Name: Optymalizacja testu zadrapań rany w celu wykrycia zmian w migracji mysich mezenchymalnych komórek zrębu po uszkodzeniu przez rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj zoptymalizowany test zadrapań do ilościowej oceny migracji mysich płucnych komórek mezenchymalnych po uszkodzeniu ekstraktem z dymu papierosowego. Ta ekonomiczna metoda wspiera badania biologii regeneracyjnej płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni pozostałym członkom laboratorium za ich pomoc techniczną w opracowaniu testu uszkodzeń CSE, a także za ich wsparcie i porady podczas opracowywania tego testu. Ponadto jesteśmy wdzięczni Komitetowi Naukowemu Holy Cross Fenwick za wsparcie dla Nicholasa Cormiera oraz programowi Holy Cross College Honors za wsparcie Alexandra Yeo.

Uwaga: W tym badaniu, mezenchymalne komórki zrębu płuc (LR-MSC) z dystalnej tkanki płucnej zostały wyizolowane albo na podstawie ich ekspresji markerów powierzchniowych komórek (CD45neg, CD31neg, Sca-1high, Epcamneg) 14,15, przy użyciu explant-out-growth 16, albo przy użyciu trawienia enzymatycznego 17. Przylegające LR-MSC hodowano w DMEM z wysoką glukozą i bez glutaminy, 15% FBS, 1x antybiotyku/antybiotyku i 2 mM glutaminy (odtąd kompletne pożywki) i inkubowano w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . LR-MSC pasażowano 3-4 razy, aby zapewnić populację komórek o stosunkowo jednorodnej charakterystyce wzrostu dla testu migracji.
1. Przygotowanie monowarstwy konfluentnej
<ol>
	<li>Aby odłączyć MSCs od standardowych naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm, umyj komórki 10 ml wstępnie ogrzanego PBS o temperaturze 37 °C, odessać PBS i dodać 4 ml trypsyny (0,25%). Inkubować przez 3-5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Odessać komórki do stożkowej probówki, dodać równą objętość kompletnej pożywki i odwirować przy 300 g przez 5 minut, aby rozpruć komórki. 
	Uwaga: Dłuższa inkubacja w trypsynie może zmienić receptory na powierzchni komórki i potencjalnie wpłynąć na migrację.</li>
	<li>Zasysanie pożywek i ponowne zawieszanie komórek w świeżych, kompletnych pożywkach. Policz komórki, z wyłączeniem martwych komórek, stosując wykluczenie błękitu trypanowego i umieść 500 000 mezenchymalnych komórek zrębu w 4 ml kompletnej pożywki na 60-milimetrowej naczyniu do hodowli komórek. 
	Uwaga: W zależności od źródła komórek mogą być konieczne testy w celu określenia optymalnej liczby potrzebnych komórek.</li>
	<li>Inkubuj komórki, aż płytki zlewają się w 90%, aby uzyskać optymalne przyłączanie i proliferację komórek, zwykle 48-72 godziny w przypadku MSCs. 
	Uwaga: 100% konfluencja nie jest zalecana, ponieważ wiele komórek zależnych od zakotwiczenia doświadcza zahamowania kontaktowego, co może zmienić ich zdolność migracyjną. Płyty z konfluencją mniejszą niż 80% spowodują, że zdjęcia staną się bezużyteczne, ponieważ oprogramowanie do analizy obrazu zinterpretuje przerwy między komórkami jako część obwodu rysy (patrz rysunek 1D).</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 90% zbieżności, uszkodzić komórki zgodnie z potrzebami aplikacji. Aby ocenić uszkodzenie komórek po ekspozycji na rozpuszczalny ekstrakt dymu papierosowego (CSE), wygeneruj 100% CSE, wciągając dym z 1 papierosa badawczego Uniwersytetu Kentucky (3R4F) przez 25 ml kompletnej pożywki w kolbie Büchnera przez 2 minuty 18.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 24 godziny w 4 ml 1-4% CSE rozcieńczonych w kompletnych pożywkach. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 4 ml ciepłego sterylnego PBS, a następnie zastąpić 4 ml świeżej, kompletnej pożywki. 
	Uwaga: Uszkodzenie komórek wysokim stężeniem ekstraktu z dymu papierosowego (>5%) może znacznie zmniejszyć konfluencję.</li>
</ol>
2. Tworzenie rysy
<ol>
	<li>W sterylnym środowisku zdejmij wieczko z 60-milimetrowej płytki uszkodzonych MSC i połóż prostą krawędź (na przykład wysterylizowaną plastikową linijkę) na górnej krawędzi płytki. Nie wyjmując podłoża, należy użyć sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl, prowadzonej przez sterylną krawędź prostą, aby wykonać od jednego do czterech równoległych rys na płytce w odległości około 5 mm od siebie i długości 50 mm. 
	Uwaga: Prosta krawędź minimalizuje ilość regulacji obrotu płytki, gdy znajduje się ona na stoliku mikroskopu. Konieczne jest, aby rysy były całkowicie pionowe (lub poziome) na ekranie. Generowanie wielu rys na płytce o średnicy 60 mm nie zmienia mikrośrodowiska w sposób, który wpływa na migrację komórek (dane nie są pokazane), ale może być brane pod uwagę w przypadku innych typów komórek. Nie zaleca się stosowania mniejszych studzienek, ponieważ zmienność komórek rosnących blisko krawędzi studzienki staje się bardziej wyraźna i może wpływać na równomierne generowanie rys.</li>
	<li>Zassać podłoże i delikatnie umyć płytki 2 ml wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża, aby zapobiec przywieraniu komórek do środka zadrapania i usunąć komórki, które zostały poluzowane przez drapanie. Zastąp 4 ml świeżej, kompletnej pożywki.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego markera permanentnego oznacz każde zadrapanie od 1 do 4 na spodniej stronie płytki w miejscu, które nie będzie przeszkadzać w obrazowaniu zadrapań. 
	Uwaga: Ważne jest, aby obrazy z tego samego szkicu były porównywane przed i po migracji, ponieważ mogą występować różnice w szerokości zadrapania.</li>
</ol>
3. Wykonywanie początkowych zdjęć rysy
Uwaga: Jeśli test zarysowania jest wykonywany na wielu płytach, zaleca się, aby początkowe obrazy wszystkich rys na jednej płycie zostały wykonane przed wykonaniem rys na następnej płycie.
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu z kontrastem odwróconej fazy z kamerą, aby wygenerować obrazy potrzebne do analizy.</li>
	<li>Umieść płytkę hodowlaną na mikroskopie i użyj obiektywu o małej mocy (10X), aby zlokalizować rysę #1. Jeżeli kondensacja pary wodnej na pokrywie płytki hodowlanej utrudnia uzyskanie wyraźnego obrazu komórek, należy użyć podgrzewanego stolika ustawionego na 37 °C.</li>
	<li>Utrzymując rysę całkowicie poziomo i w środku pola widzenia, uzyskaj tyle obrazów, ile potrzeba, aby objąć 90% długości rysy. Uzyskaj obrazy wyraźnych części rysy bez nakładania się obrazów. 
	Uwaga: Załamanie światła na krawędziach naczynia hodowlanego powoduje prześwietlenie obrazów, uniemożliwiając ich analizę. Dlatego nie rób zdjęć z pierwszych i ostatnich 5% długości rysy.</li>
	<li>Zapisz obrazy z każdej podstawki w osobnym folderze.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.4 dla zadrapań 2, 3 i 4.</li>
	<li>Płytki należy umieścić z powrotem w inkubatorze natychmiast po wstępnym obrazowaniu. Pozwól komórkom migrować przez 4-7 godzin. 
	Uwaga: 7 godzin jest optymalne przy ocenie MSC uszkodzonych za pomocą CSE. Nie zaleca się inkubacji komórek trwającej dłużej niż 7 godzin, ponieważ proliferacja komórek może działać jako zmienna zakłócająca migrację komórek (patrz uwaga opcjonalna 8.2 poniżej).</li>
</ol>
4. Analiza początkowych obrazów rys
<ol>
	<li>Pobierz ImageJ i zainstaluj wtyczkę Wound Healing Tool (patrz Tabela materiałów/sprzętu).</li>
	<li>Otwórz plik obrazu w ImageJ, a następnie kliknij "Proces" i "Znajdź krawędzie", aby podświetlić komórki otaczające rysę, aby narzędzie do gojenia ran obliczyło obszar zadrapania (Rysunek 2B). Następnie kliknij "Obraz", "Dostosuj", "Próg koloru" iw menu rozwijanym oznaczonym "Kolor progu" zmień wartość na "Czarno-biały".</li>
	<li>W menu "Próg koloru" dostosuj oba suwaki progu jasności, aż do uzyskania optymalnego kontrastu między rysą a frontem komórki. Aby zapewnić największy zakres podczas próby utworzenia kontrastu na obrazie, przesuń dolny suwak całkowicie w prawo (całkowicie obraz), a następnie dostosuj górny suwak, aby wygenerować maksymalny kontrast.</li>
	<li>Powoli przesuwaj górny suwak jasności od lewej do prawej, aż obraz będzie wyraźnie wyświetlał kontur rysy (Rysunek 2C). Po zidentyfikowaniu krawędzi rysy kliknij "Więcej narzędzi" na pasku narzędzi ImageJ, wybierz "MRI_Wound_Healing_Tool" z menu rozwijanego i naciśnij przycisk "m" (który pojawi się na pasku narzędzi ImageJ), aby podświetlić obszar rysowania i wyświetlić obliczony obszar w wyskakującym oknie wyników (Rysunek 2D).</li>
	<li>Skopiuj i wklej wszystkie liczby z okna wyników (Rysunek 2E) do arkusza kalkulacyjnego programu Excel. Upewnij się, że oddzieliłeś dane od poszczególnych zadrapań.</li>
</ol>
5. Wykonywanie końcowych zdjęć rysy
<ol>
	<li>Po migracji komórek (4-7 godzin) powtórz kroki 3.2-3.4. Wyobraź sobie płytki w tej samej kolejności, w jakiej zostały porysowane, tak aby komórki na każdej płytce miały równy czas na migrację. 
	Uwaga: Komórki mogą być obrazowane w wielu punktach czasowych, w zależności od ich wrażliwości zarówno na zmiany temperatury, jak i pH. Alternatywnie, obrazowanie żywych komórek może być wykorzystane do śledzenia komórek w czasie rzeczywistym podczas ich migracji.</li>
</ol>
6. Analiza obrazów Final Scratch
<ol>
	<li>Powtórz kroki 4.2-4.5, aby uzyskać ostateczne obrazy zadrapań.</li>
</ol>
7. Obliczanie obszaru szkicowania w celu ilościowego określenia migracji
<ol>
	<li>Oblicz średnią powierzchnię przed migracją, uśredniając początkowe wartości powierzchni odpowiednich rys.</li>
	<li>Oblicz łączną kwotę migracji, odejmując końcowy obszar migracji dla każdego obrazu, obliczony w kroku 6, od średniego obszaru przed migracją (krok 7.1). Wygeneruj listę wartości dla każdego elementu bazowego reprezentującego zmianę migracji.</li>
	<li>Połącz dane z wielu zadrapań w tej samej grupie testowej (tj. wszystkie płytki i wszystkie rysy na komórkach narażonych na 0% CSE). Użyj testu analizy wariancji, aby przeanalizować różnice między grupami eksperymentalnymi.</li>
	<li>Jeśli komórki migrują wolno i wymagają dłuższego czasu inkubacji po drapaniu (powyżej 10-12 godzin), należy przeprowadzić test inkorporacji BrDU lub EdU 19 w celu ustalenia, czy komórki ulegają proliferacji w okresie, w którym odbywa się test migracji. Wybierz czas testu migracji, aby uniknąć znacznej proliferacji komórek.</li>
</ol>
8. Opcjonalnie
<ol>
	<li>Aby ocenić, czy w wyniku procedury drapania następuje znaczące starzenie się komórek, należy wykonać test beta-galaktozydazy związany ze starzeniem się na płytce testowej w określonym czasie po zadrapaniu 19.</li>
</ol>

<ol><li>Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative%2C+facile%2C+and+high-throughput+image-based+cell+migration+method+is+a+robust+alternative+to+the+scratch+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).</li>
<li>Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+integrating+signals+from+front+to+back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).</li>
<li>Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+or+stromal+cells%3A+a+review+of+clinical+applications+and+manufacturing+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices.</a> Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).</li>
<li>Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+alters+nuclear+shape+and+reduces+cell+motility+in+three+dimensional+model+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).</li>
<li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li>
<li>Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha4beta1+Integrin+Regulates+Lamellipodia+Protrusion+Via+a+Focal+Complex%2Ffocal+Adhesion-Independent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).</li>
<li>Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+wound+healing+effect+of+Calendula+extracts+using+the+scratch+assay+with+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts.</a> J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li>
<li>Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing%3A+an+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li>
<li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).</li>
<li>Chung, C. A., Chen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cell+sedimentation+on+measuring+chondrocyte+population+migration+using+a+Boyden+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber.</a> J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).</li>
<li>Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lymphocyte+traffic+by+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules.</a> Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).</li>
<li>Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigidity-driven+growth+and+migration+of+epithelial+cells+on+microstructured+anisotropic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).</li>
<li>Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+Dependence+of+Lung+Mesenchymal+Stromal+Cell+Dynamics+Following+Pneumonectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy.</a> Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).</li>
<li>McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).</li>
<li>Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cell+Post-Transplantation+Survival%2C+Persistence%2C+Paracrine+Expression%2C+and+Repair+of+Elastase-Injured+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).</li>
<li>Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+aging+on+the+regenerative+properties+of+bone+marrow-%2C+muscle-%2C+and+adipose-derived+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells.</a> PLoS One. 9 (12), e115963(2014).</li>
<li>Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cigarette+smoke+extract+on+human+airway+smooth+muscle+cells+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD.</a> Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).</li>
<li>Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+biomarkers+of+cellular+senescence%3A+the+senescence-associated+beta-galactosidase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay.</a> Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany tutaj protokół zapewnia ilościowo solidną, ustandaryzowaną metodę wykonywania i analizowania testów zarysowań. Proste testy zarysowania są rutynowo stosowane w wielu różnych dziedzinach nauki w celu zbadania migracji komórek. Jednak tradycyjnie w teście zarysowania brakowało ustandaryzowanego protokołu konfiguracji i kwantyfikacji, co prowadziło do problemów z odtwarzalnością 7,10. Wiele modyfikacji i optymalizacji mających na celu ulepszenie testu zarysowania zmniejszyło te problemy, w tym obrazowanie...

Migracja komórek jest wysoce skoordynowana i niezbędna dla wielu procesów fizjologicznych, takich jak rozwój, naprawa i regeneracja tkanek, a także procesów patologicznych, takich jak przerzuty raka i miażdżyca 1. Zrozumienie migracji komórek jest szczególnie istotne dla pojawiających się terapii stosowanych do naprawy uszkodzonych tkanek i leczenia stanów patologicznych, w tym technologii przeszczepiania komórek i przeszczepiania sztucznych tkanek 2. Biorąc pod uwagę obecne zainteresowanie rolą mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) w pośredniczeniu w naprawie tkanek 3, interesujące jest ilościowe określenie zdolności migracyjnej tych komórek za pomocą testu, który jest rygorystycznie kwantyfikowalny, elastyczny i opłacalny. Co ważne, taki test musi być wystarczająco czuły, aby wykryć stosunkowo subtelne zmiany w zdolności migracji komórek po uszkodzeniu. Obecne metody ilościowego określania migracji komórek, w tym testy scratch, testy migracji trans-well (komory Boydena), macierze mikrofilarowe i testy stref wykluczenia komórek, mają szereg ograniczeń w odtwarzalności, możliwości dostosowywania, kwantyfikacji i opłacalności 1,4,5. Opisany tutaj zoptymalizowany test zarysowań wykazuje solidne wyniki, wymierne i oparte na obrazie możliwości analizy, opłacalność i możliwość dostosowania do innych zastosowań.
Testy scratch były używane w wielu możliwościach do oceny migracji i proliferacji komórek w różnych warunkach eksperymentalnych 5. Test polega na wysiewie wyznaczonych komórek, wyhodowaniu ich do całkowitego lub bliskiego zbiegania się i zadrapaniu powstałej monowarstwy sterylną igłą lub końcówką pipety 6. Analizę najczęściej przeprowadza się poprzez porównanie szerokości rysy w wielu punktach czasowych w losowo wybranych miejscach 7-9. Pomimo swojego znaczącego zastosowania, test zarysowania jest zagmatwany przez problemy z odtwarzalnością i kwantyfikacją. Zmienność w generowaniu rysy nie tylko zmienia mikrośrodowisko komórek, ale może również utrudniać migrację komórek poprzez uszkodzenie powierzchni płytki i leżącej pod nią macierzy zewnątrzkomórkowej 5. Testy są często przeprowadzane w ciągu 7 do 12 godzin, jednak w przypadku linii komórkowych wykazujących wolniejszą migrację i dłuższy czas testu, proliferacja staje się zmienną zakłócającą 7,10. Wreszcie, komórki starcze generowane w procesie drapania mogą uwalniać czynniki, które zakłócają sygnalizację zewnątrzkomórkową wymaganą do zamknięcia luki w monowarstwie 1. Optymalizacja testu zarysowania wymaga stworzenia spójnej szczeliny, która nie ingeruje we właściwości powierzchni, minimalizując czas trwania testu i zapobiegając niepożądanej śmierci komórki podczas manipulacji. Test oparty na zatyczce jest optymalizacją testu strefy wykluczenia komórek. Test ten wykorzystuje korek umieszczony w środku studzienki, który wyklucza wzrost komórek, ale umożliwia posiew komórek wokół centralnej strefy wykluczenia. Aby ocenić migrację, korek jest usuwany, a wynikowa strefa wykluczenia stanowi powierzchnię do przeprowadzenia migracji. Jednak test ten jest trudny do dostosowania lub dostosowania 10, a w przypadku niektórych zastosowań technika ta może być również zbyt kosztowna.
W przeciwieństwie do testów scratch i ich pochodnych, testy migracji trans-well (lub testy komory Boydena) oceniają migrację poprzez ilościowe określenie liczby komórek, które przemieszczają się z jednej komory, przez mikroporowatą membranę filtracyjną, do komory zawierającej czynniki chemotaktyczne 8,11,12. Technika ta ma ograniczoną użyteczność w przypadku komórek przylegających, takich jak MSC, ponieważ po migracji przez porowatą błonę komórki przylegają do strony błony wystawionej na działanie czynników chemotaktycznych i mogą być trudne do dokładnego określenia ilościowego. Chociaż test jest w stanie zbadać niektóre trójwymiarowe wzorce migracji, ograniczone typy komórek, dla których jest w stanie dokładnie określić ilościowo migrację komórek, ograniczają jego użyteczność 10. Inną alternatywą dla testów zarysowania jest matryca mikrofilarowa, która mierzy ruchliwość komórek w przestrzeni trójwymiarowej, wykorzystując zdolność komórek do deformacji i migracji do macierzy jako substytutu. Elastomery polidimetyliloksanu (PDMS) utwardzone na precyzyjnej formie i poddane działaniu ozonu i fibronektyny wytwarzają jednorodne i nieulegające degradacji mikrośrodowisko. Odstępy między mikrofilarami można również zmieniać w zależności od potrzeb, aby ocenić zdolność komórek do wejścia do tablicy 4. Forma jest tworzona przez głębokie reaktywne trawienie jonowe płytek krzemowych w celu stworzenia ujemnej wersji tablicy 13 o wysokim współczynniku proporcji. Chociaż test jest wzmocniony przez możliwość dostosowania, możliwość modelowania trójwymiarowej migracji i analizę poprzez bezpośrednią wizualizację migrujących komórek, trudności w tworzeniu macierzy mikrofilarów ekonomicznie utrudniają jego powszechne stosowanie.
Zoptymalizowany test zadrapań opisany w tym protokole zapewnia efektywną i opłacalną metodę tworzenia spójnych rys, które mogą być analizowane za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania. Zamiast prostych pomiarów szerokości wykonywanych w poprzek rysy przed i po migracji komórek, oprogramowanie umożliwia użytkownikowi określenie całkowitych obszarów zarysowania przed i po migracji. Ten postęp ogranicza kwestię prób określenia, gdzie należy wykonać pomiary szerokości zadrapania i czy szerokość zadrapania jest jednolita na całej jego długości. Ponadto omówiono staranną optymalizację liczby komórek, zbiegania się komórek oraz rodzaju i stopnia uszkodzeń zadanych komórkom w celu dalszej optymalizacji testu.

<table><tbody><tr><td>DMEM (wysoki poziom glukozy, bez dodatku glutaminy)</td><td>Life Technologies</td><td>31053-036</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091002</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/przeciwgrzybiczy, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV3007901</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina, 200 mM, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek TypeLE</td><td>Life Technologies</td><td>12563-01</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific SH3002802</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon standardowe 60 mm naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterylne 200 &mu; l końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-502</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop ze światłem odwróconym z przystawką do kamery</td><td>Oprogramowanie Variable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MRI_Wound_Healing plugin</td><td><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja testu zadrapań rany w celu wykrycia zmian w migracji mysich mezenchymalnych komórek zrębu po uszkodzeniu przez rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Migracja komórek jest niezbędna dla wielu procesów fizjologicznych i patologicznych, w tym rozwoju, naprawy i regeneracji tkanek, przerzutów nowotworowych i reakcji zapalnych. Biorąc pod uwagę obecne zainteresowanie rolą mezenchymalnych komórek zrębu w pośredniczeniu w naprawie tkanek, jesteśmy zainteresowani ilościowym określeniem zdolności migracyjnej tych komórek i zrozumieniem, w jaki sposób zdolność migracyjna może zostać zmieniona po uszkodzeniu. Optymalizacja rygorystycznie ilościowego testu migracji, który jest zarówno łatwy do dostosowania, jak i opłacalny w wykonaniu, jest kluczem do odpowiedzi na pytania dotyczące zmian w migracji komórek w odpowiedzi na różne bodźce. Obecne metody ilościowego określania migracji komórek, w tym testy scratch, testy migracji trans-well (komory Boydena), macierze mikrofilarowe i testy stref wykluczenia komórek, mają szereg ograniczeń w odtwarzalności, możliwości dostosowywania, kwantyfikacji i opłacalności. Pomimo swojego znaczącego zastosowania, test zarysowania jest zagmatwany przez problemy z odtwarzalnością związane z uszkodzeniem mikrośrodowiska komórki, przeszkodami w migracji komórek, wpływem sąsiednich komórek starczych i proliferacją komórek, a także brakiem rygorystycznej kwantyfikacji. Opisany tutaj zoptymalizowany test zarysowań wykazuje solidne wyniki, wymierne i oparte na obrazie możliwości analizy, opłacalność i możliwość dostosowania do innych zastosowań.

Przedstawione tutaj testy gojenia rany (scratch assays) przeprowadzono z wykorzystaniem mysich mezenchymalnych komórek macierzystych rezydujących w płucach (LR-MSCs), wyizolowanych zgodnie z opisem w uwagach do protokołu. Komórki LR-MSCs wysiano z gęstością 500 000 komórek w 60 mm szalce hodowlanej i hodowano do osiągnięcia 90% konfluencji w ciągu 48 hr. Aby wywołać uszkodzenia, 4% CSE (opisany powyżej) inkubowano z komórkami przez 24 hr po początkowym okresie wysiewu, ale przed wykonaniem testu gojenia rany. W każdym te...

Zdolność do migracji jest kluczową funkcją wielu różnych typów komórek, w tym mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC). Ilościowe określenie zmian w zdolności migracyjnej po wystąpieniu szkód jest jednak trudne. Protokół ten opisuje łatwy do adaptacji test migracji, który wykorzystuje rygorystyczne statystyki do ilościowego określenia zmian w zdolności migracyjnej MSC po uszkodzeniu.

Optymalizacja testu zadrapań rany w celu wykrycia zmian w migracji mysich mezenchymalnych komórek zrębu po uszkodzeniu przez rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Ogólnym celem niniejszego testu jest wykrycie zmian w zdolności migracyjnej mezenchymalnych komórek macierzystych płuc po uszkodzeniu rozpuszczalnym ekstraktem z dymu papierosowego. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii regeneracyjnej płuc, w tym do ustalenia, w jaki sposób można poprawić zdolność migracyjną komórek progenitorowych płuc, aby wspomóc naprawę tkanki płucnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że została ona zoptymalizowana w celu zapewnienia lepszych pomiarów ilościowych migracji komórek, przy jednoczesnym zachowaniu niskich kosztów wykonania i łatwości dostosowania do własnych potrzeb.W tej demonstracji testy zarysowania (scratch assay) zostaną wykorzystane do ilościowej oceny zdolności migracyjnej mysich mezenchymalnych komórek macierzystych płuc, czyli MSC. Po ekspozycji na rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego, MSC są hodowane w pożywce kompletnej na płytkach o średnicy 60 mm i uszkadzane zgodnie z opisem w tekście protokołu. Odpowiednia konfluencja jest istotna dla testu zarysowania, ponieważ zapewnia ona prawidłową identyfikację granic zarysowania przez oprogramowanie do obrazowania.Ten przykład przedstawia MSC przy 95% konfluencji, co jest odpowiednim stanem do wykonania zadrapań w środowisku sterylnym. Zdejmij pokrywkę z płytki z MSC przeznaczonej do zadrapania i przyłóż krawędź prowadzącą, taką jak wysterylizowana plastikowa linijka, w poprzek górnej krawędzi płytki. Krawędź prowadząca minimalizuje liczbę koniecznych korekt rotacyjnych płytki podczas jej późniejszego umieszczenia na stoliku mikroskopu w celu obrazowania.Bez usuwania pożywki, używając sterylnego końcówki do pipety 200 µL prowadzonej wzdłuż sterylnej krawędzi prowadnicy, wykonaj cztery równoległe zadrapania na płytce, w odstępach około 5 mm i o długości 50 mm. Wykonanie wielu zadrapań na płytce 60 mm nie zmienia mikrośrodowiska w sposób wpływający na migrację komórek MSC, jednak może to być istotne w przypadku innych typów komórek. Odessaj pożywkę i delikatnie przemyj płytkę 2 mL podgrzanej kompletnej pożywki.Zapobiega to przyleganiu komórek do środka zadrapania i usuwa komórki, które zostały poluzowane podczas procesu drapania. Należy zastąpić je czterema mililitrami świeżej pożywki kompletnej; używając sterylnego, trwałego markera, należy ponumerować każde zadrapanie od jeden do cztery na spodniej stronie płytki, w miejscach, które nie będą utrudniać obrazowania. Konieczne jest wykonanie obrazów początkowych każdego zadrapania, ponieważ ważne jest porównanie obrazów z tego samego zadrapania przed i po migracji, gdyż szerokość zadrapań może być zróżnicowana.Jeśli test zadrapania (scratch assay) jest przeprowadzany na wielu płytkach, zaleca się, aby obrazowanie początkowe wszystkich zadrapań na jednej płytce wykonano przed wykonaniem zadrapań na kolejnej płytce. Do uzyskania obrazów niezbędnych do analizy należy użyć odwróconego mikroskopu fazokontrastowego z kamerą. Umieść płytkę hodowlaną na mikroskopie i użyj obiektywu o niskim powiększeniu, aby zlokalizować zadrapanie.Numer jeden. Niezbędne jest, aby rysa była całkowicie pozioma na ekranie; utrzymując rysę w pełni poziomo i w centrum pola widzenia, należy wykonać tyle obrazów, ile jest konieczne, aby objąć 90% długości rysy. Obrazy należy pobierać z oddzielnych fragmentów rysy, tak aby nie nakładały się one na siebie.Nie należy wykonywać zdjęć z pierwszych i ostatnich 5% długości rysy, ponieważ refrakcja światła na krawędziach szalki hodowlanej powoduje prześwietlenie obrazów, co uniemożliwia ich analizę. Obrazy z rysy numer jeden należy zapisać w oddzielnym folderze. W ten sam sposób należy uzyskać obrazy dla rys numer dwa, trzy i cztery, zapisując zdjęcia z każdej rysy w osobnym folderze.Niezwłocznie po tym wstępnym obrazowaniu przenieś płytki z powrotem do inkubatora. Przed rozpoczęciem tego testu pozwól komórkom migrować przez od czterech do siedmiu godzin. Pobierz oprogramowanie Image J i zainstaluj wtyczkę wound healing tool.Otwórz plik obrazu w programie ImageJ, następnie kliknij Process i wybierz Find Edges, aby zaznaczyć komórki otaczające zadrapanie na potrzeby narzędzia do analizy gojenia ran (wound healing tool). Aby obliczyć powierzchnię zadrapania, kliknij Image, wybierz Adjust, a następnie Color Threshold; w menu rozwijanym opisanym jako Threshold Color zmień wartość na BNW w menu progowania kolorów. Przesuń dolny suwak całkowicie w prawo, aby obraz stał się całkowicie czarny, a następnie dostosuj górny suwak, aby uzyskać maksymalny kontrast między zadrapaniem a frontem komórek.Powoli przesuwaj górny suwak jasności od lewej do prawej, aż obraz wyraźnie wyświetli kontur zadrapania. Po zidentyfikowaniu krawędzi zadrapania kliknij więcej narzędzi. Na pasku narzędzi Image J wybierz z menu rozwijanego narzędzie MRI wound healing i naciśnij przycisk M, aby zaznaczyć obszar zadrapania i wyświetlić obliczoną powierzchnię.W wyskakującym oknie wyników skopiuj i wklej wszystkie liczby z okna wyników do arkusza kalkulacyjnego Excel. Upewnij się, że dane z poszczególnych zarysowań są od siebie oddzielone. Po tym, jak komórki migrowały przez cztery do siedmiu godzin, powtórz procedurę akwizycji obrazów dla zarysowań; obrazuj płytki w tej samej kolejności, w jakiej zostały zarysowane, aby komórki na każdej płytce miały taki sam czas na migrację.Komórki można obrazować w wielu punktach czasowych, w zależności od ich wrażliwości na zmiany temperatury oraz pH. Końcowe obrazy zadrapań są następnie analizowane za pomocą programu Image J w taki sam sposób, jak pokazano w przypadku początkowych obrazów zadrapań. W celu ilościowego określenia migracji można również obliczyć powierzchnię zadrapań.Konfluencja jest kluczowa dla powodzenia testu gojenia rany (scratch assay). Poniżej przedstawiono prawidłowe wykonanie zarysowania warstwy MSC płuc myszy przy 95% konfluencji. W przeciwieństwie do tego, konfluencja na poziomie 70% jest zbyt niska, aby poprawnie wykonać zarysowanie, co może prowadzić do powstania fałszywych granic.Są to reprezentatywne oryginalne obrazy przed migracją i po migracji z odpowiadającymi im granicami obszaru zadrapania określonymi przez oprogramowanie obrazujące. Wykresy te przedstawiają średnio obliczony obszar zadrapania w pikselach dla każdego z czterech zadrapań wykonanych na płytce z mysimi MSC płuc przy 95% konfluencji, zarówno przed, jak i po migracji po ekspozycji na 0% lub 4% ekstraktu z dymu papierosowego. Porównanie obliczonej średniej zmiany obszaru zadrapania wykazało mniejszą migrację mysich MSC płuc po ekspozycji na 4% ekstraktu z dymu papierosowego.Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zoptymalizować i uważnie monitorować konfluencję komórek dla konkretnego typu komórek, z którymi pracujemy, oraz ćwiczyć wykonywanie zarysowań, aby zapewnić ich maksymalną jednorodność. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne techniki, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian i ekspresji białek, które mogą wpływać na migrację komórek.

optimization-wound-scratch-assay-to-detect-changes-murine-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii niektórych chorób i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej. Poniższy protokół opisuje techniki oceny migracji komórek, które zostały dostosowane do badania EWG.

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.

Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do oceny wpływu peptydów na migrację komórek nabłonka oskrzeli. Metoda ta pozwala na szybkie i wysoce powtarzalne uzyskanie danych ilościowych na temat szybkości migracji komórek i zamykania ran.

Nowatorski test gojenia ran in vitro do oceny migracji komórek

Tutaj opisujemy procedurę testowania migracji komórek in vitro za pomocą automatycznego mikroskopu optycznego. Test zarysowania jest szeroko stosowany, w którym zamknięcie rysy następuje przez określony czas. Mikroskop optyczny umożliwia niezawodne i tanie wykrywanie migracji komórek.

Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej

To badanie skupia się na modelu gojenia ran in vitro (test zadrapań) jako mechanizmie określającym, jak zanieczyszczenia środowiskowe, takie jak arsen, wpływają na migrację komórek. Wyniki pokazują, że ten test in vitro dostarcza szybkich i wczesnych wskazówek dotyczących zmian w migracji komórkowej przed eksperymentami in vivo.

In vitro Test zarysowania w celu wykazania wpływu arsenu na migrację komórek skóry

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Przedstawiamy opłacalną metodę do testu migracji od razu, która zapewnia nowe podejście do określania migracji komórek bez użycia metod intensywnie wykorzystujących sprzęt. Chociaż w tym protokole wykorzystano fibroblasty, można go dostosować i wykorzystać do badania dodatkowych typów komórek i wpływu na migrację komórek.

Ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania

Poprzez włączenie projektowania doświadczeń interakcji i analizy wymagań użytkownika, wprowadzamy innowacyjny skrobak do komórek, który poprawia testy gojenia się ran komórkowych pod względem odtwarzalności, niezawodności, praktyczności, integralności komórkowej i doświadczenia użytkownika.

Narzędzie do automatycznego tworzenia stabilnych i powtarzalnych przerw bezkomórkowych w celu poprawy wiarygodności testu gojenia się ran komórkowych

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Tutaj opisujemy model in vitro do izolowania i różnicowania mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, skupiając się na ich aklimatyzacji do przewlekłego ekstraktu z dymu papierosowego (CSE). Model może zostać wykorzystany do kompleksowego scharakteryzowania multiomicznego wpływu CSE, co może dostarczyć informacji na temat reakcji komórkowych na przewlekłe narażenie na dym tytoniowy.

Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

Poznaj zoptymalizowany test zadrapań do ilościowej oceny migracji mysich płucnych komórek mezenchymalnych po uszkodzeniu ekstraktem z dymu papierosowego. Ta ekonomiczna metoda wspiera badania biologii regeneracyjnej płuc.

Optymalizacja testu zadrapań rany w celu wykrycia zmian w migracji mysich mezenchymalnych komórek zrębu po uszkodzeniu przez rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego (Wideo) | JoVE Journal

Optymalizacja testu zadrapań rany w celu wykrycia zmian w migracji mysich mezenchymalnych komórek zrębu po uszkodzeniu przez rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego

Przeglądaj więcej filmów