Wysokowydajna transdukcja komórek raka wątroby przez rekombinowane wektory serotypu 3 wirusa związanego z adenowirusem

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie aktywnych wektorów serotypu trzech wirusa związanego z adenowirusem, które mogą skutecznie transdukować ludzkie komórki raka wątroby. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję trzech różnych plazmidów do 2 9 3 komórek jednocześnie. Drugim etapem procedury jest oczyszczenie AAV three varion złożonych w 2, 9, 3 komórki.

Trzecim krokiem procedury jest określenie ciaśniejszego oczyszczonego materiału trójwektorowego AAV. Ostatnim etapem procedury jest transdukcja ludzkich komórek raka wątroby za pomocą oczyszczonych trzech wektorów AAV. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na wysoką ekspresję białka EGFP w ludzkich komórkach raka wątroby za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Główną przewagą tej techniki nad dotychczasową metodą jest osiągnięcie wysokiej efektywności transferu i ekspresji genów w ludzkich komórkach raka wątroby. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w produkcję trzech wektorów AAV, może być również stosowana do innych systemów, takich jak szerzej stosowane dwa wektory. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z powodu zaangażowania wielu kroków, które mogą być żmudne, Demonstrując procedurę, będzie biolog z naszego laboratorium.

Manipulacje eksperymentalne w tej sekcji protokołu są wykonywane w kapturze do hodowli tkankowej na 48 godzin przed rozpoczęciem tej procedury. Wysiew 10 15-centymetrowe szalki do hodowli tkankowej z ludzką embrionalną linią komórkową nerki 2, 9 3 tak, aby komórki były w 70 do 80% zlewne w dniu transfekcji w dniu transfekcji. Skorzystaj ze strony www.

ge shae. com/calc do obliczenia ilości plazmidu DA, która ma być użyta do transfekcji. Po obliczeniu prawidłowych objętości plazmidowego DNA należy przystąpić do transfekcji pipetowania odpowiedniej objętości pożywki do hodowli komórkowych bez FBS i antybiotyków do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Następnie odpipetować wymagane objętości P helper, PACG two, C3 i PDSA AAV C-B-E-G-F-P do pożywki. Całkowita objętość powinna wynosić 8 750 mikrolitrów na 10 15-centymetrowych płytek odpipetować 1 250 mikrolitrów PEI do pożywki zawierającej wir plazmidowego DNA, roztworu D-N-A-P-E-I przez kilka sekund, a następnie inkubować roztwór D-N-A-P-E-I przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie się kompleksów D-N-A-P-E-I. Pobrać 10 15-centymetrowych płytek komórek HEC 2 9 3 z inkubatora do hodowli tkankowych.

Następnie odpipetować jeden mikrolitr roztworu D-N-A-P-E-I do każdej z płytek. Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cztery do sześciu godzin. Po czterech do sześciu godzinach ostrożnie odessać pożywkę z płytek.

Następnie odpipetować 25 mililitrów kompletnego podłoża z 10% FBS do każdej płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez około 72 godziny. Po upływie 72 godzin wyjąć płytki z inkubatora i wrócić do okapu do hodowli tkankowej.

Następnie, nie odsysając pożywki z płytki, użyj skrobaka do komórek, aby zeskrobać warstwę komórek z dna płytki do pożywki do hodowli komórkowych. Wlej pożywkę zawierającą komórki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 250 mililitrów. Powtórz tę procedurę dla każdej z transfekowanych płytek, wlewając zawartość każdej płytki do tej samej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 250 mililitrów.

Zakręć probówkę zawierającą komórki i pożywkę w schłodzonej wirówce. Cztery stopnie Celsjusza przez 10 minut przy 3000 obrotach na minutę Po odwirowaniu wyrzuć supinat, a następnie odpipetuj pięć mililitrów buforu RB TMS na osad i zgnij resus. Przenieś roztwór komórkowy do czystej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.

Umieść 15-mililitrową rurkę w kąpieli etanolowej z suchym lodem, aby zamrozić przez 10 minut. Po upływie czasu inkubacji wyjmij probówkę i umieść ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Aby rozmrozić, powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania dalsze dwa razy.

Obracaj rurkę przez kilka sekund. Po każdym rozmrożeniu po ostatnim okresie rozmrażania odpipetować jeden mikrolitr 4,8 molowego chlorku magnezu i dwa mikrolitry po 25 jednostek na mikrolitr. Benon nase do wiru roztworu komórkowego do wymieszania.

Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut po inkubacji. Umieścić probówkę w schłodzonej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza i odwirowywać 4 000 obrotów na minutę przez 40 minut pod koniec okresu wirowania, przygotować gradient IAL, który ma być użyty do oczyszczenia wirusa. Aby to zrobić, odpipetuj dwa mililitry 15%dwa mililitry 25%1,5 mililitra 40%i 1,5 mililitra 60% IAL do 13-mililitrowej probówki wirówkowej.

Po odwirowaniu odpipetować supernatant S z probówki wirówkowej, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, odpipetować naczynie na gradient IAL, a następnie odpipetować wystarczającą ilość buforu RB TMS do probówki, aby całkowicie ją napełnić. Umieść rurkę w wirniku Beckman 90 TI, uważając, aby wirnik był odpowiednio wyważony. Wirować z prędkością 75 000 obrotów na minutę przez godzinę w temperaturze 16 stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu. Zebrać frakcję 40% IAL, wkładając pięciomililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 18 w gradient idal na granicy od 40 do 60%. Ostrożnie zassać strzykawkę i zebrać 40% frakcję idal.

Wyrzuć 40% frakcję IAL ze strzykawki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie napełnij probówkę do końcowej objętości 40 mililitrów buforem a. Zmontuj aparat filtracyjny za pomocą kolumny o wysokim współczynniku pułapki Q HP zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie umyj kolumnę następującymi roztworami. 25 mililitrów buforu, A 25 mililitrów buforu B 50 mililitrów buforu, A 40 mililitrów przygotowanej próbki wirusa idal w buforze, A 50 mililitrów buforu A i na koniec 20 mililitrów buforu C. Zebrać bufor C w 20-mililitrowym koncentratorze Apollo. Następnie odwirować próbkę w schłodzonej wirówce ustawionej na cztery stopnie Celsjusza przez 10 minut przy 3000 obrotach na minutę po odwirowaniu, odrzucić przepływ

Następnie dodaj 20 mililitrów schłodzonego PBS do koncentratora Apollo i odwiruj przyrost w schłodzonej wirówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut przy 3000 obrotach na minutę po odwirowaniu. Ponownie wyrzuć przepływ przez pipetę 500 mikrolitrów schłodzonego PBS na membranę, aby ponownie zawiesić wirusa z membrany. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów podwielokrotności wektora wirusowego do probówek eend orph nasączonych silikonem i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia rozmrozić jedną z 10 mikrolitrowych porcji oczyszczonego wirusa na lodzie.

Odpipetować 40 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody do probówki, aby rozcieńczyć wirusa. Następnie dodaj 0,2 mikrolitra po 25 jednostek na mikrolitr, Ben Nase i inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. W międzyczasie odpipetuj 50 mikrolitrów po 0,2 nanograma na mikrolitr wzorca plazmidu do czystej probówki eend orph.

Po inkubacji dodać 50 mikrolitrów 100-milimolowego wodorotlenku sodu do probówki zawierającej wirusa. Bens aase i do probówki zawierającej wzorzec plazmidu. Inkubować obie probówki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po upływie 30 minut natychmiast schłodzić obie probówki na lodzie przez co najmniej pięć minut. Następnie wytnij kawałek membrany transferowej do tego samego rozmiaru, co kawałek bibuły filtracyjnej bio dot. Umieść membranę transferową i trzy kawałki bibuły biofiltracyjnej na płytkiej tacy.

Napełnij tacę 10-krotnym SSC i moczyć przez 20 minut, podczas gdy membrana moczy. Ustaw aparat SF z blokiem szczelinowym zgodnie z instrukcjami producenta. Podłączyć aparaturę do kolby próżniowej, a następnie pipetować 100 mikrolitrów 10-krotnego SSC do każdej ze szczelin, które mają być załadowane rozcieńczeniem próbki wirusa i wzorca plazmidu.

Wyjąć probówki z wirówki chłodzonej do lodu ustawionej na cztery stopnie Celsjusza na jedną minutę z prędkością 13 000 obrotów na minutę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 20-krotnego SSC i jeden mikrolitr sześciokrotnego obciążenia barwnika do każdej tuby. Następnie odpipetować dodatkowe 100 mikrolitrów 10 razy SSC do każdej probówki i załadować 100 mikrolitrów każdej próbki do sąsiednich szczelin.

Powtarzać procedurę rozcieńczania i ładowania, aż całkowita objętość każdej próbki zostanie załadowana do aparatu blokowego ze szczelinami i dalsze dodawanie 10-krotnego SSC, przy objętości 100 mikrolitrów lub mniejszej. Gdy wszystkie próbki przejdą przez membranę, zdemontuj aparat do utraty szczeliny i usuń membranę za pomocą kleszczy. Uważaj, aby obchodzić się z membraną na krawędziach i umieścić membranę w komorze łącznika inspektora SL 1000 UV crosslinker.

Następnie wybierz optymalne energetycznie sieciowanie powinno zająć około 30 sekund. Teraz przygotuj się do hybrydyzacji, gotując jeden mililitr DNA plemników łososia przez pięć minut. Po gotowaniu przez pięć minut DNA plemników łososia należy natychmiast schłodzić na lodzie przez co najmniej pięć minut.

Następnie przygotuj roztwór przed hybrydyzacją zgodnie z pisemnym protokołem. Odpipetować 25 mililitrów roztworu przed hybrydyzacją zawierającego DNA plemników łososia do probówki hybrydyzacyjnej. Ostrożnie przenieś usieciowaną membranę do probówki hybrydyzacyjnej, a następnie umieść nasadkę na probówce, a następnie upewnij się, że roztwór przed hybrydyzacją dokładnie pokrywa membranę.

W pozycji poziomej inkubować w komorze hybrydyzacyjnej w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia rozpocznij przygotowanie sondy od pipetowania 50 nanogramów matrycy DNA do probówki einor i dodania 10 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody w celu rozcieńczenia, gotuj rozcieńczone DNA przez pięć minut, a następnie natychmiast schładzaj na lodzie przez co najmniej pięć minut po schłodzeniu. Odwirować rozcieńczoną matrycę DNA z prędkością 13 000 obrotów na minutę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Następnie pracuje zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi bezpieczeństwa radioaktywnego. Przygotować sondę radioaktywną, dodając dwa mikrolitry 10 milimolowych DN TPS bez DCTP dwa mikrolitry heksanukleotydu hexa. Wymieszaj jeden mikrolitr AU i pięć mikrolitrów 32 P-D-C-T-P inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę po inkubacji.

Przygotować kolumny G 50 przez centryfuzję z prędkością 3000 obrotów na minutę przez dwie minuty. Następnie załaduj sondę na kolumnę i odwiruj swoje wzmocnienie z prędkością 3000 obrotów na minutę przez dwie minuty i zbierz przepływ. W tym momencie radioaktywność przepływającego sondy jest mierzona przy użyciu standardowych procedur w celu określenia liczby na minutę na mililitr sondy.

Następnie gotuj sondę przez pięć minut. Następnie natychmiast schłodzić sondę na lodzie przez pięć minut. Sonda jest wtedy gotowa do użycia do hybrydyzacji bez zdejmowania membrany.

Odpipetować sondę w stężeniu sześciokrotnym wyśrodkować pięć zliczeń na minutę na mililitr bezpośrednio do roztworu przed hybrydyzacją w probówce hybrydyzacyjnej. Inkubacja komory hybrydyzacyjnej przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza następnego dnia. Wyrzuć roztwór hybrydyzacyjny zgodnie z instytucjonalnymi protokołami aktywności radiowej i odpipetuj 25 mililitrów dwukrotnego SSC plus 0,1% SDS do probówki i myj membranę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Wyrzucić roztwór i odpipetować 25 mililitrów 0,1 x SSC plus 0,1% SDS do probówki. Umyj membranę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po tym przemyciu wyrzuć roztwór i krótko przepłucz membranę w 25 mililitrach o temperaturze pokojowej 0,1 x SSCA.

Owiń membranę folią spożywczą i umieść w kasecie naświetlającej pracującej w ciemnym pomieszczeniu. Umieść kawałek folii na membranie i zamknij kasetę, aby chronić przed światłem. Umieść kasetę ekspozycyjną w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na sześć.

Po sześciu godzinach. Wywołaj film i określ miano szczepów wirusa, porównując gęstość prążków wirusowych z prążkami ze wzorców plazmidowych. Po ustaleniu miana, wirus może być użyty do transdukcji pierwszego nasienia komórek jeden razy 10 do czterech komórek WZW 2 93 TT.

W każdym dołku na 96-dołkowej płytce inkubuj komórki przez co najmniej 18 godzin w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać pożywkę z każdej studzienki i ostrożnie odpipetować 50 mikrolitrów pożywki bez antybiotyków i FBS do każdej z nich. Dobrze odessaj to podłoże, a następnie powtórz proces, aby umyć komórki.

Rozcieńczyć wektory rekombinantu a a v w pożywce bez FBS i antybiotyków do końcowego stężenia 5 000 VGS na komórkę. Dodać 50 mikrolitrów tego roztworu lub 50 mikrolitrów pożywki bez FBS jako kontroli ujemnej do studzienek 96-dołkowej płytki i inkubować przez dwie godziny w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%. Po inkubacji należy usunąć pożywkę zawierającą wirusa i umyć komórki dwa razy jak poprzednio, używając 50 mikrolitrów kompletnej pożywki na studzienkę.

Po odrzuceniu ostatniego prania dodaj 150 mikrolitrów kompletnej pożywki do każdej studzienki i inkubuj płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Na koniec zwizualizuj ekspresję EGFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Intensywność fluorescencji można określić ilościowo za pomocą oprogramowania Image J z ekspresją genu trans ocenianą jako całkowita powierzchnia zielonej fluorescencji na pole widzenia.

Przykład ilościowego bloku szczelinowego DNA do określania tytusa trzech wektorów RAV pokazano tutaj. Błona ta została zbadana za pomocą EGFP znakowanej P 32, specyficznej sondy DNA. Górny rząd bloku składa się z dwukrotnych rozcieńczeń oczyszczonych zapasów wirusowych trawionych za pomocą Ben Nase.

Środkowy i dolny rząd składają się z wzorców A-A-V-E-G-F-P rozcieńczonych odpowiednio z jednego nanograma lub 10 nanogramów plazmidu. Miano stad wirusowych określa się przez porównanie ze wzorcami plazmidu. Liczby pokazane na plamie odpowiadają liczbie kopii plazmidowego DNA.

Jest to przykład rekombinowanej ekspresji transgenu za pośrednictwem wektora A V. U człowieka komórki linii komórkowej hepatoblastoma zostały uwidocznione 72 godziny po transdukcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Pierwszy obraz ilustruje wyniki pozorowanej infekcji.

Drugi obraz pokazuje komórki HEP 2 93 TT transdukowane z 5 000 VGS na komórkę wszystkich dwóch wektorów AAV EGFP w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Końcowy obraz pokazuje transdukcję z 5 000 VGS na komórkę R AAV three EEG FP w tych samych warunkach. Można zauważyć, że RAAV three jest znacznie bardziej wydajny w transdukcji tego typu komórek w porównaniu do R AAV dwa.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii genowej, takie jak sposób celowania w ludzkie komórki raka wątroby. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię ludzkiego raka wątroby, ponieważ V 3 ma zdolność do ekspresji genu terapeutycznego specyficznie w ludzkim raku wątroby na wysokim poziomie.