Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

Projekt ten ma na celu przegląd działania przeciwnowotworowego leków poprzez zmianę ultrastruktury na poziomie subkomórkowej nanoskali i ustalenie związku między morfologią organelli a mechanizmem patologicznym raka. Technologia ta łączy tradycyjną technologię makroskopową elektronów z technologią rekonstrukcji trójwymiarowej bez specjalnego sprzętu. W porównaniu z innymi technikami może poprawić wydajność obrazowania i elastyczność rekonstrukcji oraz rekonstrukcję struktur docelowych w czasie rzeczywistym w dowolnym momencie, dzięki czemu jest bardzo łatwy i uniwersalny.

Ta technologia trójwymiarowej rekonstrukcji ciągłych ultracienkich szkiełek może wielokrotnie przywracać prawdziwą stereochemię bez specjalnego drogiego sprzętu. Może być stosowany do analizy jakościowej i ilościowej wszystkich organelli w dowolnym momencie. Realizuje łatwą obsługę obserwacji ultrastruktury.

Na początek zaszczep 2 miliony komórek Pan02 w 12 mililitrach DMEM i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 95% wilgotności, 5% dwutlenku węgla i 35% powietrza. Po 48 godzinach odwirować kulturę o masie 28 g przez dwie minuty i wyrzucić supernatant. Napraw komórki, dodając jeden mililitr 2,5% aldehydu glutarowego do 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówek przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnego dnia odwirować próbki o masie 1006 g przez pięć minut i odessać utrwalacz, a następnie dwukrotnie przepłukać próbkę 0,1 molowym PBS. Następnie dwukrotnie przepłukać próbki wodą podwójnie destylowaną przez 10 minut każda. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu 1% tetratlenku osmu i 1,5% żelazocyjanku potasu w stosunku 1:1 i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez godzinę.

Odwirować i przepłukać próbki dwukrotnie 0,1 molowym PBS i raz wodą podwójnie destylowaną. Następnie dodać jeden mililitr 1% tiokarbohydrazydu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut Po inkubacji odwirować i wyrzucić supernatant przed czterokrotnym przepłukaniem próbek wodą podwójnie destylowaną. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 1% tetratlenku osmu i pozostaw do utrwalenia w temperaturze pokojowej na godzinę.

Ponownie odwirować i przepłukać próbki czterokrotnie wodą podwójnie destylowaną. Dodaj jeden mililitr 2% octanu uranylu i pozwól mu zabarwić się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po przepłukaniu próbek podwójnie destylowaną wodą dodać jeden mililitr roztworu Waltona i inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po inkubacji przepłukać komórki czterokrotnie wodą podwójnie destylowaną przed odwodnieniem w serii stopniowanego etanolu przez 10 minut każda. Następnie odwodnić dwukrotnie w jednym mililitrze 100% acetonu przez 10 minut każdy. Następnie wymieszaj 200 mikrolitrów acetonu z żywicą epoksydową Pon 812 w stosunku 3:1, 1:1 i 1:3 i zanurz próbki w żywicy w temperaturze pokojowej odpowiednio przez 2, 4 i 4 godziny.

Po odpowiedniej inkubacji próbki zaimpregnować przez noc w 100% żywicy epoksydowej Pon 812. Następnego dnia przenieś próbki do płaskiej formy do zatapiania i polimeryzuj je w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po polimeryzacji, za pomocą ultramikrotomu, należy seryjnie pokroić paski o grubości 70 nanometrów na zhydrolizowanych płytkach krzemowych i wysuszyć je w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Wytnij przewodzącą taśmę węglową i przyklej ją między płytkami krzemowymi zamontowanymi z sekcjami komórek trzustki a stolikiem na próbkę SEM. Następnie ustaw napięcie przyspieszające FE-SEM na dwa kilowolty z odległością roboczą czterech milimetrów. Na górnym pasku menu kliknij ikonę HL.

Następnie przy małym powiększeniu zorientuj pierwszą sekcję docelowego paska plastra i ponownie kliknij ikonę HL, aby przejść do trybu dużego powiększenia. Zbierz obraz odpowiedni do interesującej Cię struktury, dostosowując obraz, jasność, kontrast i powiększenie. Następnie wybierz pozycję Widok projektu.

Następnie otwórz dane i zaimportuj pliki obrazów do analizy do oprogramowania. Wyrównaj obrazy, klikając Wyrównaj plasterki i Edytuj. Następnie na lewym dolnym pasku menu dostosuj wartość zakresu intensywności, modyfikując przezroczystość obrazu.

Wybierz moduł Wyodrębnij wolumin podrzędny i kliknij opcję Wyrównane zestawy danych, aby dopasować rozmiar nakładającej się części całego stosu. Następnie w podsekcji Segmentation (Segmentacja) wybierz opcję Resample (Ponowne próbkowanie). Następnie Segmentacja i kliknij Zapisz.

Następnie wybierz próg magicznej różdżki i rozmiar narzędzia pędzla, aby wybrać odpowiedni zakres. Z menu wyboru kliknij ikonę Dodaj, aby dodać wybrany obszar. Po zakończeniu segmentacji regionalnej wygeneruj plik obrazu zgodnie z najlepszymi wynikami dla rozmiaru obiektu i rozdzielczości obrazu.

Kliknij Edytor przycinania i w polu wirtualnego suwaka wprowadź liczbę sześć. Następnie z menu rozwijanego po lewej stronie kliknij prawym przyciskiem myszy szary obszar w podsekcji Projekt i wybierz opcję Generuj powierzchnię, a następnie Utwórz i zastosuj. W pliku wygenerowanym za pomocą modułu Widok powierzchni utwórz strukturę powierzchni i reprezentację 3D.

Obrazy 2D FE-SEM ujawniły, że w grupie kontrolnej mitochondria były równomiernie rozmieszczone z regularnymi strukturami grzebieniami. Natomiast grupa RSL3 wykazywała skurczone mitochondria ze zwiększoną gęstością błony i niejasnymi strukturami grzebieniami. Jednak nie wszystkie grzebienia mitochondrialne uległy degeneracji w grupie RSL3, ponieważ niektóre pozostały nienaruszone.

W porównaniu z grupą RSL3, grupa inhibitora miała w większości nienaruszone struktury grzebienia, z których tylko kilka nie było widocznych. Obrazy 3D grupy kontrolnej zapewniły dokładniejszy widok mitochondriów i ich struktur grzebienia. Obrazy 3D grupy RSL3 wykazały nieregularne i wakuolizowane mitochondria, podczas gdy grupa inhibitorowa wykazywała różne kształty grzebienia.

Kwantyfikacja zmian mitochondrialnych wykazała, że grupa RSL3 miała znacznie zmniejszoną długość i objętość mitochondriów w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy grupa inhibitora wykazała wyniki pośrednie. RSL3 spowodował również dysfunkcję mitochondriów i zmienił metabolizm komórkowy poprzez zmianę morfologii mitochondriów i wywołanie ferroptozy.