Ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania

Protokół ten zapewnia nową metodę dla starej techniki i zapewni nowe podejście dla dużej liczby badaczy zajmujących się naukami podstawowymi. Głównymi zaletami tej techniki są jej opłacalny charakter, a także zdolność adaptacji do stosowania przez szerszą publiczność naukową. Aby przygotować płytkę migracyjną, użyj jasnego markera permanentnego, aby narysować linię wzdłuż środka tylnej części każdej studzienki płytki 48-dołkowej i narysuj trzy znaki krzyżyka, aby podzielić każdą studzienkę na trzy oddzielne obszary zainteresowania.

Następnie umieść fibroblasty serca w odległości od 1,5 do dwóch razy 10 do czwartego pojedynczego pasażu do każdej studzienki i hoduj komórki w normalnych warunkach hodowli przez 24 do 48 godzin, aż osiągną 90 do 95% konfluencji. Gdy komórki są gotowe, usuń supernatant z każdej studzienki i użyj sterylnej końcówki pipety P200, aby wykonać jednoprzebiegowe zadrapanie wzdłuż narysowanych linii. Przepłukać studzienki pożywką o niskiej surowicy, aby usunąć wszelkie nieprzyłączone fibroblasty serca i dodać 500 mikrolitrów pożywki o niskiej surowicy do każdej studzienki.

Jeśli stosowane są środki farmakologiczne, dodaj je do odpowiednich studzienek. Następnie użyj odwróconego mikroskopu z obiektywem 20x, aby uchwycić dwa obrazy godziny zero na studzienkę, używając oznaczeń do ustawienia każdej studzienki, aby umożliwić obrazowanie górnej połowy zarysowanej linii. Następnie przesuń płytkę, aby ustawić dolną połowę zarysowanej linii w polu widzenia, aby zebrać drugi obraz i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.

Pod koniec inkubacji umyć każdą studzienkę niesterylnym PVS i dodać 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do każdej studzienki w dygestorium. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej umyj każdą studzienkę trzy razy w świeżym PBS przez pięć minut na pranie. Po ostatnim myciu przepuszczaj komórki za pomocą 300 mikrolitrów roztworu przepuszczalnego na studzienkę i delikatnie kołysząc przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji zastąp roztwór przepuszczalny 1% brylantowo-niebieską plamą Kumasi na 10-minutową inkubację z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej. Następnie trzy, pięciominutowe mycie w PBS z kołysaniem. Po ostatnim myciu dodaj 300 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i ostrożnie umieść płytkę w tej samej pozycji, co w przypadku obrazu godziny zero, a następnie wykonaj dwa 24-godzinne obrazy na studzienkę, jak pokazano.

Pod koniec eksperymentu otwórz obrazy i odpowiedni program do analizy obrazowania, a następnie utwórz nową warstwę na obrazie godziny zero. Kliknij dwukrotnie, aby zmienić nazwę nowej warstwy linii warstwy i wybierz narzędzie pędzla. Zmień rozmiar piksela na 10, a kolor na czerwony i narysuj dwie oddzielne linie, aby obrysować rysę.

Linie nie powinny stykać się z żadnymi komórkami. Otwórz 24-godzinny obraz w oprogramowaniu do obrazowania i wybierz narzędzie do przesuwania. Przytrzymując wciśnięty przycisk sterujący, kliknij zarówno linie, jak i warstwy tła, kliknij na środku obrazu godziny zero i przeciągnij obie warstwy na środek obrazu 24-godzinnego.

Na obrazie 24-godzinnym kliknij warstwę tła godziny zero i zmień krycie na 50%Przytrzymując przycisk sterujący, kliknij zarówno tło godziny zero, jak i warstwę linii, a następnie kliknij edytuj i przekształć swobodnie, aby swobodnie przekształcić warstwy Korzystając z transformacji swobodnej, wyrównaj obrazy tła i linii godziny zero do obrazu tła 24-godzinnego, tak aby linie migracji obszaru były prawidłowo rozmieszczone na obrazie 24-godzinnym. Po pomyślnym nałożeniu warstwy linii kliknij prawym przyciskiem myszy, aby usunąć warstwę tła godziny zero. Pozostała warstwa linii może być użyta do określenia liczby komórek, które migrowały do obszaru szkicowania w ciągu 24 godzin.

Następnie zapisz nowy obraz migracji zarówno jako plik Photoshop, jak i plik TIFF lub JPEG. Aby określić ilościowo liczbę migrujących komórek, otwórz obraz migracji i program, który akceptuje pliki TIFF lub JPEG, a następnie ręcznie policz liczbę komórek znajdujących się pomiędzy nimi i dotykając dwóch czerwonych linii dla obu obrazów dla każdej studzienki. Następnie zapisz liczbę migrujących komórek na obrazie.

Aby określić obszar migracji, otwórz 24-godzinny obraz zawierający linie migracji w oprogramowaniu do obrazowania i zapisz obraz jako obraz obszaru migracji. Po zapisaniu kliknij warstwę tła i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby usunąć warstwę. Użyj narzędzia pędzla, aby wypełnić obszar między liniami rysowania tym samym kolorem, który został użyty do linii, a następnie kliknij obraz, tryb i skalę szarości, aby zmienić obraz na czarno-biały.

Zapisz obraz i otwórz obraz obszaru migracji oraz odpowiedni program do analizy obrazu. Kliknij przycisk Edytuj i odwróć. Aby określić obszar linii migracji, kliknij pozycję Obraz, Dostosuj i Próg.

obszar migracji zmieni kolor na czerwony, a obszar procentowy zostanie wskazany w polu progu. Następnie zapisz procentową powierzchnię linii migracji i upewnij się, że ta wartość jest sparowana z liczbą migrujących komórek dla tego samego obrazu. W tej analizie 46 fibroblastów z serc bez cukrzycy i 129 fibroblastów z serc z cukrzycą migrowało w ciągu 24-godzinnego okresu eksperymentalnego.

Pomiar obszaru migracji, jak wykazano, wykazał, że obszar zadrapań bez cukrzycy stanowił 24,78% całkowitego zmierzonego obszaru, podczas gdy obszar zadrapań migracji cukrzycowych stanowił 16,77% całkowitego zmierzonego obszaru. Normalizacja do obszaru migracji zapewnia lepszą i bardziej rygorystyczną ocenę migracji komórek oraz neguje potencjalny błąd ludzki. Na przykład, jeśli porówna się tylko liczbę migrowanych fibroblastów, w tej analizie okaże się, że liczba komórek, które migrowały w tej studni, była dwukrotnie większa niż liczba migrowanych komórek w drugiej studzience.

Kiedy jednak obszar rysy został wykorzystany do normalizacji danych, zaobserwowano, że stosunek fibroblastów do obszaru migracji jest prawie taki sam w obu studzienkach. Pamiętaj, aby ponownie przechwycić obszar migracji na obrazie 24-godzinnym, tak jak na obrazie godziny zero. Po tej procedurze można przeprowadzić immunohistochemię w celu zbadania ekspresji białek w komórkach.

Wierzymy, że to nowsze podejście do testu migracji zarysowania pozwoli na otwarcie większej liczby ścieżek badań naukowych, które wcześniej nie były dostępne.