Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

Ogólnym celem tych procedur sztucznego ranienia za pomocą hodowli komórek nabłonkowych jest zbadanie migracji komórek zarówno z perspektywy ilościowej, jak i jakościowej, co pozwoli na ocenę wpływu określonych metod leczenia na gojenie się ran. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia się ran, ponieważ pozwala na precyzyjne scharakteryzowanie ról określonych procesów migracyjnych podczas rozerwania nabłonka. Główną zaletą tego podejścia jest to, że pozwala ono na korelację pomiarów migracji komórek ze zmianami w zachowaniu odpowiednich markerów molekularnych.

Implikacje tych technik rozciągają się w kierunku terapii ran klinicznych, ponieważ oferują one dogodną konfigurację do wczesnego testowania leków i zamykania ran. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda zaczyna się z powodu trudności w uzyskaniu spójnej zdolności do rozmnażania się w ranach z pokoleniem. W przypadku testu sztucznego zadrapania rany zacznij od zasiania każdej studzienki płytki hodowlanej dwoma mililitrami interesujących komórek nabłonka w kompletnym podłożu.

Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procent dwutlenku węgla przez dwa do trzech dni, aż do 100% konfluencji. Gdy komórki są gotowe, przemyj je dwa razy świeżą pożywką bez surowicy, a następnie 24 godziny hodowli w świeżej pożywce bez surowicy. Następnego dnia umieść płytkę w sterylnym miejscu pracy i przeciągnij wąską końcówkę sterylnej końcówki mikropipety po dnie każdej studzienki dwa razy, aby wytworzyć ranę w kształcie krzyża.

Spójną szczelinę rany uzyskuje się poprzez stosowanie stałego, mocnego nacisku przy jednoczesnym płynnym przesuwaniu końcówki po powierzchni nabłonka. Nadmierny nacisk zdeformuje końcówkę, powodując nieregularny promień rany. Delikatnie usunąć supernatant, aby odłączyć odłączone komórki i ostrożnie dodać do studzienek świeżą pożywkę bez surowicy.

Używając mikroskopu z odwróconą fazą kontrastową połączonego z kamerą urządzenia sprzężonego z ładunkiem, wyrównaj krawędź pola mikroskopu z sąsiednim przecięciem rys, aby uzyskać do czterech obrazów referencyjnych przed obróbką szczeliny rysy w każdym dołku. Po uzyskaniu wszystkich obrazów należy zastąpić pożywkę w wyznaczonych studzienkach zabiegowych świeżą pożywką, uzupełnioną wybranymi zabiegami będącymi przedmiotem zainteresowania i zwrócić płytki do inkubatora do hodowli komórkowych. Gdy co najmniej jeden warunek osiągnie około 90% zamknięcia szczeliny na zadrapania, delikatnie zastąp supernatant jednym mililitrem czteroprocentowej formaliny w PBS na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Następnie delikatnie umyj komórki PBS co najmniej trzy razy, aby usunąć nadmiar formaliny i zobrazuj studzienki, jak właśnie pokazano, używając tych samych parametrów obrazowania w oryginalnych obszarach referencyjnych uchwyconych po zadrapaniu. Aby przeanalizować obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu, otwórz zarejestrowany, wstępnie przetworzony obraz, który Cię interesuje, i w menu Obraz ustaw typ obrazu na 8-bitowy. W menu Proces wybierz podmenu Filtry i zastosuj filtrowanie wariancji.

W menu Obraz otwórz podmenu Dostosuj i ustaw Próg na czarno-biały. W menu Proces wybierz podmenu Binarne i zastosuj opcję Wypełnij otwory. W menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary i aktywuj opcję Obszar.

Następnie narysuj mierzalny obszar, podążając za konturem krawędzi migrującej, aby wyznaczyć odstęp. W menu Analizuj wybierz opcję Analizuj cząstki i zapisz łączne wartości powierzchni obszaru. Aby określić ilościowo migrację bezwzględną dla każdego zestawu pojedynczych próbek jako różnicę między pomiarami powierzchni szczeliny, należy wyeksportować wartości całkowitej powierzchni szczeliny przed i po obróbce do arkusza kalkulacyjnego i wykreślić wyniki kwantyfikacji.

W przypadku testu na sztucznym froncie migracji, w sterylnych warunkach, dodaj jedną warstwę do 33 wysterylizowanych okrągłych szkiełek nakrywkowych do pustych 10-centymetrowych płytek hodowlanych. Gdy powierzchnia płytki zostanie całkowicie pokryta, delikatnie wysiew interesujące komórki nabłonkowe w stężeniu, które pozwala na 100% zbieżność po dwóch lub trzech dniach hodowli. W razie potrzeby delikatnie wciśnij pokrywki sterylną końcówką mikropipety, aby zapobiec unoszeniu się na wodzie.

Gdy komórki osiągną zlewność, zastąp supernatant pożywką bez surowicy na kolejne 24 godziny hodowli. Następnie za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie przenieś jedno szkiełko nakrywkowe na nową 10-centymetrową płytkę zawierającą świeże podłoże bez surowicy, uważając, aby utrzymać szkiełko nakrywkowe wzdłuż jego obrzeża. Aby utworzyć sztuczne rany, przeciągnij wysterylizowaną żyletkę tam iz powrotem po każdym szkiełku nakrywkowym, aby utworzyć trzy- do czterech milimetrowych linii poprzecznych nad środkiem każdej kultury komórkowej, aby całkowicie usunąć środkowy pasek monowarstwowy.

Należy zwrócić uwagę, aby podczas wykonywania rany mocno przesunąć krawędź żyletki w poprzek powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby zabezpieczyć się przed nieregularnym kształtem krawędzi i powstawaniem opadających części nabłonka. Przenieść do czterech zwijanych szkiełek nakrywkowych, komórką do góry, do indywidualnych dołków sześciodołkowej płytki, zawierającej co najmniej dwa mililitry pożywki niezawierającej surowicy i delikatnie przemyć każdą studzienkę dwa razy świeżą pożywką bez surowicy, aby usunąć wszelkie oderwane komórki. Po wyrzuceniu wszystkich oderwanych komórek należy delikatnie zastąpić pożywkę płuczącą świeżą pożywką uzupełnioną odpowiednimi zabiegami i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Pod koniec odpowiedniego okresu doświadczalnego utrwalić komórki czteroprocentową formaliną w PBS, jak właśnie pokazano, i wybarwić komórki odpowiednimi fluorescencyjnymi sprzężonymi przeciwciałami, które są przedmiotem zainteresowania. Następnie zobrazuj zmiany strukturalne zachodzące na migrującej przedniej krawędzi za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zgodnie z interesującymi parametrami eksperymentalnymi. W tym eksperymencie szczeliny w ranach mierzono przed i po leczeniu naskórkowym czynnikiem wzrostu, dobrze znanym induktorem proliferacji i migracji komórek nabłonka.

Migrację bezwzględną obliczono następnie jako różnicę między powierzchniami szczeliny przed i po obróbce. Leczenie naskórkowym czynnikiem wzrostu nasila dynamikę cytoszkieletu komórek, co zaobserwowano w tych obrazach z laserowej mikroskopii skaningowej barwienia F-aktyną komórek kontrolnych i stymulowanych czynnikiem wzrostu. Ponadto obserwuje się nadekspresję c-Jun ze zwiększoną ekspresją białka widoczną w komórkach sąsiadujących z frontem migracyjnym.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sprawdzeniu integralności brzegów rany pod kątem obecności płatów komórek nabłonkowych, które mogą zakłócić kwantyfikację migracji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zarówno ilościowo, jak i jakościowo ocenić zachowania migracyjne