Optymalizacja testu zadrapań rany w celu wykrycia zmian w migracji mysich mezenchymalnych komórek zrębu po uszkodzeniu przez rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego

Ogólnym celem niniejszego testu jest wykrycie zmian w zdolności migracyjnej mezenchymalnych komórek macierzystych płuc po uszkodzeniu rozpuszczalnym ekstraktem z dymu papierosowego. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii regeneracyjnej płuc, w tym do ustalenia, w jaki sposób można poprawić zdolność migracyjną komórek progenitorowych płuc, aby wspomóc naprawę tkanki płucnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że została ona zoptymalizowana w celu zapewnienia lepszych pomiarów ilościowych migracji komórek, przy jednoczesnym zachowaniu niskich kosztów wykonania i łatwości dostosowania do własnych potrzeb.

W tej demonstracji testy zarysowania (scratch assay) zostaną wykorzystane do ilościowej oceny zdolności migracyjnej mysich mezenchymalnych komórek macierzystych płuc, czyli MSC. Po ekspozycji na rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego, MSC są hodowane w pożywce kompletnej na płytkach o średnicy 60 mm i uszkadzane zgodnie z opisem w tekście protokołu. Odpowiednia konfluencja jest istotna dla testu zarysowania, ponieważ zapewnia ona prawidłową identyfikację granic zarysowania przez oprogramowanie do obrazowania.

Ten przykład przedstawia MSC przy 95% konfluencji, co jest odpowiednim stanem do wykonania zadrapań w środowisku sterylnym. Zdejmij pokrywkę z płytki z MSC przeznaczonej do zadrapania i przyłóż krawędź prowadzącą, taką jak wysterylizowana plastikowa linijka, w poprzek górnej krawędzi płytki. Krawędź prowadząca minimalizuje liczbę koniecznych korekt rotacyjnych płytki podczas jej późniejszego umieszczenia na stoliku mikroskopu w celu obrazowania.

Bez usuwania pożywki, używając sterylnego końcówki do pipety 200 µL prowadzonej wzdłuż sterylnej krawędzi prowadnicy, wykonaj cztery równoległe zadrapania na płytce, w odstępach około 5 mm i o długości 50 mm. Wykonanie wielu zadrapań na płytce 60 mm nie zmienia mikrośrodowiska w sposób wpływający na migrację komórek MSC, jednak może to być istotne w przypadku innych typów komórek. Odessaj pożywkę i delikatnie przemyj płytkę 2 mL podgrzanej kompletnej pożywki.

Zapobiega to przyleganiu komórek do środka zadrapania i usuwa komórki, które zostały poluzowane podczas procesu drapania. Należy zastąpić je czterema mililitrami świeżej pożywki kompletnej; używając sterylnego, trwałego markera, należy ponumerować każde zadrapanie od jeden do cztery na spodniej stronie płytki, w miejscach, które nie będą utrudniać obrazowania. Konieczne jest wykonanie obrazów początkowych każdego zadrapania, ponieważ ważne jest porównanie obrazów z tego samego zadrapania przed i po migracji, gdyż szerokość zadrapań może być zróżnicowana.

Jeśli test zadrapania (scratch assay) jest przeprowadzany na wielu płytkach, zaleca się, aby obrazowanie początkowe wszystkich zadrapań na jednej płytce wykonano przed wykonaniem zadrapań na kolejnej płytce. Do uzyskania obrazów niezbędnych do analizy należy użyć odwróconego mikroskopu fazokontrastowego z kamerą. Umieść płytkę hodowlaną na mikroskopie i użyj obiektywu o niskim powiększeniu, aby zlokalizować zadrapanie.

Numer jeden. Niezbędne jest, aby rysa była całkowicie pozioma na ekranie; utrzymując rysę w pełni poziomo i w centrum pola widzenia, należy wykonać tyle obrazów, ile jest konieczne, aby objąć 90% długości rysy. Obrazy należy pobierać z oddzielnych fragmentów rysy, tak aby nie nakładały się one na siebie.

Nie należy wykonywać zdjęć z pierwszych i ostatnich 5% długości rysy, ponieważ refrakcja światła na krawędziach szalki hodowlanej powoduje prześwietlenie obrazów, co uniemożliwia ich analizę. Obrazy z rysy numer jeden należy zapisać w oddzielnym folderze. W ten sam sposób należy uzyskać obrazy dla rys numer dwa, trzy i cztery, zapisując zdjęcia z każdej rysy w osobnym folderze.

Niezwłocznie po tym wstępnym obrazowaniu przenieś płytki z powrotem do inkubatora. Przed rozpoczęciem tego testu pozwól komórkom migrować przez od czterech do siedmiu godzin. Pobierz oprogramowanie Image J i zainstaluj wtyczkę wound healing tool.

Otwórz plik obrazu w programie ImageJ, następnie kliknij Process i wybierz Find Edges, aby zaznaczyć komórki otaczające zadrapanie na potrzeby narzędzia do analizy gojenia ran (wound healing tool). Aby obliczyć powierzchnię zadrapania, kliknij Image, wybierz Adjust, a następnie Color Threshold; w menu rozwijanym opisanym jako Threshold Color zmień wartość na BNW w menu progowania kolorów. Przesuń dolny suwak całkowicie w prawo, aby obraz stał się całkowicie czarny, a następnie dostosuj górny suwak, aby uzyskać maksymalny kontrast między zadrapaniem a frontem komórek.

Powoli przesuwaj górny suwak jasności od lewej do prawej, aż obraz wyraźnie wyświetli kontur zadrapania. Po zidentyfikowaniu krawędzi zadrapania kliknij więcej narzędzi. Na pasku narzędzi Image J wybierz z menu rozwijanego narzędzie MRI wound healing i naciśnij przycisk M, aby zaznaczyć obszar zadrapania i wyświetlić obliczoną powierzchnię.

W wyskakującym oknie wyników skopiuj i wklej wszystkie liczby z okna wyników do arkusza kalkulacyjnego Excel. Upewnij się, że dane z poszczególnych zarysowań są od siebie oddzielone. Po tym, jak komórki migrowały przez cztery do siedmiu godzin, powtórz procedurę akwizycji obrazów dla zarysowań; obrazuj płytki w tej samej kolejności, w jakiej zostały zarysowane, aby komórki na każdej płytce miały taki sam czas na migrację.

Komórki można obrazować w wielu punktach czasowych, w zależności od ich wrażliwości na zmiany temperatury oraz pH. Końcowe obrazy zadrapań są następnie analizowane za pomocą programu Image J w taki sam sposób, jak pokazano w przypadku początkowych obrazów zadrapań. W celu ilościowego określenia migracji można również obliczyć powierzchnię zadrapań.

Konfluencja jest kluczowa dla powodzenia testu gojenia rany (scratch assay). Poniżej przedstawiono prawidłowe wykonanie zarysowania warstwy MSC płuc myszy przy 95% konfluencji. W przeciwieństwie do tego, konfluencja na poziomie 70% jest zbyt niska, aby poprawnie wykonać zarysowanie, co może prowadzić do powstania fałszywych granic.

Są to reprezentatywne oryginalne obrazy przed migracją i po migracji z odpowiadającymi im granicami obszaru zadrapania określonymi przez oprogramowanie obrazujące. Wykresy te przedstawiają średnio obliczony obszar zadrapania w pikselach dla każdego z czterech zadrapań wykonanych na płytce z mysimi MSC płuc przy 95% konfluencji, zarówno przed, jak i po migracji po ekspozycji na 0% lub 4% ekstraktu z dymu papierosowego. Porównanie obliczonej średniej zmiany obszaru zadrapania wykazało mniejszą migrację mysich MSC płuc po ekspozycji na 4% ekstraktu z dymu papierosowego.

Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zoptymalizować i uważnie monitorować konfluencję komórek dla konkretnego typu komórek, z którymi pracujemy, oraz ćwiczyć wykonywanie zarysowań, aby zapewnić ich maksymalną jednorodność. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne techniki, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian i ekspresji białek, które mogą wpływać na migrację komórek.