Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przedstawienie i porównanie dwóch testów stosowanych do badania inwazji i migracji komórek, testu w komorze Boydena oraz zoptymalizowanego testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo in vitro. Eksperymenty te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad inwazją i migracją, takie jak wybór najodpowiedniejszej metody. Główną zaletą tego zoptymalizowanego testu ran rysowych opartego na mikroskopii wideo in vitro jest to, że zapewnia on powtarzalne i precyzyjne porównanie warunków leczenia.

Chociaż metoda ta może oceniać migrację i inwazję komórek, może być również stosowana w innych dziedzinach nauki, takich jak leczenie lub regeneracja tkanek. Przygotować komórki SQ20B na 72 godziny przed pierwszym dniem testu, wysiewając dwa razy 10 do 1/6 komórek w 25 mililitrach pożywki hodowlanej w kolbie o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych. Pozwól komórkom rosnąć do 80% konfluencji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pierwszego dnia po trypsynizacji i zliczeniu komórek należy zasiać komórki w kolbie o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych o gęstości komórek sześć razy 10 do 1/5 komórek w trzech mililitrach pożywki hodowlanej dla każdego warunku, który ma być oceniany. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia zagłodzić komórki, zastępując pożywkę w każdej kolbie trzema mililitrami pożywki z surowicą bydlęcą o niskiej zawartości płodu.

Zagłodź komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Do testu inwazji przygotuj powlekane komory Boydena 12 godzin po rozpoczęciu głodu komórek. Umieść każdą komorę Boydena w płycie towarzyszącej.

Dodaj 500 mikrolitrów pożywki z komórek głodowych do każdej powlekanej komory. Następnego dnia, trzeciego dnia, użyj płytki towarzyszącej, aby przygotować chemoatraktant. Napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki towarzyszącej 750 mikrolitrami kompletnego podłoża z 10% FBS, hydrokortyzonem, penicyliną i streptomycyną.

Przenieś górną komorę do wstępnie napełnionej płytki towarzyszącej, uważając, aby nie powstały pęcherzyki. Do testu inwazji ostrożnie usuń 450 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej komory Boydena. Po trypsynizacji i zliczeniu wygłodzonych komórek SQ20B, zasiej trzy razy 10 do 1/4 komórek w 500 mikrolitrach 0,1% pożywki BSA, dając końcowe rozcieńczenie sześć razy 10 do 1/4 komórek na mililitr.

Umieść komorę Boydena w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny. Czwartego dnia wyjmij każdą wkładkę z płytki towarzyszącej i ostrożnie usuń komórki z górnej komory za pomocą bawełnianego wacika. Następnie utrwal i zabejcuj każdą wkładkę indywidualnie, aby uzyskać zabarwienie May-Grunwald Giemsa za pomocą zestawu do barwienia zgodnie z instrukcjami producenta.

Wykonaj analizę mikroskopową w piątym dniu. Włóż płytkę towarzyszącą z wkładkami do mikroskopu z 20-krotnym kontrastem fazowym i policz każdą migrowaną komórkę w dolnej części membrany. 72 godziny przed pierwszym dniem testu wysiewaj nasiona dwa razy 10 do komórek 1/6 SQ20B w 25 mililitrach pożywki hodowlanej w kolbie o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych i pozwól komórkom wzrosnąć do 80% zbiegu komórek.

Pierwszego dnia po trypsynizacji i zliczeniu komórek wygeneruj wstępnie rozcieńczoną próbkę komórek SQ20B o gęstości cztery razy 10 do 1/5 komórek na mililitr. Dozować 100 mikrolitrów roztworu komórkowego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, aby uzyskać końcową gęstość cztery razy 10 dla 1/4 komórek na 100 mikrolitrów w każdym dołku. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól komórkom przylegać do płytki przez 12 do 16 godzin.

Następnego dnia zanieś płytkę do maski w celu zranienia za pomocą dostępnego w handlu urządzenia do nawijania. Zdejmij górną część urządzenia do robienia ran i umieść go w roztworze do mycia łodzi. Włóż płytkę do uchwytu płyty podstawy i zdejmij pokrywę płyty.

Wymień blok sworzni, prowadząc tylne kołki bloku sworzni do tylnych otworów płyty podstawy. Popchnij i przytrzymaj czarną dźwignię i podnieś blok sworznia, kontynuując przytrzymywanie czarnej dźwigni. Za pomocą pipety z dostosowaną stożkową końcówką natychmiast usuń pożywkę z każdej studzienki, uważając, aby nie dotknąć rany.

Umyj komórki, dodając do każdego dołka 100 mikrolitrów pożywki komórkowej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Po drugim płukaniu użyj pipety z dostosowaną stożkową końcówką, aby zassać pożywkę komórkową. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki specyficznej dla każdego warunku leczenia do każdej studzienki, upewniając się, że nie tworzy się żadnych pęcherzyków w studzienkach.

Umieść 96-dołkową płytkę w przystosowanym do tego stojaku wideomikroskopu. Korzystając z oprogramowania do mikroskopu wideo, zaprogramuj harmonogram skanowania dla jednego obrazu na studzienkę. W przypadku eksperymentu z inwazją migracyjną wymagany jest maksymalnie dwugodzinny interwał.

Jeśli celem eksperymentu jest wyprodukowanie filmu, preferowany jest maksymalny odstęp 30 minut. Monitoruj i sprawdzaj migrację komórek przez co najmniej 24 godziny i do pięciu dni za pomocą odpowiedniej maski komórkowej dostosowanej do każdego typu komórki do analizy migracji komórek. Aby uzyskać maskę komórki dostosowaną do każdej linii komórkowej, wygeneruj definicję przetwarzania komórki z oprogramowania przy użyciu określonego zbioru obrazów komórek.

Śledź krzywe i eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, który można wykorzystać do analizy i porównania wyników. Aby przygotować się do testu inwazji komórek, należy zasiać komórki SQ20B w taki sam sposób, jak pokazano w teście migracji komórek, i inkubować 96-dołkową płytkę w inkubatorze. W drugim dniu testu należy przygotować macierz zewnątrzkomórkową.

Rozmrażaj matrycę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 12 godzin przed użyciem i upewnij się, że nie widać żadnych kruszyw. Schłodzić probówki do mikrowirówek na lodzie przez pięć minut. Rozcieńczyć matrycę wstępnie schłodzonymi stożkowymi końcówkami do czterech stopni Celsjusza we wstępnie schłodzonych probówkach do mikrowirówek z pożywką komórkową schłodzoną do czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać końcowe stężenie 300 mikrogramów na mililitr.

Probówki do mikrowirówek ze wstępnie rozcieńczoną matrycą należy przechowywać w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora. Pod maską należy wykonać ranę za pomocą komercyjnego urządzenia do nawijania zgodnie z protokołem producenta, jak pokazano wcześniej.

Użyj pipety z dostosowaną stożkową końcówką, aby natychmiast usunąć pożywkę z każdej studzienki i uważaj, aby nie dotknąć rany. Umyj komórki dwukrotnie za pomocą 100 mikrolitrów pożywki komórkowej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Po drugim umyciu umieść talerz na lodzie na pięć minut, aby wyrównać jego temperaturę.

Usuń zimne podłoże z każdej studzienki, uważając, aby ostrożnie pipetować od krawędzi i unikać dotykania rany. Używając stożkowych końcówek wstępnie schłodzonych w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodaj 50 mikrolitrów wstępnie rozcieńczonej matrycy do każdej studzienki. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut.

Po 30 minutach dodać 100 mikrolitrów dostosowanej pożywki komórkowej do każdego dołka, zgodnie ze wskazaniami dla każdego warunku leczenia. Umieść płytkę w odpowiednim stojaku w mikroskopie wideo. Następnie zaprogramuj skany i przeprowadź analizę wideomikroskopową, jak pokazano w teście migracji komórek.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki błony Boydena po utrwaleniu komórek. Nieoptymalna błona ma skupiska komórek w górnej części błony i nieinterpretowalne wyniki. Natomiast optymalna błona ma policzalne komórki w dolnej części błony zabarwione na niebiesko.

Optymalny wynik testu ran drapanych ilustrują te obrazy gojenia się ran po godzinie zero, 15 godzinach i 30 godzinach. Kryteriami jakości eksperymentu są: rana liniowa, brak fragmentów komórek obserwowanych w ranie i optymalna konfluencja komórek. 90% konfluencja to optymalna gęstość komórek do testu gojenia się ran, jak pokazano w panelu A.Panel C pokazuje przykład niskiej gęstości komórek, a panel B pokazuje klastry komórek spowodowane niewystarczającym myciem osadu komórkowego.

To graficzne przedstawienie gojenia się ran uzyskane za pomocą oprogramowania mikroskopu wideo pokazuje ilościowe określenie parametrów zbiegania komórek rany w zależności od czasu dla czterech warunków leczenia. Zaobserwowano, że leczenie skojarzone znacznie zmniejsza migrację komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać proces migracji i inwazji komórek.