Name: Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj trójwymiarową technikę wizualizacji zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki. Ta metoda łączy mikroskopię elektronową z rekonstrukcją 3D, umożliwiając analizę jakościową i ilościową organelli bez drogiego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez granty Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82274364, 81673607 i 81774011); a także projekt badawczy dotyczący dobrobytu publicznego w ramach grantu Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Doceniamy ogromną pomoc, wsparcie techniczne i eksperymentalne ze strony Publicznej Platformy Centrum Badań Medycznych, Akademii Chińskich Nauk Medycznych, Chińskiego Uniwersytetu Medycznego Zhejiang.

1. Przygotowanie materiału
<ol>
	<li>Hodować 2 x 106 komórek Panc02 w 12 ml pożywki DMEM (10% płodowej surowicy bydlęcej i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny) i utrzymywać w temperaturze 37 °C i wilgotności 95% w atmosferze 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza przez 48 godzin.</li>
	<li>Zebrać komórki Panc02, odwirować przy 28 x g przez 2 minuty, a następnie wyrzucić supernatant. Upewnij się, że próbka ma odpowiednią wielkość (1 x 107 komórek), ponieważ w przeciwnym razie następujące etapy utrwalania i odwadniania nie będą działać dobrze.</li>
	<li>Dodać 1 ml 2,5% aldehydu glutarowego jako utrwalacz, aby utrwalić świeże komórki Panc02 w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Próbki należy odwirowywać przy 1,006 x g przez 5 minut w każdym z następujących etapów (kroki 1.3-1.11).</li>
	<li>Odessać utrwalacz i przepłukać próbki dwukrotnie 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie dwukrotnie przepłukać wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) o temperaturze pokojowej przez 10 minut każda.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu zawierającego 1% tetratlenku osmu (OsO4) i 1,5% żelazocyjanku potasu w stosunku 1:1 w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Następnie płukać dwukrotnie 0,1 M PBS przez 10 minut za każdym razem i płukać ddH2O przez kolejne 10 minut.</li>
	<li>Dodać 1 ml 1% tiokarbohydrazydu (TCH), inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut do 1 godziny, a następnie płukać ddH2O cztery razy przez 10 minut za każdym razem.</li>
	<li>Dodać 50 μl 1% OsO4, utrwalić w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie spłukać ddH2O cztery razy przez 10 minut za każdym razem.</li>
	<li>Dodać 1 ml 2% octanu uranylu w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie płukać ddH2O cztery razy przez 10 minut za każdym razem.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu Waltona (0,066 g azotanu ołowiu rozpuszczonego w 10 ml roztworu podstawowego kwasu asparaginowego o stężeniu 0,03 mol/l) w temperaturze 60 °C przez dodatkowy 1 godzinę inkubacji.</li>
	<li>Płukać ddH2O cztery razy przez 10 minut za każdym razem, a następnie odwadniać w serii stopniowanych alkoholi przez 10 minut za każdym razem: 50% alkoholu, 70% alkoholu, 80% alkoholu i 90% alkoholu 1x i 100% alkoholu 2x. Następnie odwodnić w 100% acetonie dwa razy przez 10 minut za każdym razem. Użyj 1 ml każdego roztworu do odwodnienia.</li>
	<li>Wymieszać 200 μl acetonu z żywicą epoksydową Pon 812 w proporcjach 3:1, 1:1 i 1:3. Namocz próbkę w żywicy w temperaturze pokojowej odpowiednio przez 2 godziny, 4 godziny i 4 godziny, a następnie weź 100% żywicę epoksydową Pon 812 do impregnacji przez noc. 
	UWAGA: Podczas wykonywania etapów barwienia i zatapiania żywicy ważne jest, aby pracować w dygestorium, ponieważ są to substancje toksyczne. Dodatkowo podczas eksperymentu należy nosić fartuchy laboratoryjne i rękawice odporne na rozpuszczalniki.</li>
	<li>Próbki należy umieścić w formie do zatapiania, a następnie umieścić w piecu w temperaturze 60 °C na 48 godzin w celu polimeryzacji. Użyj flat embedding29, aby zmniejszyć widoczność żywicy wokół próbki. Upraszcza to instalację próbki i zmniejsza wpływ artefaktów ładowania na późniejszą segmentację obrazu. 
	UWAGA: Aby następnie wygenerować poziomą powierzchnię cięcia, można dodać niewielką ilość żywicy do otworu formy, uważając, aby go nie przepełnić.</li>
	<li>Przygotować płytki krzemowe, najpierw je myjąc, a następnie hydrofilując stężonym roztworemH2SO4/H2O2przez 30 min. Na hydrofilizowanych płytkach krzemowych należy kolejnie kroić paski o grubości 70 nm za pomocą ultramikrotomu i suszyć je w piecu o temperaturze 60 °C przez 10 min. 
	UWAGA: Powoli chwyć plasterek, gdy plasterek unosi się na powierzchni wafli, aby zapobiec utracie lub deformacji plasterka.</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazu i rekonstrukcja trójwymiarowa
<ol>
	<li>Przed zamontowaniem wafla silikonowego na scenie należy trzykrotnie umyć sekcje wodą destylowaną i wysuszyć je na powietrzu. Wytnij przewodzącą taśmę węglową o wymiarach 1 cm x 0,5 cm i przyklej ją między płytką krzemową a stolikiem próbki SEM, aby zakończyć konfigurację próbki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Ustawić parametr napięcia przyspieszającego FE-SEM na 2 kV z odległością roboczą 4 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B i tabela 1). 
	UWAGA: Aby poprawić stosunek sygnału do szumu i zredukować szumy na obrazie, obserwuj przy małych powiększeniach, gdy tylko jest to możliwe. Wraz ze wzrostem wielokrotności zmniejsza się zasięg skanowania SEM, co prowadzi do wzrostu akumulacji ładunku na obrazach.</li>
	<li>Kliknij ikonę H/L na górnym pasku menu. Najpierw, przy małym powiększeniu, zorientuj pierwszą sekcję docelowych pasków plasterka, a następnie ponownie kliknij opcję H/L (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A), aby przełączyć się na tryb dużego powiększenia; Zbierz obraz odpowiedni do interesującej Cię struktury, dostosowując jasność, kontrast i powiększenie obrazu.</li>
	<li>Wybierz opcję Project View > Open Data i zaimportuj pliki obrazów, które mają zostać przeanalizowane, do oprogramowania.</li>
	<li>Wyrównaj obrazy, klikając Wyrównaj plasterki > Edytuj (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B) i dostosuj wartość Zakres intensywności w lewym dolnym pasku menu, modyfikując przezroczystość obrazu. W tym przypadku użyj półautomatycznej strategii wyrównywania; W szczególności, poprzez automatyczne wyrównywanie, spraw, aby obrazy nakładały się na poprzedni obraz, a następnie wykonaj ręczne dostrajanie. 
	UWAGA: W tej pracy, podczas procesu wyrównywania, poprzedni obraz został wykorzystany jako odniesienie, a operacje przesuwania i obracania zostały wykorzystane do maksymalnego nałożenia na siebie docelowej struktury obu obrazów. Kliknięcie opcji Wyrównaj bieżącą parę plasterków może pomóc w automatycznym wyrównaniu obrazów, ale może wystąpić niewłaściwe umieszczenie.</li>
	<li>Wybierz moduł Wyodrębnij podwolumin i przytnij wyrównane zestawy danych, aby dopasować je do rozmiaru nakładającej się części całego stosu.</li>
	<li>W podsekcji Segmentacja (Rysunek 4C) wybierz opcję Resample > Segmentation > Save. Wybierz próg magicznej różdżki i rozmiar narzędzia Pędzel, aby wybrać odpowiedni zakres. Również w tym przypadku zastosuj półautomatyczną metodę segmentacji, najpierw używając Magicznej Różdżki, aby automatycznie wybrać odpowiedni duży obszar, a następnie użyj Pędzla, aby dokładnie opisać szczegóły. 
	UWAGA: Magiczna różdżka może być stosowana do segmentowania obrazów w oparciu o oczywiste różnice w intensywności pikseli istniejące między strukturą będącą przedmiotem zainteresowania a otaczającymi strukturami, zmieniając wartość maskowania i używając linii limitu rysowania. Nie jest w stanie rozróżnić artefaktów ładowania generowanych podczas akwizycji obrazu. W związku z tym może to skutkować nieprawidłową segmentacją dla regionów docelowych. Za pomocą narzędzia Pędzel można ręcznie segmentować w celu dokładnej rekonstrukcji struktur biologicznych.</li>
	<li>W obszarze Segmentacja > wybór kliknij ikonę +, aby dodać wybrany obszar (Rysunek 4C).</li>
	<li>Powtórz powyższy krok (2.8), aby wybrać tę samą strukturę docelową na różnych obrazach, aż wybór zostanie zakończony w celu rekonstrukcji interesujących mikrostruktur. 
	UWAGA: Podczas procesów przebudowy mitochondriów wybór obiektu docelowego musi być wykonany z obrazu znajdującego się w środku grupy obrazów sekwencyjnych. Jeśli żądany obszar zostanie wybrany z pierwszego lub ostatniego zdjęcia, wynik rekonstrukcji nie będzie w stanie przedstawić pełnej wizualizacji 3D.</li>
	<li>Po zakończeniu segmentacji regionalnej wygeneruj plik obrazu zgodnie z najlepszymi wynikami dla rozmiaru obiektu i rozdzielczości obrazu. Kliknij Edytor kadrowania, a następnie wprowadź liczbę 6 w polu Wirtualny suwak (Rysunek 4C).</li>
	<li>W menu rozwijanym po lewej stronie kliknij prawym przyciskiem myszy szary obszar w podsekcji Projekt i wybierz opcję Generuj powierzchnię > Utwórz > zastosuj. W wygenerowanym pliku użyj modułu Widok powierzchni, aby utworzyć strukturę powierzchni i reprezentację 3D.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja
<ol>
	<li>Kliknij Usuń małe plamki > Zastosuj (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D). W podsekcji Projekt kliknij prawym przyciskiem myszy szary obszar i wybierz Analiza etykiet > Zastosuj (Rysunek 4D).</li>
	<li>Dostosuj nazwę kolumny i wybierz grupę miar. Wybierz Volume3d i Length3d z pola Native Measurements (Pomiary natywne).</li>
	<li>Kliknij przycisk Zastosuj w lewym dolnym rogu ekranu. Skopiuj dane i wykres w oprogramowaniu statystycznym, takim jak GraphPad.</li>
</ol>

3D Technique to Visualize Mitochondrial Cristae in Pancreatic Cancer Cells

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiona tutaj metoda jest przydatnym przewodnikiem krok po kroku dotyczącym zastosowania techniki rekonstrukcji 3D, która polega na zastosowaniu mikroskopii elektronowej i technologii przetwarzania obrazu do układania i segmentacji obrazów tomograficznych 2D generowanych z szeregowych ultracienkich przekrojów. Protokół ten podkreśla ograniczenie obrazów 2D, które można rozwiązać za pomocą wizualizacji 3D ultrastruktury organelli, która ma zalety w postaci silnej odtwarzalności struktur na poziomie wysokiej rozdziel...

Mitochondria są jednymi z najważniejszych organelli w komórce. Służą jako centralny ośrodek bioenergetyki komórkowej i metabolizmu1,2 i odgrywają kluczową rolę w raku3. Rak trzustki (PC) jest jednym z najtrudniejszych nowotworów do leczenia 4 ze względu na szybkie rozprzestrzenianie się i wysoką śmiertelność. Dysfunkcja mitochondriów, która jest głównie spowodowana zmianami w morfologii mitochondriów3,5,6,7, została powiązana z mechanizmami chorobowymi leżącymi u podstaw PC8. Mitochondria są również bardzo dynamiczne, co znajduje odzwierciedlenie w częstych i dynamicznych zmianach w ich łączności sieciowej i strukturze cristae9. Przekształcenie struktury cristae może mieć bezpośredni wpływ na funkcję mitochondriów i stan komórkowy10,11, które są znacząco zmienione podczas wzrostu komórek nowotworowych, przerzutów i zmian mikrośrodowiska guza12,13.
W ostatnich latach naukowcy badali te organelle za pomocą obserwacji EM14,15,16,17; na przykład, badacze przeanalizowali dynamikę mitochondriów za pomocą technik rekonstrukcji 3D6,7,18,19. Ogólna koncepcja i metoda rekonstrukcji 3D obrazów mikroskopii elektronowej została formalnie ustalona już w 196820 i obejmowała połączenie mikroskopii elektronowej, dyfrakcji elektronów i komputerowego przetwarzania obrazu w celu rekonstrukcji ogona faga T4. Do tej pory technologia obrazowania 3D w mikroskopii elektronowej poczyniła znaczne postępy w zakresie rozdzielczości obrazu21, stopnia automatyzacji22 i objętości przetwarzania23 i jest stosowana na coraz szerszą skalę w badaniach biologicznych, od poziomu tkanki do poziomu ultrastruktury organelli w skali nanometrowej24. W ostatnich latach obrazowanie 3D w mikroskopii elektronowej stało się również obiecującą technologią dla szerokiego zakresu zastosowań25,26,27.
Rosnące zainteresowanie grzbiecikami mitochondrialnymi szczególnie ilustruje podstawowe wymagania dotyczące ultrastrukturalnego obrazowania objętościowego. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) została wykorzystana do wizualizacji próbek zebranych na miedzianej siatce (400 mesh)28, z wiązką elektronów przechodzącą przez przekrój. Jednak ze względu na ograniczony zasięg siatki miedzianej niemożliwe jest pełne zobrazowanie ciągłych warstw tej samej próbki29. Komplikuje to badanie struktur docelowych podczas obrazowania TEM. Ponadto TEM opiera się na czasochłonnych i podatnych na błędy zadaniach ręcznych, w tym wycinaniu i zbieraniu wielu warstw oraz ich sekwencyjnym obrazowaniu21, więc nie jest przystosowany do ultrastrukturalnych rekonstrukcji próbek o dużej objętości23. Obecnie rekonstrukcja obrazowania próbek wielkoobjętościowych w wysokiej rozdzielczości odbywa się dzięki zastosowaniu specjalistycznego sprzętu, takiego jak macierz kamer TEM (TEMCA)30 lub dwa systemy TEMCA drugiej generacji (TEMCA2)31, które umożliwiają zautomatyzowane obrazowanie o wysokiej przepustowości w krótkim czasie. Jednak ten rodzaj obrazowania nie ma tej zalety, że jest łatwy do uzyskania i uniwersalny ze względu na wymóg stosowania niestandardowego sprzętu.
W porównaniu z TEM, metoda automatycznego generowania tysięcy seryjnych obrazów wolumetrycznych dla dużych obszarów na podstawie SEM32,33 zwiększa wydajność i niezawodność obrazowania szeregowego oraz zapewnia wyższe rozdzielczości z34. Na przykład seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa z blokową powierzchnią czołową (SBF-SEM) i skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów (FIB-SEM) umożliwiły osiągnięcie rekonstrukcji 3D ultrastruktury z dużą prędkością, wydajnością i rozdzielczością35,36. Nieuniknione jest jednak, że powierzchnia bloku zostanie mechanicznie ogolona nożem diamentowym SBF-SEM lub przez frezowanie skupioną wiązką jonów FIB-SEM33,37. Ze względu na destrukcyjność tych dwóch metod dla próbek, nie jest możliwe ponowne zrekonstruowanie tej samej struktury docelowej do dalszej analizy38,39,40. Ponadto w niewielu badaniach podjęto próbę rekonstrukcji ultrastruktury 3D organelli komórek rakowych za pomocą EM do obserwacji zmian patologicznych12. Z tych powodów, w celu dalszego wyjaśnienia patologicznych mechanizmów komórek nowotworowych, takich jak komórki raka trzustki, proponujemy nowatorską technologię rekonstrukcji 3D obrazów przekrojów seryjnych za pomocą ultramikrotomu i skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją pola (FE-SEM) w celu analizy ultrastruktury mitochondriów na poziomie grzebienia; Dzięki tej technologii dane o wysokiej rozdzielczości mogą być pozyskiwane przy użyciu wydajnej i dostępnej metody. Seryjne ultracienkie skrawki wykonane za pomocą ultramikrotomu mogą być półtrwale przechowywane w siatkowej walizce i wielokrotnie odtwarzane, nawet po kilku latach41. FE-SEM jest wysoko ceniony jako narzędzie w różnych dziedzinach badawczych ze względu na jego zdolność do dostarczania obrazowania w wysokiej rozdzielczości, dużego powiększenia i wszechstronności42. Próbując ukazać delikatną strukturę organelli w 3D, technika wytwarzania szeregowych stosów obrazów 2D z użyteczną rozdzielczością przy użyciu elektronów rozpraszanych wstecznie wytwarzanych przez FE-SEM43,44 może być również wykorzystana do uzyskania wysokiej przepustowości i wieloskalowego obrazowania obszarów docelowych lub powiązanych z nimi struktur bez specjalnego sprzętu45. Generowanie artefaktów ładunku ma bezpośredni wpływ na jakość pozyskiwanych obrazów, dlatego szczególnie ważne jest, aby czas przebywania był krótki.
Tak więc, niniejsze badanie omawia procedury eksperymentalne stosowane w tej technice SEM do rekonstrukcji struktury 3D mitochondriów cristae46. W szczególności pokazujemy proces opracowany w celu osiągnięcia półautomatycznej segmentacji regionów mitochondrialnych i digitalizacji rekonstrukcji 3D za pomocą oprogramowania Amira, który obejmuje również tworzenie próbek warstwowych przy użyciu konwencjonalnej metody przygotowania próbek OTO44,47, uzupełnianie kolekcji sekcji za pomocą krojenia ultramikrotomowego i pozyskiwanie sekwencyjnych danych 2D przez FE-SEM.

<table><tbody><tr><td>(1S,3R)-RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>SIGMA</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amira Visage Imaging</td><td></td><td>2020.2</td></tr><tr><td>Kwas asparaginowy</td><td>MCE</td><td>HY-42068</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle' s medium</td><td>Gibco</td><td>11995115</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>MCE</td><td>HY-100579</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy z emisją w polu</td><td>HITACHI</td><td>SU8010</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10500.22</td><td></td></tr><tr><td>Ołów azotan</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-211724</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-206008B</td><td></td></tr><tr><td>Panc02</td><td>Europejska Kolekcja Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych&nbsp;</td><td></td><td></td>98102213</tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Biosharp</td><td>BL505A</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Pon 812 Żywica epoksydowa</td><td>SPI CHEM</td><td>GS02660</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>Macklin</td><td>P816416</td><td></td></tr><tr><td>Tiokarbohydrazyd</td><td>Merck</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Octan</td> uranylu LEICA <td>EMUC7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RHAWN</td><td>R032929</td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Zrozumienie dynamicznych cech ultrastruktury organelli komórkowej, która jest nie tylko bogata w nieznane informacje, ale także wyrafinowana z perspektywy trójwymiarowej (3D), jest kluczowe dla badań mechanistycznych. Mikroskopia elektronowa (EM) zapewnia dobrą głębię obrazowania i pozwala na rekonstrukcję stosów obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania ultrastrukturalnej morfologii organelli komórkowych nawet w skali nanometrowej; dlatego rekonstrukcja 3D zyskuje na znaczeniu ze względu na swoje nieporównywalne zalety. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) zapewnia wysokowydajną technologię akwizycji obrazu, która pozwala na rekonstrukcję dużych struktur w 3D z tego samego obszaru zainteresowania w kolejnych warstwach. Dlatego zastosowanie SEM w rekonstrukcji 3D na dużą skalę w celu przywrócenia prawdziwej ultrastruktury 3D organelli staje się coraz bardziej powszechne. W tym protokole sugerujemy połączenie seryjnego ultracienkiego przekroju i technik rekonstrukcji 3D w celu zbadania grzebień mitochondrialnych w komórkach raka trzustki. Szczegółowe informacje na temat wykonywania tych technik są opisane w niniejszym protokole krok po kroku, w tym metoda osmu-tiokarbohydrazydu-osmu (OTO), seryjne obrazowanie ultracienkich przekrojów oraz wyświetlanie wizualizacji.

Podczas hodowli komórkowej (Rycyna 1A) komórki raka trzustki podzielono najpierw na grupę kontrolną hodowaną w pełnej pożywce, grupę (1S,3R)-RSL348 (RSL3, aktywator ferroptozy, 100 nM) oraz grupę RSL3 (100 nM) z dodatkiem ferrostatyny-149 (Fer-1, inhibitor ferroptozy, 100 nM). W ramach powyższych kroków eksperymentalnych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wykonano odpowiednio 38 (Rycina uzupełniająca 1), 43 (<stron...

Ten protokół opisuje, jak zrekonstruować grzebienie mitochondrialne, aby uzyskać obrazowanie 3D z wysoką dokładnością, wysoką rozdzielczością i wysoką przepustowością.

Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Projekt ten ma na celu przegląd działania przeciwnowotworowego leków poprzez zmianę ultrastruktury na poziomie subkomórkowej nanoskali i ustalenie związku między morfologią organelli a mechanizmem patologicznym raka. Technologia ta łączy tradycyjną technologię makroskopową elektronów z technologią rekonstrukcji trójwymiarowej bez specjalnego sprzętu. W porównaniu z innymi technikami może poprawić wydajność obrazowania i elastyczność rekonstrukcji oraz rekonstrukcję struktur docelowych w czasie rzeczywistym w dowolnym momencie, dzięki czemu jest bardzo łatwy i uniwersalny.Ta technologia trójwymiarowej rekonstrukcji ciągłych ultracienkich szkiełek może wielokrotnie przywracać prawdziwą stereochemię bez specjalnego drogiego sprzętu. Może być stosowany do analizy jakościowej i ilościowej wszystkich organelli w dowolnym momencie. Realizuje łatwą obsługę obserwacji ultrastruktury.Na początek zaszczep 2 miliony komórek Pan02 w 12 mililitrach DMEM i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 95% wilgotności, 5% dwutlenku węgla i 35% powietrza. Po 48 godzinach odwirować kulturę o masie 28 g przez dwie minuty i wyrzucić supernatant. Napraw komórki, dodając jeden mililitr 2,5% aldehydu glutarowego do 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówek przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Następnego dnia odwirować próbki o masie 1006 g przez pięć minut i odessać utrwalacz, a następnie dwukrotnie przepłukać próbkę 0,1 molowym PBS. Następnie dwukrotnie przepłukać próbki wodą podwójnie destylowaną przez 10 minut każda. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu 1% tetratlenku osmu i 1,5% żelazocyjanku potasu w stosunku 1:1 i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez godzinę.Odwirować i przepłukać próbki dwukrotnie 0,1 molowym PBS i raz wodą podwójnie destylowaną. Następnie dodać jeden mililitr 1% tiokarbohydrazydu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut Po inkubacji odwirować i wyrzucić supernatant przed czterokrotnym przepłukaniem próbek wodą podwójnie destylowaną. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 1% tetratlenku osmu i pozostaw do utrwalenia w temperaturze pokojowej na godzinę.Ponownie odwirować i przepłukać próbki czterokrotnie wodą podwójnie destylowaną. Dodaj jeden mililitr 2% octanu uranylu i pozwól mu zabarwić się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po przepłukaniu próbek podwójnie destylowaną wodą dodać jeden mililitr roztworu Waltona i inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę.Po inkubacji przepłukać komórki czterokrotnie wodą podwójnie destylowaną przed odwodnieniem w serii stopniowanego etanolu przez 10 minut każda. Następnie odwodnić dwukrotnie w jednym mililitrze 100% acetonu przez 10 minut każdy. Następnie wymieszaj 200 mikrolitrów acetonu z żywicą epoksydową Pon 812 w stosunku 3:1, 1:1 i 1:3 i zanurz próbki w żywicy w temperaturze pokojowej odpowiednio przez 2, 4 i 4 godziny.Po odpowiedniej inkubacji próbki zaimpregnować przez noc w 100% żywicy epoksydowej Pon 812. Następnego dnia przenieś próbki do płaskiej formy do zatapiania i polimeryzuj je w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po polimeryzacji, za pomocą ultramikrotomu, należy seryjnie pokroić paski o grubości 70 nanometrów na zhydrolizowanych płytkach krzemowych i wysuszyć je w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut.Wytnij przewodzącą taśmę węglową i przyklej ją między płytkami krzemowymi zamontowanymi z sekcjami komórek trzustki a stolikiem na próbkę SEM. Następnie ustaw napięcie przyspieszające FE-SEM na dwa kilowolty z odległością roboczą czterech milimetrów. Na górnym pasku menu kliknij ikonę HL.Następnie przy małym powiększeniu zorientuj pierwszą sekcję docelowego paska plastra i ponownie kliknij ikonę HL, aby przejść do trybu dużego powiększenia. Zbierz obraz odpowiedni do interesującej Cię struktury, dostosowując obraz, jasność, kontrast i powiększenie. Następnie wybierz pozycję Widok projektu.Następnie otwórz dane i zaimportuj pliki obrazów do analizy do oprogramowania. Wyrównaj obrazy, klikając Wyrównaj plasterki i Edytuj. Następnie na lewym dolnym pasku menu dostosuj wartość zakresu intensywności, modyfikując przezroczystość obrazu.Wybierz moduł Wyodrębnij wolumin podrzędny i kliknij opcję Wyrównane zestawy danych, aby dopasować rozmiar nakładającej się części całego stosu. Następnie w podsekcji Segmentation (Segmentacja) wybierz opcję Resample (Ponowne próbkowanie). Następnie Segmentacja i kliknij Zapisz.Następnie wybierz próg magicznej różdżki i rozmiar narzędzia pędzla, aby wybrać odpowiedni zakres. Z menu wyboru kliknij ikonę Dodaj, aby dodać wybrany obszar. Po zakończeniu segmentacji regionalnej wygeneruj plik obrazu zgodnie z najlepszymi wynikami dla rozmiaru obiektu i rozdzielczości obrazu.Kliknij Edytor przycinania i w polu wirtualnego suwaka wprowadź liczbę sześć. Następnie z menu rozwijanego po lewej stronie kliknij prawym przyciskiem myszy szary obszar w podsekcji Projekt i wybierz opcję Generuj powierzchnię, a następnie Utwórz i zastosuj. W pliku wygenerowanym za pomocą modułu Widok powierzchni utwórz strukturę powierzchni i reprezentację 3D.Obrazy 2D FE-SEM ujawniły, że w grupie kontrolnej mitochondria były równomiernie rozmieszczone z regularnymi strukturami grzebieniami. Natomiast grupa RSL3 wykazywała skurczone mitochondria ze zwiększoną gęstością błony i niejasnymi strukturami grzebieniami. Jednak nie wszystkie grzebienia mitochondrialne uległy degeneracji w grupie RSL3, ponieważ niektóre pozostały nienaruszone.W porównaniu z grupą RSL3, grupa inhibitora miała w większości nienaruszone struktury grzebienia, z których tylko kilka nie było widocznych. Obrazy 3D grupy kontrolnej zapewniły dokładniejszy widok mitochondriów i ich struktur grzebienia. Obrazy 3D grupy RSL3 wykazały nieregularne i wakuolizowane mitochondria, podczas gdy grupa inhibitorowa wykazywała różne kształty grzebienia.Kwantyfikacja zmian mitochondrialnych wykazała, że grupa RSL3 miała znacznie zmniejszoną długość i objętość mitochondriów w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy grupa inhibitora wykazała wyniki pośrednie. RSL3 spowodował również dysfunkcję mitochondriów i zmienił metabolizm komórkowy poprzez zmianę morfologii mitochondriów i wywołanie ferroptozy.

a-three-dimensional-technique-for-visualization-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano nowatorskie metody wspomagane komputerowo w zakresie wielkoskalowego pozyskiwania i analizy preparatów trzustki barwionych immunohistochemicznie: (1) rejestracja wirtualnych przekrojów (Virtual Slice) całego preparatu; (2) masowa analiza danych w dużej skali; (3) rekonstrukcja 2D wirtualnych przekrojów; (4) mapowanie 3D wysepek trzustkowych oraz (5) analiza matematyczna.

Komputerowa wizualizacja i kwantyfikacja na dużą skalę masy wysepek trzustkowych, ich rozkładu wielkości oraz architektury

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Źródło: Hamid, H. S., et al. Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka. J. Vis. Exp. (2017) Ten film przedstawia metodę wizualizacji mitochondriów specyficznych dla nerwów za pomocą obrazowania trójwymiarowego. Przedstawiono w nim proces pozyskiwania sekwencyjnych skanów wstępnie znakowanych śródnaskórkowych włókien nerwowych i generowania obrazów powierzchni 3D w celu wyizolowania i wyświetlenia mitochondriów w odniesieniu do...

Wizualizacja mitochondriów w śródnaskórkowych włóknach nerwowych

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

W tym badaniu opisujemy krok po kroku protokół i kładziemy nacisk na kluczowe szczegóły dotyczące określania cech morfologicznych mitochondriów w żywych komórkach, w tym przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i analizę danych. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badania morfologii mitochondriów w celu badania różnych schorzeń.

Oznaczanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej

W tym miejscu opisujemy lokalizator zdarzeń mitochondrialnych (MEL), wtyczkę ImageJ przydatną w ilościowym określaniu trójwymiarowych zmian w rozszczepieniu mitochondriów i aktywności fuzyjnej w czasie. Opisujemy również potok przetwarzania obrazu przydatny do czyszczenia mikrofotografii przed analizą w ImageJ.

Zrozumienie zmian w morfologii mitochondriów za pomocą dynamicznych i trójwymiarowych mikrofotografii fluorescencyjnych

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Poznaj trójwymiarową technikę wizualizacji zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki. Ta metoda łączy mikroskopię elektronową z rekonstrukcją 3D, umożliwiając analizę jakościową i ilościową organelli bez drogiego sprzętu.

Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

Przeglądaj więcej filmów