SZYBKA metoda przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności stężenia peptydów w osoczu we krwi ludzkiej

Ogólnym celem metody RAPID jest zwiększenie wydajności izolacji endogennych hormonów peptydowych do pomiarów w ludzkiej krwi. Metoda RAPID została niedawno opracowana do zastosowań u szczurów i nadaje się również do stosowania w ludzkiej krwi. Metoda RAPID zwiększa wydajność oraz umożliwia wykrycie prawidłowej formy molekularnej endogennego peptydu.

Metoda RAPID jest łatwa w użyciu. Jest ona jednak bardziej czasochłonna i kosztowna w porównaniu do standardowego pobierania krwi, dlatego może znaleźć szersze zastosowanie w warunkach badawczych.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ terminowe rozcieńczenie próbek, jak i elucja, mają ogromne znaczenie dla zapewnienia odpowiedniego poziomu peptydów. Krew żylną należy pobrać w zestandaryzowanym czasie po nocnym poście z żyły przedramiennej. Następnie należy ją przetworzyć zgodnie ze standardowymi procedurami lub metodą RAPID.

Poinstruuj badanych, aby nie ćwiczyli ani nie palili przed pobraniem krwi. W przypadku standardowego procesu, pobierz krew do schłodzonych probówek z EDTA, a następnie odwiruj w ciągu 10 minut z prędkością 3000 Gs przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsiusza. Zbierz nadsącz i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsiusza do czasu dalszej analizy metodą radioimmunologiczną.

W przypadku przetwarzania metodą RAPID należy natychmiast rozcieńczyć krew w stosunku 1:10 w lodowatym buforze RAPID o pH 3,6, zawierającym 0,1 M octanu amonu, 0,5 M chlorku sodu oraz inhibitory enzymów.

W ciągu 10 minut odwiruj próbkę RAPID z prędkością 3000 Gs przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie zbierz nadsącz za pomocą pipety. Następnie napełnij wkłady chromatograficzne 100% acetonitrylem z przepływem 10 mililitrów na minutę. Po czym przeprowadź równoważenie przy użyciu 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA).

Załaduj supernatant próbki RAPID ze stałą prędkością 1 ml/min, używając pompy strzykawkowej. Po przemyciu kartridży 3 ml 0,1% TFA z prędkością 10 ml/min, powoli eluej próbkę RAPID za pomocą 2 ml 70% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA, przy prędkości 2 ml/min. Osuszone eluaty poddaj wirowaniu próżniowemu i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy metodą radioimmunologiczną.

Należy pozyskać ludzkie peptydy znakowane radioizotopem jodu 125. Peptydy należy przechowywać w formie proszku do momentu rozpoczęcia eksperymentu. Następnie należy je świeżo rozpuścić w 0.1% kwasie octowym.

W przypadku standardowego przetwarzania, bezpośrednio po pobraniu krwi do schłodzonych probówek z EDTA, przenieś 1 ml krwi do probówki zawierającej 50 µL znacznika radioaktywnego o aktywności od 3000 do 6000 CPM. W przypadku szybkiego przetwarzania (RAPID), przenieś 1 ml krwi z EDTA do probówki zawierającej 9 ml buforu RAPID oraz 500 µL znacznika radioaktywnego o aktywności od 30 000 do 60 000 CPM. Ze względu na rozcieńczenie w stosunku 1:10, w metodzie RAPID należy zastosować 10-krotnie większą objętość znacznika radioaktywnego.

Bezpośrednio po wykonaniu poszczególnych etapów metody RAPID, należy ocenić odzysk radioaktywnie znakowanych peptydów za pomocą licznika gamma. Nie należy suszyć próbek w wirówce próżniowej ani przechowywać ich w temperaturze -80°C. W celu dokonania pomiaru należy przenieść naddatek do probówek dopasowanych do licznika gamma.

Następnie należy ocenić liczbę zliczeń na minutę. W próbkach standardowych mierzy się cały nadsącz. W próbkach RAPID analizuje się jedną dziesiątą całkowitej objętości, aby uzyskać porównywalną ilość użytego znacznika promieniotwórczego.

Jako wzorzec 100% należy wykorzystać dwie próbki zawierające 50 µL peptydu znakowanego izotopem jodu 125, które nie zostaną poddane procesowaniu. Radioaktywność wszystkich próbek należy zmierzyć w tym samym czasie. Krew pobierać do schłodzonych probówek z EDTA, a następnie przenieść 1 mL krwi do probówek zawierających 200 µL znakowanego radiologicznie acylowanego greliny o aktywności od 15 000 do 20 000 CPM w celu przeprowadzenia standardowego procesowania.

W przypadku przetwarzania metodą RAPID, należy przenieść jeden mililitr krwi do probówki zawierającej dziewięć mililitrów buforu do szybkiego przetwarzania oraz 200 µL znakowanej izotopowo acylowej ghreliny o aktywności od 15 000 do 20 000 CPM. Następnie próbki należy przetwarzać w taki sam sposób jak wcześniej. W celu przeprowadzenia dalszej analizy metodą odwróconej fazy HPLC, próbki należy wprowadzić bezpośrednio na kolumnę stable bond C18 równoważoną w 17% acetonitrylu w wodzie z dodatkiem 0,1% TFA.

Po pięciu minutach równoważenia zastosuj gradient acetonitrylu od 17 do 40%, aby eluować próbkę w ciągu 40 minut, przy przepływie 1 ml/min. Zbieraj frakcje o objętości 1 ml w każdej minucie i analizuj radioaktywność za pomocą licznika gamma. W oddzielnym doświadczeniu nanieś bezpośrednio na kolumnę 200 µl znakowanej radioaktywnie acylowanej ghreliny zawierającej od 15 000 do 20 000 CPM i przeprowadź analizę HPLC w ten sam sposób co wcześniej.

W celu przeprowadzenia radioimmunologicznego testu przeciwciał (RIA), rozmrozić zamrożone nadsączniki oraz proszek suszony próżniowo w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed badaniem RIA, zawiesić ponownie wysuszone próbki RAPID w wodzie dwukrotnie destylowanej, zgodnie z pierwotną objętością osocza. Oznaczyć poziom kisspeptyny, całkowitej ghreliny oraz ghreliny acylowanej, wykorzystując komercyjne zestawy do radioimmunologicznego testu przeciwciał zgodnie z protokołami producenta.

Należy użyć probówek borokrzemowych, które umożliwiają stabilne tworzenie się osadu. Pierwszego dnia próbki należy inkubować z buforem do analizy oraz przeciwciałem pierwotnym w rozcieńczeniu zalecanym przez producenta przez 24 godziny. Drugiego dnia należy dodać znacznik jod-125, wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez 24 godziny.

W trzecim dniu należy dodać odczyn wytrącający, wymieszać w wortexie i inkubować zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie probówki należy wirować z prędkością 3 000 Gs przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu nadsączów należy zmierzyć aktywność promieniotwórczą w osadach za pomocą licznika gamma.

Oblicz poziom desacyl-ghreliny jako różnicę między całkowitą ghreliną a acyl-ghreliną. Określ stosunek acyl-ghreliny do desacyl-ghreliny, dzieląc wartość acyl-ghreliny przez wartość desacyl-ghreliny dla każdej próbki. Jeśli to możliwe, przetwórz wszystkie próbki w jednej serii, aby uniknąć zmienności międzyanalitycznej.

SZYBKA obróbka krwi zwiększa wydajność peptydów znakowanych radioaktywnie jodem 125 w ludzkiej krwi w porównaniu do standardowej obróbki krwi. Po standardowej obróbce krwi odzysk peptydów znakowanych radioaktywnie wynosił od 48% do 68% dla dziewięciu peptydów. Obróbka RAPID poprawiła wydajność we wszystkich peptydach znakowanych jodem 125, przy odzysku w zakresie od 71% do 98% Przedstawiono tutaj profil elucji acylowanej greliny znakowanej jodem 125 w ludzkiej krwi po standardowej lub SZYBKIEJ obróbce krwi.

Po obróbce metodą RAPID grelina znakowana jodem 125 eluała w oczekiwanej pozycji. Natomiast po zastosowaniu standardowej procedury zaobserwowano wcześniejszy pik, który prawdopodobnie odpowiadał desacylgrelinie.

Odpowiadało to 62% degradacji peptydu. Przetwarzanie krwi metodą RAPID poprawia stosunek greliny acylowanej do dezacylowanej w porównaniu z przetwarzaniem standardowym. Po zastosowaniu metody RAPID stosunek greliny acylowanej do dezacylowanej we krwi osób o prawidłowej masie ciała wynosił jeden do trzech.

W porównaniu z wartościami od 1 do 23 uzyskanymi po standardowym przetwarzaniu krwi. Podobne wyniki zaobserwowano w warunkach anoreksji i otyłości. SZYBKIE przetwarzanie krwi skutkuje zwiększeniem endogennych poziomów kisspeptyny we krwi w porównaniu do przetwarzania standardowego.

Zarówno u osób z anoreksją, jak i o prawidłowej masie ciała, poziomy krążącej endogennej kisspeptyny były znacząco wyższe po zastosowaniu metody RAPID w porównaniu do standardowego przetwarzania. Różnica ta nie osiągnęła poziomu istotności w warunkach otyłości. Po opanowaniu i prawidłowym wdrożeniu, technikę tę można przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna godzina.

Metoda ta jest szczególnie istotna w przypadkach, gdy oczekiwane stężenie peptydu jest niskie lub różnice między grupami są niewielkie. Nie można sformułować ogólnej rekomendacji dla wszystkich peptydów. Potencjalne korzyści dla każdego peptydu należy przetestować jednorazowo na początku badań.

Technika ta toruje drogę badaczom z różnych dziedzin do analizy wydajności, a co ważniejsze, prawidłowej formy molekularnej endogennych hormonów peptydowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat zastosowania metody RAPID w procesowaniu krwi u ludzi.