Name: Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę stereotaktycznego wstrzyknięcia wektorów wirusowych do istoty czarnej u szczurów w celu opracowania modelu choroby Parkinsona. Technika umożliwia precyzyjne dostarczanie genów i badanie mechanizmów neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Jorisowi Van Asselberghsowi i Ann Van Santvoort za doskonałą pomoc techniczną. Badania były finansowane przez IWT-Vlaanderen (IWT SBO/80020), FWO Vlaanderen (G.0768.10), przez program EC-PR6 "DiMI" (LSHB-CT-2005-512146), projekt MEFOPA (HEALTH-2009-241791), program 7PR "INMiND" (HEALTH-F2-2011-278850), KU Leuven (IOF-KP/07/001, OT/08/052A, IMIR PF/10/017) oraz MJFox Foundation (walidacja celu 2010). A. Van der Perren i C. Casteels są adiunktami Flamandzkiego Funduszu Badań Naukowych. K. Van Laere jest starszym pracownikiem klinicznym Flamandzkiego Funduszu Badań Naukowych.

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EWG) i zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną Uniwersytetu w Leuven (Belgia).
1. Produkcja i oczyszczanie rekombinowanego AAV
Uwaga: produkcja i oczyszczanie wektora rAAV zostało przeprowadzone przez Leuven Viral Vector Core (LVVC), jak opisano wcześniej17.
<ol>
	<li>Krótko mówiąc, transfekcyjne subkonfluentne komórki HEK 293T o niskim (<50) pasażowaniu przy użyciu liniowego roztworu transfekcji NaCl z polietylenu o masie 25 kD i 150 nM i trzech różnych plazmidów w stosunku 1:1:1 w pożywce DMEM 2% płodowej surowicy bydlęcej. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C w 5% CO2 należy zastąpić pożywkę świeżą pożywką DMEM 2% płodowej surowicy bydlęcej. 
	Uwaga: Plazmidy obejmują konstrukty serotypu AAV7, plazmid transferowy AAV kodujący ludzkiego mutanta A53T α-SYN pod kontrolą promotora synapsyny wzmocnionej CMVie i plazmidu pomocniczego adenowirusa pAdvDeltaF617.</li>
	<li>Zebrać pożywkę 5 dni po transfekcji przejściowej i zagęścić za pomocą filtracji o przepływie stycznym17.</li>
	<li>Oczyść cząstki wektora rAAV ze stężonego podłoża za pomocą gradientu krokowego jodiksanolu17.</li>
	<li>Używaj standardowych technik PCR w czasie rzeczywistym do oznaczania kopii genomu (GC). W tym protokole miano wektora 3,0 E11 GC/ml wykorzystano do opracowania modelu szczurzego PD17 opartego na α-SYN.</li>
</ol>
2. Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora rAAV α-SYN w SN szczura (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Trzymaj ośmiotygodniowe samice szczurów rasy Wistar o wadze około 200-250 g w normalnym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do granulowanego pokarmu i wody z kranu.</li>
	<li>Poddać szczura znieczuleniu dootrzewnowemu (i.p.) zawierającemu mieszaninę ketaminy (60 mg/kg) i medetomidyny (0,4 mg/kg). Gdy szczur jest znieczulony i nie reaguje na ściskanie różnych łap, podaj mikrotransponder podskórnie na grzbiecie szczura w celu dalszego rozpoznania za pomocą implantatora mikrotranspondera. Sprawdź, czy mikrotransponder jest prawidłowo ustawiony i czy może być odczytany przez urządzenie odczytujące.</li>
	<li>Obetnij włosy na skórze głowy. Nałóż znieczulenie miejscowe zarówno na skórę głowy, jak i uszy. Resztę zabiegu chirurgicznego należy wykonać przy przepływie laminarnym przy użyciu technik aseptycznych.</li>
	<li>Umieść szczury w stereotaktycznej ramie głowy za pomocą dwóch nauszników, ust i nosa. Przykryj ciało szczura papierowym kocem, aby uniknąć spadku temperatury ciała. Zastosuj lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę głowy jodem 1% w izopropanolu 70% i wykonaj małe nacięcie w linii środkowej skóry głowy. Delikatnie zeskrob błony na czaszce i spłucz solą fizjologiczną. Pozostaw czaszkę do wyschnięcia na kilka minut. Obserwuj szwy czaszkowe i dwa punkty odniesienia: Bregma i Lambda.</li>
	<li>Aby wprowadzić wektor rAAV do SN, zdefiniuj współrzędne w kierunku Bregmy (przednio-tylne: 5,3 mm; przyśrodkowo-boczne: 2,0 mm i grzbietowo-brzuszne: 7,2 mm liczone od opony twardej). 
	Uwaga: Trójwymiarowe współrzędne dla każdego obszaru zainteresowania można obliczyć za pomocą stereotaktycznego atlasu mózgu szczura, stosując Bregmę jako anatomiczny punkt odniesienia.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 10 μl (rozmiar 30 20 mm) wektorem rAAV i umieść ją w przyrządzie stereotaktycznym połączonym z pompą do mikroiniekcji z napędem. Kontroluj objętość, uwalniając kroplę wektora i wyeliminuj w wielowartościowym detergencie czyszczącym pH 9 (np. RBS).</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo, czy głowica jest zamocowana prosto w ramie głowicy i oceń oś lewo-prawo. Dokładnie określ wizualnie współrzędne przednio-tylne i przyśrodkowe dla Bregmy i Lambdy i zmierz ich wysokość za pomocą igły o rozmiarze 30 i średnicy 20 mm w grzbietowo-brzusznym ramieniu ramy stereotaktycznej.
	<ol>
		<li>Dopuszczaj maksymalnie 0,3 mm różnicy wysokości między Bregmą a Lambdą. Umieść igłę z powrotem na Bregmie i zastosuj współrzędne przednio-tylne i przyśrodkowe, przesuwając przednio-tylne i przyśrodkowe ramię ramy stereotaktycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W miejscu wstrzyknięcia należy zmierzyć wysokość czaszki i upewnić się, że nie różni się ona o więcej niż 0,3 mm od wysokości leku Bregma. Wywierć otwór w czaszce o średnicy około 2 mm. Zmierz wysokość opony twardej, posłuży to jako odniesienie do zastosowania współrzędnej grzbietowo-brzusznej. Alternatywnie odejmij ustaloną grubość czaszki (0,9 mm).</li>
	<li>Przeniknąć do opony twardej za pomocą igły o rozmiarze 26 i wchłonąć krew za pomocą sterylnej tkanki. Poczekaj, aż całe krwawienie ustanie, zanim przejdziesz dalej.</li>
	<li>Powoli wprowadzić strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 10 μl z roztworem wektorowym do mózgu na wcześniej ustaloną głębokość (współrzędna grzbietowo-brzuszna). Odczekaj 1 minutę z włożoną igłą. Wstrzyknąć 3 μl roztworu wektora (3,0 kopii genomu E11/ml (średnia dawka wektora) lub 1,0 E12 GC/ml (wysoka dawka wektorowa) wektora kontrolnego rAAV2/7 α-SYN lub eGFP) za pomocą zmotoryzowanej pompy do mikroiniekcji o przepustowości 0,25 μl/min.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy przytrzymać igłę na miejscu przez kolejne 5 minut, a następnie powoli ją wyjąć. Zszyj skórę głowy za pomocą powlekanego plecionego poliestru 3.0, zdezynfekuj 1% jodem w 70% izopropanolu i delikatnie wyjmij zwierzę z instrumentu stereotaktycznego. Najpierw poluzuj pasek na nos i usta, a następnie dwa nauszniki.</li>
	<li>Aby odwrócić znieczulenie, wstrzyknąć szczurowi dootrzewnowo 0,5 mg/kg atipamezolu i umieścić szczura w czystej klatce na płycie grzewczej o temperaturze 38 °C, aż się obudzi. Przykryj szczura papierowym kocem, aby zapobiec spadkowi temperatury ciała.</li>
	<li>Zapewnij łatwy dostęp do jedzenia i wody przez pierwsze godziny. Monitoruj szczura przez pierwsze kilka dni. W razie potrzeby zastosuj analgesia. 
	Uwaga: Nie ma potrzeby zdejmowania szwów z czaszki. Po 1-2 tygodniach czaszka jest całkowicie naprawiona, a szwy się poluzowują.</li>
</ol>
3. Ocena szczurów, którym wstrzyknięto rAAV2/7 α-SYN za pomocą nieinwazyjnego obrazowania PET, testów behawioralnych i analizy immunohistochemicznej
<ol>
	<li>Aby śledzić kinetykę nigrostriatalnej neurodegeneracji dopaminergicznej nieinwazyjnie w czasie u poszczególnych zwierząt, należy określić ilościowo wiązanie transportera dopaminy (DAT) za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) u małych zwierząt i znacznika transportera DA, np. [18F]-FECT16.</li>
	<li>Aby zbadać, czy poziom neurodegeneracji dopaminergicznej jest wystarczający do wywołania upośledzenia motorycznego u szczurów, należy poddać szczury testowi cylindrycznemu w celu oceny spontanicznego używania kończyn przednich.
	<ol>
		<li>Umieść szczura w cylindrze z przezroczystego szkła o szerokości 20 cm i nagraj zachowanie podczas pionowych ruchów wzdłuż ściany i lądowania za tyłem. Oceń liczbę kontaktów wykonanych przez każdą przednią łapę, co daje w sumie 20 kontaktów. Szczegółowy opis kryteriów punktacji znajduje się w Schallert i wsp.18 Liczbę uszkodzonych kontaktów kończyn przednich (np. lewa łapa przednia) należy wyrazić jako procent całkowitych kontaktów kończyn przednich (lewa i prawa łapa przednia). 
		Uwaga: Szczury kontrolne bez uszkodzeń używających obu łap w równym stopniu powinny uzyskać około 50% punktów w tym teście.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj analizę immunohistochemiczną (IHC), aby ocenić poziom ekspresji transgenu i utratę komórek dopaminergicznych.
	<ol>
		<li>W różnych końcowych stadiach należy poskładać szczury w ofierze przedawkowania pentobarbitalu sodu (60 mg/kg, i.p.) i przeprowadzić perfuzję wewnątrzsercową zimnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie 4% paraformaldehydu w PBS19. Utrwalić mózgi przez noc w temperaturze 4 °C i wyciąć przekroje mózgu koronalnego o grubości 50 μm za pomocą wibrującego mikrotomu.</li>
		<li>Wykonaj barwienie IHC na swobodnie pływających odcinkach przy użyciu przeciwciał przeciwko α-SYN i hydroksylazie tyrozynowej w celu analizy poziomów ekspresji α-SYN i poziomu neurodegeneracji16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Magen, I., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+Parkinson%27s+disease+The+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art.</a> Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).</li>
<li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+loss+and+inclusion+body+formation+in+alpha-synuclein+mice%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders.</a> Science. 287, 1265-1269 (2000).</li>
<li>Freichel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cognitive+decline+and+amygdala+pathology+in+alpha-synuclein+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice.</a> Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).</li>
<li>Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+parkinsonism%3A+strengths+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations.</a> NeuroRx. 2, 495-503 (2005).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+insolubility+of+alpha-synuclein+in+human+Lewy+body+diseases+is+recapitulated+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model.</a> Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).</li>
<li>Chesselet, M. F., Richter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Modelling of Parkinson's disease in mice.</a> Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).</li>
<li>Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+genes+at+work+in+the+living+brain+with+non-invasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging.</a> Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).</li>
<li>Manfredsson, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV-mediated+nigral+human+parkin+over-expression+partially+ameliorates+motor+deficits+via+enhanced+dopamine+neurotransmission+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease.</a> Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).</li>
<li>Vercammen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+protects+against+neurotoxicity+in+the+6-hydroxydopamine+rat+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease.</a> Mol Ther. 14, 716-723 (2006).</li>
<li>Winklhofer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parkin+protein+as+a+therapeutic+target+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+therapeutic+targets%22%5BJournal%5D)">The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).</li>
<li>Kirik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson-like+neurodegeneration+induced+by+targeted+overexpression+of+alpha-synuclein+in+the+nigrostriatal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system.</a> J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).</li>
<li>Kirik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nigrostriatal+alpha-synucleinopathy+induced+by+viral+vector-mediated+overexpression+of+human+alpha-synuclein%3A+a+new+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).</li>
<li>Lauwers, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathology+and+neurodegeneration+in+rodent+brain+induced+by+lentiviral+vector-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+pathology%22%5BJournal%5D)">Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein.</a> Brain pathology. 13, 364-372 (2003).</li>
<li>Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+cell+loss+induced+by+human+A30P+alpha-synuclein+gene+transfer+to+the+rat+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra.</a> Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).</li>
<li>Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vector-Based+Models+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Beh+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease.</a> Curr Top Beh Neurosci. , (2014).</li>
<li>Van der Perren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+follow-up+and+characterization+of+a+robust+rat+model+for+Parkinson%27s+disease+based+on+overexpression+of+alpha-synuclein+with+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors.</a> Neurobiol Aging. , (2014).</li>
<li>Van der Perren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+transduction+of+dopaminergic+neurons+in+rat+substantia+nigra+by+rAAV++2%2F1%2C+2%2F2%2C+2%2F5%2C+2%2F6.2%2C+2%2F7%2C+2%2F8+and+2%2F9%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9.</a> Gene Ther. , (2011).</li>
<li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li>
<li>Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+Methods+of+Animal+Brain+Surgery%3A+Perfusion%2C+Brain+Removal%2C+and+Histological+Techniques.+Brain+Neurotrauma%3A+Molecular%2C+Neuropsychological%2C+and+Rehabilitation+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li>
<li>Dale, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+Lewy+bodies+and+pale+bodies+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).</li>
<li>Dawson, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+flies+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of flies and mice.</a> Science. 288, 631-632 (2000).</li>
<li>Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+PD%3A+pieces+of+the+same+puzzle%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Animal models of PD: pieces of the same puzzle?</a> Neuron. 35, 219-222 (2002).</li>
<li>LeVine, H. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+beta-sheet+amyloid+fibril+structures+with+thioflavin+T%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T.</a> Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).</li>
<li>Oliveras-Salva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV2%2F7+vector-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein+in+mouse+substantia+nigra+induces+protein+aggregation+and+progressive+dose-dependent+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration.</a> Mol Neurodegener. 8, (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje faktyczny ani potencjalny konflikt interesów.

W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Miano wektora, jak również czystość wektora, mają bezpośredni wpływ na wynik fenotypowy modelu. Nadmierne miana wektorów lub niedostatecznie oczyszczone partie wektorów mogą powodować nieswoistą toksyczność. W związku z tym niezbędne jest stosowanie wysokiej jakości wsadów wektorowych oraz odpowiednich wektorów kontrolnych. Co więcej, dokładne umiejscowienie głowy szczura w ramce stereotaktycznej i dokładne określenie współrzędnych jest niezbędne do wycelowania w istotę ...

Aby zbadać patofizjologię choroby Parkinsona i opracować nowe strategie terapeutyczne, istnieje pilne zapotrzebowanie na modele zwierzęce, które bardzo przypominają neuropatologię, fizjologię i objawy motoryczne ludzkiego PD. Im wyższa wartość predykcyjna, tym lepiej możemy przełożyć nowe terapie z modeli zwierzęcych na pacjentów.
Odkrycie alfa-synukleiny (α-SYN) jako pierwszego genu PARK w 1997 roku doprowadziło do opracowania pierwszych genetycznych modeli PD. W ciągu ostatniej dekady wygenerowano wiele transgenicznych myszy z nadekspresją ludzkiego typu dzikiego (WT) lub zmutowanego (A30P, A53T) α-SYN. Poziomy nadekspresji α-SYN okazały się kluczowe w rozwoju patologii. Ważną rolę odgrywa również szczep myszy, obecność lub brak endogennego α-SYN oraz to, czy wyrażana jest pełna długość, czy skrócona forma (szczegółowy przegląd Magen i Chesselet1). Nadekspresja zarówno WT, jak i kilku klinicznych mutantów ludzkiego α-SYN u myszy transgenicznych indukuje patologiczną akumulację α-SYN i dysfunkcję neuronów2-6. Jednak do tej pory większość transgenicznych modeli myszy α-SYN nie wykazywała wyraźnej utraty komórek dopaminergicznych i deficytów behawioralnych zależnych od dopaminy.
Ta przeszkoda została pokonana przez bezpośrednie ukierunkowanie na istotę czarną (SN) z wektorami wirusowymi wykazującymi nadekspresję α-SYN. Wektory wirusowe pochodzą od wirusów, które mogą łatwo infekować komórki, wprowadzać materiał genetyczny do ich genomu gospodarza i zmuszać komórkę gospodarza do replikacji genomu wirusa w celu wytworzenia nowych cząsteczek wirusa. Wirusy mogą być modyfikowane tak, aby nie replikowały się wektory wirusowe, które zachowują zdolność do wnikania do komórek i wprowadzania genów. Poprzez usunięcie części genomu wirusa i zastąpienie ich genami będącymi przedmiotem zainteresowania, zastosowanie wektora spowoduje pojedynczą rundę infekcji bez replikacji w komórce gospodarza, ogólnie określaną jako "transdukcja". Wektory wirusowe mogą być wykorzystywane zarówno do nadekspresji, jak i wyciszania genów. Ekspresja transgenu może być białkiem reporterowym (np. białkiem zielonej fluorescencji lub lucyferazą świetlika)7, białkiem terapeutycznym do zastosowań w terapii genowej8-10 lub, jak skupimy się w tym artykule, białkiem związanym z chorobą stosowanym do modelowania choroby11-14.
Dostarczanie genów za pośrednictwem wektora wirusowego stanowi alternatywny sposób ekspresji transgenów w OUN z kilkoma zaletami. Korzystając z lokalnego dostarczania transgenu, można celować w określone regiony mózgu. Co więcej, ekspresja transgenu może być indukowana w wieku dorosłym, zmniejszając ryzyko mechanizmów kompensacyjnych podczas rozwoju. Można również tworzyć modele w różnych gatunkach i szczepach. I wreszcie, różne transgeny można łatwo łączyć. Za pomocą wektorów wirusowych można osiągnąć wysoki poziom ekspresji transgenu, co może mieć kluczowe znaczenie, ponieważ początek i nasilenie choroby często zależą od poziomu nadekspresji.
Opracowano kilka systemów wektorowych opartych na różnych wirusach. Wybór systemu wektorów zależy od wielkości genu będącego przedmiotem zainteresowania, wymaganego czasu ekspresji genu, komórki docelowej i kwestii bezpieczeństwa biologicznego. W celu zapewnienia stabilnego transferu genów w mózgu, lentiwirusowe (LV) i rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem (rAAV) są obecnie uważane za systemy wektorowe z wyboru, ponieważ prowadzą do wydajnej i długotrwałej ekspresji genów w mózgu gryzoni. W przypadku specyficznego ukierunkowania na neurony dopaminergiczne (DN) SN, wektory rAAV stopniowo konkurują z wektorami LV ze względu na ich wyższe miana i skuteczność transdukcji DN.
Najlepsze obecnie dostępne modele gryzoni oparte na α-SYN zostały opracowane z wykorzystaniem nowszych serotypów AAV (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) i zoptymalizowanych konstruktów wektorowych, mian i czystości15,16. Miano wektora, jak również czystość wektora, mają bezpośredni wpływ na wynik fenotypowy modelu. Nadmierne miana wektorów lub niedostatecznie oczyszczone partie wektorów mogą powodować nieswoistą toksyczność. W związku z tym niezbędne są odpowiednie wektory sterujące. Znaczna inwestycja czasowa w procedury produkcji, zwiększania skali i oczyszczania wektorów wirusowych okazała się również niezbędna do uzyskania powtarzalnych i wysokiej jakości partii wektorów.

<table><tbody><tr><td>Samica 8 tygodniowego szczura Wistar</td><td>Janvier</td><td>/</td><td>200-250 g</td></tr><tr><td>Ketamina (Nimatek)</td><td>Eurovet zdrowie zwierząt</td><td>804132</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine (Dormitor)</td><td>Orion-Pharma/ Janssen Animal Health</td><td>1070-499</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Znieczulenie miejscowe do skóry głowy i uszu: Xyloca&iuml; ne 2% żel</td><td>Astrazeneca</td><td>0137-547</td><td></td></tr><tr><td>Terramycine</td><td>Pfizer</td><td>0132-472</td><td></td></tr><tr><td>Bupr&eacute; norfina (Vetergesic)</td><td>Ecuphar</td><td>2623-627</td><td></td></tr><tr><td>Jodium 1% izopropanol</td><td>VWR</td><td>0484-0100</td><td></td></tr><tr><td>stereotaktyczna rama głowicy</td><td>Stoeling</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton (30 gauge -20 mm -pst 2)</td><td>Hamilton/ Filter Service</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>atipamezol (Antisedan)</td><td>Orion-Pharma/Elanco</td><td>1300-185</td><td></td></tr><tr><td>rAAV A53T & wektor alfa;-SYN</td><td>LVVC, KU Leuven</td><td>/</td><td>https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/</td></tr> <tr><td>sodowy pentobarbital (Nembutal)</td><td>Ceva Sant&eacute;</td><td>0059-444</td><td></td></tr><tr><td>mikrotom</td><td>Microm</td><td>HM650</td><td></td></tr><tr><td>króliczy synukleina poliklonalna Ab</td><td>Chemicon</td><td>5038</td><td>1:5,000</td></tr><tr><td>królik poliklonalny TH Ab</td><td>Chemicon</td><td>152</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Tomograf FOCUS 220 oparty na detektorze oksyortokrzemianu lutetu</td><td>Siemens/ Concorde Microsystems</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>radioligand: 18F-FECT</td><td>W domu</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>L-dopa: Prolopa 125</td><td>Roche</td><td></td><td>6 mg/kg i.p.</td></tr><tr><td>DMEM, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg; 31331-093</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg; 10270-106</td><td></td></tr><tr><td>25 kD liniowy polietyleniminę (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Gradient gęstości Medium: Iodixanol</td><td>Sigma</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Optimen</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg; 51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Paxinos 1 watston atlas steretacticalny, wydanie czwarte</td><td>Elsevier</td><td>/</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie szczurzego modelu choroby parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

Aby badać molekularne szlaki choroby Parkinsona (PD) i rozwijać nowe strategie terapeutyczne, badacze opierają się na modelach zwierzęcych. Identyfikacja genów związanych z chorobą Parkinsona doprowadziła do opracowania genetycznych modeli choroby Parkinsona. Większość transgenicznych modeli myszy α-SYN rozwija stopniową patologię α-SYN, ale nie wykazuje wyraźnej utraty komórek dopaminergicznych i deficytów behawioralnych zależnych od dopaminy. Przeszkoda ta została pokonana przez bezpośrednie ukierunkowanie na istotę czarną z wektorami wirusowymi wykazującymi nadekspresję genów związanych z chorobą Parkinsona. Lokalne dostarczanie genów za pomocą wektorów wirusowych zapewnia atrakcyjny sposób ekspresji transgenów w ośrodkowym układzie nerwowym. Można celować w określone obszary mózgu (np. istota), indukować ekspresję w środowisku dorosłym i osiągać wysokie poziomy ekspresji. Ponadto można stosować różne systemy wektorowe oparte na różnych wirusach. Protokół przedstawia wszystkie kluczowe kroki do wykonania wstrzyknięcia wektora wirusowego w istotę czarną szczura w celu opracowania opartego na wektorze wirusowym modelu zwierzęcego alfa-synukleiny dla choroby Parkinsona.

Ogólny schemat eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1
Nadekspresja A53T α-SYN oparta na rAAV 2/7 indukuje zależne od dopaminy deficyty motoryczne. 
Aby zbadać, czy poziom nadekspresji α-SYN jest wystarczający do wywołania zaburzeń motorycznych u szczurów, poddano zwierzęta testowi cylindra w celu oceny spontanicznego wykorzystania przednich kończyn (Rysunek 3A). Od 3 tygodni...

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób lokalne dostarczanie genów za pośrednictwem wektorów wirusowych zapewnia atrakcyjny sposób ekspresji transgenów w ośrodkowym układzie nerwowym. Protokół określa wszystkie kluczowe kroki w celu wykonania wstrzyknięcia wektora wirusowego w istotę czarną szczura w celu opracowania opartego na wektorze wirusowym modelu zwierzęcego dla choroby Parkinsona.

Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie modelu zwierzęcego choroby Parkinsona opartego na wektorze wirusowym poprzez wstrzykiwanie stereotaktyczne do ośrodkowego układu nerwowego. Metoda ta może być wykorzystana do opracowania standardowych modeli zwierzęcych umożliwiających przedkliniczne testowanie leków i może być pomocna w badaniu mechanizmów molekularnych choroby Parkinsona, a także wielu innych schorzeń neurodegeneracyjnych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość precyzyjnego celowania w konkretne obszary mózgu.Można uzyskać wysoką ekspresję transgenu w mózgu, co pozwala na tworzenie modeli zwierzęcych u konkretnych szczepów i gatunków zwierząt. Opracowano różne końcowe systemy wektorowe. Wybór systemu wektora zależy od wielkości transgenu, którego ekspresję chcemy uzyskać, czasu trwania ekspresji genów, docelowych komórek oraz kwestii bezpieczeństwa biologicznego.Procedurę zaprezentuje Annelies Aertgeerts, technik z naszego laboratorium. Rozpocznij od prawidłowego znieczulenia ośmiotygodniowej samicy szczura Wistar zgodnie z zatwierdzonymi protokołami. Sprawdź, czy osiągnięto poziom znieczulenia chirurgicznego, uciskając każdą łapę i stwierdzając brak odruchu

development-an-alpha-synuclein-based-rat-model-for-parkinson-s

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Tagliafierro, L., et al. Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje transdukcję lentiwirusową nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w celu ukierunkowanej modyfikacji epigenetycznej alfa-synukleiny, kluczowego białka w chorobie Parkinsona. Protokół umożliwia metylację DNA za pośrednictwem metylotransferazy,...

Transdukcja lentiwirusowa nerwowych komórek progenitorowych w celu epigenetycznej regulacji ekspresji alfa-synukleiny

Ten film demonstruje procedurę tworzenia szczurzego modelu choroby Parkinsona poprzez wstrzyknięcie neurotoksyny 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) do mózgu. Wlew neurotoksyny do przyśrodkowego pęczka przodomózgowia (MFB) jest specyficznie ukierunkowany na neurony dopaminergiczne odpowiedzialne za kontrolę motoryczną, prowadząc do ich zniszczenia i powielania objawów choroby Parkinsona.

Generowanie szczurzego modelu 6-hydroksydopaminy choroby Parkinsona

Ten film pokazuje proces wstrzykiwania wektora wirusowego do istoty czarnej szczura w celu modelowania choroby Parkinsona. Przedstawiono w nim etapy przygotowania szczura, mikrowstrzyknięcia wektora wirusowego do istoty czarnej oraz procedury odzyskiwania.

Wstrzyknięcie wektora wirusowego do istoty czarnej szczura w celu modelowania chorób neurodegeneracyjnych

Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Celem tego artykułu jest nakreślenie kroków wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerycznej alfa-synukleiny, późniejszej kontroli jakości i użycia wstępnie uformowanych włókienek in vivo.

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Ta praca analizuje dawkę wektora i czas ekspozycji wymagane do wywołania zapalenia nerwów, neurodegeneracji i upośledzenia motorycznego w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona. Te wektory kodujące ludzką α-synukleinę są dostarczane do istoty czarnej w celu podsumowania patologii synukleiny związanej z chorobą Parkinsona.

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

W niniejszym artykule opisujemy identyfikację serotypu 3 wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV3) jako najskuteczniejszego wektora do celowania w ludzkie komórki raka wątroby.<br...

Wysokoefektywna transdukcja komórek raka wątroby za pomocą wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono &gt;95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Poznaj metodę stereotaktycznego wstrzyknięcia wektorów wirusowych do istoty czarnej u szczurów w celu opracowania modelu choroby Parkinsona. Technika umożliwia precyzyjne dostarczanie genów i badanie mechanizmów neurodegeneracyjnych.

Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

Przeglądaj więcej filmów