przez 30 minut, a następnie pozostaw do wyschnięcia. Po odłączeniu ludzkich kardiomiocytów iPSC należy ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do wytwarzania tkanek i policzyć komórki za pomocą komory Neubauera.

Podobnie, po odłączeniu ludzkich fibroblastów serca iPSC, ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do wytwarzania tkanek i policzyć komórki. Wymieszaj potrzebną całkowitą liczbę komórek w nowej probówce i odnoś się do zawartości jako Cell Mix. I wirować w temperaturze 300G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie ponownie zawiesić mieszaninę komórkową w wymaganej objętości pożywki do wytwarzania tkanek. Aby wytworzyć mieszankę hydrożelową, dodaj wymaganą objętość fibrynogenu do probówki w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszaj. Wysiewaj mieszankę hydrożelową na powierzchni politetrafluoroetylenu, aby zapobiec przywieraniu fibryny do płytki.

Odpipetuj połowę objętości tkanki, pozostawiając ją w postaci kropli. Umieść rusztowanie polikaprolaktonu lub PCL na każdej kropli i dodaj pozostałą objętość na rusztowanie. Teraz dodaj wymaganą ilość trombiny i szybko wymieszaj hydrożel, ostrożnie unikając pęcherzyków.

Inkubuj tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby zakończyć polimeryzację fibryny. Delikatnie podnieś każdą tkankę za krawędź za pomocą sterylnej pęsety i przenieś je na 12-dołkowe płytki zawierające pożywkę do generowania tkanek uzupełnioną aprotyniną. Inkubuj tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnego dnia odświeżyć pożywkę dwoma mililitrami pożywki do konserwacji tkanek, usuwając pozostałości KSR i Y-27. Wysiew mieszaniny ośmiu do dwóch ludzkich kardiomiocytów iPSC i ludzkich fibroblastów serca iPSC do hydrożeli fibrynowych powoduje równomierne rozmieszczenie komórek w porach rusztowania w ciągu jednej godziny po polimeryzacji. Konfokalne obrazy immunofluorescencyjne wykazały mieszany rozkład komórek w tkance 3D oddziałującej z rusztowaniem PCL, przy czym większość ludzkich kardiomiocytów iPSC wybarwionych na obecność aktyniny sarkomerycznej przemieszczonych z ludzkimi fibroblastami serca iPSC znakowanymi wimentyną.

Ludzkie kardiomiocyty iPSC wykazują dobrze zorganizowaną strukturę sarkomerową dzięki regularnie rozmieszczonemu sarkomerowemu białku aktyniny. Komórki zaczęły spontanicznie bić w drugim dniu ze średnią częstotliwością dudnień 30 uderzeń na minutę w siódmym dniu, wykazując ustabilizowany skurcz w całej siatce. Z czasem zaobserwowano stopniowy spadek, osiągając 17 uderzeń na minutę w 14 dniu.

Mimo to aktywność metaboliczna pozostała stabilna między siódmym a czternastym dniem, potwierdzając trwałą żywotność komórek. Wreszcie, analiza punktów śledzenia bijących tkanek wykazała prędkość skurczu 38 mikrometrów na sekundę i amplitudę skurczu 29 mikrometrów.