Analiza rozwoju unerwienia zarodków zębów za pomocą urządzeń do kohodowli mikroprzepływowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie sposobu izolacji i współhodowli rozwijających się zwojów trójdzielnych oraz zalążków zęba. Osiąga się to najpierw poprzez sterylizację, montaż i powlekanie urządzeń mikroprzepływowych. Drugim krokiem jest wypreparowanie zwojów trójdzielnych i zalążków zęba z konkretnego etapu rozwoju u wybranego modelu myszy.

Następnie zwoje trójdzielne oraz zarodki zębowe są umieszczane w urządzeniach mikroprzepływowych i poddawane hodowli współdzielonej. Ostatnim krokiem jest utrwalenie komórek i ich barwienie metodą immunofluorescencji. Na koniec wykorzystuje się mikroskopię, aby wykazać wzorzec unerwienia będący wynikiem hodowli współdzielonej.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak konwencjonalne kokultury, jest fakt, że pozwala ona na kokultywację różnych organów i tkanek, z których każda znajduje się we własnym, optymalnym medium hodowlanym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie innowacji sztucznych, takie jak rola różnych cząsteczek w innowacji zęba oraz reguła innowacji w rozwoju zęba. Należy rozpocząć od autoklawowania narzędzi do sekcji, w tym pęsety do mikrodysekcji i nożyczek.

Następnie wysterylizuj partię szkiełek nakrywkowych o wymiarach 24 mm na 24 mm, umieszczając je w roztworze 1 M kwasu solnego na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Następnie przemyj szkiełka nakrywkowe trzy razy sterylną wodą destylowaną, a potem trzykrotnie opłucz w 99% etanolu i wysusz je w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza; po wysuszeniu włącz w komorze lampę UV na 30 minut. Następnie przechowuj szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu do momentu ich użycia.

Następnie, używając sterylnej pęsety, ostrożnie wyjmij mikroprzepływowe urządzenia do izolacji aksonów z opakowania i umieść je w sterylnej szalce Petriego, posługując się sterylnym wycinakiem do biopsji o średnicy jednego milimetra. W urządzeniach wykonaj jeden otwór dla każdej próbki, w miejscu odpowiadającym komorom hodowlanym.

Należy uważać, aby nie wybić otworu zbyt blisko mikrowżobień, ponieważ mogą one zostać uszkodzone pod wpływem nacisku. Następnie należy wysterylizować urządzenia, zanurzając je w 70% etanolu, dbając o usunięcie wszystkich pęcherzyków uwięzionego powietrza.

Następnie należy wyjąć urządzenia z etanolu i całkowicie je osuszyć w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Należy również wyjąć szkiełka nakrywkowe z 70% etanolu i pozostawić je do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przed przejściem do kolejnego etapu należy odczekać co najmniej trzy godziny.

Umieść każdą szkiełko nakrywkowe w dołku płytki sześciodołkowej. Następnie nałóż urządzenie mikrofluidyczne na szkiełko nakrywkowe i dociśnij je delikatnie, ale pewnie za pomocą pęsety, aby zapewnić pełną adhezję między urządzeniem do izolacji a szklanym szkiełkiem nakrywowym. Następnie pipetuj 150 µL poli-D-lizyny o stężeniu 0,1 mg/mL do każdej z komór hodowlanych.

Następnie należy umieścić urządzenia mikroprzepływowe w próżni na pięć minut, aby usunąć całe powietrze z komór. Jeśli w komorach nadal widoczne są pęcherzyki powietrza, należy ponownie wprowadzić do nich roztwór poli-L-lizyny.

Inkubować urządzenia z poli-L-lizyną przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia przemyć komory trzykrotnie sterylną wodą destylowaną, a następnie napełnić je 150 µL roztworu roboczego lamininy o stężeniu 5 µg/mL i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Następnie przygotować pożywki dla kultur zwojów trójdzielnych i zarodków zębów zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

Oczyścić obszar sekcji oraz stereoskop 70% etanolem i przygotować narzędzia sekcyjne po uśmierceniu zwierzęcia. Wyciąć skórę w okolicy dolnego brzucha u ciężarnej myszy z embrionami w stadium od E 14.5 do E 17.5. Następnie ostrożnie otworzyć jamę brzuszną za pomocą nożyczek.

Zlokalizuj macicę, usuń ją i umieść w probówce wypełnionej lodem. W zimnym PBS wypreparuj zarodki i umieść je pojedynczo w nowej płytce Petriego wypełnionej lodowatym PBS. Po usunięciu wszystkich zarodków z tkanek pozazarodkowych, odetnij im głowy za pomocą nożyczek.

Oddziel żuchwę od reszty głowy za pomocą mikrosekcji i nożyczek, uważając, aby nie uszkodzić zwojów nerwu trójdzielnego. Następnie weź głowę i umieść ją na schłodzonej szklanej płytce Petriego do sekcji. Użyj pęsety, aby usunąć skórę oraz czaszkę.

Następnie umieść pęsetę pod cephalonem i unieś go. Aby usunąć cephalon i móżdżek, zlokalizuj zwoje trójdzielne i za pomocą pęsety oraz igieł sekcyjnych oddziel zwoje trójdzielne od nerwów trójdzielnych, a następnie oczyść zwoje. Zakonserwuj je w zimnym PBS, używając igieł sekcyjnych w charakterze noży.

Usuń język oraz skórę otaczającą żuchwę. Oddziel lewą i prawą połowę żuchwy, przecinając ją wzdłuż linii środkowej. Następnie zlokalizuj zawiązki zębów i wyizoluj je za pomocą igieł sekcyjnych; po wypreparowaniu zwojów nerwu trójdzielnego i zawiązków zębów usuń lamininę z urządzeń mikroprzepływowych i wypełnij komory 200 microliters odpowiednich pożywek.

Za pomocą pincety ostrożnie przenieś wypreparowane zwoje trójdzielne i zawiązki zębów do otworów wykonanych wycinakiem do biopsji. Upewnij się, że zawiązki zębów nie pływają, lecz opadają, aż dotkną szkiełek podstawowych. Hoduj próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide.

Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 48 godzin przez 10 dni. Najpierw usuń pożywkę, kierując pipetę w stronę zewnętrznej części studni. Następnie, w trakcie okresu hodowli, dodawaj świeżą, uprzednio ogrzaną pożywkę po stronie studni przeciwległej do komór.

W dowolnym momencie można obrazować kokultury za pomocą mikroskopii świetlnej. Po okresie hodowli wypłukać komory, pipetując 150 µL PBS do jednej studni na komorę i pozwalając, aby PBS przepłynął przez komory. Powtórzyć płukanie łącznie trzy razy po ostatnim przemyciu.

Usunąć PBS i utrwalić próbki, pipetując 150 µL 4% paraformaldehydu w PBS do jednego otworu na komorę, pozwalając mu przepłynąć do drugiej komory. Inkubować urządzenie w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie przemyć komory dwukrotnie PBS i przejść do dalszych analiz, takich jak barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie przerostu.

Podczas hodowli współkultur neuryty z zwojów trójdzielnych wyrastają z komory hodowlanej i kierują się w stronę rozwijającego się zalążka zęba. Przy większym powiększeniu widoczne są neuryty przebiegające przez komory aksonalne oraz mikrowypustki w urządzeniu mikroprzepływowym. Postępy w obrastaniu nerwowym można śledzić w czasie, aby opisać rozwój innowacji.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza RNA lub białek, aby zbadać na przykład zmiany w ekspresji genów lub sekrecji białek w tkankach docelowych po innowacji.