Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie opartego na wektorze wirusowym modelu zwierzęcego choroby Parkinsona poprzez wstrzyknięcie stereotaktyczne do ośrodkowego układu nerwowego. Metoda ta może być wykorzystana do opracowania normalnych modeli zwierzęcych, które pozwalają na przedkliniczne testowanie leków i mogą być korzystne w badaniu mechanizmu molekularnego choroby Parkinsona, a także wielu innych zaburzeń neurodegeneracyjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że może być ona stosowana do specyficznego celowania w regiony mózgu.

Można osiągnąć wysoką ekspresję mózgu i wykorzystać ją do tworzenia modeli zwierzęcych w określonych szczepach i gatunkach zwierząt. Opracowano różne końcowe systemy wektorowe. Wybór systemu wektorów zależy od wielkości wykopu, który chcesz wyrazić, czasu trwania ekspresji genów, dźwięków, które chcesz zwalczać, oraz kwestii bezpieczeństwa biologicznego.

Procedurę zademonstruje Annelies Aertgeerts, technik z naszego laboratorium. Zacznij od odpowiedniego znieczulenia ośmiotygodniowej samicy szczura rasy Wistar zgodnie z zatwierdzonymi protokołami. Sprawdź, czy osiągnięto chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, ściskając każdą łapę i zauważając brak odruchu wycofania.

Następnie użyj implantatora MicroTransponder, aby umieścić MicroTransponder na grzbiecie szczura. Sprawdź, czy MicroTransponder jest prawidłowo ustawiony i czy można uzyskać odczyt. Teraz obetnij włosy na skórze głowy szczura i nałóż znieczulenie miejscowe na skórę głowy i uszy.

Przenieś szczura do okapu z przepływem laminarnym i wykonaj resztę procedury przy użyciu techniki aseptycznej. Umieść szczura w ramce stereotaktycznej, zabezpieczając nauszniki, a następnie pasek na usta i nos. Przykryj ciało szczura papierowym kocem, aby uniknąć spadku temperatury ciała.

Zastosuj lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Następnie zdezynfekuj skórę głowy zgodnie z zatwierdzonymi procedurami. Stosuje się tutaj jeden procent jodu w 70% izopropylu.

Po wykonaniu małego nacięcia w środkowej linii skóry głowy delikatnie zeskrob błony na czaszce i spłucz solą fizjologiczną. Po pozostawieniu czaszki do wyschnięcia upewnij się, że bregma i lambda są wyraźnie widoczne. Teraz napełnij strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 10 mikrolitrów i średnicy 30 i średnicy 20 milimetrów rekombinowanym AAV i umieść ją na zmotoryzowanej pompie do mikroiniekcji podłączonej do instrumentu stereotaktycznego.

W przypadku specyficznej transakcji neuronów dopaminergicznych istoty czarnej, rekombinowane wektory AV są pierwszym wyborem ze względu na ich wysokie miana i skuteczność transdukcji neuronów dopaminergicznych. Przetestuj przepływ, uwalniając kroplę AAV. Uwolniony AAV należy wyrzucić do wielowartościowego detergentu czyszczącego.

Sprawdź wzrokowo, czy głowica jest zamocowana prosto w ramie głowicy. Następnie sprawdź, czy czaszka jest płaska, najpierw przesuwając końcówkę igły do bregmy i mierząc wysokość w tym miejscu, opuszczając końcówkę igły w kierunku grzbietowo-brzusznym, aż dotknie czaszki. Powtórz procedurę przy lambdzie.

Po powrocie igły do bregmy, przesunąć igłę w kierunku przednim, tylnym i przyśrodkowym bocznym do współrzędnych stereotaktycznych do mikroiniekcji. Zapisz współrzędne. W miejscu wstrzyknięcia należy zmierzyć wysokość czaszki jak poprzednio i upewnić się, że nie różni się ona o więcej niż 0,3 mm od wysokości bregmy.

Następnie ostrożnie wywierć dwumilimetrowy otwór w czaszce. Po wywierceniu otworu zmierz wysokość opony twardej, aby określić odniesienie, z którego należy zastosować współrzędną grzbietowo-brzuszną. Przebić oponę twardą za pomocą igły o rozmiarze 26.

Wchłonąć krew ze sterylną tkanką i kontynuować dopiero po ustaniu krwawienia. Teraz powoli opuść igłę wstępnie załadowanej strzykawki do mikroiniekcji do mózgu do współrzędnej grzbietowo-brzusznej. I zatrzymaj się na minutę.

Następnie wstrzyknij trzy mikrolitry AAV w tempie 0,25 mikrolitra na minutę. Po wstrzyknięciu należy pozostawić igłę na miejscu przez kolejne pięć minut, aby zapobiec cofaniu się wzdłuż ścieżki igły, a następnie należy ją powoli wyjąć. Zszyj skórę głowy za pomocą kodowanego plecionego poliestru 3.0 i zdezynfekuj skórę jednym procentem jodu i 70% izopropylu.

Aby poluzować pasek na nos i usta, a następnie dwa nauszniki, delikatnie wyjmij zwierzę z instrumentu stereotaktycznego. W tym czasie podaj środek przeciwbólowy, a jeśli to konieczne, środek odwracający znieczulenie. Następnie umieść szczura w czystej klatce na płycie grzewczej ustawionej na 38 stopni Celsjusza i uważnie monitoruj, aż się obudzi.

Po operacji kinetykę neurodegeneracji można badać u całego zwierzęcia za pomocą testów behawioralnych i obrazowania PET, a po uśmierceniu przy użyciu technik immunohistochemicznych. Test cylindryczny w celu oceny spontanicznego używania kończyn przednich przeprowadzono w różnych punktach czasowych po mikrowstrzyknięciu rekombinowanego AAV eksprymującego mutację A53T alfa synukleiny do istoty czarnej. Po trzech tygodniach od wstrzyknięcia obserwowano znaczne upośledzenie motoryczne u szczurów, które otrzymywały medianę dawki.

Po czterech tygodniach od wstrzyknięcia zaobserwowano 50% zmniejszenie spontanicznego użycia przedniej łapy po lewej stronie. Natomiast zwierzęta kontrolne, którym wstrzyknięto eGFP, nie wykazywały asymetrii w użytkowaniu przedniej łapy. Szczury, które otrzymały większą dawkę rekombinowanej alfa synukleiny AAV 2 / 7A53T, wykazywały bardziej wyraźne upośledzenie używania przedniej łapy po 29 dniach od wstrzyknięcia.

Aby udowodnić, że obserwowane upośledzenie motoryczne jest zależne od dopaminy, podano pojedynczą dawkę L-doba. Gdy test cylindryczny powtórzono 45 minut po leczeniu L-dopą, zaobserwowano pełne przywrócenie używania przedniej łapy u zwierząt, którym wstrzyknięto rekombinowaną alfa synukleinę AAV 2 / 7A53T. Aby nieinwazyjnie śledzić kinetykę neurodegeneracji dopaminergicznej nigrostriatalnej w czasie, u poszczególnych zwierząt wiązanie transportowane dopaminą określono ilościowo za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej małych zwierząt z F-18FECT jako radioligandem.

Wiązanie DAT znacznie zmniejszyło się w ipsilateralnym budimanie ogoniastym rekombinowanych szczurów, którym wstrzyknięto z czasem alfa synukleinę AAV 2 / 7A53T. Po 32 dniach zaobserwowano zmniejszenie wiązania DAT nawet o 85%. Jako kontrola pozytywna, wstrzyknięcie neurotoksyny 6 OHDA do SN spowodowało 90% utratę wiązania DAT w ciągu siedmiu dni.

Wycinki mózgu szczurów, którym wstrzyknięto mikrorekombinowaną alfa synukleinę AAV 2 / 7A53T z biegiem czasu, były barwione immunologicznie na obecność hydroksylazy tyrozyny, markera neuronów dopaminergicznych. Liczba ta pokazuje postępującą utratę neuronów dopaminergicznych w ciągu 29 dni po mikroiniekcji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 45 minut.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby używać wysokiej jakości końcowych dopasowań wektorowych. Po tej procedurze można wykonać inne techniki, takie jak nieinwazyjne obrazowanie PET, analiza zachowania i analiza immunohistochemiczna w celu określenia poziomu neurodegeneracji i neuropatologii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak wykonać wstrzyknięcie wektora wirusowego do istoty czarnej w celu opracowania modeli zwierzęcych opartych na wektorach wirusowych dla choroby Parkinsona.

Nie zapominaj, że praca z wektorami wirusowymi może być niebezpieczna i że zgodnie z tą procedurą należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca przy przepływie laminarnym i odpowiednie odkażanie odpadów.