Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro
January 2nd, 2018
Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.
Ogólnym celem tych procedur sztucznego ranienia za pomocą hodowli komórek nabłonkowych jest zbadanie migracji komórek zarówno z perspektywy ilościowej, jak i jakościowej, co pozwoli na ocenę wpływu określonych metod leczenia na gojenie się ran. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia się ran, ponieważ pozwala na precyzyjne scharakteryzowanie ról określonych procesów migracyjnych podczas rozerwania nabłonka. Główną zaletą tego podejścia jest to, że pozwala ono na korelację pomiarów migracji komórek ze zmianami w zachowaniu odpowiednich markerów molekularnych.
Implikacje tych technik rozciągają się w kierunku terapii ran klinicznych, ponieważ oferują one dogodną konfigurację do wczesnego testowania leków i zamykania ran. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda zaczyna się z powodu trudności w uzyskaniu spójnej zdolności do rozmnażania się w ranach z pokoleniem. W przypadku testu sztucznego zadrapania rany zacznij od zasiania każdej studzienki płytki hodowlanej dwoma mililitrami interesujących komórek nabłonka w kompletnym podłożu.
Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procent dwutlenku węgla przez dwa do trzech dni, aż do 100% konfluencji. Gdy komórki są gotowe, przemyj je dwa razy świeżą pożywką bez surowicy, a następnie 24 godziny hodowli w świeżej pożywce bez surowicy. Następnego dnia umieść płytkę w sterylnym miejscu pracy i przeciągnij wąską końcówkę sterylnej końcówki mikropipety po dnie każdej studzienki dwa razy, aby wytworzyć ranę w kształcie krzyża.
Spójną szczelinę rany uzyskuje się poprzez stosowanie stałego, mocnego nacisku przy jednoczesnym płynnym przesuwaniu końcówki po powierzchni nabłonka. Nadmierny nacisk zdeformuje końcówkę, powodując nieregularny promień rany. Delikatnie usunąć supernatant, aby odłączyć odłączone komórki i ostrożnie dodać do studzienek świeżą pożywkę bez surowicy.
Używając mikroskopu z odwróconą fazą kontrastową połączonego z kamerą urządzenia sprzężonego z ładunkiem, wyrównaj krawędź pola mikroskopu z sąsiednim przecięciem rys, aby uzyskać do czterech obrazów referencyjnych przed obróbką szczeliny rysy w każdym dołku. Po uzyskaniu wszystkich obrazów należy zastąpić pożywkę w wyznaczonych studzienkach zabiegowych świeżą pożywką, uzupełnioną wybranymi zabiegami będącymi przedmiotem zainteresowania i zwrócić płytki do inkubatora do hodowli komórkowych. Gdy co najmniej jeden warunek osiągnie około 90% zamknięcia szczeliny na zadrapania, delikatnie zastąp supernatant jednym mililitrem czteroprocentowej formaliny w PBS na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Następnie delikatnie umyj komórki PBS co najmniej trzy razy, aby usunąć nadmiar formaliny i zobrazuj studzienki, jak właśnie pokazano, używając tych samych parametrów obrazowania w oryginalnych obszarach referencyjnych uchwyconych po zadrapaniu. Aby przeanalizować obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu, otwórz zarejestrowany, wstępnie przetworzony obraz, który Cię interesuje, i w menu Obraz ustaw typ obrazu na 8-bitowy. W menu Proces wybierz podmenu Filtry i zastosuj filtrowanie wariancji.
W menu Obraz otwórz podmenu Dostosuj i ustaw Próg na czarno-biały. W menu Proces wybierz podmenu Binarne i zastosuj opcję Wypełnij otwory. W menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary i aktywuj opcję Obszar.
Następnie narysuj mierzalny obszar, podążając za konturem krawędzi migrującej, aby wyznaczyć odstęp. W menu Analizuj wybierz opcję Analizuj cząstki i zapisz łączne wartości powierzchni obszaru. Aby określić ilościowo migrację bezwzględną dla każdego zestawu pojedynczych próbek jako różnicę między pomiarami powierzchni szczeliny, należy wyeksportować wartości całkowitej powierzchni szczeliny przed i po obróbce do arkusza kalkulacyjnego i wykreślić wyniki kwantyfikacji.
W przypadku testu na sztucznym froncie migracji, w sterylnych warunkach, dodaj jedną warstwę do 33 wysterylizowanych okrągłych szkiełek nakrywkowych do pustych 10-centymetrowych płytek hodowlanych. Gdy powierzchnia płytki zostanie całkowicie pokryta, delikatnie wysiew interesujące komórki nabłonkowe w stężeniu, które pozwala na 100% zbieżność po dwóch lub trzech dniach hodowli. W razie potrzeby delikatnie wciśnij pokrywki sterylną końcówką mikropipety, aby zapobiec unoszeniu się na wodzie.
Gdy komórki osiągną zlewność, zastąp supernatant pożywką bez surowicy na kolejne 24 godziny hodowli. Następnie za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie przenieś jedno szkiełko nakrywkowe na nową 10-centymetrową płytkę zawierającą świeże podłoże bez surowicy, uważając, aby utrzymać szkiełko nakrywkowe wzdłuż jego obrzeża. Aby utworzyć sztuczne rany, przeciągnij wysterylizowaną żyletkę tam iz powrotem po każdym szkiełku nakrywkowym, aby utworzyć trzy- do czterech milimetrowych linii poprzecznych nad środkiem każdej kultury komórkowej, aby całkowicie usunąć środkowy pasek monowarstwowy.
Należy zwrócić uwagę, aby podczas wykonywania rany mocno przesunąć krawędź żyletki w poprzek powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby zabezpieczyć się przed nieregularnym kształtem krawędzi i powstawaniem opadających części nabłonka. Przenieść do czterech zwijanych szkiełek nakrywkowych, komórką do góry, do indywidualnych dołków sześciodołkowej płytki, zawierającej co najmniej dwa mililitry pożywki niezawierającej surowicy i delikatnie przemyć każdą studzienkę dwa razy świeżą pożywką bez surowicy, aby usunąć wszelkie oderwane komórki. Po wyrzuceniu wszystkich oderwanych komórek należy delikatnie zastąpić pożywkę płuczącą świeżą pożywką uzupełnioną odpowiednimi zabiegami i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Pod koniec odpowiedniego okresu doświadczalnego utrwalić komórki czteroprocentową formaliną w PBS, jak właśnie pokazano, i wybarwić komórki odpowiednimi fluorescencyjnymi sprzężonymi przeciwciałami, które są przedmiotem zainteresowania. Następnie zobrazuj zmiany strukturalne zachodzące na migrującej przedniej krawędzi za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zgodnie z interesującymi parametrami eksperymentalnymi. W tym eksperymencie szczeliny w ranach mierzono przed i po leczeniu naskórkowym czynnikiem wzrostu, dobrze znanym induktorem proliferacji i migracji komórek nabłonka.
Migrację bezwzględną obliczono następnie jako różnicę między powierzchniami szczeliny przed i po obróbce. Leczenie naskórkowym czynnikiem wzrostu nasila dynamikę cytoszkieletu komórek, co zaobserwowano w tych obrazach z laserowej mikroskopii skaningowej barwienia F-aktyną komórek kontrolnych i stymulowanych czynnikiem wzrostu. Ponadto obserwuje się nadekspresję c-Jun ze zwiększoną ekspresją białka widoczną w komórkach sąsiadujących z frontem migracyjnym.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sprawdzeniu integralności brzegów rany pod kątem obecności płatów komórek nabłonkowych, które mogą zakłócić kwantyfikację migracji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zarówno ilościowo, jak i jakościowo ocenić zachowania migracyjne
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten manuskrypt opisuje metodę modelowania gojenia ran in vitro za pomocą odcięć przypominających rany na hodowanych monowarstwach komórek nabłonkowych. To podejście umożliwia obrazowanie i zapewnia wysokiej jakości dane do badania zachowania komórek i mechanizmów migracji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Gojenie ran
- Migracja komórek
Tło
- Gojenie ran jest krytycznym procesem biologicznym.
- Rozumienie migracji komórek jest niezbędne do opracowywania terapii.
- Sztuczna technika ranienia może dostarczyć wglądu w mechanizmy gojenia.
- Konsekwentna reprodykowalność w modelach ran często jest wyzwaniem.
Cel badania
- Aby badać migrację komórek ilościowo i jakościowo.
- Aby ocenić wpływ określonych terapii na gojenie ran.
- Aby scharakteryzować role procesów migracyjnych podczas uszkodzenia nabłonka.
Zastosowane metody
- Odcięcia przypominające rany stworzone na monowarstwach komórek nabłonkowych.
- Obrazowanie wykonywane za pomocą konfokalnej lub skaningowej mikroskopii laserowej.
- Korelację pomiarów migracji komórek z zachowaniem molekularnych markerów.
- Konfiguracja umożliwia wczesne testowanie leków i ocenę zamknięcia ran.
Główne wyniki
- Charakterystyka procesów migracyjnych podczas gojenia ran.
- Ilościowe dane na temat zachowania komórek w odpowiedzi na leczenie.
- Wgląd w implikacje dla klinicznej terapii ran.
- Demonstracja reprodykowalności i niezawodności metody.
Wnioski
- Metoda sztucznego ranienia jest skuteczna do badania migracji komórek nabłonkowych.
- To podejście może zwiększyć zrozumienie mechanizmów gojenia ran.
- Potencjalne zastosowania we wczesnym testowaniu leków na terapie ran.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Assessing epithelial cell migration in vitro provides a scalable, reproducible platform for early-stage wound healing research, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates. Quantitative and qualitative readouts from scratch and migration front assays support target validation by linking cellular behavior to molecular marker changes. This approach improves predictive confidence in preclinical models by correlating migration dynamics with treatment effects, informing go/no-go decisions in wound therapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating cell migratory measurements with changes in relevant molecular markers.
- Operational Value: Provides quantitative gap closure data and qualitative front-edge imaging to de-risk targets involved in epithelial repair pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible wound models suitable for high-content screening of compounds affecting cell migration.
- Operational Value: Supports assay scalability through defined protocols for scratch and migration front generation, enabling cross-well and cross-plate consistency.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical work by capturing migration dynamics that reflect in vivo wound healing processes.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment, such as c-Jun or F-Actin reorganization, to validate mechanism of action in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows, supporting hypothesis testing in target validation and enabling scalable assay development for lead identification in wound healing programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking migration metrics to molecular marker behavior, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Screening: Delivers quantitative gap closure measurements and qualitative front-edge imaging, enabling reliable compound evaluation in migration-focused screens.
- Analytics: Provides quantifiable outputs (gap surface area differences) and imaging-based readouts that allow statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through fluorescence imaging of structural changes at the migrating front, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for assessing epithelial migration across multiple targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through correlation of migration dynamics with molecular marker changes, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined wounding protocols and imaging parameters, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by providing early, mechanism-linked efficacy data, lowering late-stage biological risk in wound therapy development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of candidates based on quantitative migration inhibition or stimulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture techniques, microscopy (phase contrast and fluorescence), and image analysis software for accurate wound quantification.
- Dependent on sterile tissue culture equipment, microscopes with CCD or fluorescence capabilities, and tools for precise wound generation (micropipette tips, razor blades).
- Necessitates standardization of wounding pressure, timing, and imaging fields across users and labs to ensure data comparability.
- Adaptation considerations include epithelial cell line variability, confluence requirements, and serum-free conditions to avoid confounding proliferation effects.
- Practical limitations include potential wound edge irregularities from excessive pressure or improper tool handling, which can disrupt migration quantification and require manual exclusion.
