Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie kolców dendrytycznych neuronów peryferyjnych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz ich kwantyfikacja w trzech wymiarach. Osiąga się to poprzez wstępne potraktowanie szkiełek podstawkowych w płytkach sześciodołkowych poliuretanem i lamininą w celu hodowli neuralnych komórek macierzystych. Następnie neuralne komórki macierzyste są rozcieńczane w pożywce hodowlanej.

Pożywkę nanosi się, wykonując delikatny obrotowy ruch pipetą, a następnie pozwala się komórkom różnicować w kulturze do 70 dni. Po regularnej wymianie pożywki komórki są transdukowane lentiwirusem GFP, barwione przeciwciałami anty-GFP i wizualizowane. Na koniec kultury są utrwalane, a kolce dendrytyczne obrazowane przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ostatecznie dane obrazowe ludzkich kolców dendrytycznych są rekonstruowane w 3D w celu ich klasyfikacji i kwantyfikacji. Niniejszy protokół przedstawia procedurę krok po kroku w celu uzyskania neuronów glutaminergicznych warstwy drugiej do czwartej kory mózgu człowieka. Metoda ta obejmuje wykorzystanie komórek macierzystych neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, które z kolei pochodzą z ludzkich fibroblastów, zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi dotychczasowymi metodami jest możliwość automatycznej segmentacji DON right oraz PY w 3D. Wiąże się to ze znaczną oszczędnością czasu względem istniejącego oprogramowania, które zazwyczaj umożliwia jedynie analizę 2D. Klasyfikacje donr oraz spy są również bardzo praktyczne i łatwe w obsłudze.

Aby przygotować kultury neuronalne, umieść szkiełka podstawowe w sześciodołkowych naczyniach hodowlanych, dodaj poliornitynę i inkubuj przez noc w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnego dnia przemyj szkiełka podstawowe trzy razy za pomocą DPBS, dodaj lamininę i inkubuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez co najmniej 10 godzin. Przygotuj pożywkę hodowlaną zawierającą następujące składniki.

Następnie należy wykorzystać pożywkę do wysiewu i rozdysponowania neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z gęstością 50 000 komórek na centymetr kwadratowy, pipetując powolnymi ruchami obrotowymi w celu ograniczenia agregacji komórek, aby przetransdukować neurony pochodzące z ludzkich iPSC. Na dowolnym etapie dojrzewania należy dodać jedną mikrolitr roztworu stokowego zawierającego 40 nanogramów lentiwirusowego wektora GFP na dołek hodowlany z nową pożywką hodowlaną i inkubować w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Aby przygotować komórki do immunofluorescencji, należy usunąć pożywkę hodowlaną i zastosować 4% formaldehyd do utrwalenia przetransdukowanych komórek w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie użyj XPBS do trzykrotnego przemycia komórek przez 10 minut za każdym razem. Dalej, zanurz szkiełka podstawowe w PBS uzupełnionym o 0,05% Triton X 110 i surowicę konia oraz inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie przemyj szkiełka podstawowe trzykrotnie za pomocą PBS.

Do każdego szkiełka podstawowego dodać przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko GFP w rozcieńczeniu 1:1000 w 100 µL PBS z 4% surowicy końskiej. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie rozcieńczyć przeciwciało koniugowane z Alexa Fluor 488 w stosunku 1:200 w PBS z 0,5% tween 20 i inkubować komórki z roztworem przeciwciał w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a następnie przemyć preparaty trzy razy za pomocą PBS.

Użyć medium montażowego do przygotowania preparatów do mikroskopii fluorescencyjnej. Pod mikroskopem konfokalnym, w każdym wariancie badawczym, wybrać co najmniej 10 zdrowych neuronów o morfologii piramidalnej i rozgałęzionym drzewie dendrytowym w celu kwantyfikacji 60 do 100 µm na dendryt. Obrazy należy pozyskać przy użyciu obiektywu olejowego 40 x na 1,3 oraz lasera 488 nm o typowej mocy szczytowej na poziomie próbki około 20 µW, ustawiając rozmiar piksela na około 80 nm, aby zapewnić prawidłowe próbkowanie kolców dendrytycznych.

Aby pobrać próbkę z całej objętości neuronu, należy wykonać stos obrazów Z (Z stack) z odstępem między płaszczyznami Z od 150 do 300 nanometrów, co pozwoli uzyskać od 20 do 30 przekrojów Z niezbędnych do przeprowadzenia ilościowej analizy 3D kolców dendrytycznych. W oprogramowaniu analitycznym do wstępnego przetwarzania należy zastosować następujące ustawienia. Użyj filtrowania Gaussa, wybierając opcję wygładzania obrazu za pomocą filtra Gaussa.

Ustaw szerokość filtra równą rozmiarowi piksela w płaszczyźnie XY, aby przeprowadzić półautomatyczne śledzenie dendrytów za pomocą modułu filament tracer. W zakładce slice użyj narzędzia distance, aby oszacować średnicę dendrytu. Następnie w zakładce surpassed kliknij narzędzie filaments i wybierz opcję skip automatic creation w celu zwiększenia niezawodności w zakładce draw.

Teraz należy wybrać auto path jako metodę, dendrite jako typ i wprowadzić szacowaną średnicę dendrytu. Korzystając z trybu wyboru wskaźnika, zmień kursor w prostokąt, a następnie przytrzymaj klawisz shift i kliknij prawym przyciskiem myszy w punkcie początkowym dendrytu. Oprogramowanie przeprowadzi wstępne obliczenia.

Teraz przesuń wskaźnik wzdłuż dendrytu od punktu początkowego. Wyświetlona zostanie żółta linia reprezentująca najbardziej prawdopodobną ścieżkę dendrytu. Naciśnij shift i lewy przycisk myszy.

Kliknij końcówkę dendrytu w interfejsie modułu, aby przeprowadzić zautomatyzowaną segmentację kolców. Kliknij kartę tworzenia w rozwijanej liście przebudowy (rebuild). Wybierz opcję przebudowy średnicy dendrytu (rebuild dendrite diameter) i zaznacz pole zachowaj dane (keep data).

Następnie kliknij rebuild. Ustaw próg tak, aby wysegmentowana objętość odpowiadała rzeczywistej objętości dendrytu. Jako algorytm wybierz shortest distance from distance map.

Następnie kliknij przycisk „next” w zakładce „slice”, wyznaczając najmniejszy kolec, średnicę główki oraz maksymalną długość. Następnie w zakładce „surpass” wprowadź wartości parametrów; wartości od 200 do 300 nanometrów dla minimalnej średnicy oraz cztery mikrometry dla maksymalnej długości stanowią dobre punkty wyjścia. Nie zaznaczając pola „allow spines”, kliknij przycisk „next”. Następnie dostosuj próg punktów zalążkowych (seed points threshold) tak, aby niebieskie punkty reprezentujące kolce znajdowały się dokładnie w główkach kolców.

Następnie kliknij „next”. Teraz zostanie wykonane główne obliczenie, co może zająć pewną ilość czasu, aby sklasyfikować kolce. W karcie „tools” interfejsu modułu kliknij „classify spine”. Po zweryfikowaniu, że istnieją cztery klasy opisane w protokole tekstowym, interfejs modułu wygeneruje cztery nowe obiekty filamentów z wynikami klasyfikacji.

Na koniec wyeksportuj dane statystyczne w zakładce statystyki, klikając opcję eksportuj wszystkie statystyki do pliku. Na tej rycinie przedstawiono hodowlę ludzkich neuronów znakowanych przeciwciałem anty-beta III tubulina. Widoczna jest tutaj również tendencja do tworzenia skupisk komórek.

Przedstawiono tutaj neuron parametalny znakowany GFP 40 dni po zróżnicowaniu z późnego progenitora korowego. Z powierzchownych warstw kory. Wstawka pokazuje mniejsze powiększenie z widocznym ciałem komórkowym.

Panele te przedstawiają rekonstrukcję 3D fragmentów kolców dendrytycznych na różnych etapach dojrzewania. Tutaj przedstawiono analizę ilościową gęstości kolców oraz objętości główek kolców. Zgodnie z oczekiwaniami, oba te parametry zwiększają się w okresie hodowli.

Podczas przeprowadzania procedury hodowli ważne jest, aby bardzo ostrożnie wysiewać i rozmieszczać neurostemy, dodając komórki powoli i wykonując delikatne ruchy obrotowe w celu ograniczenia skupiania się komórek. Metoda ta wymaga bowiem możliwości identyfikacji pojedynczych neuronów.