Name: Analiza rozwoju unerwienia zarodków zębów za pomocą urządzeń do kohodowli mikroprzepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę izolacji i współkultury zarodkowych ganglionów nerwu trójdzielnego oraz zawiązków zębów myszy przy użyciu mikroprzepływowych urządzeń. Technika ta umożliwia badanie interakcji nerwowych z tkankami docelowymi w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została sfinansowana przez Uniwersytet w Zurychu. Autorzy pragną podziękować Estreli Neto i dr Meriem Lamghari za pomoc w ustaleniu warunków kokultury.

Wszystkie myszy były utrzymywane i traktowane zgodnie ze szwajcarską ustawą o dobrostanie zwierząt i zgodnie z przepisami Kantonalnego Urzędu Weterynaryjnego w Zurychu.
1. Przygotowanie materiału preparacyjnego, pożywek hodowlanych, urządzeń mikroprzepływowych
<ol>
	<li>Autoklaw kleszczy i nożyczek do mikropreparacji (121 °C, czas sterylizacji: 20 min) i przechowuj je w sterylnym pojemniku.</li>
	<li>Wysterylizować szklane szkiełka nakrywkowe (24 mm x 24 mm) poprzez inkubację w 1 M HCl przez 24 godziny na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C. Przemyć je trzykrotnie sterylnym, destylowanymH2Oi trzykrotnie etanolem 99%. Następnie wysuszyć szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 °C lub pod sterylnym kapturem. Na koniec przeprowadź autoklaw lub wystaw szkiełka nakrywkowe na działanie światła UV (30 min), aby zakończyć sterylizację. Szkiełka nakrywkowe można następnie przechowywać w etanolu 70%.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij urządzenia AXIS Axon Isolation Devices z opakowania za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść je na sterylnej szalce Petriego.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego stempla do biopsji (ø: 1 mm) należy wykonać jeden otwór na próbkę do hodowli (ryc. 1) w korespondencji komór hodowlanych. 
	UWAGA: Nie przebijaj zbyt blisko mikrorowków, ponieważ mogą one ulec uszkodzeniu w wyniku zastosowanego nacisku.</li>
	<li>Wysterylizuj urządzenia izolacyjne AXIS Axon, zanurzając je w etanolu 70%. Następnie należy wysuszyć urządzenia AXIS Axon Isolation Devices i szkiełka nakrywkowe całkowicie pod sterylnym kapturem przepływowym. Odczekaj co najmniej 3 godziny przed kontynuowaniem. 
	UWAGA: niepełne suszenie spowoduje wadliwy montaż urządzeń mikroprzepływowych.</li>
	<li>Umieść każde szkiełko nakrywkowe na szalce Petriego o średnicy 35 mm lub w studzience w 6-dołkowej płytce.</li>
	<li>Umieść urządzenie AXIS Axon Isolation Device na szkiełku nakrywkowym i delikatnie, ale stanowczo dociśnij szczypcami z zagiętymi końcami, aby umożliwić pełne przyleganie między urządzeniem izolacyjnym a szklanym szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>W każdej komorze hodowlanej odpipetować 150 μl poli-D-lizyny (0,1 mg/ml w sterylnym, destylowanymH2O). Umieść urządzenia mikroprzepływowe pod próżnią na 5 minut, aby usunąć całe powietrze z komór hodowlanych.</li>
	<li>Jeśli w komorach nadal widać powietrze, należy ponownie odpipetować roztwór poli-D-lizyny do komór.</li>
	<li>Inkubować urządzenia z poli-D-lizyną O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć komory trzykrotnie sterylnym, destylowanymH2O.</li>
	<li>Napełnić komory 150 μl roztworu roboczego lamininy (Sigma-Aldrich, 5 μg/ml, w pożywce PBS lub pożywce bez surowicy) i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować 50 ml pożywki do hodowli zwojów nerwu trójdzielnego 37 , w składzie: 48 ml pożywki neurobazalnej, 1 ml B-27, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 5 ng/ml czynnika wzrostu nerwów (NGF), 0,25 pM arabinozydu cytozyny.</li>
	<li>Przygotować 50 ml pożywki do kultur zarodków zębów 37, w składzie: 40 ml DMEM-F12, 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS, stężenie końcowe: 20%), 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 150 μg/ml kwasu askorbinowego.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie i sekcja embrionów myszy
<ol>
	<li>Określ wiek zarodka na podstawie czopa pochwowego (czop pochwowy: dzień rozwoju zarodka 0,5, E0,5) i potwierdź go za pomocą kryteriów morfologicznych. W tym protokole zazwyczaj używamy zarodków myszy E14.5-E17.5.</li>
	<li>Oczyść obszar sekcji i stereoskop etanolem 70%.</li>
	<li>Złożyć w ofierze ciężarną matkę przez zwichnięcie szyjki macicy. Zablokuj szyję myszy pierwszym i drugim palcem na siatce i zdecydowanie pociągnij ogon.</li>
	<li>Wypreparuj skórę wokół dolnej części brzucha i otwórz brzuch za pomocą nożyczek. Zlokalizuj macicę: w tak późnych stadiach ciąży macica obficie wypełnia jamę brzuszną.</li>
	<li>Wypreparuj macicę i umieść ją w probówce wypełnionej PBS na lodzie. Na lodzie tkankę można pozostawić na kilka godzin. Wyrzuć zwłoki matki zgodnie z wytycznymi instytucji</li>
	<li>Wypreparuj zarodki z macicy i uwolnij je od tkanek pozazarodkowych. Umieścić zarodki w PBS na lodzie.</li>
	<li>Odetnij głowę zarodkom za pomocą nożyczek i oddziel dolną szczękę od reszty głowy za pomocą nożyczek do mikropreparacji (ryc. 2A). Usuń dokładnie dolną szczękę, nie uszkadzając zwojów nerwu trójdzielnego; Ponieważ te ostatnie są zlokalizowane w bliskiej odległości od żuchwy, możliwe jest ich przypadkowe uszkodzenie. Zachowaj dolną szczękę i resztę głowy w zimnym PBS, na lodzie.</li>
	<li>Aby wypreparować TG, weź głowę i umieść ją na szklanej szalce Petriego, uprzednio wypełnionej zimnym PBS. Za pomocą kleszczy usuń skórę i czaszkę. Następnie usuń kresomózgowie i móżdżek, umieszczając kleszcze poniżej kresomózgowia i podnieś; Kresomózgowie i móżdżek odwrócą się razem, pozostawiając odsłonięte dno czaszki.</li>
	<li>Zlokalizuj zwoje nerwu trójdzielnego (pokazane na rysunku 2B). Użyj kleszczy, aby oddzielić TG od nerwów trójdzielnych. Wyeliminuj resztki wypustek nerwu trójdzielnego za pomocą igieł preparacyjnych jako noży. Umieść wypreparowane TG na szalce Petriego wypełnionej zimnym PBS i trzymaj je na lodzie.</li>
	<li>Aby wypreparować zęby embrionalne, należy umieścić dolną szczękę, uprzednio oddzieloną od czaszki, na szklanej szalce Petriego, wypełnionej zimnym PBS. Używając igieł preparacyjnych jako noży, usuń język i skórę otaczającą szczękę. Oddziel lewą i prawą półszczękę, przecinając wzdłuż linii środkowej szczęki. Zarodki zębów są łatwo widoczne, jak pokazano na rysunku 1C. Odizoluj zarodki zębów za pomocą igieł preparacyjnych i usuń nadmiar tkanek niebędących zębami. Umieść wypreparowane zarodki zębów na szalce Petriego wypełnionej zimnym PBS i trzymaj je na lodzie.</li>
</ol>
3. Współkultury mikroprzepływowe
<ol>
	<li>Po rozbiorze usuń lamininę z urządzeń mikroprzepływowych. Napełnij komory 200 μl odpowiedniego podłoża.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś wypreparowany TG i zarodki zębów do otworów utworzonych przez dziurkowanie (ryc. 1D). Upewnij się, że zarodki zębów nie unoszą się na wodzie i toną, dopóki nie zetkną się ze szkiełkami nakrywkowymi.</li>
	<li>Wyhodować próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 48 godzin. Nie opróżniaj całkowicie komór i nie pipetuj bezpośrednio do komór hodowlanych. Całkowite opróżnienie komór spowodowałoby powstanie pęcherzyków powietrza w komorach; Bezpośrednie pipetowanie do komory spowodowałoby uszkodzenie aksonów. Aby uniknąć tych problemów, usuń pożywkę, kierując pipetę w stronę zewnętrznej strony studzienek; Podobnie, odpipetować świeżą pożywkę po stronie studzienek znajdujących się naprzeciwko komór.</li>
	<li>W okresie hodowli kokultury można łatwo zobrazować za pomocą mikroskopii poklatkowej. Kokultury można utrzymywać przez ponad 10 dni.</li>
	<li>Po okresie hodowli umyć komory, pipetując 150 μl PBS do jednego dołka na komorę i pozwalając PBS przepływać przez komory trzy razy.</li>
	<li>Usunąć PBS i utrwalić próbki, pipetując 150 μl paraformaldehydu 4% (w PBS) w jednym dołku na komorę; inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć komory dwukrotnie PBS, jak opisano w ppkt 3.6.</li>
	<li>Kontynuuj dalszą analizę.</li>
</ol>

<ol><li>Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).</li>
<li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+dependence+in+tissue%2C+organ%2C+and+appendage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li>
<li>Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve-derived+sonic+hedgehog+defines+a+niche+for+hair+follicle+stem+cells+capable+of+becoming+epidermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).</li>
<li>Katayama, Y., Battista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+sympathetic+nervous+system+regulate+hematopoietic+stem+cell+egress+from+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow.</a> Cell. 124 (2), 407-421 (2006).</li>
<li>Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).</li>
<li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. a, Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnox%2C+SM+%22Science%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science(New York, N.Y.)</a>. 329 (5999), 1645-1647 (2010).</li>
<li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494(2013).</li>
<li>Oakley, B., Witt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+sensory+receptors+on+the+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Building sensory receptors on the tongue.</a> Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).</li>
<li>Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogenesis+of+mouse+vallate+gustatory+epithelium+and+taste+buds+requires+BDNF-dependent+taste+neurons.+Brain+research%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+brain+research%22%5BJournal%5D)">The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research.</a> Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).</li>
<li>Sun, H., Oakley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+anterior+gustatory+epithelia+in+the+palate+and+tongue+requires+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor.</a> Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).</li>
<li>Mistretta, C. M., Goosens, K. a, Farinas, I., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+size%2C+number%2C+and+morphology+of+gustatory+papillae+and+taste+buds+in+BDNF+null+mutant+mice+demonstrate+neural+dependence+of+developing+taste+organs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs.</a> The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).</li>
<li>Mitsiadis, T. a, Graf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+determination+during+tooth+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+reviews%22%5BJournal%5D)">Cell fate determination during tooth development and regeneration.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).</li>
<li>Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histological+study+of+the+innervation+of+developing+mouse+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">A histological study of the innervation of developing mouse teeth.</a> Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).</li>
<li>Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+nerve+fibres+during+development+of+embryonic+rat+molar+using+peripherin+and+protein+gene+product+9.5+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies.</a> Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).</li>
<li>Johnsen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+teeth%3A+qualitative%2C+quantitative%2C+and+developmental+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment.</a> Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).</li>
<li>Mitsiadis, T. a, Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+nerve+growth+factor+%28NGF%29+and+NGF+receptor+%28NGF-R%29+in+the+developing+first+molar+tooth+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+research+in+biological+diversity%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat.</a> Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).</li>
<li>Mitsiadis, T. a, Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+in+odontogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins in odontogenesis.</a> The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).</li>
<li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+research+in+biological+diversity%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).</li>
<li>Kettunen, P., Løes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+trigeminal+axon+navigation+and+patterning+with+tooth+organ+formation%3A+epithelial-mesenchymal+interactions+and+epithelial+Wnt4+and+Tgfbeta1+regulate+semaphorin+3a+expression+in+the+dental+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme.</a> Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).</li>
<li>Tuisku, F., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+neural+influence+on+tooth+germ+generation+in+a+polyphyodont+species%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species.</a> Developmental biology. 165, 1-9 (1994).</li>
<li>Zhao, H., Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li>
<li>Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+rudimentary+diastema+tooth+primordia+are+devoid+of+peripheral+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+embryology%22%5BJournal%5D)">Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers.</a> Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).</li>
<li>Lumsend, A., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+study+of+timing+and+topography+of+early+tooth+development+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo.</a> Archives of oral biology. , 301-311 (1986).</li>
<li>Kollar, E., Lumsend, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+morphogenesis%3A+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Biologia+Buccale%22%5BJournal%5D)">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li>
<li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+tooth+morphogenesis+and+neuronal+development+through+tissue+interactions%3A+lessons+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models.</a> Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li>
<li>Lumsend, A., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323 (9), 538-539 (1986).</li>
<li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).</li>
<li>Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nogo-A+regulates+neurite+fasciculation%2C+branching+and+extension+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system.</a> Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).</li>
<li>Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odontogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Odontogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 887, (2012).</li>
<li>Mitsiadis, T. a, Drouin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+Pitx1+genomic+locus+affects+mandibular+tooth+morphogenesis+and+expression+of+the+Barx1+and+Tbx1+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes.</a> Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).</li>
<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li>
<li>Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll%2Finterleukin-1+receptor+domain-containing+adapter+inducing+interferon-%CE%B2+mediates+microglial+phagocytosis+of+degenerating+axons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).</li>
<li>Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+on+microfluidics%3A+multimodal+analysis+for+studying+celll-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction.</a> Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).</li>
<li>Neto, E., Alves, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neurons+and+osteoblasts%3A+close+partners+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment.</a> Integrative Biology. , (2014).</li>
<li>Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+physiology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).</li>
<li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maxillary+factor%2C+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Dotychczasowe badania unerwienia zębów in vitro opierały się na konwencjonalnych kohodowlach zwojów nerwu trójdzielnego i tkanek lub komórek zęba 26,28,29. Badania te przeprowadzono głównie w celu zbadania atrakcyjnego wpływu tych komórek lub tkanek na aksony czuciowe 38. Chociaż przyniósł znaczny postęp w tej dziedzinie, poruszono kilka problemów technicznych. Zarodki zębów zaczynają się degenerować po kilku dniach posiewu 37. Opierając się na tych obserwacjach, rosnące neurony ...

Unerwienie odgrywa kluczową rolę w rozwoju, homeostazie i regeneracji narządów i tkanek 1,2. Ponadto unerwienie bierze udział w regulacji proliferacji, mobilizacji i różnicowania komórek macierzystych 3-5. Rzeczywiście, ostatnie badania przeprowadzone w tkankach kompleksu ustno-twarzowego wykazały, że nerwy przywspółczulne są niezbędne do funkcjonowania nabłonkowych komórek progenitorowych podczas rozwoju i regeneracji gruczołów ślinowych 6,7. Podobnie wykazano, że unerwienie jest niezbędne do rozwoju i utrzymania kubków smakowych 8–11. Dlatego ważne jest, aby przeanalizować wciąż zaniedbywaną rolę unerwienia w rozwoju innych ważnych narządów i tkanek ustno-twarzowych, takich jak zęby.
Pomimo bogatego unerwienia zębów dorosłych i w przeciwieństwie do wszystkich innych organów i tkanek ciała, rozwijające się zęby zaczynają się unerwiać w najwcześniejszych stadiach posturodzeniowych. Zęby rozwijają się w wyniku sekwencyjnych i wzajemnych interakcji między ektodermą jamy ustnej a mezenchymą pochodzącą z grzebienia nerwowego czaszki. Interakcje te powodują powstawanie ameloblastów pochodzenia nabłonkowego i odontoblastów pochodzących z mezenchymy, które są odpowiedzialne za tworzenie odpowiednio szkliwa i zębiny 12. Nerwy czuciowe ze zwojów nerwu trójdzielnego i nerwy współczulne ze zwojów szyjnych górnych unerwiają zęby stałe 13–15. Podczas embriogenezy włókna nerwowe wychodzące ze zwojów nerwu trójdzielnego wystają w kierunku rozwijających się zarodków zęba i stopniowo je otaczają, ale nie przenikają do mezenchymy brodawki zębowej 13. Włókna nerwowe dostają się do mezenchymy miazgi zębowej w bardziej zaawansowanych stadiach rozwojowych, które korelują z różnicowaniem odontoblastów i odkładaniem się macierzy zębiny 16. Unerwienie miazgi zębowej następuje wkrótce po wyrzynaniu się zęba w jamie ustnej 13. Wcześniejsze badania wykazały, że różne semaforyny i neurotrofiny biorą udział w regulacji unerwienia podczas odontogenezy 16-19. Wcześniejsze badania wyraźnie wykazały, że unerwienie jest warunkiem wstępnym tworzenia się zębów u ryb 20. Nowsze badania wykazały, że homeostaza komórek macierzystych mezenchymy zębów w siekaczach myszy jest regulowana przez nerwy czuciowe poprzez wydzielanie jeża sonicznego (shh) 21. Niemniej jednak rola unerwienia w inicjacji, rozwoju i regeneracji zębów jest nadal wysoce kontrowersyjna u ssaków 22–24.
Mnóstwo badań in vivo dostarczyło ważnych informacji na temat wzorców unerwienia tkanek zębowych podczas procesów rozwoju i naprawy różnych modeli zwierzęcych 13,25,26. Jednak większość z tych podejść nie jest optymalna, aby podkreślić molekularne podstawy interakcji między włóknami nerwowymi a docelowymi narządami i tkankami. Kokultury stanowią cenną metodę badania i manipulowania interakcjami między włóknami nerwowymi a zębami w kontrolowanym i izolowanym środowisku 26–29. Jednocześnie kokultura podlega różnym dostosowaniom technicznym. Na przykład nerwy i określone tkanki zęba (np. miazga zębowa, mieszek włosowy, nabłonek zębów) często wymagają różnych pożywek hodowlanych, aby zagwarantować przeżycie tkanek przez długi czas 30–32.
W ostatnich dziesięcioleciach, konwencjonalne kokultury z użyciem tej samej pożywki były przeprowadzane przez bardzo krótkie okresy (np. dwa dni) w celu zbadania atrakcyjnego lub odpychającego wpływu rozwijających się tkanek jamy ustnej i zębowej na czuciowe włókna nerwowe 27–29. Wydłużenie okresu hodowli jest jednak konieczne w celu zbadania wpływu unerwienia na morfogenezę i cytoróżnicowanie zębów oraz zbadania dynamiki rozgałęzień włókien nerwowych w narządach docelowych. W związku z tym niesąsiadujące ze sobą kokultury byłyby bardziej odpowiednie do przeprowadzania badań nad interakcjami między tkankami neuronalnymi i zębowymi.
Systemy mikroprzepływowe pozwalają na kohodowle neuronów i różnych typów komórek w odpowiednich pożywkach hodowlanych. W tych urządzeniach tkanki zębowe i neurony są oddzielone w różnych przedziałach, umożliwiając jednocześnie wzrost aksonów z ciał komórek nerwowych przez mikrokanały w kierunku przedziału zawierającego tkankę docelową 33. Urządzenia mikroprzepływowe były już wykorzystywane do badania interakcji między neuronami a mikroglejem 34,35, a także interakcji międzykomórkowych w nowotworach i neowaskularyzacji 35. Co więcej, systemy te zostały wykorzystane do badania interakcji między zwojami korzeni grzbietowych a osteoblastami 36.
Ostatnio wykazaliśmy, że zwoje nerwu trójdzielnego (TG) i zęby są w stanie przetrwać przez długi czas, gdy są hodowane wspólnie w urządzeniach mikroprzepływowych 37. Ponadto wykazaliśmy, że zęby z różnych stadiów rozwojowych utrzymują w tych warunkach in vitro takie same odpychające lub przyciągające efekty unerwienia nerwu trójdzielnego, jakie wykazują in vivo 37. Protokół ten dostarcza informacji na temat prostego, skutecznego i elastycznego sposobu wspólnej hodowli zwojów/nerwów i tkanek docelowych oraz badania roli określonych cząsteczek w takich interakcjach w kontrolowanym i izolowanym środowisku.

<table><tbody><tr><td>AXIS Axon Isolation Devices</td><td>Millipore</td><td>AX15010-TC</td><td>Dostępne są mikrokanały o różnej długości</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz beta-NGF</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG-100</td><td>Beta-NGF dla ludzi i szczurów (R& D Systems) są odpowiednikami</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza rozwoju unerwienia zarodków zębów za pomocą urządzeń do kohodowli mikroprzepływowej

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Unerwienie odgrywa kluczową rolę w rozwoju, homeostazie i regeneracji narządów i tkanek. Jednak mechanizmy leżące u podstaw tych zjawisk nie są jeszcze dobrze poznane. W szczególności zaniedbywana jest rola unerwienia w rozwoju i regeneracji zębów.
Kilka badań in vivo dostarczyło ważnych informacji na temat wzorców unerwienia tkanek zębowych podczas procesów rozwoju i naprawy różnych modeli zwierzęcych. Jednak większość z tych podejść nie jest optymalna, aby podkreślić molekularne podstawy interakcji między włóknami nerwowymi a docelowymi narządami i tkankami.
Współkultury stanowią cenną metodę badania i manipulowania interakcjami między włóknami nerwowymi a zębami w kontrolowanym i izolowanym środowisku. W ostatnich dziesięcioleciach konwencjonalne kokultury z użyciem tej samej pożywki były przeprowadzane przez bardzo krótkie okresy (np. dwa dni) w celu zbadania atrakcyjnego lub odpychającego wpływu rozwijających się tkanek jamy ustnej i zębów na czuciowe włókna nerwowe. Wydłużenie okresu hodowli jest jednak konieczne w celu zbadania wpływu unerwienia na morfogenezę zębów i cytoróżnicowanie.
Systemy mikroprzepływowe pozwalają na kohodowle neuronów i różnych typów komórek w odpowiednich pożywkach hodowlanych. Niedawno wykazaliśmy, że zwoje nerwu trójdzielnego (TG) i zęby są w stanie przetrwać przez długi czas, gdy są hodowane wspólnie w urządzeniach mikroprzepływowych i że utrzymują w tych warunkach ten sam wzorzec unerwienia, który wykazują in vivo.
Na tej podstawie opisujemy, jak izolować i współhodować rozwijające się zwoje nerwu trójdzielnego i zarodki zębów w mikroprzepływowym systemie kohodowli. Protokół ten opisuje prosty i elastyczny sposób wspólnej hodowli zwojów/nerwów i tkanek docelowych oraz badania roli określonych cząsteczek w takich interakcjach w kontrolowanym i izolowanym środowisku.

Wyniki te pokazują, że izolowane zwoje trójdzielne mogą rosnąć w jednej komorze urządzenia mikroprzepływowego i ponadto, że rozwój izolowanych zarodków zęba jest podtrzymywany przez długi czas w drugiej komorze urządzenia mikroprzepływowego. W dwóch komorach stosowane są różne pożywki hodowlane, a mikrowżobienia między nimi umożliwiają wzrost aksonów ze zwoju trójdzielnego w kierunku rozwijających się zarodków zębów. Rysunek 3 przedstawia wizualizację neurofilamentów za pomocą immunofluorescencji 37...

Współkultury stanowią cenną metodę badania interakcji między nerwami a docelowymi tkankami i narządami. Systemy mikroprzepływowe umożliwiają kokulturację zwojów nerwowych i całych rozwijających się narządów lub tkanek w różnych pożywkach hodowlanych, stanowiąc w ten sposób cenne narzędzie do badania in vitro wzajemnych oddziaływań między neuronami a ich celami.

Analiza rozwoju unerwienia zarodków zębów za pomocą urządzeń do kohodowli mikroprzepływowej

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie sposobu izolacji i współhodowli rozwijających się zwojów trójdzielnych oraz zalążków zęba. Osiąga się to najpierw poprzez sterylizację, montaż i powlekanie urządzeń mikroprzepływowych. Drugim krokiem jest wypreparowanie zwojów trójdzielnych i zalążków zęba z konkretnego etapu rozwoju u wybranego modelu myszy.Następnie zwoje trójdzielne oraz zarodki zębowe są umieszczane w urządzeniach mikroprzepływowych i poddawane hodowli współdzielonej. Ostatnim krokiem jest utrwalenie komórek i ich barwienie metodą immunofluorescencji. Na koniec wykorzystuje się mikroskopię, aby wykazać wzorzec unerwienia będący wynikiem hodowli współdzielonej.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak konwencjonalne kokultury, jest fakt, że pozwala ona na kokultywację różnych organów i tkanek, z których każda znajduje się we własnym, optymalnym medium hodowlanym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie innowacji sztucznych, takie jak rola różnych cząsteczek w innowacji zęba oraz reguła innowacji w rozwoju zęba. Należy rozpocząć od autoklawowania narzędzi do sekcji, w tym pęsety do mikrodysekcji i nożyczek.Następnie wysterylizuj partię szkiełek nakrywkowych o wymiarach 24 mm na 24 mm, umieszczając je w roztworze 1 M kwasu solnego na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Następnie przemyj szkiełka nakrywkowe trzy razy sterylną wodą destylowaną, a potem trzykrotnie opłucz w 99% etanolu i wysusz je w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza; po wysuszeniu włącz w komorze lampę UV na 30 minut. Następnie przechowuj szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu do momentu ich użycia.Następnie, używając sterylnej pęsety, ostrożnie wyjmij mikroprzepływowe urządzenia do izolacji aksonów z opakowania i umieść je w sterylnej szalce Petriego, posługując się sterylnym wycinakiem do biopsji o średnicy jednego milimetra. W urządzeniach wykonaj jeden otwór dla każdej próbki, w miejscu odpowiadającym komorom hodowlanym.Należy uważać, aby nie wybić otworu zbyt blisko mikrowżobień, ponieważ mogą one zostać uszkodzone pod wpływem nacisku. Następnie należy wysterylizować urządzenia, zanurzając je w 70% etanolu, dbając o usunięcie wszystkich pęcherzyków uwięzionego powietrza.Następnie należy wyjąć urządzenia z etanolu i całkowicie je osuszyć w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Należy również wyjąć szkiełka nakrywkowe z 70% etanolu i pozostawić je do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przed przejściem do kolejnego etapu należy odczekać co najmniej trzy godziny.Umieść każdą szkiełko nakrywkowe w dołku płytki sześciodołkowej. Następnie nałóż urządzenie mikrofluidyczne na szkiełko nakrywkowe i dociśnij je delikatnie, ale pewnie za pomocą pęsety, aby zapewnić pełną adhezję między urządzeniem do izolacji a szklanym szkiełkiem nakrywowym. Następnie pipetuj 150 µL poli-D-lizyny o stężeniu 0,1 mg/mL do każdej z komór hodowlanych.Następnie należy umieścić urządzenia mikroprzepływowe w próżni na pięć minut, aby usunąć całe powietrze z komór. Jeśli w komorach nadal widoczne są pęcherzyki powietrza, należy ponownie wprowadzić do nich roztwór poli-L-lizyny.Inkubować urządzenia z poli-L-lizyną przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia przemyć komory trzykrotnie sterylną wodą destylowaną, a następnie napełnić je 150 µL roztworu roboczego lamininy o stężeniu 5 µg/mL i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Następnie przygotować pożywki dla kultur zwojów trójdzielnych i zarodków zębów zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.Oczyścić obszar sekcji oraz stereoskop 70% etanolem i przygotować narzędzia sekcyjne po uśmierceniu zwierzęcia. Wyciąć skórę w okolicy dolnego brzucha u ciężarnej myszy z embrionami w stadium od E 14.5 do E 17.5. Następnie ostrożnie otworzyć jamę brzuszną za pomocą nożyczek.Zlokalizuj macicę, usuń ją i umieść w probówce wypełnionej lodem. W zimnym PBS wypreparuj zarodki i umieść je pojedynczo w nowej płytce Petriego wypełnionej lodowatym PBS. Po usunięciu wszystkich zarodków z tkanek pozazarodkowych, odetnij im głowy za pomocą nożyczek.Oddziel żuchwę od reszty głowy za pomocą mikrosekcji i nożyczek, uważając, aby nie uszkodzić zwojów nerwu trójdzielnego. Następnie weź głowę i umieść ją na schłodzonej szklanej płytce Petriego do sekcji. Użyj pęsety, aby usunąć skórę oraz czaszkę.Następnie umieść pęsetę pod cephalonem i unieś go. Aby usunąć cephalon i móżdżek, zlokalizuj zwoje trójdzielne i za pomocą pęsety oraz igieł sekcyjnych oddziel zwoje trójdzielne od nerwów trójdzielnych, a następnie oczyść zwoje. Zakonserwuj je w zimnym PBS, używając igieł sekcyjnych w charakterze noży.Usuń język oraz skórę otaczającą żuchwę. Oddziel lewą i prawą połowę żuchwy, przecinając ją wzdłuż linii środkowej. Następnie zlokalizuj zawiązki zębów i wyizoluj je za pomocą igieł sekcyjnych; po wypreparowaniu zwojów nerwu trójdzielnego i zawiązków zębów usuń lamininę z urządzeń mikroprzepływowych i wypełnij komory 200 microliters odpowiednich pożywek.Za pomocą pincety ostrożnie przenieś wypreparowane zwoje trójdzielne i zawiązki zębów do otworów wykonanych wycinakiem do biopsji. Upewnij się, że zawiązki zębów nie pływają, lecz opadają, aż dotkną szkiełek podstawowych. Hoduj próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide.Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 48 godzin przez 10 dni. Najpierw usuń pożywkę, kierując pipetę w stronę zewnętrznej części studni. Następnie, w trakcie okresu hodowli, dodawaj świeżą, uprzednio ogrzaną pożywkę po stronie studni przeciwległej do komór.W dowolnym momencie można obrazować kokultury za pomocą mikroskopii świetlnej. Po okresie hodowli wypłukać komory, pipetując 150 µL PBS do jednej studni na komorę i pozwalając, aby PBS przepłynął przez komory. Powtórzyć płukanie łącznie trzy razy po ostatnim przemyciu.Usunąć PBS i utrwalić próbki, pipetując 150 µL 4% paraformaldehydu w PBS do jednego otworu na komorę, pozwalając mu przepłynąć do drugiej komory. Inkubować urządzenie w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie przemyć komory dwukrotnie PBS i przejść do dalszych analiz, takich jak barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie przerostu.Podczas hodowli współkultur neuryty z zwojów trójdzielnych wyrastają z komory hodowlanej i kierują się w stronę rozwijającego się zalążka zęba. Przy większym powiększeniu widoczne są neuryty przebiegające przez komory aksonalne oraz mikrowypustki w urządzeniu mikroprzepływowym. Postępy w obrastaniu nerwowym można śledzić w czasie, aby opisać rozwój innowacji.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza RNA lub białek, aby zbadać na przykład zmiany w ekspresji genów lub sekrecji białek w tkankach docelowych po innowacji.

analysis-developing-tooth-germ-innervation-using-microfluidic-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Film pokazuje tworzenie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego. Neuronalne komórki prekursorowe i komórki progenitorowe mięśni są umieszczane w różnych studzienkach w urządzeniu i pozostawiane do dojrzewania odpowiednio w neuronach ruchowych i miotubach. Stworzenie gradientu objętościowego i chemicznego prowadzi do rozwoju aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generowanie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Ten film prezentuje technikę tworzenia wspólnej kultury neuronów trójdzielnych i pierwotnych komórek miazgi zębowej za pomocą filtra transwell. W tym fizycznie oddzielonym stanie komórki mezenchymalne uzyskane z tkanki miazgi zęba wydzielają parakrynne cząsteczki sygnałowe, które przechodzą przez pory, promując różnicowanie i migrację neuronów w kierunku komórek mezenchymalnych, tworząc system kohodowli.

Ustanowienie wspólnej hodowli komórek miazgi zębowej i neuronów trójdzielnych do komunikacji krzyżowej

Ten film demonstruje wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do badania interakcji między miazgą zarodkową zęba a zwojami nerwu trójdzielnego. Pokazuje rozmieszczenie tkanek wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego i zapewnia szczegółową wizualizację wzrostu neurytu nerwu trójdzielnego w kierunku zarodka zęba przez mikrorowki urządzenia. Dodatkowo podkreśla rolę czynników molekularnych pochodzących z zębów w promowaniu lub hamowaniu rozszerzania się neurytów do miazgi zarodkowej zęba, co ma...

Analiza interakcji między zarodkami zębów a zwojami nerwu trójdzielnego przy użyciu mikroprzepływowego systemu kohodowli

Ten film demonstruje ocenę aktywności elektrycznej neuronów w kokulturze pochodzących z hiPSC korowych neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego z układami wieloelektrodowymi.

Ocena interakcji neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka w kokulturze

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę hodowli zarazków zębów w wycinkach żuchwy za pomocą rozdrabniacza tkanek. Metoda ta pozwala na unikalny dostęp do zęba podczas rozwoju, zapewniając doskonałą możliwość manipulacji i śledzenia linii, niedostępną przy użyciu bardziej tradycyjnych metod hodowli.

Metoda hodowli Slice do śledzenia rozwoju zarodków zębów w hodowli eksplantatów

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

Metoda hodowli narządów typu Trowella została wykorzystana do rozwikłania skomplikowanych sieci sygnałowych, które regulują rozwój zębów, a ostatnio do badania regulacji związanych z komórkami macierzystymi stale rosnącego siekacza myszy. Fluorescencyjne modele zwierzęce i metody obrazowania na żywo ułatwiają dogłębną analizę komórek macierzystych zębów i ich specyficznego mikrośrodowiska niszowego.

Zastosowanie hodowli narządów typu Trowell do badania regulacji komórek macierzystych zęba

Ostatnie prace odkrywają wpływ neuronów na komórki glejaka dziecięcego (pHGG) wysokiego stopnia i ich wzajemne interakcje. Niniejsza praca pokazuje rozwój modelu in vitro kokulturującego komórki pHGG i neurony glutaminergiczne oraz rejestrującego ich interakcje elektrofizjologiczne w celu naśladowania tych interakcji.

Wspólna hodowla neuronów glutaminergicznego i pediatrycznych komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości w urządzeniach mikroprzepływowych w celu oceny interakcji elektrycznych

neuroHuMiX to zaawansowany model jelita na chipie do badania interakcji komórek bakteryjnych, nabłonkowych i neuronalnych w proksymalnych i reprezentatywnych warunkach wspólnej hodowli. Model ten pozwala na rozwikłanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw komunikacji między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym.

Model Gut-on-A-Chip do badania osi mikrobiom jelitowy i układu nerwowego

Poznaj metodę izolacji i współkultury zarodkowych ganglionów nerwu trójdzielnego oraz zawiązków zębów myszy przy użyciu mikroprzepływowych urządzeń. Technika ta umożliwia badanie interakcji nerwowych z tkankami docelowymi w kontrolowanych warunkach in vitro.

Analiza rozwoju unerwienia zarodków zębów za pomocą urządzeń do kohodowli mikroprzepływowej

Przeglądaj więcej filmów