Charakterystyka, kwantyfikacja i analiza izotopowa specyficzna dla związku węgla pirogennego przy użyciu polikarboksylowych kwasów benzenowych (BPCA)

Ogólnym celem tej metody markerów molekularnych jest charakterystyka, kwantyfikacja i analiza izotopowa frakcji węgla pirogenicznego w próbkach środowiskowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w różnych dziedzinach, od archeologii i kryminalistyki środowiskowej po badania nad biowęglem i obiegiem węgla. Główną zaletą tej techniki jest wykrywanie węgla pirogenicznego w szerokim zakresie kontinuum spalania.

Jednoczesna charakterystyka, ilościowe oznaczenie i analiza izotopowa węgla pirogenicznego. Metoda ta znajduje zastosowanie w bardzo szerokim zakresie materiałów z próbek środowiskowych. Demonstrację przygotowania próbek oraz chromatografii przeprowadzi Ulrich Hanke, doktorant z naszego laboratorium.

Kolejna analiza izotopowa oczyszczonych związków docelowych zostanie przeprowadzona przez Negar Haghipour, koordynatora laboratorium w ETH Zurich. Aby rozpocząć tę procedurę, należy odważyć wcześniej liofilizowane i homogenizowane próbki do kwarcowych probówek do mineralizacji, a następnie zabezpieczyć je przed kurzem folią aluminiową. W całym procesie należy stosować wyłącznie czyste, odwapnione i odporne na działanie kwasów szkło laboratoryjne, dokładnie oczyszczone narzędzia oraz wodę i rozpuszczalniki o czystości do chromatografii.

Do probówek do mineralizacji dodać 2 mL 65% kwasu azotowego. W celu dokładnego zwilżenia każdej próbki należy zastosować mieszalnik wirogrzałkowy (vortex). Następnie probówki do mineralizacji należy umieścić w komorze ciśnieniowej.

Zamknij komorę ciśnieniową zgodnie z instrukcją obsługi i umieść ją w rozgrzanym piecu w temperaturze 170 °C na osiem godzin. Po wyjęciu probówek do mineralizacji z ochłodzonej komory ciśnieniowej, przefiltruj próbki do kolb miarkowych z użyciem wody oraz jednorazowych filtrów z włókna szklanego. Następnie doprowadź objętość do 25 mL wodą.

Dla każdej próbki przygotuj dwie kolumny szklane z 11 gramami żywicy kationowymiennej na jedną kolumnę. Przygotuj żywicę wewnątrz kolumn, płucząc je kolejno wodą, dwumolowym wodorotlenkiem sodu oraz dwumolowym kwasem solnym. Sprawdź przewodność wody.

Które należy przepłukać przez żywicę po jej kondycjonowaniu. Następnie przenieś jedną połowę próbki na każdą kolumnę i przepłucz sekwencyjnie pięć razy 10 mililitrami wody. Następnie poddaj roztwory wodne liofilizacji.

Przygotuj wkłady do ekstrakcji w fazie stałej C18 zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Następnie ponownie rozpuść każdy liofilizat w trzech mililitrach metanolu i wody. Eluuj każdą połowę próbki przez osobny wkład do ekstrakcji w fazie stałej C18 do probówek o pojemności 2,5 mililitra.

Następnie przemyć wkłady jednym mililitrem metanolu i wody. Osusz probówki z roztworami próbek za pomocą koncentratora próżniowego nagrzanego do 45 °C, przy podciśnieniu wynoszącym około 50 mbar. Po osuszeniu ponownie rozpuść każdy osad w jednym mililitrze wody i wymieszaj za pomocą wstrząsarki wortexowej.

Następnie przenieś roztwory do fiolek do autopróbnika o pojemności 1,5 ml. Do analizy chromatograficznej przygotuj rozpuszczalnik A, mieszając 20 ml 85% kwasu ortofosforowego z 980 ml wody, a następnie przefiltruj roztwór przez jednorazowy filtr z włókna szklanego przy użyciu próżni. Przygotuj roztwory wzorcowe z dostępnych komercyjnie wielokarboksylowych kwasów benzenowych (BPCAs) w celu sporządzenia zewnętrznej serii stężeń wzorcowych.

Przeprowadź chromatografię i określ zawartość BPCA, porównując odpowiednie powierzchnie pików BPCA z pomiarami serii standardów zewnętrznych. Wymagania dotyczące czystości odczynników i sprzętu laboratoryjnego są szczególnie rygorystyczne w przypadku analizy związku specyficznego dla węgla-14 w BPCA. Ocena próbek blank i testy wymazowe są istotne dla monitorowania potencjalnych źródeł kontaminacji próbek.

Jeśli planowane są analizy zawartości węgla-13 i węgla-14 dla poszczególnych związków frakcji węgla pirogenicznego, należy powtórzyć chromatografię kilka razy dla każdej próbki i zebrać poszczególne BPCA w wystarczającej ilości, korzystając z kolektora frakcji podłączonego do HPLC. Rozpuszczalnik należy usunąć poprzez odparowanie frakcji za pomocą łagodnego strumienia azotu, podgrzewając je do 70 °C. Następnie należy przygotować odczynnik utleniający, rozpuszczając dwa gramy nadtlenkosiarczanu sodu w 15 ml wody.

Ponownie rozpuść każdy osad w czterech mililitrach wody i przenieś próbki do 12 mililitrowych szczelnych fiolek borokrzemianowych. Następnie dodaj jeden mililitr odczynnika utleniającego i zamknij każdą fiolkę standardowym zakrętką z septem z gumy butylowej. Przepłucz szczelne fiolki zawierające roztwory wodne helem przez osiem minut, aby usunąć dwutlenek węgla z fiolki i roztworu.

Następnie utlenij próbki w szczelnych fiolkach, podgrzewając je w temperaturze 100 °C przez 60 minut. Po ostygnięciu próbek do temperatury pokojowej, przeanalizuj bezpośrednio dwutlenek węgla powstały w wyniku utleniania za pomocą spektrometru mas do pomiaru stosunków izotopowych w celu oznaczenia zawartości Carbon-13 oraz za pomocą akceleracyjnego spektrometru mas w celu oznaczenia zawartości Carbon-14. Opisana procedura pozwala na rozdzielenie linii bazowych wszystkich związków docelowych BPCA za pomocą HPLC; tutaj przedstawiono chromatogramy materiałów referencyjnych: tramazem oraz spalonej trawy.

Poprzez dostosowanie parametrów chromatografii rozdział może zostać dalej zmodyfikowany w zależności od konkretnych potrzeb. Analiza ilościowa chromatogramów materiałów referencyjnych z zastosowaniem standardów zewnętrznych powinna przynieść przedstawione tutaj wartości węgla pirogenicznego. Tutaj wymieniono wartości węgla-13 i węgla-14 otrzymane podczas analizy zawartości izotopowej węgla w oczyszczonych BPCAs materiałów referencyjnych.

Po opanowaniu techniki badanie to można przeprowadzić w ciągu trzech dni roboczych. W związku z tym przepustowość próbek zależy od liczby próbek przetwarzanych jednocześnie. Pomiar kilkunastu próbek tygodniowo w dubletach i z informacją izotopową jest łatwo osiągalny.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać niezbędne kroki w celu skutecznej analizy węgla pirogenicznego na poziomie poszczególnych związków.