Name: Oznaczanie gatunków i oznaczanie ilościowe w mieszaninach z zastosowaniem spektrometrii mas MRM peptydów stosowanych do weryfikacji autentyczności mięsa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji i ilościowego oznaczania gatunków w surowych mieszaninach mięsa przy użyciu spektrometrii mas MRM. Technika ta umożliwia wykrycie nawet 1% mięsa końskiego w wołowinie, zapewniając szybką i niezawodną analizę w zakresie bezpieczeństwa żywności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Instytutu Badań nad Żywnością BBSRC Core Strategic Grant, BBSRC Project BB/J004545/1.

1. Proteoliza i analiza mioglobin referencyjnych
<ol>
	<li>Proteoliza mioglobin referencyjnych
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory oczyszczonych mioglobin odniesienia (zakres 0,2 - 0,5 mg/ml w 25 mM wodorowęglanie amonu)3.</li>
		<li>Przenieść 1 ml podwielokrotności każdej próbki do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Termiczną denaturację wyekstrahowanych białek poprzez ogrzewanie próbki w gorącym bloku w temperaturze 95 °C przez 30 minut. Schładzać próbkę przez około 15 minut, aż osiągnie temperaturę pokojową. Dodać 30 mg mocznika (końcowe stężenie 0,5 M) w celu poprawy trawienia, a następnie wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proteoliza tryptyczna
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór trypsyny o stężeniu 1 mg/ml w 25 mM wodorowęglanu amonu i przechowywać na lodzie w razie potrzeby. Dodać wystarczającą ilość trypsyny, tak aby końcowa aktywność enzymu wynosiła 420 BAEE (chlorowodorek estru etylowego N-benzoilo-L-argininy) jednostek/mg wyekstrahowanego białka, następnie wymieszać przez delikatne wirowanie i pozostawić do proteolizy przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przeprowadzić elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE)17, aby wykazać kompletność proteolizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsalanie próbki po proteolizie
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:2 v:v wodą.</li>
		<li>Aktywować polimerowy wkład z odwróconymi fazami (RP) wypełniony materiałem o stężeniu 30 mg RP, dodając 1 ml metanolu, a następnie zrównoważyć wkład, dodając 1 ml 1% kwasu mrówkowego.</li>
		<li>Załaduj próbkę do wkładu pod wpływem grawitacji.</li>
		<li>Przemyć 1 ml 5% metanolu/1% kwasu mrówkowego pod wpływem grawitacji.</li>
		<li>Eluować peptydy za pomocą 1 ml acetonitrylu/wody (90:10 v:v; 0,1% kwasu mrówkowego) pod wpływem grawitacji do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml wstępnie napełnionych 5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
		<li>Usunąć rozpuszczalnik w próżni w temperaturze 50 °C za pomocą parownika odśrodkowego przez 120 minut, a następnie ponownie rozpuścić pozostałość w 250 μl acetonitrylu/wody (3:97 v:v; 0,1% kwas mrówkowy).</li>
		<li>Przenieść roztwór do fiolki z automatycznym próbnikiem o małej objętości. 
		Uwaga: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do analizy metodą chromatografii mas metodą chromatografii cieczowej (LC/MS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie list przejść dla MRM
	<ol>
		<li>Zlokalizuj sekwencje mioglobiny dla różnych mięs z bazy danych UniProt .</li>
		<li>Wprowadź sekwencje mioglobiny do pola "Cel" w oprogramowaniu do przewidywania peptydów i przejść (np. Skyline). W razie potrzeby najedź kursorem na peptyd, aby wyświetlić jego listę fragmentów.</li>
		<li>Kliknij "Ustawienia" i wybierz "Ustawienia peptydów". Wprowadź preferencje dotyczące trawienia (tj. trypsyna) i liczbę pominiętych rozszczepień (0). Wprowadź wymagany wybór dla dodatkowych parametrów, w szczególności długości peptydu (6 - 25), wykluczeń N-końcowych (0) i zakładanych modyfikacji aminokwasów (brak).</li>
		<li>Kliknij "Ustawienia" i wybierz "Ustawienia przejścia". Wybierz preferencje dla typu instrumentu używanego do analizy LC/MS.</li>
		<li>Kliknij "Eksportuj" i wybierz "Lista przejść", aby utworzyć arkusz kalkulacyjny zawierający wygenerowane przejścia i parametry MRM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza metodą LC/MS
	<ol>
		<li>Skonfiguruj system gradientu binarnego (woda (A) i acetonitryl (B), każdy z 0,1% kwasem mrówkowym v:v) wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC) z automatycznym samplerem, kolumną HPLC z rdzeniem C18 (10 cm x 2,1 mm, wielkość cząstek 2,6 μm) podłączoną do potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego działającego w trybie dodatniego elektrorozpylania z detekcją MRM.</li>
		<li>W oprogramowaniu do zbierania danych (np. Analityk) wybierz "Plik" i "Nowy", a następnie kliknij "Metoda pozyskiwania" w wyskakującym okienku, a następnie kliknij "OK". 
		Uwaga: Spowoduje to otwarcie edytora metody instrumentu, który zawiera listę podłączonych urządzeń, które umożliwią konfigurację nowej metody LC/MS.</li>
		<li>Kliknij "Pompa binarna" i wprowadź wartość natężenia przepływu (300 μl/min) oraz czasy gradientu w tabeli, ustawiając binarny profil gradientu od 3% B do 30% B w ciągu 22 minut, zwiększając do 100% B po 23 minutach przez 5 minut wymywania przed powrotem do warunków początkowych i ponownej równowagi przez kolejne 6 minut.</li>
		<li>Kliknij na "Autosampler" i wprowadź objętość iniekcji (5 μl). Włącz "Cykl mycia igły" i wprowadź "Czas prania" (30 sekund) i wybierz "Port spłukiwania".</li>
		<li>Kliknij "Termostatowany regulator kolumny" i w "Właściwościach pieca kolumnowego" ustaw "Lewą temperaturę" i "Prawą temperaturę" (40 °C).</li>
		<li>Kliknij "Spektrometr mas", a następnie kliknij "Edytuj parametry", aby wprowadzić warunki gazu źródłowego. Wybierz "Typ skanowania" jako "MRM(MRM)" i "Polaryzacja" jako "Pozytywna". Przejdź do "Podsumowanie okresu" i wprowadź "Czas trwania", całkowity czas analizy LC i równoważenia (35 min).</li>
		<li>W tabeli kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Potencjał deklastrowania (DP)" i "Energia zderzenia (CP)", aby dodać te kolumny do tabeli. Wprowadź wartości Q1, Q3, czasu (ms), ID, DP i CE dla wszystkich przemian, dla pojedynczego gatunku mięsa, utworzonych na liście przejść (patrz krok 1.4.5). 
		Uwaga: Czas (ms) odnosi się do czasu przebywania, czasu, jaki spektrometr masowy spędza na skanowaniu każdego przejścia, którego suma nie powinna przekraczać 3 sekund.</li>
		<li>Zapisz plik Metody pozyskiwania (rozszerzenie pliku .dam). 
		Uwaga: Kroki 1.5.2 - 1.5.8 należy powtórzyć dla każdego gatunku mięsa. Spowoduje to utworzenie jednego pliku metody dla każdego gatunku mięsa w trybie ekranowym w ramach przygotowań do poniższej analizy.</li>
		<li>W oprogramowaniu do zbierania danych kliknij "Acquire" (Pobierz) i wybierz opcję "Equilibrate'. W oknie, które się otworzy, wybierz wymaganą metodę akwizycji, aby rozpocząć równoważenie instrumentu.</li>
		<li>Umieść fiolki z próbkami w stojaku w próbniku automatycznym.</li>
		<li>Kliknij "Plik" i wybierz "Nowy", a następnie "Partia przejęcia". W zakładce 'Sample' wybierz 'Add Set', a następnie 'Add Samples'. Wprowadź liczbę próbek do analizy i kliknij przycisk "OK". W polu "Akwizycja" wybierz z menu rozwijanego plik metody, który zostanie użyty do analizy.</li>
		<li>W tabeli wybierz opcję "Kod tablicy" i wybierz odpowiednią konfigurację tacy z menu rozwijanego. Kliknij lewym przyciskiem myszy nagłówek kolumny "Kod płyty", a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Wypełnij". W polu "Pozycja fiolki" należy wprowadzić pozycję każdej próbki w próbniku automatycznym w wierszach.</li>
		<li>W polu "Plik danych" wprowadź nazwę pliku do pobrania, następnie kliknij lewym przyciskiem myszy nagłówek kolumny, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję "Wypełnij". W polu "Nazwa próbki" należy wpisać tożsamość każdej z próbek, które mają zostać poddane analizie. Zapisz jako plik wsadowy akwizycji (rozszerzenie pliku .dab).</li>
		<li>Kliknij zakładkę "Prześlij", a następnie zaznacz próbki, które muszą zostać przeanalizowane na LC/MS. Kliknij na "Prześlij". Kliknij "Pobierz" i "Rozpocznij próbkę", aby rozpocząć analizę. 
		Uwaga: Każda metoda akwizycji będzie skanować w poszukiwaniu przejść MRM na całej długości chromatografu dla pojedynczego gatunku mięsa. Ustawienia spektrometru mas do akwizycji MRM różnią się w zależności od typu instrumentu i peptydu.</li>
		<li>Przeglądaj wygenerowane pliki danych za pomocą oprogramowania do przeglądania danych. Kliknij na XIC (wyekstrahowane jony) i na liście rozwijanej zaznacz wszystkie fragmenty (wartości Q3) dla pojedynczego prekursora (Q1). Otworzy się nowy panel, który pokazuje tylko wybrane przejścia.</li>
		<li>Zapisać czas retencji (Rt) dla grup jednoczesnych przejść, ponieważ odpowiadają one pojedynczemu peptydowi.</li>
		<li>Powtórz poprzednie dwa kroki dla każdego zestawu przejść w celu przypisania pików do odpowiednich peptydów dla każdego z gatunków mięsa.</li>
		<li>Zapisać peptydy markerowe, które są odpowiednie do identyfikacji gatunku (np. peptyd HPGDFGADAQGAMTK, prekursor m/z = 752, Rt = 12,0 min, dla konia), wraz z ich czasami retencji, i zanotować, które tworzą odpowiadające im pary odpowiednie do względnego oznaczania ilościowego. 
		Uwaga: Na przykład peptyd markerowy konia (prekursor m/z = 752) ma odpowiadający mu peptyd wołowy, HPSDFGADAQAAMSK (prekursor m/z = 767, Rt = 13,2 min).</li>
		<li>W celu stworzenia jednej metody dynamicznej obejmującej wszystkie gatunki mięsa, w oprogramowaniu do przeglądania danych, dla każdego gatunku mięsa po kolei, otwórz dane przejścia XIC dla każdego prekursora (przypisanego do określonego peptydu w 1.5.8).</li>
		<li>Powiększ klaster szczytowy w wybranym czasie przechowywania, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając kursor poniżej klastra. Zidentyfikuj najbardziej intensywne przejścia (klikając prawym przyciskiem myszy etykietę szczytu).</li>
		<li>Ręcznie rejestruj przejścia i czasy przechowywania w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
		<li>Aby wprowadzić parametry jako nową metodę dynamiczną w oprogramowaniu LC/MS, kliknij "Spektrometr mas", a następnie kliknij "Edytuj parametry", aby wprowadzić warunki gazu źródłowego. Wybierz "Typ skanowania" jako "MRM(MRM)" i "Polaryzacja" jako "Pozytywna".</li>
		<li>Przejdź do "Podsumowanie okresu" i wprowadź czas trwania (ustawiony jako całkowity czas dla analizy i równoważenia LC). W tabeli kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Potencjał deklastrowania (DP)" i "Energia zderzenia (CP)", aby dodać te kolumny do tabeli. 
		Uwaga: kolumna "Czas" odnosi się teraz do oczekiwanego czasu przechowywania (min) dla każdego przejścia.</li>
		<li>W sekcji "Edytuj parametry" w oprogramowaniu do zbierania danych LC/MS zaznacz pole "Zaplanowane MRM". Wprowadź wartości Q1, Q3, czasu (min), ID, DP i CE dla przejść utworzonych w arkuszu kalkulacyjnym (1.5.21) i zapisz metodę akwizycji (rozszerzenie pliku .dam). 
		Uwaga: Ta metoda zazwyczaj zmniejsza liczbę przejść MRM do 4 najbardziej intensywnych dla każdego peptydu i skanuje tylko w oknie czasu retencji dla każdego piku peptydu, zapewniając lepszą czułość i jakość danych. Metoda "dynamiczna" to metoda "kontrolowanego okna czasu przechowywania", czasami nazywana planowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie i analiza próbek kalibracyjnych
<ol>
	<li>Ekstrakcja mieszanek mięsnych
	<ol>
		<li>Używając mięsa uprzednio zamrożonego, a następnie zmielonego na proszek, przygotuj szereg mieszanek mięsnych, ważąc odpowiednie ilości mięsa (całkowita masa około 300 mg) w plastikowych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać 4 ml buforu ekstrakcyjnego (0,15 M chlorek potasu + 0,15 M bufor fosforanowy o pH 6,5). Wir przez 30 sek. Ekstrahować na wytrząsarce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przy 250 cyklach/min. 
		Uwaga: Cykle/min odnoszą się do ruchu oscylacyjnego.</li>
		<li>Przenieść 2 ml ekstraktu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 17 000 x g.</li>
		<li>Przenieść 200 μl podwielokrotności supernatantu (rezerwując niewielką ilość do oznaczania białka, patrz 2.2) do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml i wysuszyć za pomocą parownika odśrodkowego (wstępnie ustawiony program: 50 °C, bez odpowietrzania i czas trwania 120 min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test białka
	<ol>
		<li>Przenieść 7 μl podwielokrotności zarezerwowanego supernatantu (patrz 2.1.4) w trzech egzemplarzach do studzienek płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Przenieść 7 μl podwielokrotności szeregu wzorców białkowych w trzech egzemplarzach, w zakresie 0 - 1,0 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), na tę samą płytkę 96-dołkową.</li>
		<li>Dodać 200 μl odczynnika do oznaczania białek Coomassie plus do każdego dołka.</li>
		<li>Porównaj wizualnie kolor studzienek próbki z wzorcami białka, aby sprawdzić, czy próbki mieszczą się w zakresie wzorców kalibracyjnych. W razie potrzeby powtórzyć czynność z rozcieńczoną próbką, aby znalazła się w zakresie.</li>
		<li>Odstaw talerz na 3 minuty.</li>
		<li>Rozbij wszelkie pęcherzyki, które się utworzyły, za pomocą igły podskórnej.</li>
		<li>Przeanalizuj płytkę na czytniku płytek przy użyciu standardowego protokołu punktu końcowego o długości fali 595 nm.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie białka w próbkach, korzystając z danych kalibracyjnych z wzorców białka. 
		Uwaga: Jest to wymagane do obliczenia ilości trypsyny użytej w trawieniu tryptycznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proteoliza mieszanek mięsnych
	<ol>
		<li>Ponownie rozpuścić wysuszoną pozostałość z etapu 2.1.4 w 1 ml 25 mM roztworu wodorowęglanu amonu. Dobrze wymieszaj na rotamixerze.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem od kroków 1.1.3 do 1.3.7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza metodą LC/MS
	<ol>
		<li>Skonfiguruj LC/MS jak poprzednio (krok 1.5.1).</li>
		<li>Utwórz nową partię akwizycji, jak opisano wcześniej (kroki 1.5.9 - 1.5.14), wybierając metodę pozyskiwania utworzoną w kroku 1.5.24, która wykorzystuje dynamiczną metodę LC/MS łączącą wszystkie gatunki mięsa, i uzyskaj dane dla próbek strawionego mięsa.</li>
		<li>Wyświetlić pełny chromatogram w oprogramowaniu do przeglądania danych. Wyświetla XIC dla każdego zestawu przejść po kolei. Potwierdź wzrokowo, że każda grupa zawiera wymaganą liczbę pików w kształcie dzwonu w oczekiwanym czasie retencji, potwierdzając w ten sposób istnienie wybranego peptydu.</li>
		<li>Wykonaj ocenę ilościową za pomocą oprogramowania do przeglądania danych, aby zintegrować obszary pików dla każdego z interesujących Cię przejść, klikając dwukrotnie opcję "Zbuduj metodę kwantyfikacji" na pasku nawigacyjnym.</li>
		<li>W okienku "Wybierz próbkę" wybierz "Plik danych" i "Próbkę" do analizy, aby wygenerować tabelę "Anality".</li>
		<li>Kliknij zakładkę "Integracja", aby wyświetlić pierwsze z przejść (analitów), które mają zostać zintegrowane.</li>
		<li>Kliknij pole "Analit", aby wyświetlić rozwijaną listę przejść. Wybierz kolejno każde przejście, aby je wyświetlić i wizualnie potwierdzić, że do integracji wybrano właściwy pik. Aby zmodyfikować lub wymusić integrację, kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij kursor nad docelowy szczyt (zostanie on podświetlony na zielono). Kliknij przycisk "Wybierz szczyt" i kliknij "Zastosuj".</li>
		<li>Zapisz obszar roboczy jako plik metody (.qmf). 
		Uwaga: Spowoduje to utworzenie pliku metody kwantyfikacji do późniejszego obliczenia powierzchni pików próbki.</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie "Kreator kwantyfikacji" na pasku nawigacyjnym. W oknie "Wybierz próbki" utwórz "Zestaw ilościowy", wybierając pojedynczy "Plik danych", a następnie jedną lub więcej "Dostępne próbki". Wybierz "Dalej", aby wyświetlić pole "Wybierz ustawienia i zapytanie". Pozostaw ustawienia domyślne, wybierz "Dalej", aby wyświetlić "Wybierz metodę". Z rozwijanego pola "Metoda" wybierz plik "Metoda integracji" utworzony w kroku 2.4.8, a następnie wybierz "Zakończ". 
		Uwaga: W ten sposób tworzona jest "Tabela wyników", zawierająca obszary pików przejściowych powstających w wyniku mieszanek mięsnych.</li>
		<li>Zapisz 'Tabelę wyników' (rozszerzenie pliku .rdb), wyeksportuj jako plik tekstowy (.txt) i otwórz go w arkuszu kalkulacyjnym, aby przejrzeć dane.</li>
		<li>Wykreśl wykresy procentu (według obszaru piku przejściowego) jednego mięsa w innym w porównaniu z zmierzonym procentem (w/w) dwóch mięs dla wybranego MRM dla wybranych przejść z odpowiednich peptydów, koncentrując się na tych przypadkach, w których dwa fragmenty zawierają taką samą liczbę aminokwasów, jak liczona od końca C-końcowego. 
		Uwaga: Identyczne fragmenty z identycznymi miejscami fragmentacji dają optymalne wyniki.</li>
		<li>Należy zbadać wykresy z ppkt 2.4.11 powyżej. Wizualnie lub za pomocą narzędzia linii trendu w pakiecie kreślenia zidentyfikuj grupę wykresów, które są zarówno liniowe, jak i o podobnym nachyleniu. Użyj jednej lub więcej z tych kombinacji CPCP plus fragmentów do kalibracji w prawdziwych próbkach mięsa. 
		Uwaga: Wykres przedstawiający nietypowy gradient może wskazywać na tłumienie peptydów lub fragmentów, co w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia siły sygnału. Wykresy nieliniowe mogą wskazywać na słabą detekcję pików lub inne problemy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Próbki mięsa
<ol>
	<li>Ekstrakcja białek z docelowych próbek mięsa
	<ol>
		<li>W stosownych przypadkach należy wyciąć z próbki obcy materiał niemięsny za pomocą szpatułki. Na przykład zeskrob sos i makaron ze schłodzonej lasagne.</li>
		<li>Odważyć 20 g mięsa do metalowej zlewki.</li>
		<li>Dodać 100 ml 0,15 M buforu chlorku potasu/0,15 M monofosforanu potasu o pH 6,5.</li>
		<li>Wyekstrahuj białka, mieszając mięso w homogenizatorze wysokoobrotowym przez 1 minutę.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem z kroku 2.1.4 - 2.3.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza próbek metodą LC/MS
	<ol>
		<li>Powtórz krok 2.4.2, aby uzyskać dane przy użyciu metody dynamicznej LC/MS.</li>
		<li>Zidentyfikuj peptydy z każdej mioglobiny mięsnej, jak to opisano w kroku 2.4.3.</li>
		<li>Do oznaczania ilościowego należy użyć oprogramowania do oznaczania ilościowego, aby zintegrować obszary pików dla każdego interesującego przejścia, jak opisano w kroku 2.4.9.</li>
		<li>W celu identyfikacji gatunków w mieszaninie należy zapisać te peptydy markerowe spełniające uzgodnione kryteria liczby przejść i sygnał do szumu w odniesieniu do tych przejść.</li>
		<li>Do oznaczania ilościowego należy użyć zintegrowanych obszarów pików przejściowych, jak uzgodniono w kroku 2.4.12, a następnie obliczyć procentową zawartość mioglobiny w odniesieniu do powierzchni piku przejściowego, w odniesieniu do dwóch gatunków w mieszaninie.</li>
		<li>Wykorzystać wcześniejszą wiedzę z literatury18 na temat prawdopodobnych poziomów mioglobiny w mięsie, aby oszacować względne ilości wagowe dwóch rodzajów mięsa obecnych w próbce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>O'Mahony, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+horse+meat+in+beef+products-a+global+problem%5BTitle%5D)+AND+%22QJM-An+Int.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Finding horse meat in beef products-a global problem.</a> QJM-An Int. J. Med. 106, 595-597 (2013).</li>
<li>Sentandreu, M. A., Sentandreu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Authenticity+of+meat+products%3A+Tools+against+fraud%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Authenticity of meat products: Tools against fraud.</a> Food Res. Int. 60, 19-29 (2014).</li>
<li>Watson, A. D., Gunning, Y., Rigby, N. M., Philo, M., Kemsley, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meat+Authentication+via+Multiple+Reaction+Monitoring+Mass+Spectrometry+of+Myoglobin+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Meat Authentication via Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry of Myoglobin Peptides.</a> Anal. Chem. 87, 10315-10322 (2015).</li>
<li>Food Standards Agency. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Report+of+the+investigation+by+the+Food+Standards+Agency+into+incidents+of+adulteration+of+comminuted+beef+products+with+horse+meat+and+DNA%22">Report of the investigation by the Food Standards Agency into incidents of adulteration of comminuted beef products with horse meat and DNA</a>. , (2013).</li>
<li>Taylor, A. J., Linforth, R., Weir, O., Hutton, T., Green, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+electrospray+mass-spectrometry+for+meat+pigment+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Science%22%5BJournal%5D)">Potential of electrospray mass-spectrometry for meat pigment identification.</a> Meat Science. 33, 75-83 (1993).</li>
<li>Ponce-Alquicira, E., Taylor, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+ESI-CID-MS%2FMS+analysis+of+myoglobins+from+different+meat+species%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species.</a> Food Chem. 69, 81-86 (2000).</li>
<li>Gallien, S., Duriez, E., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring+applied+to+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring applied to proteomics.</a> J. Mass Spectrom. 46, 298-312 (2011).</li>
<li>Orduna, A. R., Husby, E., Yang, C. T., Ghosh, D., Beaudry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+meat+authenticity+using+bioinformatics%2C+targeted+peptide+biomarkers+and+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Addit.+Contam.+Part+A-Chem%22%5BJournal%5D)">Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry.</a> Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1709-1717 (2015).</li>
<li>Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+peptides+for+horse+meat+speciation+in+highly+processed+foodstuffs%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Addit.+Contam.+Part+A-Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs.</a> Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).</li>
<li>von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meat+Authentication%3A+A+New+HPLC-MS%2FMS+Based+Method+for+the+Fast+and+Sensitive+Detection+of+Horse+and+Pork+in+Highly+Processed+Food%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food.</a> J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).</li>
<li>von Bargen, C., Dojahn, J., Waidelich, D., Humpf, H. U., Brockmeyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Sensitive+High-Performance+Liquid+Chromatography+Tandem+Mass+Spectrometry+Method+for+the+Detection+of+Horse+and+Pork+in+Halal+Beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">New Sensitive High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Horse and Pork in Halal Beef.</a> J. Agric. Food Chem. 61, 11986-11994 (2013).</li>
<li>Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Authentication+of+processed+meat+products+by+peptidomic+analysis+using+rapid+ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry.</a> Food Chem. 187, 297-304 (2015).</li>
<li>Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Peptide+markers+for+authentication+purposes+in+raw+and+cooked+meat+using+ambient+liquid+extraction+surface+analysis+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).</li>
<li>Sentandreu, M. A., Fraser, P. D., Halket, J., Patel, R., Bramley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proteomic-Based+Approach+for+Detection+of+Chicken+in+Meat+Mixes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A Proteomic-Based Approach for Detection of Chicken in Meat Mixes.</a> J. Proteome Res. 9, 3374-3383 (2010).</li>
<li>Elliott, M. H., Smith, D. S., Parker, C. E., Borchers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Current trends in quantitative proteomics.</a> J. Mass Spectrom. 44, 1637-1660 (2009).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE, Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2016).</li>
<li>Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeeton%2C+JT+%22Encyclopedia+of+Meat+Sciences%22">Encyclopedia of Meat Sciences</a>. Devine, C., Dikeman, M. 1, Academic Press. 235-243 (2014).</li>
<li>Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Peptide+Markers+for+Authentication+Purposes+in+Raw+and+Cooked+Meat+Using+Ambient+Liquid+Extraction+Surface+Analysis+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Peptide Markers for Authentication Purposes in Raw and Cooked Meat Using Ambient Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ważny jest wybór odpowiedniego białka docelowego. Dobre białko docelowe musi mieć odpowiednie formy u gatunków będących przedmiotem zainteresowania, wystarczającą zmienność sekwencji zależną od gatunku, specyficzność gatunkową i występować w dostępnych ilościach w organizmach. Do oceny mieszanin, które zostały poddane przetwarzaniu (na przykład obróbce cieplnej), pożądane jest białko o sekwencji stosunkowo odpornej na to przetwarzanie. Mioglobina jest dobrym kandydatem do czerwonego mięsa, w tym gotowanego czerwonego mięsa, ale nie jest jedyną możliwością. Po ustaleniu białka docelowego najbardziej krytyczną częścią protokołu jest proteoliza białka. Białko inne niż mioglobina może wymagać alternatywnego protokołu proteolizy.
Opisany protokół obejmuje segment oparty na referencyjnym oczyszczonym białku. Ma to na celu odkrycie okien czasowych retencji oraz odpowiednich jonów prekursorowych i fragmentacyjnych. Ten segment jest bardzo pomocny, ale nie jest niezbędny.
Chociaż odpowiadające sobie pary peptydów z dwóch interesujących gatunków można wymienić nawet bez eksperymentu, czasami zdarza się, że różnica w sekwencji ma dramatyczne konsekwencje dla profilu trawienia. Na przykład para peptydów VLGFHG (wołowina) i ELGFQG (koń) daje nietypowy wynik kwantyfikacji (objawiający się jako gradient mniejszy niż jeden na rysunku 2). Dzieje się tak, ponieważ ten ostatni peptyd powstaje w wyniku stosunkowo stłumionego rozszczepienia K-E, co powoduje niedoszacowanie poziomu konia w mieszance. Dlatego najlepiej unikać odpowiednich peptydów zaczynających się od różnych aminokwasów. Często fragmenty z dwóch odpowiadających sobie peptydów mają identyczne sekwencje aminokwasów i są dobrze wychowane, ale nie zawsze tak jest i należy to sprawdzić podczas opracowywania metody. Identyfikacja gatunków jest znacznie mniej wrażliwa na te kwestie niż względna ilość.
Protokół został zademonstrowany w odniesieniu do czterech sztuk mięsa czerwonego3. Można uwzględnić dodatkowe gatunki mięsa, chociaż jakość kształtu piku przejściowego może ulec pogorszeniu, jeśli zbyt wiele peptydów markerowych ulega koelucji, skutecznie skracając czas przebywania i ostatecznie pogarszając względne szacunki ilościowe. Ulepszone oprzyrządowanie, które jest już dostępne, poprawi ten cel. Powiązaną kwestią jest to, że nie wszystkie mięsa mają różne mioglobiny. Na przykład mioglobiny konia, osła i zebry są identyczne, a zatem ściśle mówiąc, metoda jest w stanie wykryć konia, osła lub zebrę tylko w wołowinie. W niektórych przypadkach, mimo że mioglobiny nie są identyczne, niektóre kluczowe peptydy mogą być. Na przykład niektóre peptydy markerowe pochodzące z mioglobiny jagnięcej pojawiają się również u kóz.
Komplikacją stojącą przed tą i każdą inną metodą oznaczania ilościowego opartą na białkach jest to, że poziom białka musi być przyjęty jako stały dla wszystkich gatunków, jeśli poziomy białka lub peptydów mają być trywialnie równe poziomom mięsa w mieszance. W przypadku mioglobiny i czterech czerwonych mięs nie jest to uniwersalna prawda. Ogólnie rzecz biorąc, poziomy są zależne od gatunku, przy czym wieprzowina wykazuje najniższy poziom z tych czterech. Ponadto poziom mioglobiny zmienia się w zależności od kawałka mięsa i wieku zwierzęcia. Tak więc, chociaż proporcje obszarów pików przejściowych są wiarygodnie odwzorowane na proporcjach mioglobiny, odwzorowanie na stosunek rzeczywistego mięsa jest oszacowaniem opierającym się na założeniach dotyczących prawdopodobnych źródeł mięsa w mieszance.
Podejście przedstawione w tej pracy różni się pod wieloma względami od innych opublikowanych wkładów. Bardziej typową drogą jest zastosowanie metod proteomicznych do identyfikacji różnych zależnych od gatunku peptydów markerowych, w którym to przypadku markery dla różnych gatunków nie mają ze sobą szczególnego związku8-12,14,19. W przeciwieństwie do tego, wybraliśmy białka wspólne dla wszystkich interesujących gatunków, aż do wariantów sekwencji zależnych od gatunku3. Oprócz tego, że ma to kluczowe znaczenie dla naszej strategii względnej oceny ilościowej, ma to tę zaletę, że strategie przygotowania próbek można zoptymalizować. Ponadto można oczekiwać, że takie odpowiadające im białka będą zachowywać się podobnie, na przykład podczas ekstrakcji lub komercyjnego przetwarzania próbek, takich jak gotowanie lub konserwowanie. Identyfikacja gatunku zwykle przebiega następnie poprzez wykrywanie różnych peptydów markerowych, podczas gdy w podejściu CPCP identyfikacja gatunków przebiega poprzez wykrywanie blisko spokrewnionych peptydów posiadających zazwyczaj jedną lub dwie różnice w sekwencji. Wreszcie, kwantyfikacja białek w celu oszacowania procentu wagowego jednego gatunku w innym może konwencjonalnie przebiegać poprzez bezwzględną ocenę ilościową każdego białka osobno w oparciu o znane standardy7,14,15. Jednak w przypadku metody CPCP nie ma potrzeby stosowania metod kalibracji. Zamiast tego poziomy względne szacuje się, porównując siły sygnału dwóch odpowiadających sobie peptydów z dwóch gatunków, całkowicie pomijając etap pomiaru bezwzględnego. Ponieważ ostatecznym celem jest procentowy udział wagowy jednego gatunku w innym, względna ocena ilościowa, CPCP jest zarówno bardziej bezpośredni, jak i prostszy niż porównywanie dwóch bezwzględnych pomiarów ilościowych. Cechy te przekładają się na krótki czas eksperymentowania, który ma wynosić około dwóch godzin przy użyciu udoskonalonych protokołów, co sprawia, że technika ta jest przydatna jako narzędzie szybkiego nadzoru w dziedzinie wykrywania oszustw związanych z żywnością.

Europejski skandal z 2013 roku, w którym niezadeklarowane mięso końskie zostało znalezione w wielu produktach z wołowiny sprzedawanej w supermarketach1, podkreśla potrzebę metod testowania zdolnych do wykrywania i mierzenia oszustw związanych z żywnością w mięsie. Zbadano kilka technologii, w szczególności test immunoenzymatyczny (ELISA) i metody oparte na DNA2. Alternatywna metoda, oparta na spektrometrii mas, skupia się na peptydach specyficznych dla gatunku, które z kolei powstają z białek specyficznych dla danego gatunku. Poniżej przedstawiamy jedno z takich podejść opartych na peptydach, które oferuje zarówno identyfikację, jak i względną ocenę ilościową gatunków domieszek w mieszance mięsnej3. 
Protokół jest sformułowany w kontekście czerwonych mięs i chęci określenia obecności jednego w drugim na poziomie 1% wagowym, poziomie uważanym przez niektórych za reprezentujący fałszywe zafałszowanie żywności, a nie zanieczyszczenie4. Metoda ta opiera się przede wszystkim na identyfikacji białka, które jest nominalnie "takie samo" we wszystkich docelowych mięsach. Mioglobina, białko odpowiedzialne za czerwony kolor mięsa, jest dobrym kandydatem, ponieważ występuje w dużych ilościach, jest stosunkowo tolerancyjne na ciepło i rozpuszczalne w wodzie, a wcześniej było używane do oznaczania gatunków mięsa5,6. Na przykład mioglobiny dla wołowiny (Bos Taurus), wieprzowiny (Sus scrofa), koni (Equus caballus) i jagnięciny (Ovis aries)3 są nominalnie takie same, zgodnie z wymaganiami, ale ich sekwencje nie są identyczne. Takie grupy "podobnych, ale różnych" białek, takie jak te cztery mioglobiny, można wygodnie opisać jako "odpowiadające im białka". Różnice w sekwencji tych czterech mioglobin są specyficzne dla gatunku: na przykład pełne białka mioglobiny dla bydła mięsnego i konia, odpowiednio P02192 i P68082, zawierają 154 aminokwasy z 18 różnicami w sekwencji między nimi. Podlegając proteolizie przy użyciu trypsyny, białka te wytwarzają dwa zestawy peptydów, z których niektóre są identyczne, a niektóre wykazują jedną lub więcej różnic aminokwasów specyficznych dla gatunku: odpowiednie białka dają zatem początek odpowiadającym im peptydom. 
Podejście CPCP ma zatem na celu najpierw zidentyfikowanie białek z dwóch lub więcej gatunków, w przypadku gdy białka te wykazują ograniczone warianty sekwencji specyficznych dla gatunku. Są to odpowiednie białka. W wyniku proteolizy odpowiednie białka dają początek peptydom, z których niektóre wykazują również specyficzne dla gatunku warianty sekwencji odziedziczone po białku macierzystym. Są to odpowiadające im peptydy. Podejście CPCP można wykorzystać do porównania poziomów dwóch odpowiadających sobie białek w próbce mieszanego gatunku poprzez monitorowanie poziomów odpowiednich peptydów.
Naturalną technologią wykrywania znanych peptydów jest wielokrotna spektrometria mas monitorująca reakcje, czyli MRM-MS7. Peptydy specyficzne dla gatunku dają jony prekursorowe, które wraz z jonami fragmentacyjnymi spektrometrii mas można łatwo wyszczególnić z wyprzedzeniem za pomocą narzędzi programowych. Listy te są następnie wykorzystywane do instruowania spektrometru mas, aby rejestrował tylko określone pary jonów prekursor plus fragment, zwane przejściami. Konkretny peptyd docelowy jest zatem identyfikowany nie tylko na podstawie czasu jego retencji w chromatografii poprzedzającej spektrometr masowy, ale także na podstawie zestawu przejść mających wspólny jon prekursorowy. Jest to wysoce selektywny sposób wykrywania znanych peptydów, który efektywnie wykorzystuje zasoby spektrometru mas.
Inni autorzy używali spektrometrii mas do testowania zafałszowań mięsa za pomocą markerów peptydowych, ale z różnych białek8-14. Stosowanie odpowiednich białek, odpowiednich peptydów (CPCP) oznacza jednak, że warunki eksperymentalne mogą być optymalizowane, co pomaga w identyfikacji gatunków w mieszaninie na podstawie znanych przemian specyficznych dla gatunku. Ponadto odpowiednie białka i peptydy będą na ogół zachowywać się podobnie na etapach ekstrakcji, proteolizy i wykrywania. Ponieważ obszary pików przejściowych są ilościowe i odtwarzalne, proporcje powierzchni pików wynikające z par odpowiadających sobie peptydów z różnych gatunków zapewniają bezpośrednie oszacowanie względnych ilości dwóch mięs w mieszance. Z kolei bardziej tradycyjne metody oznaczania ilościowego wykorzystują kalibracje oparte na materiałach referencyjnych w celu ustalenia bezwzględnej oceny ilościowej14,15.
Chociaż protokół jest opisany w kontekście mioglobiny i mięsa, białka inne niż mioglobina mogą być używane do identyfikacji i względnej kwantyfikacji za pomocą strategii CPCP w mieszankach mięsnych, choć potencjalnie z modyfikacjami protokołu. Ponadto strategia ta ma również zastosowanie do mieszanin binarnych innych gatunków, które mają wspólne jedno lub więcej odpowiadających im białek.
Punktem wyjścia dla protokołu jest oczyszczona 'referencyjna' mioglobina, którą dla niektórych gatunków można kupić, ale dla innych trzeba przygotować za pomocą konwencjonalnej chromatografii wykluczającej rozmiar. Procedura przygotowania mioglobiny referencyjnej nie jest zawarta w protokole, ale jest opisana w innym miejscu3. Narzędzia programowe16 służą do sporządzania wykazu peptydów kandydujących i przejść wynikających z mioglobin będących przedmiotem zainteresowania. Każda mioglobina referencyjna jest poddawana proteolizie, a powstałe peptydy są analizowane za pomocą chromatografii cieczowej z jonizacją elektronrozpylaną i tandemową spektrometrią mas (LC-ESI-MS / MS) w celu ustalenia, które z kandydujących jonów prekursorowych i przejść są najbardziej przydatne oraz w celu określenia pasujących czasów retencji peptydów. Wynikiem tego etapu jest poprawiona lista peptydów docelowych wraz z ich przejściami, odpowiednia do określenia gatunku, oraz lista par CPCP, odpowiednich do względnej oceny ilościowej. Aby przetestować prawdziwe mięso, przygotowuje się ekstrakcje próbek, a następnie poddaje się je proteolizie w celu wytworzenia peptydów zarówno z mioglobiny, jak i innych obcych białek. Peptydy na bazie mioglobiny są następnie monitorowane przez LC-ESI-MS/MS na podstawie ich wymienionych przejść. Gatunki obecne w mieszaninie identyfikuje się na podstawie pików przejściowych związanych z peptydami markerowymi. Oszacowania względnych ilości dwóch mięs w mieszance binarnej oblicza się przy użyciu stosunków powierzchni pików przejściowych. Zestaw badanych mieszanin par mięs pozwoli na sprawdzenie stosunku powierzchni pików dla danej pary przejść i skalibrowanie ich w stosunku do rzeczywistych mieszanek.

<table><tbody><tr><td>Baza danych Uniprot</td> <td><a href="http://www.uniprot.org/">www.uniprot.org</a></td><td></td><td>Swobodnie dostępna baza danych sekwencji białek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Skyline</td><td><a href="http://www.skyline.gs.washington.edu/">www.skyline.gs.washington.edu</a></td><td></td><td>Darmowe oprogramowanie do pobrania, które umożliwia tworzenie ukierunkowanych metod do badań proteomicznych, peptydów i fragmentów Prognozy&nbsp;</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Wielka Brytania www.sigmaaldrich.com</td><td>O9830</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, klasa HPLC</td><td>Fisher Scientific, Loughoborough, Wielka Brytania www. fisher.co.uk</td><td>10674922</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa HPLC</td><td>Fisher Scientific, Loughoborough, Wielka Brytania www. fisher.co.uk</td><td>10010010</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Wielka Brytania www.sigmaaldrich.com</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (z trzustki bydlęcej leczonej TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Wielka Brytania www.sigmaaldrich.com</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Wielka Brytania www.sigmaaldrich.com</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek Coomassie Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com</td><td>1856210</td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec białka</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Wielka Brytania www.sigmaaldrich.com</td><td>P0914</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Ultra Turrax T25</td><td>Fisher Scientific, Loughoborough, Wielka Brytania www. fisher.co.uk</td><td>13190693</td><td></td></tr><tr>Wytrząsarka <td></td><td></td><td></td><td>laboratoryjna Edmund and Buhler KS10</td></tr><tr><td>Wirówka Heraeus Fresco 17</td><td>Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka próżniowa RC 1022</td><td>Czytnik</td> płytek Jouan <td></td><td></td></tr><tr><td></td> Strata-X 33u polimerowe wkłady z odwróconymi fazami 60 mg/3 ml probówki Phenomenex, Macclesfield, Wielka Brytania <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8B-S100-UBJ</td><td></td></tr><tr><td>4000 QTrap potrójny kwadrupolowy spektrometr masowy</td><td>AB Sciex, Warrington, Wielka Brytania www.sciex.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>system LC o szybkiej rozdzielczości 1200</td><td>Agilent, Stockport, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XB C18 kolumna kapilarna z odwróconymi fazami (100 mm x 2,1 mm, 2,6 i mikro; m wielkość cząstek)</td><td>Phenomenex, Macclesfield, Wielka Brytania www.phenomenex.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyst 1.6.2 oprogramowanie</td><td>AB Sciex, Warrington, Wielka Brytania www.sciex.com</td><td></td><td>Akwizycja i analiza danych QTrap, w tym integracja obszaru pików</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>Fiolki z automatycznym podajnikiem próbek</td></tr></tbody></table>

oznaczanie gatunków i oznaczanie ilościowe w mieszaninach z zastosowaniem spektrometrii mas mrm peptydów stosowanych do weryfikacji autentyczności mięsa

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Opisujemy prosty protokół identyfikacji i kwantyfikacji dwóch składników w binarnych mieszaninach gatunków posiadających jedno lub więcej podobnych białek. Kluczowe znaczenie dla tej metody ma identyfikacja "odpowiadających im białek" u gatunków będących przedmiotem zainteresowania, innymi słowy białek, które są nominalnie takie same, ale mają różnice w sekwencji specyficzne dla danego gatunku. Podlegając proteolizie, odpowiednie białka spowodują powstanie pewnych peptydów, które są również podobne, ale z wariantami specyficznymi dla gatunku. Są to "odpowiadające im peptydy". Peptydy specyficzne dla danego gatunku mogą być stosowane jako markery do określania gatunków, podczas gdy pary odpowiadających im peptydów pozwalają na względną ocenę ilościową dwóch gatunków w mieszaninie. Peptydy są wykrywane za pomocą spektrometrii mas monitorowania wielu reakcji (MRM), wysoce specyficznej techniki, która umożliwia określanie gatunków na podstawie peptydów nawet w złożonych systemach. Ponadto stosunek obszarów pików MRM pochodzących z odpowiednich peptydów wspiera względną ocenę ilościową. Ponieważ odpowiadające im białka i peptydy będą w zasadzie zachowywać się podobnie zarówno podczas przetwarzania, jak i podczas ekstrakcji doświadczalnej i przygotowania próbek, względna ocena ilościowa powinna pozostać stosunkowo solidna. Ponadto podejście to nie wymaga wzorców i kalibracji wymaganych w metodach bezwzględnego oznaczania ilościowego. Protokół jest opisany w kontekście czerwonego mięsa, które ma dogodne odpowiadające im białka w postaci odpowiednich mioglobin. Ta aplikacja jest istotna dla wykrywania fałszowania żywności: metoda może wykryć 1% masy mięsa końskiego w wołowinie. Odpowiednia kwant ilościowa białka i odpowiedniego peptydu (CPCP) przy użyciu współczynników powierzchni pików MRM daje dobre oszacowanie masy w stosunku do składu wagowego mieszanki konia i wołowiny.

W pojedynczym eksperymencie MRM w trybie dynamicznym każde zaprogramowane przejście jest rejestrowane osobno (jako liczba zliczeń detektora na sekundę, cps) w określonym oknie czasu retencji. W związku z tym, ze wszystkich danych zebranych w jednym eksperymencie można indywidualnie wyekstrahować intensywność piku dla każdego przejścia. Wówczas jedynym skończonym sygnałem jest ten w oknie czasu retencji ustawionym dla danego przejścia. Poza tym oknem sygnał z definicji wynosi zero. Sygnał dla dowolnego przejścia, na przykład 752 → 1269 z konia (monoizotopowa masa peptydowa 1,501.66 daltonów, jon prekursorowy m/z 751.84 daltonów, stan ładunku = 2, jon fragmentacyjny y13), zazwyczaj musi konkurować jedynie z szumem pomiarowym, a nie z pikami innych przejść, które mogłyby pochodzić od innych gatunków. Wynikiem jest zatem zestaw czystych pików, jeden dla każdego przejścia, przy wspólnym czasie retencji dla przejść dzielących wspólny jon prekursorowy.
Rysunek 1 przedstawia wynik dla zestawu czterech przejść 752 → (1269, 706, 248, 1366) dla mieszaniny 1% w/w konia w wołowinie. Ponieważ cztery wyświetlone przejścia są powiązane z koniem i nie występują w próbkach czystej wołowiny, jagnięciny lub wieprzowiny, piki te wskazują na obecność konia. W zależności od kryteriów odporności, zestaw dwóch lub więcej przejść, z których każde przekracza określony poziom sygnału do szumu, pozwala na identyfikację. Rysunek ten potwierdza zatem obecność konia w mieszaninie 1% w/w konia w wołowinie.
Sporadycznie wykrywana jest pojedyncza, odizolowana tranzycja. Wskazuje to na przypadkowe dopasowanie jonu prekursorowego i pojedynczego fragmentu, prawdopodobnie pochodzącego z obcego białka, do tych oczekiwanych dla danego układu i zaprogramowanych w spektrometrze mas. Pojedynczy charakter piku oraz jego wystąpienie w nieoczekiwanym czasie retencji są charakterystyczne dla przypadkowej tranzycji, którą można zignorować.
Pole powierzchni każdego piku przejścia można obliczyć indywidualnie. Na podstawie odpowiedniego fragmentu stosunek pól powierzchni pików przejścia dla konia do wołowiny, na przykład 752 → 1269 (koń) do 767 → 1299 (wołowina), będzie proporcjonalny do stosunku faktycznej ilości mięs w mieszaninie. Rysunek 2 przedstawia wykres procentowej zawartości na podstawie pola piku dla tych dwóch przejść w zależności od procentowej masy konia w mieszaninie mięsa końskiego i wołowiny. Jeśli procentowe pola powierzchni pików przejścia odpowiadają procentowej masie mięsa, nachylenie prostej wynosi 1. Nachylenie na tym wykresie wynosi 1,03, co wskazuje, że dla tych przejść i pary CPCP pola powierzchni pików przejścia stanowią wiarygodną miarę względnych ilości obu rodzajów mięsa w mieszaninie. Gdyby mięso końskie w próbce zawierało dwukrotnie więcej mioglobiny niż wołowina, to przy niezmienności pozostałych czynników nachylenie prostej byłoby większe od jedności.
<img alt="Wykres chromatograficzny przedstawiający czas retencji w funkcji intensywności dla wielu związków w analizie rozdziału." src="/files/ftp_upload/54420/54420fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Intensywności przejść MRM w funkcji czasu retencji dla 1% w/w konia w wołowinie. Przejścia to 752 → (1269, 706, 248, 1366), przedstawione odpowiednio w kolorze pomarańczowym, czarnym, niebieskim i zielonym. Peptyd markerowy to HPGDFGADAQGAMTK. Cztery fragmenty przejścia mogą być oznaczone odpowiednio jako y13, y7, y2 i y14, gdzie yn oznacza odliczanie n aminokwasów od końca C-końcowego peptydu. Stosunek sygnału do szumu w czterech przejściach waha się od 23 do 53. Dodatkowa czerwona linia oznacza przejście 752 → 1269 dla 0% konia, 100% wołowiny w celu porównania. Wyświetlono tylko obszar czasu retencji o wartościach niezerowych. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Watson et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54420/54420fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres wykrywania mięsa konia; pole piku przejścia w funkcji procentowej zawartości wagowej w mieszance z wołowiną." src="/files/ftp_upload/54420/54420fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wykres zawartości konia w wołowinie, wyrażonej jako procent wagowy, w funkcji zawartości konia w wołowinie jako procentu pola piku przejścia. Na wykresie wykorzystano parę peptydów: wołowina (767) i koń (752) oraz jon fragmentowy y13 dla obu. Jeśli A oznacza pole piku, to rzędna wynosi 100AH / (AH + AB). Nachylenie linii najlepiej dopasowanej (R2 = 0,99) wynosi 1,03. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Watson et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54420/54420fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiamy protokół identyfikacji i ilościowego określania składników w mieszaninach gatunków o podobnych białkach. Spektrometria mas wykrywa peptydy w celu identyfikacji i podaje względną ocenę ilościową za pomocą stosunków powierzchni pików. Jako narzędzie do wykrywania oszustw, metoda ta może wykryć 1% koniny w wołowinie.

Oznaczanie gatunków i oznaczanie ilościowe w mieszaninach z zastosowaniem spektrometrii mas MRM peptydów stosowanych do weryfikacji autentyczności mięsa

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie spektrometrii mas z monitorowaniem wielu reakcji (MRM) do identyfikacji i kwantyfikacji gatunków obecnych w surowych mieszankach mięsnych, aby służyły one jako narzędzie do wykrywania oszustw żywnościowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w obszarze uczciwości żywności, takie jak potwierdzenie gatunków obecnych w produktach typu kiełbasy lub burgery. Nasze podejście opiera się na spektrometrii mas komponentu białkowego.Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania szybkiego i ilościowego wyniku. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że białka znane pod tą samą nazwą u różnych gatunków są na tyle odmienne, aby umożliwić identyfikację gatunkową, a jednocześnie na tyle podobne, aby pozwolić na oznaczanie ilościowe. Próbki oczyszczonych mioglobin referencyjnych poddaj denaturacji termicznej poprzez ogrzewanie w bloku grzejnym w temperaturze 95 °C przez 30 minut.Schładzać próbkę przez około 15 minut, aż osiągnie temperaturę pokojową. Następnie dodać 30 mg mocznika w celu usprawnienia trawienia i wymieszać. Dodać do próbki roztwór trypsyny w stosunku 1:30 enzymu do substratu w przeliczeniu na masę.Następnie wymieszać poprzez delikatne wirowanie w wibratorze i pozostawić do proteolizy przez noc w temperaturze 37 °C. Następnie odsolić próbkę po proteolizie, najpierw rozcieńczając ją w stosunku jeden do dwóch objętościowo wodą. Aktywować polimerowy wkład do chromatografii odwróconej wypełniony 30 mg materiału do fazy odwróconej, dodając 1 mL metanolu.Następnie przeprowadź równoważenie wkładu, dodając 1 mL 1% kwasu mrówkowego. Nałóż próbkę na wkład, pozwalając jej spłynąć grawitacyjnie. Następnie przemyj wkład 1 mL 5% metanolu zawierającego 1% kwasu mrówkowego.Peptydy eluerować jedną mililitr wodnego roztworu acetonitrylu do probówek do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów, wypełnionych uprzednio pięcioma mikrolitrami DMSO. Następnie odparować rozpuszczalnik pod próżnią w temperaturze 50 °C przy użyciu ewaporatora odśrodkowego przez 120 minut. Po tym czasie pozostałość rozpuścić ponownie w 250 µL wodnego roztworu acetonitrylu.Przenieś roztwór do fiolki do autopróbnika o małej objętości. Znajdź sekwencje mioglobiny dla różnych rodzajów mięsa w bazie danych UniProt. Wprowadź sekwencje mioglobiny do pola docelowego w oprogramowaniu do przewidywania peptydów i przejść.W razie potrzeby najedź kursorem na peptyd, aby wyświetlić listę jego fragmentów. Po wprowadzeniu preferencji zgodnie z opisem w protokole tekstowym, kliknij Export i wybierz Transition List, aby utworzyć arkusz kalkulacyjny zawierający wygenerowane przejścia MRM oraz parametry. Przygotuj system wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z gradientem binarnym, autosamplerem i kolumną HPLC C18 typu core shell, podłączony do potrójnego kwadrupolo spektrometru mas pracującego w trybie dodatniej jonizacji elektrospray z detekcją MRM.W sekcji parametrów edycji oprogramowania do gromadzenia danych z chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas należy wybrać typ skanowania MRM oraz polaryzację dodatnią. Wprowadź wartości Q1, Q3, czas, ID, DP i CE dla przejść utworzonych w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie zapisz metodę akwizycji. Po ustawieniu parametrów metody zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przejdź do oprogramowania do gromadzenia danych, kliknij Acquire i wybierz Equilibrate.W otwartym oknie wybierz wymaganą metodę akwizycji, aby rozpocząć równoważenie instrumentu. Następnie umieść fiolki z próbkami w statywie w autoprobniku. Kliknij Plik i wybierz Nowy, a następnie Partia akwizycji.W polu nazwa próbki wpisz identyfikator każdej z próbek przeznaczonych do analizy. Szczegółowe informacje na temat wizualizacji pozyskanych danych znajdują się w protokole tekstowym. Należy użyć mięsa, które zostało wcześniej zamrożone, a następnie zmielone na proszek.Przygotować szereg mieszanin mięsnych, odważając odpowiednie ilości mięsa do plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów. Do sproszkowanego mięsa dodać cztery mililitry buforu do ekstrakcji. Po 30 sekundach mieszania w wstrząsaczu wierzchołkowym (vortex), przeprowadzić ekstrakcję na wstrząsarce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej przez dwie godziny przy 250 cyklach na minutę.Przenieś dwa mililitry ekstraktu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów i wiruj przez pięć minut w temperaturze czterech stopni celsius i 17 000 G. Przenieś alikwoty nadsączu o objętości 200 mikrolitrów do probówek do wirówki o pojemności dwóch mililitrów. Próbki osusz za pomocą ewaporatora odwirującego przed oznaczeniem stężenia białek w próbkach zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić proteolizę mieszanin mięsnych, rozpuść ponownie osuszoną pozostałość w jednym mililitrze 25 milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu.Wymieszać dokładnie za pomocą wortexa i przeprowadzić proteolizę w sposób opisany wcześniej. Następnie przygotować i uruchomić analizę LCMS w podobny sposób, stosując zaplanowane MRM. Wyświetlić pełny chromatogram w oprogramowaniu do analizy danych.Wyświetlaj kolejno wyekstrahowane jony dla każdego zestawu przejść. Potwierdź wizualnie, czy każdy klaster zawiera wymaganą liczbę szczytów w kształcie dzwonu w oczekiwanym czasie retencji. W ten sposób potwierdź obecność wybranego peptydu.Następnie dwukrotnie kliknij Quantitation Wizard na pasku nawigacji. W oknie Select Samples utwórz zestaw do kwantyfikacji, wybierając jeden plik danych. Następnie wybierz jedną lub więcej dostępnych próbek.Wybierz Dalej, aby wyświetlić ustawienia wyboru oraz pole zapytania. Pozostaw ustawienia domyślne i wybierz Dalej, aby wyświetlić Wybierz metodę. Z rozwijanego pola Metoda wybierz plik metody całkowania, a na koniec wybierz Zakończ.Zapisz tabelę wyników, wyeksportuj ją do pliku tekstowego, a następnie otwórz w arkuszu kalkulacyjnym, aby przejrzeć dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rysunek ten przedstawia najintensywniejsze przejścia MRM dla konia, uzyskane z mieszaniny mięsa konia i wołowego w stosunku 1% wagowo. Dla kontrastu czerwona linia pokazuje przejście dla wołowiny w przypadku braku obecności konia.Jest to wykres zmierzonej w stosunku do przygotowanej ilości koniny w wołowinie, wyrażony w postaci stosunków. Wykres wyraźnie pokazuje, w jaki sposób metoda ta może być wykorzystywana do pomiarów ilościowych. Po opanowaniu techniki i zastosowaniu przetwarzania seryjnego, przepustowość tej metody może osiągnąć do 20 próbek na 24 godziny.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wyborze odpowiedniego białka do analizy ekstrakcyjnej. Mioglobina jest dobrym kandydatem do badania gatunków czerwonego mięsa, ponieważ występuje w dużych ilościach, jest rozpuszczalna w wodzie i odporna na działanie ciepła. Procedurę tę można rozszerzyć o kolejne gatunki, aby zidentyfikować i określić ich ilość jednocześnie.Maksymalna liczba jest ograniczona jedynie prędkością skanowania spektrometrii mas. Technika ta utorowuje drogę badaczom do wykorzystania peptydowego fingerprintingu w obszarach takich jak ochrona konsumenta i marki.

species-determination-quantitation-mixtures-using-mrm-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Prosty zestaw metod izolacji i identyfikacji najliczniej występujących białek ekspresjonowanych w mięśniach szkieletowych. Na żelu dwuwymiarowym z 10 mg mięśnia można wyróżnić około 800 plamek, co umożliwia określenie specyficznej dla płci ekspresji białek. Metody te dają porównywalne wyniki w większości tkanek.

Dymorfizm płciowy mięśni szkieletowych w ujęciu proteomicznym

Procedury znakowania izotopami stabilnymi z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O (procedury LeO) są wszechstronnymi narzędziami w ilościowych i jakościowych badaniach proteomicznych. W procedurach wspomaganych proteazami (PALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez proteolityczne rozszczepienie oraz reakcje wymiany tlenu karboksylowego katalizowane przez proteazy. W procedurze katalizowanej kwasowo (ALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez wymianę tlenu karboksylowego przy niskim pH.

Procedury znakowania katalizowane przez proteazy i kwasy z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Opisana jest ulepszona metoda polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy do genotypowania gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami służy do oddzielania strawionych amplikonów. Metoda ta może wyjaśnić monoizotopowe masy oligonukleotydów, co jest przydatne do identyfikacji składu zasadowego.

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Ten artykuł opisuje metodę przygotowania próbki opartą na inaktywacji termicznej w celu zachowania endogennych peptydów unikających degradacji po śmierci, a następnie względnej kwantyfikacji za pomocą znakowania izotopowego plus LC-MS.

Przygotowanie próbki i względna ocena ilościowa przy użyciu redukcyjnej metylacji amin do badań peptydomicznych

Poznaj metodę identyfikacji i ilościowego oznaczania gatunków w surowych mieszaninach mięsa przy użyciu spektrometrii mas MRM. Technika ta umożliwia wykrycie nawet 1% mięsa końskiego w wołowinie, zapewniając szybką i niezawodną analizę w zakresie bezpieczeństwa żywności.

Oznaczanie gatunków i oznaczanie ilościowe w mieszaninach z zastosowaniem spektrometrii mas MRM peptydów stosowanych do weryfikacji autentyczności mięsa (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie gatunków i oznaczanie ilościowe w mieszaninach z zastosowaniem spektrometrii mas MRM peptydów stosowanych do weryfikacji autentyczności mięsa

Przeglądaj więcej filmów