Name: Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metody oceny inwazji i migracji komórek: test komory Boydena oraz zoptymalizowany test ran drapanych z użyciem mikroskopii wideo. Porównaj ich zalety i ograniczenia w badaniach nad komórkami SQ20B.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te techniki zostały opracowane przy wsparciu LabEx PRIMES (ANR-11-LABX-0063), Contrat Plan-Etat-Region (CPER) w ramach naukowych ETOILE (CPER 2009-2013) oraz Lyric Grant INCa-DGOS-4664.

UWAGA: Testy komory Boydena i zadrapania bez włączenia ECM są określane jako testy migracji, a te same testy z ECM są określane jako testy inwazji.
1. Test w komorze Boydena
UWAGA: Ten protokół jest dostosowany do linii komórkowej SQ20B, która wywodzi się z nawracającego raka krtani z rakiem płaskonabłonkowym głowy i szyi (HNSCC) i została uzyskana od Johna Little'a (Boston, MA, USA).
Dzień 1
<ol>
	<li>Wysiewanie komórek
	<ol>
		<li>Zasiać 2 106 komórek SQ20B w 12 ml pożywki hodowlanej (CM) w kolbie o długości 175 cm2 na 72 godziny przed pierwszym dniem i pozwolić komórkom urosnąć do 80% zbiegu komórek.
		<ol>
			<li>Aby przygotować CM dla komórek SQ20B, uzupełnij zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 0,04 mg / ml hydrokortyzonu, 100 U / ml penicyliny i 0,1 g / l streptomycyny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pod kapturem z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki. Usunąć pożywkę, przemyć komórki sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodać 2,5 ml trypsyny, kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,5 g/l). Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie zatrzymać reakcję przez dodanie 12,5 ml CM ogrzanego do temperatury 37 °C. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.</li>
		<li>Wysiewać komórki w kolbie o średnicy 25cm2 o gęstości komórek 6, 10,5 komórek dla każdego warunku, który ma być oceniany. Inkubować komórki przez 24 godziny w 3 ml CM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dzień 2
<ol start="2">
	<li>Głód komórek i przygotowanie komór powlekanych
	<ol>
		<li>Zagłodzić komórki, zastępując pożywkę w każdej kolbie 3 ml pożywki z niskopłodowej surowicy bydlęcej (FBS) przy użyciu 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) zamiast FBS. Zagłodź komórki przez 24 godziny w inkubatorze.
		<ol>
			<li>Aby przygotować głodówkę CM (s-CM), uzupełnij DMEM 0,1% BSA, 0,04 mg/ml hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny i 0,1 g/l streptomycyny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby uzyskać test migracji, przejdź do kroku 1.3.</li>
		<li>Do testu inwazji, 12 godzin przed dniem 3, przygotuj powlekane komory Boydena, dodając 500 μl s-CM do każdej powlekanej komory. Używaj komercyjnie przygotowanych powlekanych komór Boydena i przechowuj je w temperaturze 4 °C przed użyciem. Umieścić każdą komorę Boydena na płytce towarzyszącej i ustawić ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dzień 3
<ol start="3">
	<li>Wysiew komórek w komorze Boydena
	<ol>
		<li>Użyj płytki towarzyszącej, aby przygotować chemoatraktant. Napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki towarzyszącej 750 μl kompletnego podłoża z 10% FBS, 0,04 mg/ml hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny i 0,1 g/l streptomycyny.
		<ol>
			<li>Dostosuj chemoatraktant do każdej linii komórkowej i każdego warunku leczenia. Aby przygotować chemoatraktant CM (ca-CM), uzupełnij DMEM o 10% FCS, 0,4 mg/ml hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny i 0,1 g/l streptomycyny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przenieś górną komorę do wstępnie napełnionej płytki towarzyszącej, uważając, aby nie powstały bąbelki.</li>
		<li>Do testu inwazji ostrożnie usuń 450 μl CM z każdej komory Boydena.</li>
		<li>Pod kapturem z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki. Usunąć pożywkę, przemyć komórki sterylnym PBS, dodać 0,5 ml trypsyny EDTA (0,5 g/l), a następnie inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję przez dodanie CM ogrzanego do 37 °C. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.</li>
		<li>Wysiew 3 104 komórek SQ20B w 500 μl 0,1% pożywki BSA, co daje końcowe rozcieńczenie 6 104 komórek/ml. 
		UWAGA: Stężenie komórek powinno być dostosowane do każdej linii komórkowej.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dzień 4
<ol start="4">
	<li>Utrwalanie i barwienie komórek
	<ol>
		<li>Napraw komórki przed czasem podwojenia specyficznym dla tej linii komórkowej. Napraw ogniwa SQ20B przed 24 godzinami.</li>
		<li>Wyjmij każdą wkładkę z płytki towarzyszącej i ostrożnie usuń komórki z górnej komory za pomocą bawełnianego wacika. Szczególnie ważne jest usunięcie wszystkich komórek znajdujących się w górnej komorze.</li>
		<li>Napraw i zabejcuj każdą wkładkę indywidualnie, aby uzyskać kolorystykę May-Grunwald Giemsa9 za pomocą dołączonego zestawu do barwienia. Alternatywnie, użyj 4% paraformaldehydu w innej płytce towarzyszącej, aby uzyskać 30-minutowe utrwalenie.</li>
		<li>Przechowuj wkładki na pustej 24-dołkowej płytce towarzyszącej pod okapem laboratoryjnym, aby wysuszyć każdą komorę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dzień 5
<ol start="5">
	<li>Analiza mikroskopowa
	<ol>
		<li>Umieść płytkę towarzyszącą z wkładkami do mikroskopu z 20 kontrastami fazowymi i policz każdą migrowaną komórkę w dolnej części membrany. Zoptymalizuj właściwą pozycję ostrości, przesuwając obiektyw od dołu do góry i zatrzymaj pozycję w dolnej części membrany.</li>
		<li>Oblicz stosunek liczby migrowanych komórek do komórek zasiewanych. Powtórzyć każde liczenie dla każdego stanu leczenia w trzech egzemplarzach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test ran drapanych: Migracja komórek
UWAGA: Instrukcje muszą być dostosowane do każdego typu komórki.
Dzień 1
<ol>
	<li>Wysiewanie komórek
	<ol>
		<li>Zasiaj 2 x 106 komórek SQ20B w 12 ml CM w kolbie o długości 175 cm2 72 godziny przed pierwszym dniem i pozwól komórkom urosnąć do 80% zbiegu komórek.</li>
		<li>Pod kapturem z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki. Usunąć pożywkę, przemyć komórki sterylnym PBS, dodać 2,5 ml trypsyny EDTA (0,5 g/l) i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję przez dodanie 12,5 ml CM ogrzanego do 37 °C. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.</li>
		<li>Wytwarzać wstępnie rozcieńczoną próbkę o gęstości komórek 4 x 105/ml, uzyskując końcową gęstość 4 104 komórek na 100 μl w każdym dołku. Stężenie to musi być dostosowane dla każdej linii komórkowej i powinno mieścić się w zakresie od 1 x 104 do 6 104 komórek.</li>
		<li>Komórki nasienne umieścić w każdym dołku płytki 96-dołkowej, umieszczając 100 μl roztworu przygotowanego w kroku 2.1.2.</li>
		<li>Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na 5 minut, aby równomiernie rozproszyć komórki na dnie studzienek.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze i pozostawić komórki do przylegania do płytki przez 12-16 godzin (maksymalnie) w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dzień 2
<ol start="2">
	<li>Test ran drapanych
	<ol>
		<li>Wyjąć z inkubatora płytki przygotowane w kroku 2.1</li>.
		<li>Pod maską wykonaj ranę za pomocą komercyjnego urządzenia do nawijania zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Natychmiast usunąć pożywkę z każdej studzienki za pomocą pipety z dostosowaną stożkową końcówką, uważając, aby nie dotknąć rany.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie, powtarzając aspirację i używając 100 μl CM ogrzanego do temperatury 37 °C dla każdej studzienki.</li>
		<li>Wyjmij CM za pomocą pipety z dostosowaną stożkową końcówką po etapach mycia.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 100 μl pożywki specyficznej dla każdego stanu leczenia.</li>
		<li>Staraj się unikać tworzenia pęcherzyków w studzienkach. Pomocna może być w tym przypadku technika odwróconego pipetowania. Alternatywnie usuń bąbelki za pomocą igły strzykawki.</li>
		<li>Umieść płytkę w przystosowanym do tego stojaku wideomikroskopu.</li>
		<li>Aby poprawić jakość obrazu, pozwól płytce ogrzać się przez co najmniej 15 minut przed pierwszym skanowaniem, aby uniknąć kondensacji pary wodnej na dolnej stronie płytki.</li>
		<li>Zaprogramuj harmonogram skanów za pomocą oprogramowania mikroskopu wideo na jednym obrazie na studzienkę. W przypadku eksperymentu inwazji-migracji wymagany jest maksymalnie 2-godzinny interwał. Jeśli celem eksperymentu jest wyprodukowanie filmu, preferowany jest interwał wynoszący maksymalnie 30 minut.</li>
		<li>Pod koniec eksperymentu dokładnie umyj urządzenie do nawijania i postępuj zgodnie z każdym z czterech etapów mycia wskazanych przez producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dni 3, 4 i 5
<ol start="3">
	<li>Analiza migracji z wykorzystaniem wideomikroskopu
	<ol>
		<li>Przez minimum 24 godziny do maksymalnie 5 dni monitoruj i sprawdzaj migrację komórek.</li>
		<li>Użyj odpowiedniej maski komórki dostosowanej do każdego typu komórki, aby przeanalizować migrację komórek. Aby uzyskać maskę komórki dostosowaną do każdej linii komórkowej, wygeneruj definicję przetwarzania komórki z oprogramowania przy użyciu określonego zbioru obrazów komórek.</li>
		<li>Śledź krzywe i eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, który można wykorzystać do analizy i porównania wyników.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test ran drapanych: inwazja komórek
UWAGA: Instrukcje muszą być dostosowane do każdego typu komórki.
Dzień 1
<ol>
	<li>Wysiewanie komórek
	<ol>
		<li>Użyj tego samego protokołu do wysiewu komórek, jak opisano w kroku 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dzień 2
<ol start="2">
	<li>Przygotowanie ECM
	<ol>
		<li>Przed użyciem rozmrażać matrycę przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że nie widać żadnych kruszyw. Jeżeli agregaty są widoczne, należy utrzymywać matrycę w temperaturze 4 °C przez dłuższy czas, aż znikną agregaty. Utrzymuj matrycę na lodzie. Używaj wstępnie schłodzonych końcówek do pipet. 
		UWAGA: Matryca zestala się, jeśli nie będzie przechowywana w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Schłodzić probówki do mikrowirówek na lodzie przez 5 minut.</li>
		<li>Pobrać CM schłodzony do temperatury 4 °C z lodówki i rozcieńczyć matrycę we wstępnie schłodzonych probówkach do mikrowirówek, aby uzyskać końcowe stężenie 300 μg/ml.</li>
		<li>Probówki do mikrowirówek z rozcieńczoną matrycą umieścić z powrotem w lodówce w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Stojak chłodzący przystosowany do probówek do mikrowirówek jest pomocny w utrzymywaniu probówek w temperaturze 4°C przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dzień 2
<ol start="3">
	<li>Test ran drapanych i leczenie ECM
	<ol>
		<li>Wyjąć z inkubatora płytkę przygotowaną w kroku 3.1.</li>
		<li>Pod maską wykonaj ranę za pomocą komercyjnego urządzenia do nawijania zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Natychmiast usunąć podłoże z każdej studzienki za pomocą pipety z dostosowaną stożkową końcówką, uważając, aby nie dotknąć rany.</li>
		<li>Umyć komórki dwukrotnie, powtarzając procedurę aspiracji i używając 100 μl CM ogrzanego do 37 °C.</li>
		<li>Po drugim płukaniu umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 4 °C, aby wyrównać jego temperaturę przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć zimne podłoże z każdej studzienki za pomocą pipety aspiracyjnej ze stożkową końcówką, uważając, aby pipetować ostrożnie od krawędzi i nie dotykając rany.</li>
		<li>Dodać 50 μl wstępnie rozcieńczonej matrycy do każdego dołka za pomocą wstępnie schłodzonych stożkowych końcówek w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 min. 
		UWAGA: Wstępnie podgrzany stojak w temperaturze 37 °C jest pomocny w przyspieszeniu nagrzewania płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 100 μl dostosowanego CM do każdej studzienki, zgodnie ze wskazaniami dla każdego warunku leczenia.</li>
		<li>Staraj się unikać tworzenia pęcherzyków w studzienkach. Pomocna może być w tym przypadku technika odwróconego pipetowania. Alternatywnie usuń bąbelki za pomocą igły strzykawki.</li>
		<li>Umieść płytkę w odpowiednim stojaku w mikroskopie wideo.</li>
		<li>Aby poprawić jakość obrazu, pozwól płytce ogrzać się przez co najmniej 15 minut przed pierwszym skanowaniem, aby uniknąć kondensacji pary wodnej na dolnej stronie płytki.</li>
		<li>Zaprogramuj harmonogram skanowania, korzystając z oprogramowania mikroskopu wideo na jednym obrazie na studzienkę, w trybie skanowania ran zadrapań. Maksymalny 2-godzinny interwał wymagany dla eksperymentu inwazji i migracji. Jeśli celem eksperymentu jest wyprodukowanie filmu, preferowany jest interwał wynoszący maksymalnie 30 minut.</li>
		<li>Pod koniec eksperymentu dokładnie umyj urządzenie do nawijania i postępuj zgodnie z każdym z czterech etapów mycia wskazanych przez producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dni 3, 4 i 5
<ol start="4">
	<li>Analiza inwazji komórek za pomocą wideomikroskopu.
	<ol>
		<li>Powtórz krok 2.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-enhanced+cell+migration%2Finvasion+process%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review.</a> Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).</li>
<li>Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+E-cadherin+and+integrins+in+mesoderm+differentiation+and+migration+at+the+mammalian+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak.</a> Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).</li>
<li>Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+cancer+stem%28-like%29+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).</li>
<li>Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+biologic+activity+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications.</a> J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).</li>
<li>Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).</li>
<li>Chen, H. -C. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/922b/e08c04a3ad311a32ca0fc52644681f1bf8b7.pdf">Boyden chamber assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).</li>
<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576902">Wound-healing assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).</li>
<li>Piaton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+and+best+practice+guidelines+for+May-Gr%C3%BCnwald-Giemsa+staining%3A+literature+review+and+insights+from+the+quality+assurance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Path%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance.</a> Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell.</a> Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+ion+irradiation+withstands+cancer+stem+cells%E2%80%99+migration%2Finvasion+process+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC).</a> Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).</li>
<li>Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Subpopulation+Having+Stem+Cell+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics.</a> J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy tutaj dwie różne metody badania procesu inwazji i migracji komórek. Analiza tego procesu jest ważna dla zrozumienia czynników związanych z nawrotem przerzutów, które można wyjaśnić zwiększoną ruchliwością subpopulacji komórek nowotworowych zwanych rakowymi komórkami macierzystymi10,11.
Eksperyment z komorą Boydena jest jedną z najczęściej stosowanych technik badania inwazji i migracji komórek. Jedną z zalet tego podejścia...

Inwazja i migracja komórek są zaangażowane w rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych, co jest główną przyczyną oporności na leczenie1 i może prowadzić do nawrócenia lokoregionalnego lub przerzutowego po leczeniu raka2. Przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) to początkowy proces inwazji i migracji komórek, w którym komórki rakowe przechodzą z fenotypu nabłonkowego na mezenchymalny. E-kadheryna jest zewnątrzkomórkowym markerem fenotypu nabłonkowego3, a zwiększona ekspresja N-kadheryny i wimentyny jest charakterystyczna dla fenotypu mezenchymalnego4. Migracja zależy również od wewnętrznej zdolności komórek nowotworowych do inwazji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) poprzez działanie metaloproteaz macierzy5.
Ten mechanizm inwazji i migracji został opisany dla raka w wielu miejscach, szczególnie w raku głowy i szyi6. Wielu badaczy skupiło się na procesach migracji i inwazji, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób rozprzestrzeniają się komórki nowotworowe, w nadziei, że ta wiedza doprowadzi do nowych strategii leczenia. Bardzo ważne jest, aby badania te były przeprowadzane przy użyciu wiarygodnych i powtarzalnych testów.
Analiza ruchliwości komórek in vitro może być wyzwaniem. Opracowany wiele lat temu test komory Boydena jest uważany za standard analizy inwazji i migracji7. Jest to jednak czasochłonne i często niedokładne. Drugim testem jest test gojenia się ran8, który polega na wykonaniu rysy na monowarstwowej kulturze komórkowej i uchwyceniu obrazów inwazji i migracji komórek w ustalonych odstępach czasu. Technika ta była szeroko krytykowana ze względu na duże różnice między wynikami dwóch kolejnych testów. Jednak zastosowanie nowoczesnych technologii, zwłaszcza w mikroskopii, poprawiło odtwarzalność testu ran drapanych. Mikroskopy wideo można łatwo wprowadzić do inkubatorów i mogą one generować obrazy migracji komórek w czasie rzeczywistym. Urządzenia te rejestrują dane mikroskopowe i zapewniają automatyczną analizę zbiegania się komórek rany w czasie. Celem niniejszego artykułu jest opisanie testu komorowego Boydena i zoptymalizowanego testu ran drapanych, a także omówienie zalet i wad każdego z tych podejść.

<table><tbody><tr><td>Surowica płodu cielęcego Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon rozpuszczalny w wodzie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 100 X</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Mieszanka orzechów (1X) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>Roztwór należy przygotować tuż przed użyciem, ponieważ jest bardzo niestabilny</td></tr><tr><td>Cząstka redlicy Z1</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Olympus&nbsp;</td>Linia komórkowa <td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B</td><td>Prezent od Johna Little' s Laboratoryjny</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>aparat do robienia ran</td><td>Essen Bioscience</td><td>4494</td><td>Przechowywać w bezpiecznym i suchym miejscu</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka ImageLock</td><td>Essen Bioscience</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox 96F z radiatorem CoolSink 96F</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox z systemem M30</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka</td> <td>BoydenDominique Dutcher</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka powlekana Boyden Dominique</td><td>Dutcher</td><td>354483</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Companion 24-dołkowa płytka</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel standard</td><td>BD BioScience</td><td>BD 354234</td><td>Przechowywać w temperaturze -20&stopieC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia RAL 555 Diagnostyka</td><td>RAL</td><td>&nbsp; 361550</td><td>Przechowywać w bezpiecznym i suchym miejscu</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>33511</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą boydena

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Zdolność komórek nowotworowych do inwazji i migracji jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do progresji i nawrotów raka. W wielu badaniach analizowano zdolności migracyjne i inwazyjne, aby zrozumieć, w jaki sposób rozprzestrzeniają się komórki nowotworowe, w celu opracowania nowych strategii leczenia. Analiza komórkowych i molekularnych podstaw tych zdolności doprowadziła do scharakteryzowania ruchliwości komórek oraz właściwości fizykochemicznych cytoszkieletu i mikrośrodowiska komórkowego. Przez wiele lat test z komorą Boydena i test ran drapanych były standardowymi technikami badania inwazji i migracji komórek. Jednak te dwie techniki mają ograniczenia. Test w komorze Boydena jest trudny i czasochłonny, a test rany drapanej ma niską odtwarzalność. Rozwój nowoczesnych technologii, zwłaszcza w mikroskopii, zwiększył powtarzalność testu ran drapanych. Korzystając z wydajnych systemów analizy, mikroskop wideo "w inkubatorze" może być używany do automatycznej analizy migracji i inwazji komórek w czasie rzeczywistym. Celem tego artykułu jest przedstawienie i porównanie dwóch testów stosowanych do badania inwazji i migracji komórek: testu komory Boydena i zoptymalizowanego testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo in vitro.

Opisujemy tutaj dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek. Rysunek 1 przedstawia eksperyment z wykorzystaniem komory Boydena. Wkładki są umieszczone w odpowiadającej im płytce z medium chemoatraktantem, a komórki są wysiewane w CM. Membrana może być niepowlekana (test migracji) lub powlekana (test inwazji). Komórki są wysiewane do górnej komory w s-CM. Dolna komora jest wypełniona CM pełniącym rolę chemoatraktanta. Komórki są utrwalane przed upływe...

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przedstawienie i porównanie dwóch testów stosowanych do badania inwazji i migracji komórek, testu w komorze Boydena oraz zoptymalizowanego testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo in vitro. Eksperymenty te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad inwazją i migracją, takie jak wybór najodpowiedniejszej metody. Główną zaletą tego zoptymalizowanego testu ran rysowych opartego na mikroskopii wideo in vitro jest to, że zapewnia on powtarzalne i precyzyjne porównanie warunków leczenia.Chociaż metoda ta może oceniać migrację i inwazję komórek, może być również stosowana w innych dziedzinach nauki, takich jak leczenie lub regeneracja tkanek. Przygotować komórki SQ20B na 72 godziny przed pierwszym dniem testu, wysiewając dwa razy 10 do 1/6 komórek w 25 mililitrach pożywki hodowlanej w kolbie o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych. Pozwól komórkom rosnąć do 80% konfluencji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pierwszego dnia po trypsynizacji i zliczeniu komórek należy zasiać komórki w kolbie o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych o gęstości komórek sześć razy 10 do 1/5 komórek w trzech mililitrach pożywki hodowlanej dla każdego warunku, który ma być oceniany. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia zagłodzić komórki, zastępując pożywkę w każdej kolbie trzema mililitrami pożywki z surowicą bydlęcą o niskiej zawartości płodu.Zagłodź komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Do testu inwazji przygotuj powlekane komory Boydena 12 godzin po rozpoczęciu głodu komórek. Umieść każdą komorę Boydena w płycie towarzyszącej.Dodaj 500 mikrolitrów pożywki z komórek głodowych do każdej powlekanej komory. Następnego dnia, trzeciego dnia, użyj płytki towarzyszącej, aby przygotować chemoatraktant. Napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki towarzyszącej 750 mikrolitrami kompletnego podłoża z 10% FBS, hydrokortyzonem, penicyliną i streptomycyną.Przenieś górną komorę do wstępnie napełnionej płytki towarzyszącej, uważając, aby nie powstały pęcherzyki. Do testu inwazji ostrożnie usuń 450 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej komory Boydena. Po trypsynizacji i zliczeniu wygłodzonych komórek SQ20B, zasiej trzy razy 10 do 1/4 komórek w 500 mikrolitrach 0,1% pożywki BSA, dając końcowe rozcieńczenie sześć razy 10 do 1/4 komórek na mililitr.Umieść komorę Boydena w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny. Czwartego dnia wyjmij każdą wkładkę z płytki towarzyszącej i ostrożnie usuń komórki z górnej komory za pomocą bawełnianego wacika. Następnie utrwal i zabejcuj każdą wkładkę indywidualnie, aby uzyskać zabarwienie May-Grunwald Giemsa za pomocą zestawu do barwienia zgodnie z instrukcjami producenta.Wykonaj analizę mikroskopową w piątym dniu. Włóż płytkę towarzyszącą z wkładkami do mikroskopu z 20-krotnym kontrastem fazowym i policz każdą migrowaną komórkę w dolnej części membrany. 72 godziny przed pierwszym dniem testu wysiewaj nasiona dwa razy 10 do komórek 1/6 SQ20B w 25 mililitrach pożywki hodowlanej w kolbie o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych i pozwól komórkom wzrosnąć do 80% zbiegu komórek.Pierwszego dnia po trypsynizacji i zliczeniu komórek wygeneruj wstępnie rozcieńczoną próbkę komórek SQ20B o gęstości cztery razy 10 do 1/5 komórek na mililitr. Dozować 100 mikrolitrów roztworu komórkowego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, aby uzyskać końcową gęstość cztery razy 10 dla 1/4 komórek na 100 mikrolitrów w każdym dołku. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól komórkom przylegać do płytki przez 12 do 16 godzin.Następnego dnia zanieś płytkę do maski w celu zranienia za pomocą dostępnego w handlu urządzenia do nawijania. Zdejmij górną część urządzenia do robienia ran i umieść go w roztworze do mycia łodzi. Włóż płytkę do uchwytu płyty podstawy i zdejmij pokrywę płyty.Wymień blok sworzni, prowadząc tylne kołki bloku sworzni do tylnych otworów płyty podstawy. Popchnij i przytrzymaj czarną dźwignię i podnieś blok sworznia, kontynuując przytrzymywanie czarnej dźwigni. Za pomocą pipety z dostosowaną stożkową końcówką natychmiast usuń pożywkę z każdej studzienki, uważając, aby nie dotknąć rany.Umyj komórki, dodając do każdego dołka 100 mikrolitrów pożywki komórkowej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Po drugim płukaniu użyj pipety z dostosowaną stożkową końcówką, aby zassać pożywkę komórkową. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki specyficznej dla każdego warunku leczenia do każdej studzienki, upewniając się, że nie tworzy się żadnych pęcherzyków w studzienkach.Umieść 96-dołkową płytkę w przystosowanym do tego stojaku wideomikroskopu. Korzystając z oprogramowania do mikroskopu wideo, zaprogramuj harmonogram skanowania dla jednego obrazu na studzienkę. W przypadku eksperymentu z inwazją migracyjną wymagany jest maksymalnie dwugodzinny interwał.Jeśli celem eksperymentu jest wyprodukowanie filmu, preferowany jest maksymalny odstęp 30 minut. Monitoruj i sprawdzaj migrację komórek przez co najmniej 24 godziny i do pięciu dni za pomocą odpowiedniej maski komórkowej dostosowanej do każdego typu komórki do analizy migracji komórek. Aby uzyskać maskę komórki dostosowaną do każdej linii komórkowej, wygeneruj definicję przetwarzania komórki z oprogramowania przy użyciu określonego zbioru obrazów komórek.Śledź krzywe i eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, który można wykorzystać do analizy i porównania wyników. Aby przygotować się do testu inwazji komórek, należy zasiać komórki SQ20B w taki sam sposób, jak pokazano w teście migracji komórek, i inkubować 96-dołkową płytkę w inkubatorze. W drugim dniu testu należy przygotować macierz zewnątrzkomórkową.Rozmrażaj matrycę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 12 godzin przed użyciem i upewnij się, że nie widać żadnych kruszyw. Schłodzić probówki do mikrowirówek na lodzie przez pięć minut. Rozcieńczyć matrycę wstępnie schłodzonymi stożkowymi końcówkami do czterech stopni Celsjusza we wstępnie schłodzonych probówkach do mikrowirówek z pożywką komórkową schłodzoną do czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać końcowe stężenie 300 mikrogramów na mililitr.Probówki do mikrowirówek ze wstępnie rozcieńczoną matrycą należy przechowywać w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora. Pod maską należy wykonać ranę za pomocą komercyjnego urządzenia do nawijania zgodnie z protokołem producenta, jak pokazano wcześniej.Użyj pipety z dostosowaną stożkową końcówką, aby natychmiast usunąć pożywkę z każdej studzienki i uważaj, aby nie dotknąć rany. Umyj komórki dwukrotnie za pomocą 100 mikrolitrów pożywki komórkowej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Po drugim umyciu umieść talerz na lodzie na pięć minut, aby wyrównać jego temperaturę.Usuń zimne podłoże z każdej studzienki, uważając, aby ostrożnie pipetować od krawędzi i unikać dotykania rany. Używając stożkowych końcówek wstępnie schłodzonych w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodaj 50 mikrolitrów wstępnie rozcieńczonej matrycy do każdej studzienki. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut.Po 30 minutach dodać 100 mikrolitrów dostosowanej pożywki komórkowej do każdego dołka, zgodnie ze wskazaniami dla każdego warunku leczenia. Umieść płytkę w odpowiednim stojaku w mikroskopie wideo. Następnie zaprogramuj skany i przeprowadź analizę wideomikroskopową, jak pokazano w teście migracji komórek.Przedstawiono reprezentatywne wyniki błony Boydena po utrwaleniu komórek. Nieoptymalna błona ma skupiska komórek w górnej części błony i nieinterpretowalne wyniki. Natomiast optymalna błona ma policzalne komórki w dolnej części błony zabarwione na niebiesko.Optymalny wynik testu ran drapanych ilustrują te obrazy gojenia się ran po godzinie zero, 15 godzinach i 30 godzinach. Kryteriami jakości eksperymentu są: rana liniowa, brak fragmentów komórek obserwowanych w ranie i optymalna konfluencja komórek. 90% konfluencja to optymalna gęstość komórek do testu gojenia się ran, jak pokazano w panelu A.Panel C pokazuje przykład niskiej gęstości komórek, a panel B pokazuje klastry komórek spowodowane niewystarczającym myciem osadu komórkowego.To graficzne przedstawienie gojenia się ran uzyskane za pomocą oprogramowania mikroskopu wideo pokazuje ilościowe określenie parametrów zbiegania komórek rany w zależności od czasu dla czterech warunków leczenia. Zaobserwowano, że leczenie skojarzone znacznie zmniejsza migrację komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać proces migracji i inwazji komórek.

evaluation-cell-invasion-migration-process-comparison-video

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii niektórych chorób i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej. Poniższy protokół opisuje techniki oceny migracji komórek, które zostały dostosowane do badania EWG.

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.

Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

Tutaj opisujemy procedurę testowania migracji komórek in vitro za pomocą automatycznego mikroskopu optycznego. Test zarysowania jest szeroko stosowany, w którym zamknięcie rysy następuje przez określony czas. Mikroskop optyczny umożliwia niezawodne i tanie wykrywanie migracji komórek.

Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Przedstawiamy opłacalną metodę do testu migracji od razu, która zapewnia nowe podejście do określania migracji komórek bez użycia metod intensywnie wykorzystujących sprzęt. Chociaż w tym protokole wykorzystano fibroblasty, można go dostosować i wykorzystać do badania dodatkowych typów komórek i wpływu na migrację komórek.

Ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Poznaj metody oceny inwazji i migracji komórek: test komory Boydena oraz zoptymalizowany test ran drapanych z użyciem mikroskopii wideo. Porównaj ich zalety i ograniczenia w badaniach nad komórkami SQ20B.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Przeglądaj więcej filmów