Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie modelu zwierzęcego choroby Parkinsona opartego na wektorze wirusowym poprzez wstrzykiwanie stereotaktyczne do ośrodkowego układu nerwowego. Metoda ta może być wykorzystana do opracowania standardowych modeli zwierzęcych umożliwiających przedkliniczne testowanie leków i może być pomocna w badaniu mechanizmów molekularnych choroby Parkinsona, a także wielu innych schorzeń neurodegeneracyjnych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość precyzyjnego celowania w konkretne obszary mózgu.

Można uzyskać wysoką ekspresję transgenu w mózgu, co pozwala na tworzenie modeli zwierzęcych u konkretnych szczepów i gatunków zwierząt. Opracowano różne końcowe systemy wektorowe. Wybór systemu wektora zależy od wielkości transgenu, którego ekspresję chcemy uzyskać, czasu trwania ekspresji genów, docelowych komórek oraz kwestii bezpieczeństwa biologicznego.

Procedurę zaprezentuje Annelies Aertgeerts, technik z naszego laboratorium. Rozpocznij od prawidłowego znieczulenia ośmiotygodniowej samicy szczura Wistar zgodnie z zatwierdzonymi protokołami. Sprawdź, czy osiągnięto poziom znieczulenia chirurgicznego, uciskając każdą łapę i stwierdzając brak odruchu cofania.

Następnie, użyj implantera MicroTransponder, aby umieścić nadajnik MicroTransponder na grzbiecie szczura. Sprawdź, czy MicroTransponder jest umieszczony prawidłowo i czy można uzyskać odczyt. Teraz zgoleń sierść na skórze głowy szczura i zastosuj znieczulenie miejscowe na skórę głowy oraz uszy.

Przenieś szczura do komory z laminarnym przepływem powietrza i wykonaj resztę procedury, stosując technikę aseptyczną. Umieść szczura w ramie stereotaksycznej, mocując najpierw pręty uszne, a następnie pręt ustno-nosowy. Przykryj ciało szczura papierowym kocem, aby zapobiec spadkowi temperatury ciała.

Nanieś smar do oczu, aby zapobiec ich wysuszeniu. Następnie zdezynfekuj skórę głowy zgodnie z zatwierdzonymi procedurami. W tym przypadku zastosowano 1% jod w 70% izopropanolu.

Po wykonaniu niewielkiego nacięcia w linii środkowej skóry głowy, delikatnie zeskrob błony z czaszki i wypłucz solą fizjologiczną. Po wyschnięciu czaszki upewnij się, że bregma i lambda są wyraźnie widoczne. Następnie napełnij strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 10 µL (rozmiar igły 30 gauge, długość 20 mm) rekombinowanym AAV i umieść ją w zmotoryzowanej pompie do mikroiniekcji połączonej z aparatem stereotaksycznym.

Do specyficznej transdukcji neuronów dopaminergicznych istoty czarnej pierwszym wyborem są rekombinowane wektory AV, ze względu na ich wysokie miana oraz wydajność w transdukcji neuronów dopaminergicznych. Sprawdź przepływ, uwalniając kroplę AAV. Wszelki uwolniony AAV należy zutylizować przy użyciu wielowartościowego detergentu czyszczącego.

Wizualnie sprawdź, czy głowa jest zamocowana prosto w uchwycie głowy. Następnie sprawdź, czy czaszka jest wypoziomowana, przesuwając najpierw końcówkę igły do punktu bregma i mierząc wysokość w tym miejscu poprzez obniżanie końcówki igły w kierunku grzbietowo-brzusznym, aż dotknie ona czaszki. Powtórz tę procedurę w punkcie lambda.

Po powrocie igły do punktu bregma, przesuń ją w kierunku przednio-tylnym oraz przyśrodkowo-bocznym do współrzędnych stereotaktycznych przeznaczonych do mikroiniekcji. Zapisz współrzędne. W miejscu iniekcji zmierz wysokość czaszki tak jak wcześniej i upewnij się, że nie różni się ona o więcej niż 0.3mm od wysokości punktu bregma.

Następnie ostrożnie wywierć w czaszce otwór o średnicy 2 mm. Po wywierceniu otworu zmierz wysokość opony twardej, aby wyznaczyć punkt odniesienia do naniesienia współrzędnej grzbietowo-brzusznej. Przebij oponę twardą za pomocą igły 26G.

Wchłoń wszelką krew za pomocą sterylnej chusteczki i kontynuuj procedurę dopiero po całkowitym ustąpieniu krwawienia. Następnie powoli opuść igłę napełnionej strzykawki do mikroiniekcji do mózgu, osiągając odpowiednią współrzędną grzbietowo-brzuszną. Odczekaj jedną minutę.

Następnie wstrzyknij 3 µL AAV z prędkością 0,25 µL na minutę. Po wstrzyknięciu pozostaw igłę w tym samym miejscu przez kolejne pięć minut, aby zapobiec cofaniu się preparatu wzdłuż toru igły, a następnie powoli ją wyjmij. Zaszyj skórę głowy za pomocą plecionej nici poliestrowej 3.0 i zdezynfekuj skórę 1% jodkiem oraz 70% izopropanolem.

Należy poluzować poprzeczkę nosowo-ustną, a następnie dwie poprzeczki uszne, aby delikatnie wyjąć zwierzę z instrumentu stereotaktycznego. W tym momencie należy podać leki przeciwbólowe, a w razie potrzeby środek odwracający działanie anestetyku. Następnie szczura należy umieścić w czystej klatce na płycie grzewczej ustawionej na 38 °C i uważnie monitorować go aż do pełnego wybudzenia.

Po operacji kinetykę neurodegeneracji można badać w całym organizmie zwierzęcia za pomocą testów behawioralnych i obrazowania PET, a po uśmierceniu zwierzęcia – stosując techniki immunohistochemiczne. Test cylindra, służący do oceny spontanicznego wykorzystania przedniej kończyny, przeprowadzono w różnych odstępach czasu po mikroiniekcji rekombinowanego AAV wykazującego mutację A53T alfa-synukleiny do istoty czarnej. Od trzeciego tygodnia po iniekcji stwierdzono istotne zaburzenia motoryczne u szczurów, które otrzymały dawkę średnią.

Cztery tygodnie po wstrzyknięciu zaobserwowano 50% spadek spontanicznego używania przeciwległej przedniej łapy. Natomiast u zwierząt kontrolnych po wstrzyknięciu eGFP nie stwierdzono asymetrii w używaniu przedniej łapy. Szczury, które otrzymały wyższą dawkę rekombinowanego AAV 2/7A53T alpha synuclein, wykazały bardziej wyraźne upośledzenie używania przedniej łapy w 29. dniu po wstrzyknięciu.

Aby udowodnić, że zaobserwowany upośledzenie funkcji motorycznych było zależne od dopaminy, podano pojedynczą dawkę L-dopy. Po powtórzeniu testu cylindra 45 minut po podaniu L-dopy, u zwierząt, którym wstrzyknięto rekombinowany AAV 2/7A53T alpha synuclein, zaobserwowano pełny powrót funkcji przedniej łapy. W celu nieinwazyjnego śledzenia kinetyki nigrostriatalnej neurodegeneracji dopaminergicznej w czasie u poszczególnych zwierząt, ilościowo określono wiązanie transportera dopaminy, wykorzystując pozytonową tomografię emisyjną dla małych zwierząt z F-18FECT jako radioligandem.

Wiązanie DAT uległo znacznemu zmniejszeniu w obrębie ipsilateralnego jądra ogoniastego szczurów, którym wstrzyknięto rekombinowany AAV 2/7A53T alfa-synukleina, wraz z upływem czasu. Po 32 dniach zaobserwowano spadek wiązania DAT sięgający 85%. Jako kontrolę pozytywną zastosowano wstrzyknięcie neurotoksyny 6 OHDA do SN, co wywołało 90% utratę wiązania DAT w ciągu siedmiu dni.

Przekroje mózgu szczurów, którym w określonych odstępach czasu wstrzyknięto mikrostrzykawką rekombinowany AAV 2/7A53T alfa-synukleinę, poddano immunostaining pod kątem hydroksylazy tyrozynowej, która jest markerem neuronów dopaminergicznych. Rysunek ten obrazuje postępującą utratę neuronów dopaminergicznych w okresie 29 dni po mikroiniekcji. Po opanowaniu technika ta może być wykonana w 45 minut.

Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zastosowanie wysokiej jakości dopasowanych wektorów końcowych. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne techniki, takie jak nieinwazyjne obrazowanie PET, analiza behawioralna oraz analiza immunohistochemiczna, aby określić stopień neurodegeneracji i neuropatologii. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak wykonać iniekcję wektora wirusowego do istoty czarnej w celu opracowania modeli zwierzęcych choroby Parkinsona opartych na wektorach wirusowych.

Należy pamiętać, że praca z wektorami wirusowymi może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w komorze z laminarnym przepływem powietrza oraz właściwa dekontaminacja odpadów.