SZYBKA metoda przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności stężenia peptydów w osoczu we krwi ludzkiej

Ogólnym celem tej metody RAPID jest poprawa wydajności endogennych hormonów peptydowych mierzonych we krwi ludzkiej. Metoda RAPID została niedawno opracowana do stosowania u szczurów i nadaje się również do stosowania we krwi ludzkiej. Metoda RAPID poprawia plon, a także pozwala na wykrycie prawidłowej formy molekularnej endogennego peptydu.

Metoda RAPID jest łatwa w użyciu. Jednak metoda RAPID jest bardziej czasochłonna i droższa w porównaniu ze standardowym pobieraniem krwi. Więc może to być bardziej przydatne w środowisku badawczym.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ terminowe rozcieńczenie próbek, jak również elucja mają ogromne znaczenie dla zapewnienia odpowiedniego poziomu peptydów. Krew żylną należy pobrać w standardowym czasie po całonocnym poście z żyły przedramienia. I przetwarzaj zgodnie ze standardowymi procedurami lub metodą RAPID.

Poinstruuj badanych, aby nie ćwiczyli ani nie palili przed pobraniem krwi. W przypadku standardowego przetwarzania należy zebrać krew do schłodzonych probówek zawierających EDTA i odwirować w ciągu 10 minut w temperaturze 3000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania za pomocą testu radioimmunologicznego.

W przypadku przetwarzania RAPID należy natychmiast rozcieńczyć krew od 1 do 10 w lodowatym buforze RAPID. PH trzy punkt sześć, zawierający punkt zerowy jeden molowy amoniumatytan. Punkt zerowy pięć molowych chlorków sodu i inhibitorów enzymów.

W ciągu 10 minut odwirować próbkę RAPID o masie 3000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant za pomocą pipety. Następnie naładuj wkłady chromatograficzne 100% aktytonitrylem w ilości 10 mililitrów na minutę. Po zrównoważeniu z 0,1% trifluorooctem lub TFA.

Załadować supernatantem próbki RAPID ze stałą szybkością jednego mililitra na minutę za pomocą pompy strzykawkowej. Po umyciu wkładów trzema mililitrami 0,1%TFA, w ilości 10 mililitrów na minutę, powoli eluuj próbkę RAPID dwoma mililitrami 70% acetonitrylu zawierającymi 0,1% TFA, w ilości dwóch mililitrów na minutę. Wyluzowane próbki należy wysuszyć za pomocą wirowania próżniowego i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania za pomocą testu radioimmunologicznego.

Uzyskaj jod 125 znakowane radiowo ludzkie peptydy. Przechowuj peptydy w postaci proszku do czasu eksperymentu. Następnie świeżo rozcieńczyć w 0,1% kwasie octowym.

W przypadku standardowego przetwarzania, bezpośrednio po pobraniu krwi, do schłodzonych probówek zawierających EDTA, przenieść jeden mililitr krwi do probówki z 50 mikrolitrami radioznacznika, zawierającej od 3000 do 6000 CPM. W przypadku przetwarzania RAPID przenieś jeden mililitr krwi zawierającej EDTA do probówki zawierającej dziewięć mililitrów buforu RAPID, a 500 mikrolitrów radioznacznika zawiera od 30 000 do 60 000 CPM. Ze względu na rozcieńczenie od 1 do 10, należy użyć 10 razy większej objętości radioznacznika do SZYBKIEGO przetwarzania.

Bezpośrednio po zastosowaniu różnych etapów metody RAPID należy ocenić odzysk peptydów znakowanych radioaktywnie za pomocą licznika gamma. Nie suszyć próbek przez wirowanie próżniowe i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W celu pomiaru przenieś supernatant do probówek pasujących do licznika gamma.

I oceń liczbę zliczeń na minutę. Zmierzyć cały supernatant w próbkach wzorcowych. W próbkach RAPID należy przeanalizować jedną dziesiątą całkowitej objętości, aby uzyskać porównywalną ilość użytego znaku radioaktywnego.

Jako 100% standardu należy użyć dwóch próbek z 50 mikrolitrami peptydu znakowanego radioaktywnie jodem 125, które nie są poddawane przetwarzaniu. Zmierzyć radioaktywność wszystkich próbek w tym samym czasie. Pobrać krew w schłodzonych probówkach zawierających EDTA i przenieść jeden mililitr do probówek zawierających 200 mikrolitrów znakowanej radioaktywnie greliny acylowej, zawierającej 15 000 do 20 000 CPM, w celu standardowego przetwarzania.

W celu SZYBKIEGO przetwarzania przenieś jeden mililitr krwi do probówki zawierającej dziewięć mililitrów szybkiego buforu i 200 mikrolitrów znakowanej radioaktywnie greliny acylowej zawierającej od 15 000 do 20 000 CPM. Następnie przetwarzaj próbki jak poprzednio. W celu dalszej analizy za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, bezpośrednio załadować próbki do stabilnej kolumny C18 o stabilnym spoiwie, zrównoważonym w 17% acetonitrylu w wodzie uzupełnionej 0,1% TFA.

Po pięciu minutach równoważenia użyj gradientu od 17 do 40% acetonitrylu, aby eluować próbkę w ciągu 40 minut, z prędkością jednego mililitra na minutę. Zbieraj ułamki jednego mililitra co minutę i analizuj radioaktywność za pomocą licznika gamma. W oddzielnym eksperymencie załaduj 200 mikrolitrów znakowanej radioaktywnie greliny acylowej zawierającej od 15 000 do 20 000 CPM bezpośrednio na kolumnę i wykonaj HPLC jak poprzednio.

W przypadku testu radioimmunologicznego rozmrozić zamrożone supernatanty i wysuszony próżniowo proszek w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed testem radioimmunologicznym należy zawiesić suche próbki RAPID w wodzie podwójnie destylowanej, zgodnie z pierwotną objętością osocza. Oceń kisspeptynę i grelinę całkowitą, a także grelinę acylową, używając komercyjnych testów radioimmunologicznych zgodnie z protokołami producenta.

Używaj rurek borokrzemianowych, które umożliwiają stabilne formowanie palety. Pierwszego dnia inkubować próbki z buforem do oznaczania i pierwotnym roztworem w rozcieńczeniu dostarczonym przez producenta przez okres 24 godzin. Drugiego dnia dodaj ślad jodu 125, wiruj i inkubuj przez okres 24 godzin.

Trzeciego dnia dodać odczynnik wytrącający, wirować i inkubować zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie odwirować probówki w temperaturze 3 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatanty i policzyć radioaktywność w paletach, używając licznika gamma.

Obliczyć desacylogrelinę jako różnicę całkowitej greliny minus acyl greliny. Ocenia stosunek acylu i greliny desacylowej, nurkując acyl po grelinie desacylowej dla każdej pojedynczej próbki. Jeśli to możliwe, należy przetworzyć wszystkie próbki w jednej partii, aby uniknąć zmienności między testami.

SZYBKIE przetwarzanie krwi zwiększa wydajność peptydów znakowanych radioaktywnie jodem 125 w ludzkiej krwi w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi. Po standardowym przetwarzaniu krwi odzysk peptydów znakowanych radioaktywnie wahał się od 48% do 68% w dziewięciu peptydach. Przetwarzanie RAPID poprawiło wydajność wszystkich peptydów znakowanych jodem 125, z odzyskiem w zakresie od 71% do 98%Pokazano tutaj profil elucji greliny acylowej znakowanej jodem 125 w ludzkiej krwi po standardowym lub SZYBKIM przetwarzaniu krwi.

Po SZYBKIM przetworzeniu jod 125 znakowany greliną wymknął się w oczekiwanej pozycji. Natomiast po standardowej procedurze zaobserwowano wcześniejszy pik. Prawdopodobnie odpowiada desacyl grelinie.

Oznaczało to 62% degradację peptydu. SZYBKIE przetwarzanie krwi poprawia stosunek acylu i desacylogreliny w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem. Po SZYBKIM przetwarzaniu stosunek acylu i greliny desacylo-greliny we krwi osób o normalnej masie ciała wynosił od jednego do trzech.

W porównaniu do jednego do 23 po standardowym przetwarzaniu krwi. Podobne wyniki zaobserwowano w stanach anoreksji i otyłości. SZYBKIE przetwarzanie krwi powoduje zwiększenie endogennego stężenia kisspeptyny we krwi w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem.

Zarówno u osób z anoreksją, jak i u osób z prawidłową masą ciała, poziomy endogennej kisspeptyny w krążeniu były istotnie wyższe po podaniu produktu RAPID w porównaniu ze standardowym leczeniem. Różnica ta nie osiągnęła znaczenia w warunkach otyłości. Po opanowaniu i prawidłowym wykonaniu tę technikę można wykonać w mniej niż godzinę.

Metoda ta jest szczególnie ważna, gdy oczekiwane stężenie peptydu jest niskie lub różnice między grupami są niewielkie. Nie można podać ogólnych zaleceń dotyczących peptydów. Potencjalne korzyści dla każdego peptydu powinny być przetestowane raz na początku.

Technika ta toruje drogę naukowcom z różnych dziedzin do badania plonów, a co ważniejsze, prawidłowej formy molekularnej endogennych hormonów peptydowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stosować metodę RAPID do przetwarzania krwi u ludzi.