Oznaczanie gatunków i oznaczanie ilościowe w mieszaninach z zastosowaniem spektrometrii mas MRM peptydów stosowanych do weryfikacji autentyczności mięsa

Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie spektrometrii mas do monitorowania reakcji wielokrotnych w celu identyfikacji i ilościowego określenia gatunków obecnych w mieszankach surowego mięsa w celu wykorzystania ich jako narzędzia do wykrywania fałszowania żywności. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie integralności żywności, takie jak potwierdzenie gatunków obecnych w produktach takich jak kiełbasy czy burgery. Nasze podejście opiera się na spektrometrii mas składnika białkowego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że może dać szybki i ilościowy wynik. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że białka znane pod tą samą nazwą i różne gatunki są w rzeczywistości wystarczająco różne, aby umożliwić identyfikację gatunku, ale wystarczająco podobne, aby umożliwić ocenę ilościową. Termicznie denaturowane oczyszczone mioglobiny referencyjne poprzez ogrzewanie próbki w gorącym bloku w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Schładzać próbkę przez około 15 minut, aż osiągnie temperaturę pokojową. Następnie dodaj 30 miligramów mocznika, aby poprawić trawienie i wymieszaj. Dodać roztwór trypsyny do próbki w stosunku wagowym enzymu do substratu od 1 do 30.

Następnie wymieszaj przez delikatne wirowanie i pozwól mu się proteolizować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odsalić próbkę po proteolizie, najpierw rozcieńczając próbkę od jednej do dwóch objętości wodą. Aktywuj polimerowy wkład z odwróconą fazą wypełniony 30 miligramami materiału z odwróconymi fazami, dodając jeden mililitr metanolu.

Następnie zrównoważyć wkład, dodając jeden mililitr jednego procenta kwasu mrówkowego. Załaduj próbkę do wkładu pod wpływem grawitacji. Teraz umyj jednym mililitrem pięcioprocentowego metanolu zawierającego jeden procent kwasu mrówkowego.

Eluować peptydy jednym mililitrem wody acetonitrylowej do dwóch mililitrowych probówek mikrocentrofugowych wstępnie napełnionych pięcioma mikrolitrami DMSO. Następnie usuń rozpuszczalnik w próżni w temperaturze 50 stopni Celsjusza za pomocą parownika odśrodkowego przez 120 minut. Następnie ponownie rozpuść pozostałość w 250 mikrolitrach wody acetonitrylowej.

Przenieść roztwór do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek o małej objętości. Zlokalizuj sekwencje mioglobiny dla różnych spotkań w bazie danych UniProt . Wprowadź sekwencje mioglobiny do pola docelowego oprogramowania do przewidywania peptydów i przejść.

W razie potrzeby najedź kursorem na peptyd, aby wyświetlić jego listę fragmentów. Po wprowadzeniu preferencji zgodnie z opisem w protokole tekstowym, kliknij Eksportuj i wybierz Lista przejść, aby utworzyć arkusz kalkulacyjny zawierający wygenerowane przejścia i parametry MRM. Skonfiguruj wysokowydajny system chromatografii cieczowej lub HPLC gradientu binarnego z automatycznym podajnikiem próbek i kolumną HPLC z rdzeniem C18 podłączoną do potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego działającego w trybie dodatniego elektrorozpylania z detekcją MRM.

W sekcji edycji parametrów oprogramowania do zbierania danych spektrometrii mas chromatografii cieczowej wybierz typ skanowania jako MRM, a polaryzację jako dodatnią. Wprowadź wartości Q1, Q3, czasu, ID, DP i CE dla przejść utworzonych w arkuszu kalkulacyjnym i zapisz metodę akwizycji. Po ustawieniu parametrów metody zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przejdź do oprogramowania do zbierania danych, kliknij Acquire i wybierz Equilibrate.

W oknie, które zostanie otwarte, wybierz wymaganą metodę akwizycji, aby rozpocząć równoważenie instrumentu. Następnie umieść fiolki z próbkami w stojaku w automatycznym podajniku próbek. Kliknij Plik i wybierz Nowy, a następnie Partia przejęcia.

W polu Nazwa próbki należy wpisać tożsamość każdej z próbek, które mają być analizowane. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wizualizacji pozyskanych danych. Użyj mięsa, które zostało wcześniej zamrożone, a następnie zmielone na proszek.

Przygotuj szereg mieszanek mięsnych, ważąc odpowiednie ilości mięsa do 15-mililitrowych plastikowych probówek wirówkowych. Dodać cztery mililitry buforu ekstrakcyjnego do proszku mięsnego. Po wirowaniu przez 30 sekund ekstrahować na wytrząsarce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej przez dwie godziny z prędkością 250 cykli na minutę.

Przenieść dwa mililitry ekstraktu do dwumililitrowej probówki do mikrowirówki i wirować przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 17 000 G. Przenieść 200 mikrolitrowych porcji supernatantu do dwóch mililitrowych probówek wirówkowych. Wysuszyć próbki za pomocą parownika odśrodkowego przed określeniem stężenia białka w próbkach zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić proteolizę mieszanek mięsnych, należy ponownie rozpuścić wysuszoną pozostałość w jednym mililitrze 25-milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu.

Dobrze wymieszaj przez wirowanie i wykonaj proteoloysis jak poprzednio. Następnie skonfiguruj i uruchom LCMS w podobny sposób, korzystając z zaplanowanego MRM. Wyświetlić pełny chromatogram w oprogramowaniu do przeglądania danych.

Wyświetla wyekstrahowane jony dla każdego zestawu przejść po kolei. Wizualnie potwierdź, że każda grupa zawiera wymaganą liczbę szczytów w kształcie dzwonu w oczekiwanym czasie przechowywania. Potwierdzając tym samym istnienie wybranego peptydu.

Następnie kliknij dwukrotnie Kreatora kwantyfikacji na pasku nawigacyjnym. W oknie Wybierz próbki utwórz zestaw kwantyfikacji, wybierając pojedynczy plik danych. Następnie wybierz jedną lub więcej dostępnych próbek.

Wybierz przycisk Dalej, aby wyświetlić pole wyboru ustawień i zapytania. Pozostaw ustawienia domyślne i wybierz przycisk Dalej, aby wyświetlić opcję Wybierz metodę. Z listy rozwijanej Metoda wybierz plik metody integracji, a na koniec wybierz pozycję Zakończ.

Zapisz tabelę wyników, wyeksportuj ją jako plik tekstowy i otwórz ją w arkuszu kalkulacyjnym, aby przejrzeć dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rysunek ten przedstawia najbardziej intensywne przejścia MRM dla konia uzyskane z mieszanki jednego procenta masy do masy z wołowiną. Natomiast czerwona linia pokazuje przejście od wołowiny, gdy nie ma konia.

Jest to wykres zmierzonej w stosunku do przygotowanej ilości koniny w wołowinie wyrażonej w stosunkach. Wykres wyraźnie pokazuje, w jaki sposób metoda może być wykorzystana do wykonywania pomiarów ilościowych. Po opanowaniu i zastosowaniu przetwarzania wsadowego przepustowość tą metodą może osiągnąć do 20 próbek na 24 godziny.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o wybraniu odpowiedniego białka do analizy ekstrakcyjnej. Mioglobina jest dobrym kandydatem do badania gatunków czerwonego mięsa, ponieważ jest obfita, rozpuszczalna w wodzie i stabilna termicznie. Procedura ta może zostać rozszerzona na kolejne gatunki, które mają być identyfikowane i oznaczane ilościowo jednocześnie.

Maksymalna liczba jest ograniczona jedynie szybkością skanowania spektrometrii mas. Technika ta toruje naukowcom drogę do wykorzystania odcisków palców pepto w obszarach takich jak ochrona konsumentów i marki.