Analiza rozwoju unerwienia zarodków zębów za pomocą urządzeń do kohodowli mikroprzepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, jak wyizolować i współkulturować rozwijające się zwoje nerwu trójdzielnego i zarodki zębów. Osiąga się to poprzez uprzednią sterylizację, montaż i powlekanie urządzeń mikroprzepływowych. Drugim krokiem jest wypreparowanie zwojów nerwu trójdzielnego i zarodków zębów z określonego etapu rozwojowego u myszy będącej przedmiotem zainteresowania.

Następnie zwoje nerwu trójdzielnego i zarodki zębów są umieszczane w urządzeniach mikroprzepływowych i poddawane kohodowli. Ostatnim krokiem jest utrwalenie komórek i wybarwienie ich za pomocą immunofluorescencji. Ostatecznie mikroskopia służy do pokazania wzorca unerwienia, który jest wynikiem kohodowli.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalne kokultury, jest to, że metoda ta pozwala na kokulturę różnych narządów i tkanek, z których każda znajduje się w optymalnej hodowli. Średni. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie innowacji w dziedzinie sztucznej inteligencji, takie jak rola różnych cząsteczek w innowacjach zębów oraz zasada innowacji w rozwoju zębów. Zacznij od autoklawowania narzędzi preparacyjnych, które obejmują parę kleszczy do mikrodysekcji i nożyczki.

Następnie wysterylizuj partię szklanych szkiełek nakrywkowych o wymiarach 24 milimetry na 24 milimetry, umieszczając je w roztworze jednego molowego kwasu solnego na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy sterylną wodą destylowaną, a następnie trzykrotnie spłucz w 99% etanolu, wysusz je pod sterylnym kapturem przepływowym po wyschnięciu, włącz światło UV kaptura na 30 minut. Następnie przechowuj szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu, aż będą potrzebne.

Następnie za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie wyjmij urządzenia mikroprzepływowe do izolacji aksonów z opakowania i umieść je na sterylnej szalce Petriego za pomocą sterylnego jednomilimetrowego stempla do biopsji. Utwórz jeden otwór w urządzeniach dla każdej próbki. W korespondencji izb kulturowych.

Uważaj, aby nie uderzać zbyt blisko mikrorowków, ponieważ mogą one zostać uszkodzone przez nacisk. Następnie wysterylizuj urządzenia, zanurzając je w 70% etanolu. Uważaj, aby usunąć całe uwięzione powietrze.

Następnie wyjmij urządzenia z etanolu i wysusz je całkowicie pod sterylnym kapturem przepływowym. Usuń również szkiełka nakrywkowe z 70% roztworu etanolu i pozostaw je do wyschnięcia pod sterylnym kapturem przepływowym. Odczekaj co najmniej trzy godziny, zanim przejdziesz dalej.

Umieść każde szkiełko nakrywkowe w dołku na płytce z sześcioma dołkami. Następnie umieść urządzenie mikroprzepływowe na szkiełku nakrywkowym i delikatnie, ale mocno dociśnij kleszkami, aby umożliwić pełne przyleganie między urządzeniem izolacyjnym a szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Następnie odpipetuj 150 mikrolitrów po 0,1 miligrama na mililitr, poli D lycine do każdej z komór hodowlanych.

Następnie umieść urządzenia mikroprzepływowe pod próżnią na pięć minut, aby usunąć całe powietrze z komór. Jeśli w komorach nadal widać powietrze. Roztwór poli D lizyny wpuścić do komór.

Następnego dnia inkubować urządzenia z poli delizyną przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj komory trzykrotnie sterylną wodą destylowaną, a następnie napełnij komory 150 mikrolitrami po pięć mikrogramów na mililitr, roztworem roboczym laminy i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie należy naprawcze podłoża dla zwojów nerwu trójdzielnego i kultur zarodków zębów, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.

Oczyść obszar sekcji i stereoskop etanolem 70% i umieść narzędzia do sekcji po złożeniu ofiary. Wypreparuj skórę wokół dolnej części brzucha ciężarnej myszy z zarodkami myszy w stadium od E 14,5 do E 17,5. Następnie ostrożnie otwórz brzuch za pomocą nożyczek.

Zlokalizuj macicę, usuń ją i umieść w probówce wypełnionej lodem. Zimny PBS preparuje zarodki i umieszcza je pojedynczo na nowej szalce Petriego wypełnionej lodowatym PBS. Gdy wszystkie zarodki zostaną usunięte z dodatkowych tkanek embrionalnych, odetnij je za pomocą nożyczek.

Oddziel dolną szczękę od reszty głowy za pomocą mikropreparacji, nożyczek, uważając, aby nie uszkodzić zwojów nerwu trójdzielnego. Następnie weź głowę i umieść ją na schłodzonej szklanej szalce Petriego. Użyj kleszczy, aby usunąć skórę i czaszkę.

Następnie umieść kleszcze poniżej cefalonu i podnieś. Aby usunąć głowo i móżdżek, zlokalizuj zwoje nerwu trójdzielnego i użyj kleszczy i igieł preparacyjnych, aby oddzielić zwoje nerwu trójdzielnego od nerwów trójdzielnych i oczyścić zwoje. Przechowuj je w zimnym PBS, używając igieł do preparowania jako noży.

Usuń język i skórę otaczającą szczękę. Oddziel lewą i prawą szczękę hemi, przecinając wzdłuż linii środkowej szczęki. Następnie zlokalizuj zarodki zębów i wyizoluj je za pomocą igieł preparacyjnych po rozcięciu zwojów nerwu trójdzielnego i zarodków zębów, usuń lamininę z urządzeń mikroprzepływowych i napełnij komory 200 mikrolitrami odpowiednich pożywek.

Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś wypreparowane zwoje nerwu trójdzielnego i zarodki zębów do otworów utworzonych za pomocą stempla biopsyjnego. Upewnij się, że zarodki zębów nie unoszą się na wodzie i toną, dopóki nie zetkną się z szkiełkami nakrywkowymi. Hodowla, próbki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Zmieniaj pożywkę co 48 godzin przez 10 dni, aby zmienić pożywkę. Najpierw usuń pożywkę, kierując pipetę w stronę zewnętrznej strony studzienek. Następnie dodaj świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę po stronie welsów znajdujących się naprzeciwko komór w okresie hodowli.

Obrazowanie kultur co w dowolnym momencie za pomocą mikroskopii świetlnej. Po okresie hodowli umyj komory, pipetując 150 mikrolitrów PBS do jednej studzienki na komorę i pozwalając PBS przepływać przez komory. Powtórz pranie w sumie trzy razy po ostatnim praniu.

Usunąć PBS i utrwalić próbki, pipetując 150 mikrolitrów 4% aldehydu paraform w PBS do jednej studzienki na komorę i pozwalając mu przepłynąć do drugiej komory. Inkubuj urządzenie w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie dwukrotnie umyj komory PBS i przystąp do dalszej analizy, takiej jak barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie wyrostka.

Podczas hodowli węgla neuryty ze zwojów nerwu trójdzielnego rozgałęziają się z przedziału hodowlanego i rozciągają się w kierunku rozwijającego się zarodka zęba. Przy większym powiększeniu można zobaczyć neuryty rozciągające się przez komory aksonalne i mikrorowki w urządzeniu mikroprzepływowym. Postęp wzrostu nerwów można śledzić w czasie, aby opisać rozwój innowacji.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak RNA lub PROTEINIZACJA, w celu zbadania, na przykład, zmian ekspresji genów lub wydzielania białek w tkankach docelowych po wprowadzeniu innowacji.