Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie kolców dendrytycznych z neuronów peralnych pochodzących z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych i ilościowe określenie ich w trzech wymiarach. Osiąga się to poprzez uprzednie potraktowanie szkiełek nakrywkowych w sześciodołkowych płytkach poliuretanem i lamininą w celu hodowli nerwowych komórek macierzystych. Następnie nerwowe komórki macierzyste rozcieńczone w hodowli.

Pożywkę plateruje się delikatnym ruchem pipety obrotowej i pozwala się na rozróżnienie do 70 dni w hodowli. Poprzez regularne odnawianie pożywki, komórki są transdukowane lentiwirusem GFP, barwione przeciwciałami anty GFP i wizualizowane. Na koniec hodowle są utrwalane, a kolce dendrytyczne są obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ostatecznie dane obrazowe ludzkich kolców dendrytycznych są rekonstruowane w 3D w celu ich klasyfikacji i kwantyfikacji. Protokół ten zapewnia stopniową procedurę uzyskiwania neuronów glutaminergicznego warstwy od drugiej do czwartej kory mózgowej człowieka. Polega ona na wykorzystaniu nerwowych komórek macierzystych pochodzących z indukowanych przez człowieka pre potencjalnych komórek macierzystych, które pochodzą z ludzkich fibroblastów w oparciu o wcześniej opublikowaną metodę.

Główną zaletą tej techniki naszych istniejących metod jest to, że pozwala na automatyczną segmentację DON right i PY w 3D. Wiąże się to ze znaczną oszczędnością czasu w porównaniu z istniejącymi programami, które zazwyczaj przygotowują się tylko na podstawie analizy 2D. Donr i szpieg w klasyfikacjach jest również bardzo przydatny i łatwy w użyciu.

Aby przygotować kultury neuronalne, umieść szklaną pokrywę w sześciu naczyniach do hodowli dołków i dodaj poliornitynę inkubowaną przez noc pod okapem przepływowym następnego dnia. Za pomocą DPBS trzykrotnie umyć szkiełka nakrywkowe i dodać lamininę, inkubować pod kapturem przepływowym przez co najmniej 10 godzin. Przygotować pożywkę zawierającą następujące składniki.

Następnie użyj pożywki do płytki i wysyłki nerwowych komórek macierzystych lub NSCS o gęstości 50 000 komórek na centymetr kwadratowy Pipetowania powolnymi ruchami obrotowymi w celu zmniejszenia grupowania komórek w celu transdukcji ludzkich neuronów pochodzących z IPSC. Na dowolnym etapie dojrzewania dodać jeden mikrolitr roztworu podstawowego zawierającego 40 nanogramów wektora lentiwirusowego GFP na studzienkę hodowlaną zawierającą świeżą pożywkę hodowlaną i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Aby przygotować komórki do immunofluorescencji, usuń pożywkę hodowlaną i użyj 4% formaldehydu do utrwalenia transdukowanych komórek w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie użyj jednego XPBS, aby umyć komórki trzy razy po 10 minut każde. Następnie zanurz szkiełka nakrywkowe w PBS uzupełnionym 0,05% surowicą Triton X 110% koń i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie użyj PBS, aby trzykrotnie umyć szkiełka nakrywkowe.

Dodaj jedno 1000. przeciwciało pierwszorzędowe GFP w 100 mikrolitrach PBS 4% surowicy końskiej do każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować w ciemnym pudełku w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Teraz rozcieńczyć sprzężone przeciwciało Alexa Fluor 4 88 od 1 do 200 w PBS 0,5% tween 20 i inkubować komórki z roztworem przeciwciała w temperaturze pokojowej przez godzinę po użyciu PBS do trzykrotnego umycia szkiełek.

Użyj medium montażowego do montażu szkiełek do mikroskopii fluorescencyjnej. Pod mikroskopem konfokalnym wybierz co najmniej 10 zdrowych neuronów na stan z morfologią parametalu i fałdowaną arboryzacją dendrytyczną, aby określić ilościowo od 60 do 100 mikrometrów na dendryt. Uzyskuj obrazy za pomocą obiektywu olejowego 40 x na, 1,3 i lasera 488 nm o typowej mocy szczytowej na poziomie próbki około 20 mikrowatów, ustaw rozmiar piksela około 80 nanometrów, aby prawidłowo pobrać próbki kolców dendrytycznych.

Aby pobrać próbkę całej objętości neuronu, należy uzyskać stos Z o odstępach Z od 150 do 300 nanometrów, uzyskując od 20 do 30 plasterków Z w celu przeprowadzenia kwantyfikacji 3D kolców dendrytycznych. Użyj następujących ustawień oprogramowania analitycznego do przetwarzania wstępnego. Użyj filtra Gaussa, wybierając filtr Gaussa wygładzający przetwarzanie obrazu.

Ustaw szerokość filtra równą rozmiarowi piksela w płaszczyźnie XY, aby wykonać półautomatyczne śledzenie dendrytów z modułu śledzenia filamentu. Na karcie plasterków użyj narzędzia odległości, aby oszacować średnicę dendrytu. Następnie w przekroczonej zakładce kliknij narzędzie filamentów i wybierz pomiń automatyczne tworzenie, aby uzyskać lepszą solidność W zakładce rysowania.

Teraz przedstawione wybierz auto path jako metodę, dendryt jako typ i wprowadź szacowaną średnicę dendrytu. Korzystając z trybu wyboru wskaźnika, zamień kursor w pole i wybierz shift i kliknij prawym przyciskiem myszy punkt początkowy dendrytu. Oprogramowanie wykona wstępne obliczenia.

Teraz przesuń wskaźnik wzdłuż dendrytu od punktu początkowego. Pokazana jest żółta linia reprezentująca najbardziej prawdopodobną ścieżkę dendrytów. Naciśnij Shift i w lewo.

Kliknij punkt końcowy dendrytu, aby przeprowadzić automatyczną segmentację kręgosłupa w interfejsie modułu. Kliknij kartę tworzenia na liście rozwijanej przebudowy. Wybierz opcję odbuduj średnicę dendrytu i zaznacz pole zachowaj dane.

Następnie kliknij odbuduj. Ustaw próg tak, aby objętość podzielona na segmenty odpowiadała rzeczywistej objętości dendrytu. Jako algorytm wybierz najkrótszą odległość z mapy odległości.

Następnie kliknij przycisk dalej pod zakładką plasterka, określ najmniejszy grzbiet, średnicę głowy i maksymalną długość. Następnie pod zakładką przekroczenia wprowadź wartości parametrów około 200 do 300 nanometrów dla minimalnej średnicy i cztery mikrometry dla maksymalnej długości są dobre Punkty początkowe bez zaznaczania pola zezwalaj na kolce, kliknij przycisk Dalej. Następnie dostosuj próg punktów początkowych tak, aby niebieskie punkty reprezentujące kolce znajdowały się w rzeczywistych głowach grzbietów.

Następnie kliknij przycisk Dalej. Obliczenia rdzenia zostaną teraz wykonane i może zająć trochę czasu, aby sklasyfikować kręgosłupy w zakładce narzędzi w interfejsie modułu, kliknij klasyfikuj kręgosłup. Po sprawdzeniu, czy istnieją cztery klasy zgodnie z opisem w protokole tekstowym, interfejs modułu wygeneruje cztery nowe obiekty filamentu z wynikami klasyfikacji.

Na koniec wyeksportuj dane statystyczne w zakładce statystyki, klikając eksport wszystkich statystyk do pliku. Rysunek ten ilustruje kulturę ludzkich neuronów oznaczonych przeciwciałem anty beta 3 tubuliny. Widoczna jest tu również tendencja do grupowania komórek.

Pokazany tutaj jest neuron parametaliczny oznaczony GFP 40 dni po różnicowaniu od późnego przodka kory. Z powierzchownych warstw korowych. Wstawka pokazuje mniejsze powiększenie z pozornym korpusem komórki.

Panele te reprezentują rekonstrukcję 3D segmentów kolców dendrytycznych na różnych etapach dojrzewania. Analiza ilościowa gęstości kręgosłupa i objętości głowy kręgosłupa jest pokazana tutaj. Zgodnie z oczekiwaniami te dwa parametry zwiększają się w okresie hodowli.

Podczas próby przeprowadzenia procedury hodowli ważne jest, aby bardzo ostrożnie platerować i wysyłać komórki macierzyste układu nerwowego, dodając komórki powoli delikatnym ruchem obrotowym w celu zmniejszenia choliny komórkowej. Rzeczywiście, metoda ta wymaga identyfikacji pojedynczych neuronów.