Znakowanie balistyczne neuronów piramidowych w wycinkach mózgu i w pierwotnej hodowli komórkowej

Protokół ten umożliwia ocenę potencjalnych zmian morfologicznych w neuronach i kolcach dendrytycznych, które mogą podkreślać nieprawidłowości neurochemiczne i behawioralne. Jest unikalny i przydatny do wizualizacji neuronów w różnych regionach mózgu u szczurów, co w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem rekonstrukcyjnym pozwala naukowcom wyjaśnić możliwe mechanizmy leżące u podstaw dysfunkcji neurokognitywnej. Zacznij od przygotowania roztworu PVP zgodnie ze wskazówkami z manuskryptu.

Napełnij rurkę PVP i pozostaw ją na 20 minut. I wyrzuć go przez drugi koniec za pomocą 10-mililitrowej strzykawki. Połącz 170 miligramów wolframowych kulek mikronośnika z 250 mikrolitrami chlorku metylenu.

Następnie dokładnie zwiruj zawiesinę. Następnie dodaj 6 miligramów lipofilowego barwnika DilC18(3) do 300 mikrolitrów chlorku metylenu i wiruj. Odpipetuj 250 mikrolitrów zawiesiny z kulkami wolframowymi na szkiełko

Poczekaj, aż zawiesina wyschnie na powietrzu i dodaj 300 mikrolitrów roztworu barwnika. Po wysuszeniu użyj brzytwy, aby podzielić mieszaninę na dwie 1,5-mililitrowe probówki wirówkowe i napełnić probówki wodą. Sonikować mieszaninę w łaźni wodnej aż do uzyskania jednorodności.

Upewnij się, że końcówka sonikatora leży bezpośrednio na rurkach. Połącz obie mieszaniny w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. I sonikuj przez kolejne trzy minuty, upewniając się, że nie pozostały żadne duże grudki pokrytych barwnikiem.

Po sonikacji wciągnąć mieszaninę do rurki pokrytej PVP za pomocą 10-mililitrowej strzykawki. I wprowadzić rurki do stacji przygotowawczej. Obracaj rurkę przez jedną minutę.

Ostrożnie usuń całą wodę za pomocą strzykawki. Włącz gazowy azot i dostosuj przepływ azotu do około 0,5 litra na minutę. Obróć rurkę w stacji przygotowawczej i susz ją azotem przez 30 minut.

Wyjmij rurkę ze stacji i pokrój ją na 13-milimetrowe segmenty za pomocą obcinaka do rur. Upewnij się, że szczur nie reaguje na szkodliwe bodźce i nie ma odruchów. Następnie zabezpiecz go w pozycji leżącej.

Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej. Oddziel membranę i otwórz klatkę piersiową nożyczkami. Następnie włóż igłę o rozmiarze 20 i średnicy 25 milimetrów do lewej komory.

Natychmiast przetnij prawy przedsionek nożyczkami i przelej 15 mililitrów 100 milimolowych PBS z natężeniem przepływu 5 milimetrów na minutę. Następnie przelej 100 mililitrów 4% PFA buforowanego w PBS. Po perfuzji usuń cały mózg szczura.

I namocuj go za pomocą 4%PFA przez 10 minut. Użyj matrycy mózgu szczura, aby wyciąć przekrój koronalny o grubości 500 mikrometrów. Wykonaj cięcie pięścią i trzymaj ostrze na miejscu.

Następnie wykonaj drugie cięcie drugim ostrzem i pionowo usuń pierwsze ostrze, trzymając tkankę na powierzchni ostrza. Umieść plastry mózgu na 24-dołkowej płytce z 1 mililitrem PBS w każdym dołku. I powtarzaj proces, aż wszystkie plasterki zostaną pokrojone.

Usuń PBS z każdej docelowej studzienki. Załaduj chrząstkę kawałkiem rurki Dil/wolframu i umieść ją w aplikatorze. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej między dwoma sitami siatkowymi.

I podłącz aplikator do węża helowego. Następnie dostosuj ciśnienie wyjściowe helu do 90 funtów na cal kwadratowy. Umieść aplikator pionowo na środku docelowej studzienki w odległości 1,5 centymetra między próbką a siatką.

Następnie odpal rurkę Dil/wolfram. Załaduj chrząstkę następną rurką i w sposób ciągły wystrzeliwujek z rurki na pozostałe plastry. Napełnić 24-dołkową płytkę 100-milimolowym PBS.

I umyj plastry trzy razy 500 mikrolitrami świeżego PBS. Upewnij się, że plastry nie przewracają się podczas prania. Po zakończeniu dodaj 500 mikrolitrów świeżego PBS do plastrów.

I wysiaduj je przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Po inkubacji za pomocą cienkiej szczoteczki przenieś plastry mózgu na szkiełka podstawowe. I natychmiast dodaj jeden mililitr środka montażowego zapobiegającego blaknięciu do każdej sekcji.

Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 15 milimetrów na sekcjach i wysusz szkiełka w ciemności. Włącz system mikroskopu konfokalnego i przełącz się na obiektyw 60X. Dostosuj ustawienia obrazowania zgodnie ze wskazówkami rękopisu.

I uzyskaj obrazy stosu Z dla docelowego typu neuronu w oparciu o granice regionów mózgu i cechy morfologiczne neuronów. Wyizoluj pierwotny neuron korowy od szczurów F344/N w pierwszym dniu po urodzeniu i hoduj je w naczyniu o szklanym dnie o grubości 35 milimetrów przez tydzień. Odświeżenie połowy podłoża trzeciego dnia po izolacji.

Umyj naczynie dwukrotnie 1 mililitrem 100-milimolowego PBS. I utrwal komórki za pomocą 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Proszę oznaczyć komórki balistycznie zgodnie z wcześniejszym opisem.

I umyj je jeszcze trzy razy 1 mililitrem PBS. Dodaj 500 mikrolitrów PBS do komórek i inkubuj je przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Następnie dodaj 200 mikrolitrów środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.

I uzyskaj obrazy stosu Z dla każdego docelowego neuronu. Typowe neurony piramidowe w okolicy hipokampa w sekcjach mózgu szczura zostały zidentyfikowane za pomocą technologii znakowania balistycznego charakteryzującej się jednym dużym dendrytem wierzchołkowym i kilkoma mniejszymi dendrytami podstawnymi wokół somy. Oprogramowanie do analizy ilościowej rekonstrukcji neuronów wykorzystano do śledzenia gałęzi dendrytycznych i wykrywania kolców.

Następnie oprogramowanie wykorzystano do oceny złożoności rozgałęzień dendrytycznych i złożoności trzpieni neuronalnych. Zmiany morfologiczne w kolcach dendrytycznych oceniano na podstawie długości, objętości i średnicy głowy. Następnie kolce podzielono na cienkie, przysadziste i grzybowe.

Zbadano również względną częstość występowania kolców między każdym promieniem. Co więcej, technika znakowania balistycznego została zwalidowana na pierwotnym neuronie piramidowym w hodowli komórkowej. Neurony piramidalne zidentyfikowano na podstawie trójkątnego kształtu somy i dużego dendrytu wierzchołkowego.

Następnie wykorzystano oprogramowanie do rekonstrukcji neuronów do analizy rozkładu cienkich kolców dendrytycznych i długości kolców dendrytycznych. Podczas próbowania tego protokołu ważne jest, aby unikać dużych grudek lub skupisk kulek wolframowych pokrytych barwnikiem balistycznym od rozpoczęcia przygotowania. Skupiska nie pozwoliłyby na rozróżnienie poszczególnych neuronów.

W połączeniu z oprogramowaniem do rekonstrukcji neuronów, metoda ta pozwala nam badać morfologię neuronów i dendrytycznych kręgosłupów w neuronach piramidowych hipokampa. Oprogramowanie do rekonstrukcji neuronów wykorzystuje algorytm do automatycznej wspomaganej klasyfikacji kolców dendrytycznych. Kwantyfikacja wielu parametrów neuronalnych daje możliwość lepszego zrozumienia mechanizmu leżącego u podstaw neuronalnej dysfunkcji poznawczej.