Name: Ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj ekonomiczną metodę testu migracji zarysowania z wykorzystaniem fibroblastów kardiologicznych. Protokół umożliwia analizę migracji komórek bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Nagrodę Badań Medycznych Armii Stanów Zjednoczonych #81XWH-16-1-0710, Szkołę Farmacji Uniwersytetu Mississippi oraz Wydział Nauk Biomolekularnych.

1. Ogólna hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla fibroblastów serca w zmodyfikowanej pożywce Eagles (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 1 g/l glukozy, pirogronian sodu, L-glutaminę i uzupełniona 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2% L-glutaminy i 0,02% odczynnika przeciwdrobnoustrojowego (patrz tabela materiałów) i utrzymywane w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Hodowla fibroblastów serca do osiągnięcia 90-95% zbiegu w pasażu 0 (P0). W tym momencie fibroblasty są gotowe do rozszczepienia na 48-dołkową płytkę, która jest używana do testu migracji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płyty migracyjnej
<ol>
	<li>Przygotuj 48-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, rysując linię za pomocą żółtego lub jasnego markera permanentnego w dół środka dołka. Następnie narysuj trzy znaki krzyżyka dzielące studnię na trzy oddzielne obszary zainteresowania. Sekcje te będą używane do obrazowania. 
	UWAGA: Użycie markera permanentnego w jasnym kolorze pozwoli na łatwe obrazowanie migrujących komórek. Ciemne znaczniki, takie jak lub niebieski, uniemożliwią wizualizację migrujących komórek.</li>
	<li>Jeśli oceniasz migrację na podłożu (np. kolagenie), w tym czasie pokryj studzienkę zgodnie z instrukcjami i stężeniami stosowanymi dla określonego podłoża.</li>
	<li>Umieść ~ 15 000-20 000 fibroblastów serca, P1, do każdej studzienki i komórek hodowlanych, w normalnych warunkach hodowli (warunki wymienione w poprzedniej sekcji), aż osiągną 90-95% zbieżności. Konfluencja powinna zostać osiągnięta między 24 a 48 godzinami. 
	UWAGA: Podczas ustawiania płytki migracyjnej należy pamiętać o uwzględnieniu kontroli pozytywnej (znana komórka migrująca, taka jak komórki 3T318), kontroli ujemnej (komórki nieporysowane) i studzienki ślepej.</li>
</ol>
3. Test migracji scratch i utrwalanie
<ol>
	<li>Gdy komórki osiągną 90-95% zbieżności, usuń pożywkę i zarysuj wzdłuż narysowanej linii za pomocą sterylnej końcówki pipety P200. 
	UWAGA: Końcówka do pipet P200 jest typowym rozmiarem końcówki pipety używanym w teście zarysowywania10,14,19. Ponadto wykonuj tylko jedno przejście z końcówką P200, ponieważ więcej niż jedna próba może skutkować wieloma liniami zadrapań.</li>
	<li>Przepłukać studzienkę pożywką o niskiej zawartości surowicy (1,5% FBS), aby usunąć wszelkie nieprzyłączone fibroblasty serca.</li>
	<li>Dodać 500 μl pożywki o niskiej surowicy do każdego dołka. Jeśli używasz jakichkolwiek środków farmakologicznych, dodaj je w tym czasie. 
	UWAGA: Stosuje się pożywkę o niskiej zawartości surowicy, ponieważ umożliwia/promuje migrację komórek i zapobiega proliferacji fibroblastów, co mogłoby zniekształcić wyniki testu migracji20. Dla tego protokołu użyto 1,5% FBS.</li>
	<li>Uchwyć obrazy z 0 godzin przed inkubacją fibroblastów w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
	<ol>
		<li>Uchwyć obrazy z 0 godzin za pomocą odwróconego mikroskopu z obiektywem 20x. Zrób dwa zdjęcia 0 godzin na studzienkę. Pozwoli to na pełniejsze pokrycie linii migracji.</li>
		<li>Korzystając z oznaczeń (linii i kresek), ustaw studnię tak, aby uchwycić górną połowę linii zadrapania. Unikaj obrazowania środkowej kreski, aby upewnić się, że ten sam obszar migracji nie jest obrazowany dwukrotnie, co może zniekształcić wyniki.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do obrazowania (Tabela materiałów), aby uchwycić obraz 0 h #1. Następnie przesuń płytkę, aby ustawić dolną połowę dołka/linii zadrapania w polu widzenia kamery. Ponownie, unikaj przechwytywania środkowej kreski. Po umieszczeniu na miejscu uchwyć obraz 0 h #2 (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1). 
		UWAGA: Unikanie środkowej kreski na obu obrazach 0 godzin zapobiegnie dwukrotnemu uchwyceniu obszarów migracji, co w przypadku wykonania mogłoby spowodować powtórzenie wyników i zniekształcenie danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji przez 24 godziny wyjąć pożywkę z dołka i umyć studzienkę 1x niesterylnym PBS (odtąd wszystkie używane 1x PBS są niesterylne).</li>
	<li>W dygestorium dodać 500 μl 4% paraformaldehydu do studzienki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usuń paraformaldehyd i przemyj 3x 1x PBS przez 5 minut każdy w temperaturze RT.</li>
	<li>Po umyciu komórek przystąp do przechwytywania obrazów 24 godzin lub dodaj 1x PBS do każdego dołka i umieść w temperaturze 4 °C do późniejszego czasu. Komórki mogą pozostawać w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie, aż będą gotowe do obrazowania.
	<ol>
		<li>Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 300 μl roztworu przepuszczalnego (1x PBS i 0,01% trytonu X-100) do każdej studzienki. Inkubować komórki/płytkę z delikatnym, ciągłym kołysaniem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń roztwór przepuszczalny i dodaj 1% barwnika Coomassie Brilliant Blue (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% kwasu octowego, 45% metanolu i 45%dH2O) przez 10 minut z delikatnym, ciągłym kołysaniem w temperaturze RT. 
		UWAGA: Jeśli płytki są pokryte substratem macierzy zewnątrzkomórkowej, przed przeprowadzeniem testu migracji należy przetestować pokrytą płytkę barwieniem Coomassie. Rysunek 2 pokazuje, że substrat matrycowy może być użyty z tym testem i nie wpływa na wizualizację komórek.</li>
		<li>Umyj studzienki 3x z 1x PBS przy RT z ciągłym kołysaniem przez 5 min każda.</li>
		<li>Po umyciu dodaj 300 μL 1x PBS i uchwyć obrazy w ciągu 24 godzin.</li>
		<li>Uchwyć obrazy z 24 godzin, wyrównując studnię do tej samej pozycji, która została użyta do przechwycenia obrazów z godziny 0. W tym celu należy otworzyć wcześniej wykonane obrazy z godziny 0 godzin i za pomocą oznaczenia wykonanego markerem permanentnym wyrównać studnię w tej samej pozycji. Linia biegnąca w środku i dodatkowe znaki kreski powinny umożliwiać ścisłe wyrównanie między obrazem z 24 godzin a obrazem z 0 godzin (Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie obrazów 0 h i 24 h
<ol>
	<li>Otwórz zdjęcia z 0 godzin i 24 godzin wykonane z tego samego dołka i pozycji w oprogramowaniu do obrazowania (tabela materiałów).</li>
	<li>Utwórz nową warstwę na obrazie 0 h. Następnie kliknij nową warstwę i zmień nazwę warstwy na "warstwa liniowa", klikając dwukrotnie tekst. 
	UWAGA: Od tego momentu ta warstwa będzie nazywana warstwą liniową.</li>
	<li>Kliknij narzędzie Pędzel (ikona pędzla) i ustaw rozmiar na 10 pikseli, a kolor na czerwony.</li>
	<li>Po wybraniu warstwy linii narysuj dwie, oddzielne linie, które wyznaczają obszar rysy. Linie nie powinny stykać się z żadnymi komórkami, ponieważ linie te oznaczają obszar migracji.</li>
	<li>Kliknij narzędzie Przesuwanie (ikona strzałki), a następnie naciśnij przycisk Ctrl i kliknij zarówno warstwę linii, jak i tła.</li>
	<li>Kliknij na środku obrazu 0 h i przeciągnij obie te warstwy na środek obrazu 24 h.</li>
	<li>Teraz korzystając z obrazu 24 h, kliknij warstwę tła 0 h i zmień krycie na 50%.</li>
	<li>Trzymając wciśnięty Ctrl, kliknij zarówno tło 0 h, jak i warstwę linii, a następnie przekształć warstwy (Edit>Free Transform). Korzystając z transformacji swobodnej, wyrównaj obraz tła i linii 0 h do obrazu tła 24 h. Ten krok skutkuje nałożeniem się obrazu 0 h i 24 h, co jest niezbędne do ustawienia linii oznaczających obszar migracji w odpowiednim miejscu na obrazie 24 h.</li>
	<li>Po pomyślnym nałożeniu warstw tła 0 h i linii na obraz tła 24 h usuń warstwę tła 0 h. Usuń, klikając warstwę tła 0 h, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i kliknij usuń warstwę.</li>
	<li>Usunięcie obrazu tła 0 h pozostawi tylko linię i warstwę tła 24 h (obecnie nazywaną obrazem migracji). Warstwa liniowa wskaże obszar migracji/rysy na obrazie z 24 godzin i może być wykorzystana do określenia liczby migrujących komórek.</li>
	<li>Zapisz jako nowy obraz migracji zarówno jako plik programu Photoshop, jak i plik TIFF/JPEG. UWAGA: reprezentatywny rysunek, który obrazuje ten proces, jest przedstawiony w Rysunek 3.</li>
</ol>
5. Zliczanie liczby migrujących komórek
<ol>
	<li>Otwórz obraz migracji. Można to zrobić w programie, który akceptuje pliki TIFF/JPEG (Table of Materials).</li>
	<li>Policz liczbę komórek, które znajdują się pomiędzy, a także dotykają dwóch czerwonych linii.</li>
	<li>Zapisz liczbę migrujących komórek na obrazie. W każdym dołku będą migrować dwa obrazy, a wartości te nie powinny być łączone, dopóki wartości nie zostaną skorygowane dla obszaru migracji (szczegółowo opisane w następnej sekcji).</li>
</ol>
6. Określ obszar migracji
<ol>
	<li>Otwórz obraz z 24 godzin, który zawiera linie migracji w oprogramowaniu do obrazowania w sekcji 5 (Tabela materiałów).</li>
	<li>Zapisz jako ten obraz jako "Obraz obszaru migracji".</li>
	<li>Po zapisaniu kliknij warstwę tła, kliknij prawym przyciskiem myszy i kliknij usuń warstwę. Powinno to pozostawić tylko linie rysy na obrazie (Rysunek 3).</li>
	<li>Za pomocą narzędzia Pędzel (ikona pędzla) wypełnij obszar między liniami zadrapania. Dopasuj kolor pędzla do koloru użytego do narysowania linii migracji.</li>
	<li>Zmień obraz na skalę szarości, aby wygenerować obraz czarno-biały (Image>Mode>Grayscale), a następnie zapisz obraz (Rysunek 4).</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie analityczne (Tabela materiałów), a następnie otwórz plik "Obszar migracji" w oprogramowaniu do analizy.</li>
	<li>Aby określić obszar linii migracji, kliknij opcję Image>Adjust>Threshold (Próg obrazudostosuj. obszar migracji zmieni kolor na czerwony, a obszar procentowy zostanie wskazany w polu Próg. Obszar zostanie podany jako procent obszaru, który obejmuje linia migracji w porównaniu z całym obszarem uchwyconym na obrazie.</li>
	<li>Zapisz procentowy obszar linii migracji i upewnij się, że ta wartość jest sparowana z liczbą migrowanych komórek dla tego samego obrazu.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Normalizuje liczbę migrujących komórek do procentowego obszaru zadrapania. Podziel liczbę migrujących komórek przez procentowy obszar linii migracji (# migrowane komórki % obszaru migracji). Zrób to dla obrazu, a nie średniej na podstawie migracji na studnię.</li>
	<li>Po znormalizowaniu wartości na obraz dodaj wartości dwóch obrazów, które reprezentują pojedynczą studnię. Wartość ta zostanie wykorzystana do analizy graficznej i statystycznej. Jeśli projekt eksperymentalny zawierał wiele powtórzeń. Średnie wartości powtórzeń przed analizą statystyczną.</li>
</ol>

<ol><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilbert%2C+SF+%22Developmental+biology%22">Developmental biology</a>. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nature Immunology. 6, (2005).</li>
<li>Yahata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Function+of+Angiotensin+II+in+Skin+Wound+Healing+Induction+of+Fibroblast+and+Keratinocyte+Migration+by+Angiotensin+II+via+Heparin-Binding+Epidermal+Growth+Factor+%28EGF%29-like+Growth+Factor-Mediated+EGF+Receptor+Transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Migration+Single-Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell Migration Single-Cell Migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).</li>
<li>Brand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+is+increased+in+active+Crohn%27s+disease+and+promotes+proinflammatory+gene+expression+and+intestinal+epithelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration.</a> American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).</li>
<li>Chi, Z., Melendez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Cell+Adhesion+Molecules+and+Immune-Cell+Migration+in+the+Initiation%2C+Onset+and+Development+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis.</a> Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).</li>
<li>Chen, H., Nalbantoglu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ring+cell+migration+assay+identifies+distinct+effects+of+extracellular+matrix+proteins+on+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration.</a> BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).</li>
<li>Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+alterations+in+cardiac+fibroblast+function+following+induction+of+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload.</a> Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).</li>
<li>Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+myofibroblasts+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical%2C+Cosmetic+and+Investigational+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing.</a> Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7(2014).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Reviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li>
<li>Even-Ram, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+3D+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell migration in 3D matrix.</a> Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).</li>
<li>Valster, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays.</a> Methods. 37, 208-215 (2005).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li>
<li>Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing%3A+An+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li>
<li>Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+dilution+impact+on+in+vitro+wound+healing%3A+Normoxic+and+hypoxic+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).</li>
<li>Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+Mouse+3T3+Fibroblasts+in+Response+to+a+Serum+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).</li>
<li>Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+quantify+the+wound+closure+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach to quantify the wound closure dynamic.</a> Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).</li>
<li>Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Diabetic+Conditions+and+AGE%2FRAGE+Signaling+on+Cardiac+Fibroblast+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).</li>
<li>Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+Cell+Migration+by+Substrate+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension.</a> Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

To nowe podejście do testu migracji zarysowania zapewnia naukowcom bardziej dostępną metodę badania zmian w migracji komórek. Chociaż test ten jest zgodny z tą samą procedurą podawania zadrapania, podobną do innych testów zadrapań, zapewnia nową metodę obrazowania i dokładnej analizy migracji komórek10. Zamiast korzystać z metod mikroskopii poklatkowej i komór do obrazowania żywych komórek, metoda ta szczegółowo opisuje użycie powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego. Korzystając z ogólnego ...

Migracja komórek jest kluczowa dla wielu fizjologicznych i patologicznych zdarzeń. Jest wymagany podczas rozwoju, do wywołania odpowiedzi immunologicznej i do prawidłowego gojenia się ran1,2,3. Wiele z tych zdarzeń migracji komórek może być wywołanych przez sygnały fizyczne lub chemiczne. Na przykład podczas odpowiedzi immunologicznej leukocyty migrują w kierunku miejsca urazu w odpowiedzi na chemoatraktant2. Dodatkowo leukocyty będą również uwalniać cytokiny w celu wywołania migracji dodatkowych komórek odpornościowych, a także innych typów komórek, takich jak fibroblasty, które biorą udział w procesie gojenia się ran, a tym samym inicjują odpowiedź wielokomórkową4. Zdolność komórek do migracji jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania fizjologicznego; Jednakże, gdy migracja komórek nie jest kontrolowana, może wywołać niepożądaną reakcję i przyczynić się do zdarzeń patologicznych, takich jak przewlekłe zapalenie, choroby naczyniowe, przerzuty raka i zaburzenia gojenia się ran2,3,4,5,6,7. Upośledzone gojenie się ran jest częstą dolegliwością diabetyków z powodu defektów w migracji komórek, a jeśli te wady nie zostaną rozwiązane, może to prowadzić do dalszych powikłań (np. amputacja8,9). To badanie, jak również inne, wskazało na potrzebę dalszego zrozumienia procesu, w którym zachodzi migracja komórek, zarówno w normalnych warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych, i ma zasadnicze znaczenie dla rozwoju tej dziedziny badań. Aby to osiągnąć, muszą być dostępne testy migracji, które są zarówno dostępne, jak i przystępne cenowo dla tych badaczy, którzy mogą nie posiadać sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia tych testów.
Obecnie dostępne są różne testy migracji do badania szerokiego zakresu tematów dotyczących migracji komórek. Opracowano zarówno modele migracji 2D, jak i 3D, z których każdy koncentruje się na określonych obszarach wpływających na migrację komórek. Modele migracji 3D są zwykle kojarzone z badaniami inwazji komórek i oceniają wpływ macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek10,11,12, podczas gdy testy migracji 2D mają szerszy zakres zastosowań i są używane przede wszystkim do badania migracji chemotaktycznej, gojenia się ran i zmian funkcjonalnych podczas migracji komórek13,14,15,16. Niektóre z tych testów wymagają dodatkowego sprzętu, takiego jak komory Boydena lub pierścienie wykluczające, co może zmniejszyć dostępność tych testów dla niektórych badaczy. Jednym z bardziej opłacalnych testów jest test scratch, który jest zwykle używany do oceny gojenia się ran i ogólnych zmian w migracji komórek14,17. Podczas gdy większość laboratoriów jest wyposażona w sprzęt do przeprowadzania testów zarysowań, sprzęt używany do śledzenia migracji komórek jest zwykle niedostępny lub zbyt drogi do zakupu. Obejmuje to mikroskopię poklatkową, która wymaga mikroskopu odwróconego i systemu obrazowania na żywo. Te drogie urządzenia nie są powszechnie dostępne w każdym laboratorium. W związku z tym obserwacja ta podkreśla potrzebę nowego protokołu, który umożliwi ocenę migracji komórek za pomocą łatwiej dostępnego sprzętu.
Przedstawiony tutaj protokół zapewnia nowy i niedrogi sposób oceny migracji komórek. Metoda ta jest zgodna z tą samą procedurą, co testy zarysowania, ale różni się analizą badania migracji komórek poprzez wykorzystanie sprzętu powszechnie dostępnego w warunkach laboratoryjnych nauk podstawowych. Protokół ten wykorzystujący powszechnie stosowany sprzęt pozwala na dokładniejsze określenie migracji komórek bez użycia mikroskopii poklatkowej. Oprócz określania migracji, metoda ta uwzględnia również zmienne czynniki w obszarze zadrapania, które, jak zauważono, mają duży wpływ na migrację komórek. Ogólnie rzecz biorąc, ten nowy protokół analizy migracji komórek daje szansę większej liczbie laboratoriów na zbadanie i wniesienie wkładu w dziedzinę migracji komórek.

<table><tbody><tr><td>Adobe Wszystkie aplikacje</td><td>Adobe</td><td></td><td>Obejmuje to Adobe Photoshop, który jest oprogramowaniem do obrazowania używanym z tym protokołem</td></tr><tr><td>Avant Pipette Tips 200ul Binding niesterylne</td><td>MIDSCI</td><td>AVR1</td><td>Końcówki są autoklawowane w celu sterylizacji</td></tr><tr><td>AxioCam Erc 5s Camera</td><td>Zeiss</td><td>426540-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych Costar z płaskim dnem 48 dołków</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z L-glutaminą, glukozą 1 g / l i pirogronianem sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10014CM</td><td></td></tr><tr><td>Obraz J</td><td>NIH</td><td></td><td>Jest to darmowe oprogramowanie oferowane przez rząd USA i jest oprogramowaniem analitycznym używanym z tym protokołem</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>Najwyższej jakości płodowa surowica bydlęca pochodzenia amerykańskiego</td><td>Innowacyjne badania</td><td>IFBS-HU</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGEN</td><td>ant-pm-2</td><td>Jest to środek przeciwdrobnoustrojowy stosowany z tym prokotolem do hodowli fibroblastów serca</td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Primovert</td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td>491206-0002-000</td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue Edition 2.3</td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td></td><td>jest dostarczane z zakupem aparatu</td></tr></tbody></table>

ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Migracja komórek jest kluczowym elementem zarówno w zdarzeniach fizjologicznych, jak i patologicznych. Normalna migracja komórek jest wymagana do podstawowych funkcji, takich jak rozwój i narastanie odpowiedzi immunologicznej. Kiedy w procesie migracji komórek dochodzi do defektu lub zmiany, może to mieć szkodliwe skutki (np. przerzuty raka, gojenie się ran i tworzenie blizn). Ze względu na znaczenie migracji komórek konieczne jest posiadanie dostępu do testu migracji komórek, który jest niedrogi, elastyczny i powtarzalny. Wykorzystując powszechny test migracji zarysowującej, opracowaliśmy nowe podejście do analizy migracji komórek, które wykorzystuje ogólny sprzęt laboratoryjny. Opisana metoda wykorzystuje markery wizualne, które pozwalają na ponowne uchwycenie określonych obszarów zainteresowania bez użycia mikroskopii poklatkowej. Ponadto zapewnia elastyczność w projektowaniu eksperymentu, począwszy od zmiany substratu macierzy migracyjnej, a skończywszy na dodaniu modyfikatorów farmakologicznych. Ponadto protokół ten nakreśla sposób uwzględnienia obszaru migracji komórek, który nie jest brany pod uwagę przez kilka metod podczas badania migracji komórek. To nowe podejście oferuje szerszej publiczności test migracji zarysowej i zapewni naukowcom większe możliwości zbadania fizjologicznego i patofizjologicznego wpływu migracji komórek.

Niniejsza procedura dokumentuje nowe podejście do badania migracji komórek, które jest zarówno efektywne kosztowo, jak i łatwo adaptowalne dla większości laboratoriów. W wielu badaniach do oceny migracji komórek wykorzystywano mikroskopię poklatkową, jednak sprzęt wymagany do tej metody nie jest powszechnie dostępny w wielu laboratoriach. Tymczasem wykorzystanie linii i kresek do demarkacji umożliwia ponowne uchwycenie konkretnych obszarów zainteresowania w różnych punktach czasowych bez użycia kosztownego sprzętu (<stro...

Przedstawiamy opłacalną metodę do testu migracji od razu, która zapewnia nowe podejście do określania migracji komórek bez użycia metod intensywnie wykorzystujących sprzęt. Chociaż w tym protokole wykorzystano fibroblasty, można go dostosować i wykorzystać do badania dodatkowych typów komórek i wpływu na migrację komórek.

Ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Protokół ten zapewnia nową metodę dla starej techniki i zapewni nowe podejście dla dużej liczby badaczy zajmujących się naukami podstawowymi. Głównymi zaletami tej techniki są jej opłacalny charakter, a także zdolność adaptacji do stosowania przez szerszą publiczność naukową. Aby przygotować płytkę migracyjną, użyj jasnego markera permanentnego, aby narysować linię wzdłuż środka tylnej części każdej studzienki płytki 48-dołkowej i narysuj trzy znaki krzyżyka, aby podzielić każdą studzienkę na trzy oddzielne obszary zainteresowania.Następnie umieść fibroblasty serca w odległości od 1,5 do dwóch razy 10 do czwartego pojedynczego pasażu do każdej studzienki i hoduj komórki w normalnych warunkach hodowli przez 24 do 48 godzin, aż osiągną 90 do 95% konfluencji. Gdy komórki są gotowe, usuń supernatant z każdej studzienki i użyj sterylnej końcówki pipety P200, aby wykonać jednoprzebiegowe zadrapanie wzdłuż narysowanych linii. Przepłukać studzienki pożywką o niskiej surowicy, aby usunąć wszelkie nieprzyłączone fibroblasty serca i dodać 500 mikrolitrów pożywki o niskiej surowicy do każdej studzienki.Jeśli stosowane są środki farmakologiczne, dodaj je do odpowiednich studzienek. Następnie użyj odwróconego mikroskopu z obiektywem 20x, aby uchwycić dwa obrazy godziny zero na studzienkę, używając oznaczeń do ustawienia każdej studzienki, aby umożliwić obrazowanie górnej połowy zarysowanej linii. Następnie przesuń płytkę, aby ustawić dolną połowę zarysowanej linii w polu widzenia, aby zebrać drugi obraz i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.Pod koniec inkubacji umyć każdą studzienkę niesterylnym PVS i dodać 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do każdej studzienki w dygestorium. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej umyj każdą studzienkę trzy razy w świeżym PBS przez pięć minut na pranie. Po ostatnim myciu przepuszczaj komórki za pomocą 300 mikrolitrów roztworu przepuszczalnego na studzienkę i delikatnie kołysząc przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji zastąp roztwór przepuszczalny 1% brylantowo-niebieską plamą Kumasi na 10-minutową inkubację z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej. Następnie trzy, pięciominutowe mycie w PBS z kołysaniem. Po ostatnim myciu dodaj 300 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i ostrożnie umieść płytkę w tej samej pozycji, co w przypadku obrazu godziny zero, a następnie wykonaj dwa 24-godzinne obrazy na studzienkę, jak pokazano.Pod koniec eksperymentu otwórz obrazy i odpowiedni program do analizy obrazowania, a następnie utwórz nową warstwę na obrazie godziny zero. Kliknij dwukrotnie, aby zmienić nazwę nowej warstwy linii warstwy i wybierz narzędzie pędzla. Zmień rozmiar piksela na 10, a kolor na czerwony i narysuj dwie oddzielne linie, aby obrysować rysę.Linie nie powinny stykać się z żadnymi komórkami. Otwórz 24-godzinny obraz w oprogramowaniu do obrazowania i wybierz narzędzie do przesuwania. Przytrzymując wciśnięty przycisk sterujący, kliknij zarówno linie, jak i warstwy tła, kliknij na środku obrazu godziny zero i przeciągnij obie warstwy na środek obrazu 24-godzinnego.Na obrazie 24-godzinnym kliknij warstwę tła godziny zero i zmień krycie na 50%Przytrzymując przycisk sterujący, kliknij zarówno tło godziny zero, jak i warstwę linii, a następnie kliknij edytuj i przekształć swobodnie, aby swobodnie przekształcić warstwy Korzystając z transformacji swobodnej, wyrównaj obrazy tła i linii godziny zero do obrazu tła 24-godzinnego, tak aby linie migracji obszaru były prawidłowo rozmieszczone na obrazie 24-godzinnym. Po pomyślnym nałożeniu warstwy linii kliknij prawym przyciskiem myszy, aby usunąć warstwę tła godziny zero. Pozostała warstwa linii może być użyta do określenia liczby komórek, które migrowały do obszaru szkicowania w ciągu 24 godzin.Następnie zapisz nowy obraz migracji zarówno jako plik Photoshop, jak i plik TIFF lub JPEG. Aby określić ilościowo liczbę migrujących komórek, otwórz obraz migracji i program, który akceptuje pliki TIFF lub JPEG, a następnie ręcznie policz liczbę komórek znajdujących się pomiędzy nimi i dotykając dwóch czerwonych linii dla obu obrazów dla każdej studzienki. Następnie zapisz liczbę migrujących komórek na obrazie.Aby określić obszar migracji, otwórz 24-godzinny obraz zawierający linie migracji w oprogramowaniu do obrazowania i zapisz obraz jako obraz obszaru migracji. Po zapisaniu kliknij warstwę tła i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby usunąć warstwę. Użyj narzędzia pędzla, aby wypełnić obszar między liniami rysowania tym samym kolorem, który został użyty do linii, a następnie kliknij obraz, tryb i skalę szarości, aby zmienić obraz na czarno-biały.Zapisz obraz i otwórz obraz obszaru migracji oraz odpowiedni program do analizy obrazu. Kliknij przycisk Edytuj i odwróć. Aby określić obszar linii migracji, kliknij pozycję Obraz, Dostosuj i Próg.obszar migracji zmieni kolor na czerwony, a obszar procentowy zostanie wskazany w polu progu. Następnie zapisz procentową powierzchnię linii migracji i upewnij się, że ta wartość jest sparowana z liczbą migrujących komórek dla tego samego obrazu. W tej analizie 46 fibroblastów z serc bez cukrzycy i 129 fibroblastów z serc z cukrzycą migrowało w ciągu 24-godzinnego okresu eksperymentalnego.Pomiar obszaru migracji, jak wykazano, wykazał, że obszar zadrapań bez cukrzycy stanowił 24,78% całkowitego zmierzonego obszaru, podczas gdy obszar zadrapań migracji cukrzycowych stanowił 16,77% całkowitego zmierzonego obszaru. Normalizacja do obszaru migracji zapewnia lepszą i bardziej rygorystyczną ocenę migracji komórek oraz neguje potencjalny błąd ludzki. Na przykład, jeśli porówna się tylko liczbę migrowanych fibroblastów, w tej analizie okaże się, że liczba komórek, które migrowały w tej studni, była dwukrotnie większa niż liczba migrowanych komórek w drugiej studzience.Kiedy jednak obszar rysy został wykorzystany do normalizacji danych, zaobserwowano, że stosunek fibroblastów do obszaru migracji jest prawie taki sam w obu studzienkach. Pamiętaj, aby ponownie przechwycić obszar migracji na obrazie 24-godzinnym, tak jak na obrazie godziny zero. Po tej procedurze można przeprowadzić immunohistochemię w celu zbadania ekspresji białek w komórkach.Wierzymy, że to nowsze podejście do testu migracji zarysowania pozwoli na otwarcie większej liczby ścieżek badań naukowych, które wcześniej nie były dostępne.

a-cost-effective-and-adaptable-scratch-migration-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zdolność do migracji jest kluczową funkcją wielu różnych typów komórek, w tym mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC). Ilościowe określenie zmian w zdolności migracyjnej po wystąpieniu szkód jest jednak trudne. Protokół ten opisuje łatwy do adaptacji test migracji, który wykorzystuje rygorystyczne statystyki do ilościowego określenia zmian w zdolności migracyjnej MSC po uszkodzeniu.

Optymalizacja testu zadrapań rany w celu wykrycia zmian w migracji mysich mezenchymalnych komórek zrębu po uszkodzeniu przez rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Migracja komórek jest niezbędna do rozwoju, utrzymania i naprawy tkanek oraz nowotworzenia, a także jest regulowana przez czynniki wzrostu, chemokiny i cytokiny. Protokół ten opisuje test punktowy, dwuwymiarowy, nieograniczony test migracji w celu oceny fenotypu migracyjnego dołączonych, spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe.

Wykorzystanie testu punktowego do analizy migracji arkuszy komórek

Tutaj opisujemy procedurę testowania migracji komórek in vitro za pomocą automatycznego mikroskopu optycznego. Test zarysowania jest szeroko stosowany, w którym zamknięcie rysy następuje przez określony czas. Mikroskop optyczny umożliwia niezawodne i tanie wykrywanie migracji komórek.

Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej

To badanie skupia się na modelu gojenia ran in vitro (test zadrapań) jako mechanizmie określającym, jak zanieczyszczenia środowiskowe, takie jak arsen, wpływają na migrację komórek. Wyniki pokazują, że ten test in vitro dostarcza szybkich i wczesnych wskazówek dotyczących zmian w migracji komórkowej przed eksperymentami in vivo.

In vitro Test zarysowania w celu wykazania wpływu arsenu na migrację komórek skóry

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Poprzez włączenie projektowania doświadczeń interakcji i analizy wymagań użytkownika, wprowadzamy innowacyjny skrobak do komórek, który poprawia testy gojenia się ran komórkowych pod względem odtwarzalności, niezawodności, praktyczności, integralności komórkowej i doświadczenia użytkownika.

Narzędzie do automatycznego tworzenia stabilnych i powtarzalnych przerw bezkomórkowych w celu poprawy wiarygodności testu gojenia się ran komórkowych

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Ta metoda pozwala na monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym oraz ilościowe pomiary różnych parametrów migracji komórkowej, takich jak prędkość, przemieszczenie i wektor prędkości. W przeciwieństwie do metod tradycyjnych, to podejście w czasie rzeczywistym nie opiera się na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym; zamiast tego umożliwia ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów.

Ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Poznaj ekonomiczną metodę testu migracji zarysowania z wykorzystaniem fibroblastów kardiologicznych. Protokół umożliwia analizę migracji komórek bez specjalistycznego sprzętu.

Ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania

Przeglądaj więcej filmów