Name: Wysokowydajna transdukcja komórek raka wątroby przez rekombinowane wektory serotypu 3 wirusa związanego z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: Poznaj metodę produkcji wektorów AAV3 do wysokowydajnej transdukcji komórek raka wątroby człowieka. Protokół obejmuje transfekcję, oczyszczanie i analizę ekspresji EGFP w celach terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr. R. Jude Samulskiemu i dr. Xiao Xiao za uprzejme przekazanie odpowiednio plazmidów rekombinowanego AAV3 oraz AAV-EGFP, a także dr Gail Tomlinson za hojne udostępnienie linii komórkowych Hep293TT. Badania te były częściowo finansowane z grantów Public Health Service R01 HL-076901, R01 HL-097088 oraz P01 DK-058327 (Projekt 1) przyznanych przez National Institutes of Health (dla AS).

1. Pakowanie wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3 (rAAV3)
<ol>
<li>Przejdź do witryny: „<a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a>" i oblicz ilość DNA.</li>
<li>Wstępnie zmieszaj plazmidy pHelper (pomocniczy adenowirusa), pACG2c3 (pomocniczy AAV) i pdsAAV-CB-EGFP (wektor rAAV) w pożywce bez FBS i antybiotyków. Objętość całkowita powinna wynosić 8,750 μL dla dziesięciu płytek o powierzchni 15 cm2.</li>
<li>Dodaj bezpośrednio 1,250 μL PEI (0,1% m/v, Polysciences, Cat# 23966, pH 4,5) do roztworu DNA z kroku 1.2. Mieszaj roztwór DNA-PEI w wirówce typu vortex przez kilka sekund.</li>
<li>Inkubuj roztwór DNA-PEI w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min w celu utworzenia kompleksu.</li>
<li>Dodaj 1 mL roztworu DNA-PEI na każdą płytkę 15 cm2.</li>
<li>Usuń pożywkę po 4 godzinach, zastępując ją świeżymi 25 mL pełną pożywką z 10%FBS (C-DMEM).</li>
<li>Siedemdziesiąt dwie godziny po transfekcji zeskrob komórki i przelej je do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 250 mL.</li>
<li>Wiruj przy 3000 rpm w temperaturze 4°C przez 10 min. Odlej nadosad.</li>
<li>Resuspenduj osad komórkowy w 5 mL buforu RB TMS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Przenieś do nowej probówki stożkowej 15 mL.</li>
<li>Zamroź w kąpieli z suchego lodu i etanolu przez 10 min, a następnie odmroź w 37°C przez 10 min. Powtórz czynność trzy razy.</li>
<li>Dodaj 1 μL 4,8 M MgCl2 i 2 μL Benzonazy (25 U/ μL, Novagen, Cat# 70664-3). Wymieszaj w vortexie i inkubuj w 37°C przez 40 min.</li>
<li>Odwiruj przy 4,000 rpm w temperaturze 4°C przez 40 min i zbierz nadosad (klarowny lizat).</li>
<li>W probówce wirówkowej Quick-Seal 13 mL (Beckman, Cat# 342413) przygotuj gradient jodiksanolu (OptiPrep, Cat# 1114542) od góry do dołu: 2 mL 15%, 2 mL 25%, 1,5 mL 40% i 1,5 mL 60% jodiksanolu. Nałóż nadosad (krok 1.12) na górę gradientu jodiksanolu. Wypełnij probówki buforem RB TMS.</li>
<li>Wiruj przy 75,000 rpm przez 1 godzinę w 16°C, używając rotora Beckman 90Ti.</li>
<li>Zbierz frakcję 40% jodiksanolu, wprowadzając strzykawkę na granicy 40-60%.</li>
<li>Przenieś frakcję 40% jodiksanolu do jednej probówki stożkowej 50 mL i uzupełnij do 40 mL buforem A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5).</li>
<li>Złóż aparat do filtracji, używając kolumny HiTrap Q HP (GE Healthcare, Cat# 17-1154-01). Przemyj kolumnę następującymi buforami: 25 mL buforu A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5); 25 mL buforu B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5); 50 mL buforu A; 40 mL próbki wirusa w buforze A; 50 mL buforu A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5); 20 mL buforu C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5);</li>
<li>Zbierz bufor C do koncentratora Apollo 20 mL (Orbital Biosciences). Wiruj przy 3,000 rpm w 4°C przez 10 min.</li>
<li>Odrzuć przelew i dodaj 20 mL schłodzonego PBS, a następnie wiruj przy 3,000 rpm w 4°C przez 10 min.</li>
<li>Odrzuć przelew i dodaj 500 μL schłodzonego PBS. Wypłucz wektory z membrany, przenieś do probówek Eppendorf traktowanych silikonem i przechowuj zamrożone w małych aliquotach w -80°C.</li>
</ol>
2. Oznaczanie miana wektora rAAV3
<ol>
<li>Odmrozić 10 μL oczyszczonego wirusa w probówce Eppendorf na lodzie. Dodać 40 μL ddH2O.</li>
<li>Dodać 0,2 μL Benzonazy (25 U/ μL, Novagen, Cat# 70664) i inkubować w 37°C przez 1 godzinę.</li>
<li>Odmiarkować 50 μL standardu plazmidowego (0,2 ng/ μL) do drugiej probówki Eppendorf.</li>
<li>Dodać 50 μL 100 mM NaOH do każdej probówki i inkubować w 65°C przez 30 min.</li>
<li>Natychmiast schłodzić na lodzie przez co najmniej 5 min.</li>
<li>Wyciąć membranę transferową (Millipore, Cat# INYC00010) zgodnie z rozmiarem papieru filtrującego Bio-Dot (Bio-Rad, Cat# 1620161). Płukać membranę w 10x SSC przy użyciu trzech papierów filtrujących przez 20 min.</li>
<li>Przygotować aparat do slot blot SF (Bio-Dot, Cat# 170-6542). Podłączyć go do kolby próżniowej i dodać 100 μL 10x SSC do aparatu do slot blot.</li>
<li>Dodać 100 μL 20x SSC i 1 μL 6x barwnika do ładowania do każdej z próbek z kroku 2.5.</li>
<li>Nanieść 100 μL każdej z próbek na membranę w aparacie do slot blot.</li>
<li>Dodać kolejne 100 μL 10x SSC do każdej z próbek.</li>
<li>Powtarzać kroki 2.9 i 2.10, aż cała próbka przejdzie przez membranę.</li>
<li>Zdemontować aparat do slot blot i wyjąć membranę. Umieścić ją w urządzeniu do sieciowania UV Inspector Linker SL-1000. Włączyć funkcję „Energy”, wybrać „Optimal Crosslink” (wartość 1200) i nacisnąć „Start”.</li>
<li>Gotować 1 mL DNA z plemników łososia (SS) (Fisher, Cat# NC9753983) przez 5 min. Schłodzić na lodzie przez co najmniej 5 min.</li>
<li>Przygotować roztwór do prehybrydyzacji, mieszając 27,5 mL ddH2O, 15 mL 20x SSC, 5 mL 50x roztworu Denhardta, 1,25 mL 20% SDS, 0,25 mL PolyA oraz 1 mL SS DNA z kroku 2.13.</li>
<li>Zawiesić membranę w 25 mL roztworu do prehybrydyzacji w zakorkowanym cylindrze szklanym i inkubować w 65°C w komorze do hybrydyzacji przez noc.</li>
<li>Rozcieńczyć 50 ng matryc DNA w 10 μL ddH2O. Gotować w 100°C przez 5 min i natychmiast schłodzić na lodzie przez co najmniej 5 min.</li>
<li>Wirować przy 3000 rpm w temperaturze pokojowej przez 1 min. Dodać 2 μL 10 mM 3 dNTP (bez dCTP), 2 μL mieszaniny heksanukleotydów (Roche, Cat# 11277081001), 1 μL fragmentu Klenow (Roche, Cat# 11008404001) oraz 5 μL α-32P-dCTP. Inkubować w 37°C przez 10 min.</li>
<li>Wirować kolumny G-50 (GE Healthcare, Cat# 27-5330-01) przy 3000 rpm przez 2 min. Nanieść sondę z kroku 2.17 na kolumnę. Wirować przy 3000 rpm przez 2 min i zebrać frakcję przejściową.</li>
<li>Zmierzyć radioaktywność. Gotować sondę w 100°C przez 5 min i natychmiast schłodzić na lodzie przez co najmniej 5 min.</li>
<li>Dodać sondę (6x105 cpm/ mL) do roztworu do prehybrydyzacji z membraną.</li>
<li>Inkubować przez noc w 65°C w komorze do hybrydyzacji.</li>
<li>Odlać roztwór do hybrydyzacji i płukać membranę w 2x SSC + 0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez 15 min.</li>
<li>Odlać roztwór i płukać membranę w 0,1x SSC + 0,1% SDS w 65°C przez 30 min.</li>
<li>Odlać roztwór i krótko płukać membranę w 0,1x SSC w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Naświetlać film w -80°C przez 6 godzin, a następnie go wywołać. Typowy wynik przedstawiono na Rysunku 1.</li>
</ol>
3. Transdukcja za pośrednictwem wektora rAAV3 i ekspresja transgenu w ludzkich komórkach raka wątroby
<ol>
<li>Wysiać 1x104 komórek (Huh7 lub Hep293TT) do każdej studni płytki 96-dołkowej. Inkubować w wilgotnym inkubatorze CO2 przez co najmniej 18 godzin.</li>
<li>Usunąć pożywkę z płytki 96-dołkowej.</li>
<li>Przemyć komórki dwukrotnie 50 μL pożywki bez FBS i antybiotyków, a następnie usunąć płyn.</li>
<li>Dodać 50 μL pożywki bez FBS i antybiotyków oraz wektory rAAV w dawce 5,000 vgs/cell.</li>
<li>Inkubować płytki w inkubatorze CO2 przez 4 godziny.</li>
<li>Odlać pożywkę. Przemyć komórki dwukrotnie 50 μL pożywki kompletnej, a następnie usunąć płyn.</li>
<li>Dodać 150 μL C-DMEM do każdej studni i inkubować płytkę w inkubatorze CO2 przez 72 godziny, a następnie zwizualizować ekspresję EGFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (DMI 4000B; Leica Microsystems).</li>
<li>Obrazy z trzech studni z komórkami zakażonymi wirusem poddać analizie ilościowej przy użyciu oprogramowania ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).</li>
<li>Ekspresję transgenu ocenia się jako całkowitą powierzchnię fluorescencji zielonej (pixel2) na pole widzenia. Typowy wynik przedstawiono na Rysunku 2.</li>
<li>Ekspresję transgenu można również określić za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem, można efektywnie generować wektory AAV różnych serotypów. Typowa wydajność wynosi ~500 μL zawierających ~1011 vgs/μL oczyszczonego zapasu wektora. Czystość zapasu wektora określa się poprzez porównanie sygnałów hybrydyzacji w ilościowych testach DNA slot blot, z trawieniem Benzonazą i bez niego. Oczyszczone wektory rAAV3 efektywnie transdukują ludzkie linie komórkowe raka wątroby – hepatoblastomy (HB) oraz raka hepatokomórkowego (HCC).
<img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="Kwantyfikacja rAAV3; wyniki dot blot; seria rozcieńczeń od 10 μl do 0,31 μl; analiza genomu wirusa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1.	Ilościowa analiza DNA metodą slot-blot w celu oznaczenia mian wektorów rAAV3. Dwukrotne rozcieńczenia oczyszczonych zapasów wirusa, trawione Benzonazą (górny rząd), analizowano na ilościowych slot-blotach DNA z użyciem sondy DNA specyficznej dla EGFP znakowanej 32P. Miano wektora AAV3 określono poprzez porównanie z 1 ng (środkowy rząd) lub 10 ng (dolny rząd) standardów plazmidowych AAV-EGFP naniesionych na membranę. Liczby odpowiadają kopiom DNA.
<img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="Porównanie w mikroskopii fluorescencyjnej: komórki Mock, scAAV2-EGFP oraz scAAV3-EGFP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. 	Ekspresja transgenu za pośrednictwem rekombinantnego wektora AAV w ludzkich komórkach raka wątroby. Komórki Hep293TT, niedawno opracowana linia komórkowa hepatoblastomy ludzkiej4, zostały poddane infekcji pozorowanej (lewy panel) lub transdukcji wektorami scAAV2-EGFP lub scAAV3-EGFP w dawce 5,000 vgs/cell w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Ekspresję transgenu zwizualizowano 72 godziny po transdukcji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.

<ol><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).</li>
<li>Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV3-mediated+transfer+and+expression+of+the+pyruvate+dehydrogenase+E1+alpha+subunit+gene+causes+metabolic+remodeling+and+apoptosis+of+human+liver+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+%26+Metabol%22%5BJournal%5D)">AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells.</a> Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).</li>
<li>Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocyte+growth+factor+receptor+is+a+cellular+coreceptor+for+adeno-associated+virus+serotype+3%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3.</a> Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).</li>
<li>Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+cancer+cell+line+derived+from+an+aggressive+childhood+liver+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Blood+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor.</a> Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H. Jr, Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+adeno-associated+virus+2+vectors%3A+point+mutations+in+tyrosines+lead+to+high-efficiency+transduction+at+lower+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).</li>
<li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+of+the+mouse+retina+by+tyrosine-mutant+AAV+serotype+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors.</a> Mol Ther. 17, 463-471 (2009).</li>
<li>Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+adeno-associated+virus+%28AAV%29-protein+phosphatase-5+helper+viruses+for+efficient+liver+transduction+by+single-stranded+AAV+vectors%3A+therapeutic+expression+of+factor+IX+at+reduced+vector+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses.</a> Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).</li>
<li>Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+of+fibroblasts+and+mesenchymal+stem+cells+by+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+for+their+potential+use+in+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy.</a> Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).</li>
<li>Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r, Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+long-term+transduction+and+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+stem+cells+transduced+with+tyrosine-modified+recombinant+adeno-associated+virus+serotype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2.</a> Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).</li>
<li>Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+6+capsid+tyrosine-to-phenylalanine+mutations+improve+gene+transfer+to+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle.</a> Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).</li>
<li>Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+and+correction+of+murine+hemophilia+B+using+AAV2+vectors+devoid+of+multiple+surface-exposed+tyrosines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines.</a> Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).</li>
<li>Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+PDH+deficiency+using+AAV8-siRNA+vector-mediated+knockdown+of+pyruvate+dehydrogenase+E1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+%26+Metabol%22%5BJournal%5D)">An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α.</a> Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).</li>
<li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+properties+of+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina.</a> Mol Ther. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opracowano rekombinowane wektory oparte na niepatogennym ludzkim parwowirusie, wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV), które są obecnie wykorzystywane w licznych badaniach klinicznych nad terapią genową5. Wcześniej, spośród 10 najczęściej stosowanych serotypów AAV, raportowano, że wydajność transdukcji wektorów AAV3 jest ogólnie szczególnie niska, zarówno in vitro, jak i in vivo1. Jednakże nasza niedawna obserwacja, że wektory AAV3 niezwykle dobrze transdukują linie komórkowe raka wątroby człowieka, co określono ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej2, oraz że AAV3 wykorzystuje ludzki receptor czynnika wzrostu hepatocytów (hHGFR) jako komórkowy koreceptor do wiązania i wnikania do tych komórek3, silnie sugeruje selektywny tropizm tkankowy AAV3 do ludzkich komórek wątroby w ogóle, a w szczególności do ludzkich komórek raka wątroby. Ponieważ jednak wektory AAV3 wydajnie transdukują również prawidłowe ludzkie hepatocyty2, ich potencjalne zastosowanie w terapii genowej nowotworów in vivo mogłoby zostać ograniczone. Jedną z możliwych strategii obejścia tego problemu jest celowanie transkrypcyjne w komórki nowotworowe poprzez identyfikację produktu genu, który jest selektywnie produkowany przez guz, a nie przez prawidłowe hepatocyty. Na przykład wcześniejsze badania wykazały, że poziom α-fetoproteiny (AFP) w surowicy jest wykorzystywany jako specyficzny marker do śledzenia obecności, progresji i/lub nawrotu niektórych typów raka wątroby, ponieważ prawidłowe hepatocyty zazwyczaj produkują bardzo niewielkie ilości tego białka. Rzeczywiście, wykorzystaliśmy wektory AAV3 zawierające promotor AFP, aby skierować ekspresję transgenu do komórek raka wątroby, a nie do prawidłowych hepatocytów2, a obecnie trwają badania nad sprawdzeniem skuteczności tego podejścia w mysim modelu ksenograftu raka wątroby. W naszych dodatkowych badaniach zaobserwowaliśmy, że wydajność transdukcji wektorów różnych serotypów AAV może zostać znacząco zwiększona poprzez mutagezę celowaną reszt tyrozyny wyeksponowanych na powierzchni kapsydów wirusowych6-14. Ponieważ 6 z 7 tyrozyn wyeksponowanych na powierzchni jest również konserwatywnych w AAV3, przeprowadziliśmy mutagezę celowaną tych reszt i zaobserwowaliśmy, że wydajność transdukcji mutantów tyrozynowych wektorów AAV3 jest znacznie wyższa w ludzkich komórkach raka wątroby (dane niepublikowane). Obecnie trwają również badania nad oceną bezpieczeństwa i skuteczności mutantów tyrozynowych wektorów AAV3 w mysich modelach ksenograftów hepatoblastomy i raka wątrobowokomórkowego człowieka; w przypadku sukcesu, optymalne mutanty tyrozynowe wektorów serotypu AAV3 mogą okazać się użyteczne w celowaniu w ludzkie nowotwory wątroby w ramach potencjalnej terapii genowej.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaza</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna HiTrap Q HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>DNA z plemni łososia</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>Gradient iodiksanolu</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoefektywna transdukcja komórek raka wątroby za pomocą wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

Opracowano rekombinowane wektory oparte na niepatogennym ludzkim parwowirusie, wirusie towarzyszącym adenowirusom 2 (AAV2), które są obecnie wykorzystywane w wielu badaniach klinicznych nad terapią genową. W ostatnim czasie wyizolowano również szereg dodatkowych serotypów AAV, które wykazują selektywny tropizm tkankowy w różnych modelach zwierząt małych i dużych1. Spośród 10 najczęściej stosowanych serotypów AAV, AAV3 jest zdecydowanie najmniej wydajny w transdukcji komórek i tkanek in vitro, jak i in vivo.
Jednak w naszych niedawno opublikowanych badaniach udokumentowaliśmy, że wektory AAV3 niezwykle efektywnie transdukują linie komórkowe raka wątroby u ludzi – hepatoblastoma (HB) oraz raka hepatokomórkowego (HCC), ponieważ AAV3 wykorzystuje ludzki receptor czynnika wzrostu hepatocytów jako koreceptor komórkowy do wiązania i wnikania do tych komórek2,3.
W niniejszym artykule opisujemy kroki niezbędne do osiągnięcia wysokowydajnej transdukcji ludzkich komórek raka wątroby za pomocą rekombinowanych wektorów AAV3 niosących gen reporterowy. Zastosowanie rekombinowanych wektorów AAV3 niosących gen terapeutyczny może w przyszłości doprowadzić do potencjalnej terapii genowej nowotworów wątroby u ludzi.

W niniejszym artykule opisujemy identyfikację serotypu 3 wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV3) jako najskuteczniejszego wektora do celowania w ludzkie komórki raka wątroby.

Wysokoefektywna transdukcja komórek raka wątroby za pomocą wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3

Opracowano rekombinowane wektory oparte na niepatogennym ludzkim parwowirusie – wirusie adeno-zależnym 2 (AAV2), które są obecnie wykorzystywane w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie aktywnych wektorów wirusa adeno-zależnego serotypu 3, które mogą efektywnie transdukować ludzkie komórki raka wątroby. Osiąga się to poprzez jednoczesną transfekcję trzech różnych plazmidów do komórek 293. Drugim krokiem procedury jest oczyszczanie wirionów AAV3 zmontowanych w komórkach 293.Trzecim krokiem procedury jest oznaczenie miana oczyszczonego zapasu wektorów AAV3. Ostatnim krokiem procedury jest transdukcja ludzkich komórek raka wątroby przy użyciu oczyszczonych wektorów AAV3. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące wysoką ekspresję białka EGFP w ludzkich komórkach raka wątroby w badaniu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest osiągnięcie wysokiej wydajności transferu i ekspresji genów w ludzkich komórkach raka wątroby. Choć metoda ta pozwala na analizę produkcji wektorów AAV3, może być ona również zastosowana w innych systemach, takich jak powszechniej stosowane wektory AAV2. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na wieloetapowość procesu, który może być żmudny. Procedurę zaprezentuje biolog z naszego laboratorium.Manipulacje eksperymentalne w tej sekcji protokołu wykonuje się w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 48 godzin przed rozpoczęciem tej procedury. Wysiej linię komórkową ludzkiej nerki zarodkowej 2, 9 3 do 10 szalek hodowlanych o średnicy 15 centymetrów w taki sposób, aby w dniu transfekcji komórki osiągnęły 70 do 80% konfluencji. Skorzystaj ze strony internetowej www.Strona ge shae. com/calc służy do obliczenia ilości plazmidowego DNA niezbędnego do transfekcji. Po obliczeniu odpowiednich objętości plazmidowego DNA należy przystąpić do transfekcji, pipetując odpowiednią objętość pożywki do hodowli komórkowej bez FBS i antybiotyków do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.Następnie pipetuj wymagane objętości P helper, PACG two, C3 oraz PDSA AAV C-B-E-G-F-P do pożywki. Całkowita objętość powinna wynosić 8 750 µL. Dla 10 płytek 15 cm pipetuj 1 250 µL PEI do pożywki zawierającej plazmidowe DNA. Wymieszaj roztwór DNA-PEI w wirówce vorex przez kilka sekund, a następnie inkubuj roztwór DNA-PEI przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie się kompleksów DNA-PEI. Wyjmij z inkubatora do hodowli tkankowych 10 płytek 15 cm z komórkami HEC 2 9 3.Następnie pipetuj 1 µL roztworu D-N-A-P-E-I do każdej z płytek. Inkubuj płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cztery do sześciu godzin. Po upływie czterech do sześciu godzin ostrożnie odessij medium z płytek.Następnie pipetuj 25 ml pożywki kompletnej z 10% FBS do każdej płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez około 72 h. Po upływie 72 h wyjmij płytki z inkubatora i przenieś je z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza.Następnie, bez odsysania medium z płytki, należy użyć skrobaka do komórek, aby zeskrobać warstwę komórek z dna płytki do medium hodowlanego. Medium zawierające komórki należy przelać do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 250 ml. Powtórz tę procedurę dla każdej z transfekowanych płytek, przelewając zawartość każdej z nich do tej samej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 250 ml.Wiruj probówkę zawierającą komórki i medium w schłodzonej wirówce. Cztery stopnie Celsiusza przez 10 minut przy 3000 obrotach na minutę. Po wirowaniu odlej nadsącz, a następnie pipetuj pięć mililitrów buforu RB TMS na osad i resuspenduj. Przenieś zawiesinę komórkową do czystej, stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.Umieść probówkę 15 ml w kąpieli z etanolu i suchego lodu, aby zamrozić próbkę przez 10 minut. Po upływie czasu inkubacji wyjmij probówkę i pozostaw ją w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Aby rozmrozić próbkę, powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania jeszcze dwa razy.Mieszaj probówkę na wirówce typu vortex przez kilka sekund. Po każdym rozmrożeniu następującym po końcowym okresie rozmrażania, pipetuj jeden mikrolitr 4,8 molarnego chlorku magnezu oraz dwa mikrolitry 25 jednostek na mikrolitr. Benon nase do roztworu komórkowego, a następnie wymieszaj na wirówce typu vortex.Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 minut po zakończeniu inkubacji. Umieścić probówkę w schłodzonej wirówce w temperaturze 4 °C i wirować z prędkością 4 000 obr./min przez 40 minut; pod koniec procesu wirowania przygotować gradient IAL, który zostanie wykorzystany do oczyszczania wirusa. W tym celu pipetować 2 ml 15%, 2 ml 25%, 1,5 ml 40% oraz 1,5 ml 60% IAL do szczelnej probówki wirówkowej o pojemności 13 ml.Po wirowaniu pobierz pipetą supernatant S z probówki wirówkowej, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, nanieś supernatant na gradient IAL, a następnie dolej do probówki wystarczającą ilość buforu RB TMS, aby całkowicie ją wypełnić. Umieść probówkę w rotorze Beckman 90 TI, dbając o to, aby rotor był odpowiednio zrównoważony. Wiruj przy 75 000 obr./min przez jedną godzinę w temperaturze 16 °C.Po wirowaniu należy zebrać frakcję 40% IAL, wprowadzając strzykawkę o pojemności 5 ml z igłą o rozmiarze 18G do gradientu IdAL na granicy 40–60%. Należy ostrożnie aspirować zawartość strzykawki i zebrać frakcję 40% IdAL.Wypchnij frakcję 40%IAL ze strzykawki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie dopełnij probówkę buforem a do końcowej objętości 40 ml. Zmontuj aparat do filtracji, używając kolumny high trap Q HP, zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie przemyj kolumnę kolejnymi roztworami: 25 ml buforu A, 25 ml buforu B, 50 ml buforu A, 40 ml przygotowanej próbki wirusa idal w buforze A, 50 ml buforu A, a na koniec 20 ml buforu C. Zbierz bufor C do koncentratora Apollo o pojemności 20 ml. Następnie odwiruj próbkę w schłodzonej wirówce ustawionej na 4 °C przez 10 minut przy 3000 obr./min; po wirowaniu odrzuć frakcję przepływową.Następnie należy dodać 20 milliliters schłodzonego PBS do koncentratora Apollo i ponownie odwirować w schłodzonej wirówce w temperaturze four degrees Celsius przez 10 minutes przy 3000 rotations per minute. Po wirowaniu ponownie należy odrzucić przesącz, a następnie nanieść pipetą 500 microliters schłodzonego PBS na membranę, aby resuspender wirusa z membrany. Następnie należy nanieść alikwoty wektora wirusowego o objętości 10 microliter do rurek typu eend orph traktowanych silikonem i przechowywać w temperaturze minus 80 degrees Celsius do momentu użycia; jedną z alikwotów oczyszczonego wirusa o objętości 10 microliter należy rozmrozić na lodzie.Do probówki pipetujemy 40 µL wody dwukrotnie destylowanej w celu rozcieńczenia wirusa. Następnie dodajemy 0,2 µL Ben Nase w stężeniu 25 units/µL i inkubujemy mieszaninę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. W tym czasie do czystej probówki eend orph pipetujemy 50 µL standardu plazmidowego o stężeniu 0,2 ng/µL.Po inkubacji do probówki zawierającej wirusa należy dodać 50 µL 100 mM wodorotlenku sodu. Mieszaninę enzymów Bens aase dodać do probówki zawierającej standard plazmidowy. Obie probówki inkubować w temperaturze 65 °C przez 30 minut.Po upływie 30 minut należy natychmiast schłodzić obie probówki na lodzie przez co najmniej pięć minut. Następnie wyciąć kawałek membrany transferowej o takim samym rozmiarze jak kawałek papieru filtrującego bio dot. Umieścić membranę transferową i trzy kawałki papieru filtrującego bio w płytkiej kuwecie.Napełnić kuwetę 10-krotnym roztworem SSC i moczyć przez 20 minut, podczas gdy membrana jest namaczana. Przygotować aparat do slot-blottingu SF zgodnie z instrukcjami producenta. Podłączyć aparat do kolby próżniowej, a następnie nanieść pipetą 100 µL 10-krotnego roztworu SSC do każdego z slotów, które zostaną załadowane rozcieńczeniem próbki wirusa i standardem plazmidowym.Wyjmij probówki z lodowej wirówki chłodzącej ustawionej na 4 °C, po wirowaniu przez jedną minutę przy 13 000 obr./min. Następnie do każdej probówki dodaj 100 µL 20x SSC oraz 1 µL 6x barwnika do nakładania próbek. Następnie pipetuj dodatkowe 100 µL 10x SSC do każdej probówki i nałóż po 100 µL każdej próbki do sąsiednich oczek.Powtarzać procedurę rozcieńczania i nakładania, aż całkowita objętość każdej próbki zostanie naniesiona do aparatury z blokiem szczelin, a dalsze dodatki 10× SSC wyniosą 100 µL lub mniej. Po tym, jak wszystkie próbki przejdą przez membranę, zdemontować aparaturę z blokiem szczelin i wyjąć membranę za pomocą pincety. Należy uważać, aby chwytać membranę za brzegi, a następnie umieścić ją w komorze crosslinkera UV Inspector Linker SL 1000.Następnie wybierz optymalną energię; sieciowanie powinno trwać około 30 sekund. Teraz przygotuj próbkę do hybrydyzacji, gotując 1 mL DNA sperm z łososia przez pięć minut. Po pięciu minutach gotowania DNA sperm z łososia należy natychmiast schłodzić na lodzie przez co najmniej pięć minut.Następnie przygotuj roztwór do prehybrydyzacji zgodnie z protokołem pisemnym. Do probówki do hybrydyzacji pipetuj 25 ml roztworu do prehybrydyzacji zawierającego DNA sperm spermy łososia. Ostrożnie przenieś sieciowaną membranę do probówki do hybrydyzacji, a następnie zakręć probówkę, upewniając się, że roztwór do prehybrydyzacji całkowicie pokrywa membranę.W pozycji poziomej inkubować w komorze hybrydyzacyjnej w temperaturze 65 °C przez noc. Następnego dnia rozpocząć przygotowanie sondy, pipetując 50 ng matrycy DNA do probówki typu Eppendorf i dodając 10 µL wody dwukrotnie destylowanej w celu rozcieńczenia; rozcieńczone DNA gotować przez pięć minut, a następnie natychmiast chłodzić na lodzie przez co najmniej pięć minut. Odwirować rozcieńczoną matrycę DNA przy 13 000 obr./min przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Następnie, działając zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi bezpieczeństwa radiologicznego, należy przygotować radioaktywną sondę poprzez dodanie 2 µL 10 mM DN TPS bez DCTP oraz 2 µL heksanukleotydu. Następnie zmieszać 1 µL AU i 5 µL 32 P-D-C-T-P i inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Przygotować kolumny G 50 poprzez wirowanie z prędkością 3000 obr./min przez dwie minuty. Następnie nanieść próbę na kolumnę i wirować z prędkością 3000 obr./min przez dwie minuty, a następnie zebrać frakcję przepływową. Na tym etapie mierzy się radioaktywność frakcji przepływowej przy użyciu standardowych procedur w celu określenia liczby zliczeń na minutę na mililitr próby.Następnie gotuj sondę przez pięć minut. Po tym czasie niezwłocznie schłodź sondę na lodzie przez pięć minut. Sonda jest następnie gotowa do użycia w hybrydyzacji bez wyjmowania membrany.Pipetuj sondę o stężeniu 6 counts per minute per milliliter bezpośrednio do roztworu przedhybrydyzacyjnego w probówce do hybrydyzacji. Inkubuj komorę do hybrydyzacji przez noc w temperaturze 65 °C. Następnego dnia usuń roztwór do hybrydyzacji zgodnie z instytucjonalnymi protokołami dotyczącymi radioaktywności, a następnie pipetuj do probówki 25 ml 2× SSC z dodatkiem 0,1% SDS i przemywaj membranę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Odlać roztwór i pipetować 25 ml 0,1x SSC z dodatkiem 0,1% SDS do probówki. Przemywać membranę w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Po tym przemyciu odlać roztwór i krótko opłukać membranę w 25 ml 0,1x SSC w temperaturze pokojowej.Owiń membranę folią spożywczą i umieść w kasecie ekspozycyjnej, pracując w ciemni. Połóż arkusz filmu na membranie i zamknij kasetę, aby zabezpieczyć ją przed światłem. Umieść kasetę ekspozycyjną w zamrażarce o temperaturze -80 °C na sześć godzin.Po sześciu godzinach wywołaj film i określ miano zapasów wirusa, porównując gęstość prążków wirusowych z prążkami standardów plazmidowych. Po ustaleniu miana wirusa można go użyć do transdukcji komórek; najpierw wysiej 1x10⁴ komórek Hep 2 93 TT.W każdym dołku płytki 96-dołkowej inkubuj komórki przez co najmniej 18 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Po inkubacji odessij pożywkę z każdego dołka i ostrożnie pipetuj do każdego z nich 50 µL pożywki bez antybiotyków i FBS. Odessij tę pożywkę, a następnie powtórz proces, aby wypłukać komórki.Rozcień rekombinowane wektory a a v w pożywce bez FBS i antybiotyków do stężenia końcowego 5 000 VGS na komórkę. Do dołków płytki 96-dołkowej dodaj 50 µL tego roztworu lub 50 µL pożywki bez FBS jako kontrolę negatywną i inkubuj przez dwie godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po inkubacji usuń pożywkę zawierającą wirusa i przemyj komórki dwukrotnie w sposób opisany wcześniej, używając 50 µL pożywki kompletnej na dołek.Po odlaniu ostatniego płukania, dodaj 150 µL kompletnego medium do każdego dołka i inkubuj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez 72 godziny. Na koniec zwizualizuj ekspresję EGFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Intensywność fluorescencji można ilościowo określić za pomocą oprogramowania Image J, oceniając ekspresję transgenu jako całkowitą powierzchnię zielonej fluorescencji na pole widzenia.Poniżej przedstawiono przykład ilościowego bloku slotowego DNA do wyznaczania miana wektorów RAV3. Membrana ta została poddana hybrydyzacji ze specyficzną sondą DNA znakowaną P 32 EGFP. Górny rząd bloku obejmuje dwukrotne rozcieńczenia oczyszczonych zapasów wirusa poddanych trawieniu nukleazą Ben.Środkowy i dolny rząd składają się ze standardów A-A-V-E-G-F-P rozcieńczonych odpowiednio z 1 ng lub 10 ng plazmidu. Miano zapasów wirusowych określa się poprzez porównanie ze standardami plazmidowymi. Liczby widoczne na transferze odpowiadają liczbie kopii DNA plazmidowego.Jest to przykład ekspresji transgenu za pośrednictwem rekombinowanego wektora AAV. W ludzkiej linii komórkowej hepatoblastomy komórki wizualizowano 72 godziny po transdukcji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Pierwszy obraz przedstawia wyniki infekcji pozorowanej.Na drugim zdjęciu przedstawiono komórki HEP 2 93 TT transdukowane 5 000 VGS na komórkę wszystkich wektorów AAV two EGFP w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Ostatnie zdjęcie pokazuje transdukcję 5 000 VGS na komórkę R AAV three EEG FP w tych samych warunkach. Widać, że RAAV three jest znacznie wydajniejszy w transdukcji tego typu komórek w porównaniu do R AAV two.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie terapii genowej, takie jak sposób celowania w komórki raka wątroby u ludzi. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię raka wątroby u ludzi, ponieważ V three posiada zdolność do ekspresji genu terapeutycznego specyficznie w raku wątroby u ludzi na wysokim poziomie.

high-efficiency-transduction-liver-cancer-cells-recombinant-adeno

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wysokoefektywne transdukowanie komórek raka wątroby przez wektory rekombinowanego adeno-związanego wirusa o serotypie 3

Prezentujemy podstawową technikę inżynierii molekularnej i ewolucji syntetycznych wektorów do terapii genowej opartych na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA (DNA family shuffling). Ponadto przedstawiamy ogólne wytyczne oraz reprezentatywne przykłady selekcji i analizy poszczególnych chimerycznych kapsydów o ulepszonych właściwościach w odniesieniu do komórek docelowych w hodowli lub u myszy.

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Opisujemy tworzenie wątrobowych neo-wysepek u myszy z cukrzycą indukowaną STZ (streptozotocyną) poprzez transfer genów Neurogenin3 (Ngn3) i Betacellulin (Btc) z wykorzystaniem zależnego od helpera wektora adenowirusowego (HDAd) oraz odwrócenie hiperglikemii. Nasza metoda wykorzystuje zależne od helpera wektory adenowirusowe, które charakteryzują się wysoką wydajnością transdukcji in vivo oraz długotrwałą ekspresją genów.

Tworzenie neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą za pomocą transferu genów za pośrednictwem adenowirusowego wektora zależnego od pomocnika

Transdukcja zhumanizowanej wątroby szczura z wykorzystaniem wektorów wirusa towarzyszącego adenowirusom

Źródło: Hiller, T. et. al. Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2. J. Vis. Exp. (2016)W tym filmie zaprezentowano barwienie immunohistochemiczne w celu oceny transferu genów wirusowych w recelularyzowanym modelu wątroby szczura. Ekspresja reportera, potwierdzona detekcją przeciwciał i kolokalizacją z barwieniem jąder komórkowych, wskazuje na skuteczną transdukcję wirusową w komórkach.

Potwierdzenie transdukcji wirusowej w recelularyzowanej wątrobie szczura przy użyciu barwienia immunohistochemicznego

Film demonstruje lokoregionalne dostarczanie wirusów onkolitycznych poprzez wstrzyknięcie do tętnicy wątrobowej jako podejście terapeutyczne w przypadku raka wątrobowokomórkowego. Wirusy te selektywnie replikują się w komórkach nowotworowych, indukując lizę komórek i uwalniając antygeny związane z komórkami nowotworowymi. Proces ten wyzwala immunogenną śmierć komórki, indukując odpowiedź przeciwnowotworową.

Celowanie w nowotwory wątroby za pomocą wirusów onkolitycznych za pośrednictwem tętnicy wątrobowej

Wirusoterapie onkolityczne są w trakcie opracowywania jako nowe terapie w leczeniu raka wątrobowokomórkowego (HCC).  W tym artykule opisano metodę lokoregionalnej terapii HCC poprzez wątrobowe podawanie wirusa onkolitycznego do tętnic.

Przeztętnicze podawanie wirusów onkolitycznych w lokoregionalnej terapii ortotopowego HCC u szczurów

Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.

Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Wstrzyknięcie organoidów raka jelita grubego (CRC) do żyły wrotnej powoduje przerzuty do wątroby bogate w zręb. Ten mysi model przerzutów do wątroby CRC stanowi użyteczne narzędzie do badania interakcji guz-zręb i opracowywania nowych terapii ukierunkowanych na zręb, takich jak terapie genowe za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem.

Wstrzyknięcie do żyły wrotnej organoidów raka jelita grubego w celu zbadania zrębu z przerzutami do wątroby

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Ten protokół opisuje, w jaki sposób dośledzionowa iniekcja małego RNA spinki do włosów dostarczanego przez AAV8 osiąga taką samą skuteczność knockdownu genu w wątrobie jak iniekcja do żyły wrotnej, co stanowi prostszą procedurę ze znacznie niższą śmiertelnością i powikłaniami okołooperacyjnymi i pooperacyjnymi.

Skuteczny knockdown genu w wątrobie poprzez wstrzyknięcie do śledziony małego RNA dostarczonego przez serotyp 8 (AAV8) wirusa związanego z adenowirusem

Poznaj metodę produkcji wektorów AAV3 do wysokowydajnej transdukcji komórek raka wątroby człowieka. Protokół obejmuje transfekcję, oczyszczanie i analizę ekspresji EGFP w celach terapeutycznych.

Wysokoefektywna transdukcja komórek raka wątroby za pomocą wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3

Przeglądaj więcej filmów