Ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania
30 czerwca 2020
Przedstawiamy opłacalną metodę do testu migracji od razu, która zapewnia nowe podejście do określania migracji komórek bez użycia metod intensywnie wykorzystujących sprzęt. Chociaż w tym protokole wykorzystano fibroblasty, można go dostosować i wykorzystać do badania dodatkowych typów komórek i wpływu na migrację komórek.
Protokół ten zapewnia nową metodę dla starej techniki i zapewni nowe podejście dla dużej liczby badaczy zajmujących się naukami podstawowymi. Głównymi zaletami tej techniki są jej opłacalny charakter, a także zdolność adaptacji do stosowania przez szerszą publiczność naukową. Aby przygotować płytkę migracyjną, użyj jasnego markera permanentnego, aby narysować linię wzdłuż środka tylnej części każdej studzienki płytki 48-dołkowej i narysuj trzy znaki krzyżyka, aby podzielić każdą studzienkę na trzy oddzielne obszary zainteresowania.
Następnie umieść fibroblasty serca w odległości od 1,5 do dwóch razy 10 do czwartego pojedynczego pasażu do każdej studzienki i hoduj komórki w normalnych warunkach hodowli przez 24 do 48 godzin, aż osiągną 90 do 95% konfluencji. Gdy komórki są gotowe, usuń supernatant z każdej studzienki i użyj sterylnej końcówki pipety P200, aby wykonać jednoprzebiegowe zadrapanie wzdłuż narysowanych linii. Przepłukać studzienki pożywką o niskiej surowicy, aby usunąć wszelkie nieprzyłączone fibroblasty serca i dodać 500 mikrolitrów pożywki o niskiej surowicy do każdej studzienki.
Jeśli stosowane są środki farmakologiczne, dodaj je do odpowiednich studzienek. Następnie użyj odwróconego mikroskopu z obiektywem 20x, aby uchwycić dwa obrazy godziny zero na studzienkę, używając oznaczeń do ustawienia każdej studzienki, aby umożliwić obrazowanie górnej połowy zarysowanej linii. Następnie przesuń płytkę, aby ustawić dolną połowę zarysowanej linii w polu widzenia, aby zebrać drugi obraz i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.
Pod koniec inkubacji umyć każdą studzienkę niesterylnym PVS i dodać 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do każdej studzienki w dygestorium. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej umyj każdą studzienkę trzy razy w świeżym PBS przez pięć minut na pranie. Po ostatnim myciu przepuszczaj komórki za pomocą 300 mikrolitrów roztworu przepuszczalnego na studzienkę i delikatnie kołysząc przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji zastąp roztwór przepuszczalny 1% brylantowo-niebieską plamą Kumasi na 10-minutową inkubację z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej. Następnie trzy, pięciominutowe mycie w PBS z kołysaniem. Po ostatnim myciu dodaj 300 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i ostrożnie umieść płytkę w tej samej pozycji, co w przypadku obrazu godziny zero, a następnie wykonaj dwa 24-godzinne obrazy na studzienkę, jak pokazano.
Pod koniec eksperymentu otwórz obrazy i odpowiedni program do analizy obrazowania, a następnie utwórz nową warstwę na obrazie godziny zero. Kliknij dwukrotnie, aby zmienić nazwę nowej warstwy linii warstwy i wybierz narzędzie pędzla. Zmień rozmiar piksela na 10, a kolor na czerwony i narysuj dwie oddzielne linie, aby obrysować rysę.
Linie nie powinny stykać się z żadnymi komórkami. Otwórz 24-godzinny obraz w oprogramowaniu do obrazowania i wybierz narzędzie do przesuwania. Przytrzymując wciśnięty przycisk sterujący, kliknij zarówno linie, jak i warstwy tła, kliknij na środku obrazu godziny zero i przeciągnij obie warstwy na środek obrazu 24-godzinnego.
Na obrazie 24-godzinnym kliknij warstwę tła godziny zero i zmień krycie na 50%Przytrzymując przycisk sterujący, kliknij zarówno tło godziny zero, jak i warstwę linii, a następnie kliknij edytuj i przekształć swobodnie, aby swobodnie przekształcić warstwy Korzystając z transformacji swobodnej, wyrównaj obrazy tła i linii godziny zero do obrazu tła 24-godzinnego, tak aby linie migracji obszaru były prawidłowo rozmieszczone na obrazie 24-godzinnym. Po pomyślnym nałożeniu warstwy linii kliknij prawym przyciskiem myszy, aby usunąć warstwę tła godziny zero. Pozostała warstwa linii może być użyta do określenia liczby komórek, które migrowały do obszaru szkicowania w ciągu 24 godzin.
Następnie zapisz nowy obraz migracji zarówno jako plik Photoshop, jak i plik TIFF lub JPEG. Aby określić ilościowo liczbę migrujących komórek, otwórz obraz migracji i program, który akceptuje pliki TIFF lub JPEG, a następnie ręcznie policz liczbę komórek znajdujących się pomiędzy nimi i dotykając dwóch czerwonych linii dla obu obrazów dla każdej studzienki. Następnie zapisz liczbę migrujących komórek na obrazie.
Aby określić obszar migracji, otwórz 24-godzinny obraz zawierający linie migracji w oprogramowaniu do obrazowania i zapisz obraz jako obraz obszaru migracji. Po zapisaniu kliknij warstwę tła i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby usunąć warstwę. Użyj narzędzia pędzla, aby wypełnić obszar między liniami rysowania tym samym kolorem, który został użyty do linii, a następnie kliknij obraz, tryb i skalę szarości, aby zmienić obraz na czarno-biały.
Zapisz obraz i otwórz obraz obszaru migracji oraz odpowiedni program do analizy obrazu. Kliknij przycisk Edytuj i odwróć. Aby określić obszar linii migracji, kliknij pozycję Obraz, Dostosuj i Próg.
obszar migracji zmieni kolor na czerwony, a obszar procentowy zostanie wskazany w polu progu. Następnie zapisz procentową powierzchnię linii migracji i upewnij się, że ta wartość jest sparowana z liczbą migrujących komórek dla tego samego obrazu. W tej analizie 46 fibroblastów z serc bez cukrzycy i 129 fibroblastów z serc z cukrzycą migrowało w ciągu 24-godzinnego okresu eksperymentalnego.
Pomiar obszaru migracji, jak wykazano, wykazał, że obszar zadrapań bez cukrzycy stanowił 24,78% całkowitego zmierzonego obszaru, podczas gdy obszar zadrapań migracji cukrzycowych stanowił 16,77% całkowitego zmierzonego obszaru. Normalizacja do obszaru migracji zapewnia lepszą i bardziej rygorystyczną ocenę migracji komórek oraz neguje potencjalny błąd ludzki. Na przykład, jeśli porówna się tylko liczbę migrowanych fibroblastów, w tej analizie okaże się, że liczba komórek, które migrowały w tej studni, była dwukrotnie większa niż liczba migrowanych komórek w drugiej studzience.
Kiedy jednak obszar rysy został wykorzystany do normalizacji danych, zaobserwowano, że stosunek fibroblastów do obszaru migracji jest prawie taki sam w obu studzienkach. Pamiętaj, aby ponownie przechwycić obszar migracji na obrazie 24-godzinnym, tak jak na obrazie godziny zero. Po tej procedurze można przeprowadzić immunohistochemię w celu zbadania ekspresji białek w komórkach.
Wierzymy, że to nowsze podejście do testu migracji zarysowania pozwoli na otwarcie większej liczby ścieżek badań naukowych, które wcześniej nie były dostępne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie wprowadza opłacalną i elastyczną metodę do badania migracji komórek, pozwalającą na analizę migracji bez potrzeby skomplikowanego sprzętu. Korzystając z fibroblastów kardiomioców, protokół zapewnia nowe podejście, które można łatwo zmodyfikować dla różnych typów komórek i warunków wpływających na migrację.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Migracja komórek
- Zachowanie fibroblastów
- Biologia eksperymentalna
Tło
- Znaczenie badania migracji komórek
- Wyzwania istniejących metod
- Potrzeba tanich i wszechstronnych technik
Stosowane metody
- Badanie migracji poprzez rysowanie
- Fibroblasty kardiomioców
- Oprogramowanie do obrazowania i analizy
Główne wyniki
- Metoda skutecznie ilościowo oceniana migrację komórek przez 24 godziny
- Wykazano różnice w migracji między fibroblastami z serc cukrzycowych i niecukrzycowych
- Podkreśla znaczenie normalizacji danych dotyczących migracji w celu poprawy dokładności
Wnioski
- Nowe podejście poprawia dostępność badania migracji poprzez rysowanie dla szerszych zastosowań badawczych
- Dostarcza kluczowych informacji na temat biologicznych wpływów różnych warunków na migrację komórek
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This cost-effective scratch migration assay enables biopharma R&D teams to evaluate cell migration mechanisms without specialized imaging infrastructure, supporting early-stage target validation and phenotypic screening. By normalizing migration data to the scratched area, the method improves data rigor and reduces false positives in mechanistic de-risking workflows. The adaptability of the protocol allows integration into discovery pipelines assessing pharmacological modifiers or disease-relevant systems, enhancing predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cell migration pathways in fibrosis, wound healing, and metastasis models.
- Operational Value: Uses general laboratory equipment, reducing dependency on live-cell imaging systems and lowering assay implementation costs.
- Predictive Value: Normalization to migration area provides a more rigorous assessment of cell motility, improving target validation confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports preparation of validated biological systems for compound screening by enabling consistent scratch creation and region-of-interest recapture.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through visual markers and defined areas of interest, improving reproducibility across wells and experiments.
- Scalability: Compatible with 48-well plate formats, allowing medium-throughput evaluation of pharmacological modifiers or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrated applicability in diabetic vs. non-diabetic cardiac fibroblast models, supporting disease-relevant system evaluation.
- Mechanistic De-risking: Enables assessment of how pathological conditions alter migration behavior, informing target selection and pathway validation.
- Biomarker Alignment: Permits downstream immunohistochemistry to examine protein expression within migrated cells, linking functional assays to molecular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing quantitative, image-based outputs that support go/no-go decisions in early preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by quantifying cellular responses to pharmacological or genetic modifiers in a reproducible format.
- Screening: Enables assay readiness through standardized scratch creation and imaging alignment, allowing reliable comparison of migration across conditions.
- Analytics: Generates dual readouts—cell count and migration area percentage—enabling normalization and reducing variability in data interpretation.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by using disease-relevant primary cells (e.g., diabetic cardiac fibroblasts) to model pathophysiological migration defects.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across cell types and matrices, positioning it as a reusable platform capability rather than a single-use technique.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in migration assays.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through visual fiducials and area-based normalization.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by minimizing false leads from unnormalized migration data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on rigorous, quantifiable migration phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture skills and access to an inverted microscope with 20x objective.
- Depends on standard imaging software capable of layer alignment, thresholding, and area measurement (e.g., Photoshop or open-source alternatives).
- Necessitates cross-team standardization of image capture positioning and analysis protocols to ensure consistency.
- Adaptable to various extracellular matrix coatings and pharmacological treatments, though optimization may be needed for non-fibroblast cell types.
- Manual cell counting step introduces potential inter-operator variability; automated image analysis could improve throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:33
Migration Plate Preparation
1:11
Scratch Migration Assay
2:13
Fixation
3:28
Image Analysis
5:20
Migrating Cell Quantification and Migration Area Determination
6:56
Results: Representative Scratch Migration Assay Analyses
8:15
Conclusion
