Optymalizacja testu zadrapań rany w celu wykrycia zmian w migracji mysich mezenchymalnych komórek zrębu po uszkodzeniu przez rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego

Ogólnym celem tego testu jest wykrycie zmian w zdolności migracyjnej mezenchymalnych komórek zrębu płuc po uszkodzeniu rozpuszczalnym ekstraktem dymu papierosowego. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii regeneracyjnej płuc, w tym w jaki sposób można poprawić zdolność migracyjną komórek progenitorowych płuc, aby pomóc w naprawie płuc. Główną zaletą tej techniki jest to, że została zoptymalizowana, aby zapewnić lepsze pomiary ilościowe migracji komórek, a jednocześnie pozostać ekonomiczną w wykonaniu i łatwą do dostosowania.

W tej demonstracji test zadrapań zostanie wykorzystany do ilościowego określenia zdolności migracyjnej mysich mezenchymalnych komórek zrębu płuc (MSC). Po wystawieniu na działanie rozpuszczalnego ekstraktu dymu papierosowego, MSCs są hodowane w kompletnych pożywkach na 60-milimetrowych płytkach i uszkadzane zgodnie z opisem w tekście protokołu. Odpowiednia zbieżność jest ważna dla testu zadrapania, ponieważ zapewnia, że oprogramowanie do obrazowania może prawidłowo zidentyfikować granice rysy.

Ten przykład pokazuje MSC przy 95% zbieżności odpowiednie do drapania w sterylnym środowisku. Zdejmij pokrywkę z płytki z uszkodzonymi MSC i połóż prostą krawędź, taką jak wysterylizowana plastikowa linijka na górnej krawędzi płytki. Prosta krawędź minimalizuje ilość regulacji obrotu potrzebnych dla płytki, gdy jest ona później umieszczana na stoliku mikroskopu w celu obrazowania.

Nie wyjmując podłoża, użyj sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, prowadzonej przez sterylną prostą krawędź, aby wykonać cztery równoległe rysy w poprzek płytki, oddalone od siebie o około pięć milimetrów i długie na 50 milimetrów. Generowanie wielu rys na 60-milimetrowej płytce nie zmienia mikrośrodowiska w sposób, który wpływa na migrację komórek dla MSC, ale może być brane pod uwagę w przypadku innych typów komórek. Zassać podłoże i delikatnie umyć płytkę dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża.

Zapobiega to przyleganiu komórek do środka zadrapania i usuwa komórki, które zostały poluzowane przez drapanie. Zastąp czterema mililitrami świeżego, kompletnego podłoża za pomocą sterylnego, trwałego markera, oznacz każde zadrapanie od jednego do czterech na spodniej stronie płytki w miejscach, które nie będą zakłócać obrazowania. Początkowe obrazy zadrapań każdego zadrapania muszą zostać wykonane, ponieważ ważne jest, aby obrazy z tego samego zadrapania były porównywane przed i po migracji, ponieważ mogą występować różnice w szerokości zadrapania.

Jeśli test zarysowania jest wykonywany na wielu płytkach, zaleca się, aby przed wykonaniem rys na następnej płytce wykonano wstępne obrazy wszystkich rys na jednej płycie. Użyj mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym z kamerą, aby uzyskać obrazy potrzebne do analizy. Umieść płytkę hodowlaną na mikroskopie i użyj obiektywu o małej mocy, aby zlokalizować rysę.

Numer jeden. Konieczne jest, aby rysa była całkowicie pozioma na ekranie, jednocześnie utrzymując rysę całkowicie poziomo i w środku pola widzenia, uzyskaj tyle obrazów, ile potrzeba, aby objąć 90% długości rysy. Uzyskuj obrazy z odrębnych części rysy bez nakładania się obrazów.

Nie rób zdjęć od pierwszych i ostatnich 5% długości rysy, ponieważ załamanie światła na krawędziach naczynia hodowlanego nadmiernie naświetla obrazy, uniemożliwiając ich analizę. Zapisuj obrazy od zera, numer jeden w folderze. Uzyskaj obrazy dla rys dwóch, trzech i czterech w ten sam sposób i zapisz obrazy z każdej rysy w osobnym folderze.

Płytki należy umieścić z powrotem w inkubatorze natychmiast po wykonaniu wstępnego obrazowania. Pozwól komórkom migrować przez cztery do siedmiu godzin przed rozpoczęciem tego testu. Pobierz oprogramowanie Image J i zainstaluj wtyczkę narzędzia do gojenia ran.

Otwórz plik obrazu na obrazie J, a następnie kliknij proces i znajdź krawędzie, aby podświetlić komórki otaczające rysę dla narzędzia do gojenia ran. Aby obliczyć obszar zarysowania, kliknij opcję Dostosuj obraz i próg koloru, a następnie w menu rozwijanym oznaczonym kolorem progu zmień wartość na BNW w menu progu koloru. Przesuń dolny suwak całkowicie w prawo, aby obraz był całkowicie, a następnie dostosuj górny suwak, aby wygenerować maksymalny kontrast między rysą a frontem komórki.

Powoli przesuwaj górny suwak jasności od lewej do prawej, aż obraz będzie wyraźnie wyświetlał kontur rysy. Po zidentyfikowaniu krawędzi rysy kliknij więcej narzędzi. Na pasku narzędzi obrazu J wybierz narzędzie do gojenia ran MRI z menu rozwijanego i naciśnij przycisk M, aby podświetlić obszar zarysowania i wyświetlić obliczony obszar.

W wyskakującym oknie wyników skopiuj i wklej wszystkie liczby z okna wyników do arkusza kalkulacyjnego programu Excel. Upewnij się, że oddzieliłeś dane od poszczególnych zadrapań. Po migracji komórek przez cztery do siedmiu godzin powtórz procedurę akwizycji obrazu dla zadrapań, obrazuj płytki w tej samej kolejności, w jakiej zostały porysowane, tak aby komórki na każdej płytce miały równy czas na migrację.

Komórki mogą być obrazowane w wielu punktach czasowych, w zależności od ich wrażliwości zarówno na zmiany temperatury, jak i pH. Końcowe obrazy zadrapań są następnie analizowane przy użyciu obrazu J w taki sam sposób, jak pokazano w przypadku początkowych obrazów zadrapań. Obszary zarysowania można również obliczyć w celu ilościowego określenia migracji, poprawnie.

Konfluencja ma kluczowe znaczenie dla powodzenia testu zarysowania. Udane zadrapanie mysich płuc MSC przy 95% zbiegu jest pokazane tutaj. W przeciwieństwie do tego, zbieg 70% jest zbyt niski, aby uzyskać udane zadrapanie i może powodować fałszywe granice.

Są to reprezentatywne oryginalne obrazy sprzed i po migracji z odpowiadającymi im granicami obszaru zarysowania zdefiniowanymi przez oprogramowanie do obrazowania. Wykresy te pokazują średni obliczony obszar rysy w pikselach dla każdego z czterech zadrapań wykonanych na płytce mysich komórek MSC płuc przy 95% zbiegu, przed lub po migracji, z ekspozycją na 0% lub 4% ekstrakt dymu papierosowego. Porównanie obliczonej średniej zmiany powierzchni zadrapania wykazało mniejszą migrację mysiego płuca MSC po ekspozycji na 4% ekstrakt z dymu papierosowego.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o optymalizacji i uważnym monitorowaniu zbiegania się komórek dla konkretnego typu komórek, z którymi pracowaliśmy, oraz ćwiczeniu generowania zadrapań, aby upewnić się, że są one jak najbardziej jednolite. Po tej procedurze można wykonać inne techniki, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian i ekspresji białek, które mogą wpływać na migrację komórek.