Name: SZYBKA metoda przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności stężenia peptydów w osoczu we krwi ludzkiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Poznaj metodę RAPID do przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności peptydów endogennych w osoczu ludzkim. Technika ta umożliwia dokładną ocenę form molekularnych hormonów peptydowych w badaniach naukowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą STE 1765/3-1 (A.S.) oraz niemieckie Ministerstwo Edukacji i Badań 03IPT614A (C.G.). Dziękujemy Reinhardowi Lommelowi i Petrze Buße za doskonałe wsparcie techniczne, a także Karin Johansson i Christinie Hentzschel za pomoc w organizacji i wykonaniu pomiarów antropometrycznych

Protokół został zatwierdzony przez lokalną komisję etyczną ds. badań na ludziach (numer protokołu EA1/114/10).
1. Przetwarzanie krwi
<ol>
	<li>Krew żylną należy pobrać między godziną 07:00 a 08:00 po całonocnym poście z żyły przedramienia i obrać ją zgodnie ze standardową procedurą lub metodą RAPID. Poinstruuj badanych, aby nie ćwiczyli ani nie palili przed pobraniem krwi.</li>
	<li>W przypadku standardowego przetwarzania należy zebrać krew do schłodzonych probówek zawierających EDTA i odwirować w ciągu 10 minut przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania za pomocą testu radioimmunologicznego.</li>
	<li>W przypadku przetwarzania RAPID należy natychmiast rozcieńczyć krew (w ciągu 1 minuty po pobraniu krwi) w stosunku 1:10 w lodowatym buforze (pH 3,6) zawierającym 0,1 M octanu amonu, 0,5 M NaCl i inhibitory enzymów (diprotyna A, E-64-d, leki przeciwbólowe, leupeptyna, chymostatyna, 1 μg/ml). Następnie odwirować w ciągu 10 minut przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant za pomocą pipety w probówkach polipropylenowych, jak opisano wcześniej u szczurów6.
	<ol>
		<li>Naładować wkłady chromatograficzne (360 mg, 55-105 μm) 100% acetonitrylem (szybkość 10 ml/min), zrównoważyć 0,1% trifluorooctanem (TFA, szybkość 10 ml/min) i załadować supernatantem ze stałą szybkością 1 ml/min za pomocą pompy strzykawkowej.</li>
		<li>Następnie przemyć wkłady 3 ml 0,1% TFA (szybkość 10 ml/min) i powoli eluować 2 ml 70% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (2 ml/min).</li>
		<li>Wysuszyć eluowane próbki za pomocą wirowania próżniowego i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania za pomocą testu radioimmunologicznego. 
		UWAGA: Przeprowadź wszystkie etapy w probówkach polipropylenowych (przetwarzanie RAPID) i borokrzemianowych (test radioimmunologiczny), które wykazują znacznie niższe właściwości wiązania powierzchniowego, a tym samym minimalizują utratę peptydów dla większości peptydów badanych przed26.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pomiary
UWAGA: Czynności opisane w tej sekcji należy wykonywać w laboratorium certyfikowanym do pracy z materiałem radioaktywnym. Należy podjąć standardowe środki ostrożności podczas pracy z 125I.
<ol>
	<li>Odzyskiwanie peptydów znakowanych radioaktywnie
	<ol>
		<li>Otrzymaj 125znakowanych radioaktywnie peptydów ludzkich (np. acylo-greliny, GLP-1, glukagonu, insuliny, kisspeptyny, leptyny, nesfatyny-1, PYY3-36 i somatostatyny-28).</li>
		<li>Trzymaj peptydy w postaci proszku do czasu eksperymentu, a następnie świeżo rozcieńcz w 0,1% kwasie octowym (~ 100 000 cpm na ml).</li>
		<li>W przypadku standardowego przetwarzania krwi, bezpośrednio po pobraniu krwi do schłodzonych probówek zawierających EDTA, należy przenieść 1 ml krwi do probówki z 50 μl radioznacznika zawierającego 3000-6000 cpm (liczonego bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu).</li>
		<li>W przypadku przetwarzania metodą RAPID należy przenieść 1 ml krwi zawierającej EDTA do probówki zawierającej 9 ml buforu RAPID (dla składu patrz 1.3) i 500 μl radioznacznika zawierającego 30 000-60 000 cpm. Ze względu na rozcieńczenie 1:10 należy użyć 10-krotnie większej objętości radioznacznika do SZYBKIEGO przetwarzania.</li>
		<li>Następnie należy przetworzyć próbki zgodnie z opisem w krokach od 1.2 do 1.3.2.</li>
		<li>W przypadku doświadczeń z odzyskiem nie suszyć próbek przez wirowanie próżniowe i nie przechowywać ich w temperaturze -80 °C. Zamiast tego należy ocenić odzysk peptydów znakowanych radioaktywnie bezpośrednio po tym procesie za pomocą licznika gamma.</li>
		<li>Zmierz cały supernatant w próbkach wzorcowych, natomiast w próbkach RAPID przeanalizuj 1/10 całkowitej objętości, aby uzyskać porównywalność ilości użytego znaku radioaktywnego. W celu pomiaru przenieś supernatant do probówek pasujących do licznika gamma i oceń liczbę na minutę</li>
		<li>Jako 100% standardu należy użyć dwóch próbek zawierających 50 μl 125I-znakowanego radioaktywnie peptydu, które nie są poddawane przetwarzaniu. Mierzyć w tym samym czasie z innymi próbkami, jak opisano w ppkt 2.1.7.</li>
		<li>Wykonaj eksperyment pięć do sześciu razy dla każdego peptydu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysokosprawna chromatografia cieczowa znakowanej radioaktywnie greliny
	<ol>
		<li>Pobrać krew ze schłodzonych probówek zawierających EDTA i przenieść 1 ml do probówek zawierających 200 μl znakowanej radioaktywnie greliny acylowej zawierającej 15 000-20 000 cpm (liczonej bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu).</li>
		<li>W przypadku przetwarzania RAPID przenieść 1 ml krwi do probówki zawierającej 9 ml buforu RAPID (dla składu patrz 1.3) i 200 μl znakowanej radioaktywnie greliny acylowej zawierającej 15 000-20 000 cpm.</li>
		<li>Następnie należy przetworzyć próbki zgodnie z opisem w krokach od 1.2 do 1.3.2.</li>
		<li>W celu dalszej analizy za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, bezpośrednio załadować próbki do kolumny C18 o stabilnym wiązaniu (2,1 mm x 50 mm, 1,8 μm) zrównoważonej 17% acetonitrylem w wodzie (oba uzupełnione 0,1% TFA).</li>
		<li>Po 5 minutach równowagi należy użyć gradientu od 17-40% acetonitrylu, aby wymyć próbkę w ciągu 40 minut (natężenie przepływu 1 ml/min).</li>
		<li>Zbieraj frakcje 1 ml co minutę i analizuj radioaktywność za pomocą licznika gamma.</li>
		<li>W oddzielnym eksperymencie załadować 200 μl znakowanej radioaktywnie greliny acylowej zawierającej 15 000-20 000 cpm bezpośrednio na kolumnę i przeprowadzić HPLC zgodnie z opisem w krokach 2.2.4 do 2.2.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test radioimmunologiczny
	<ol>
		<li>W przypadku testu radioimmunologicznego rozmrażać zamrożone supernatanty (standardowe przetwarzanie) i suszony próżniowo proszek (metoda RAPID) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Bezpośrednio przed testem radioimmunologicznym należy ponownie zawiesić suche próbki RAPID w podwójnie destylowanymH2Ozgodnie z pierwotną objętością osocza (500 μl).</li>
		<li>Ocenić kisspeptynę i całkowitą (w tym zarówno desacyl, jak i acyl grelinę), a także acyl grelinę, jak opisano wcześniej12,27, przy użyciu komercyjnych testów radioimmunologicznych zgodnie z protokołami producentów. Używaj rurek borokrzemianowych, które umożliwiają stabilne tworzenie granulek.
		<ol>
			<li>Pierwszego dnia należy inkubować próbki z buforem do oznaczania i pierwszorzędowym przeciwciałem (np. antygreliną) w rozcieńczeniu dostarczonym przez producenta przez okres 24 godzin.</li>
			<li>W drugim dniu dodać znacznik 125I (np. 125I-greliny), odwirować i inkubować przez okres 24 godzin.</li>
			<li>Trzeciego dnia dodać odczynnik strącający, odwirować i inkubować zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie odwirować probówki o stężeniu 3 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatanty i policzyć radioaktywność w granulkach za pomocą licznika gamma</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obliczyć desacyl grelinę jako różnicę całkowitej minus acyl greliny. Ocenić stosunek acylu/desacylogreliny, dzieląc acyl przez desacyl grelinę dla każdej pojedynczej próbki.</li>
		<li>Przetwarzaj wszystkie próbki – jeśli to możliwe – w jednej partii, aby uniknąć zmienności między testami. Zmienność wewnątrztestowa w niniejszym doświadczeniu wynosiła <8% dla kisspeptyny, <7% dla całkowitej i <9% dla acyl greliny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Określ rozkład danych za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa. Wyraż dane jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM).</li>
	<li>Oceń różnice między dwiema grupami za pomocą testu t. Oceń różnice między wieloma grupami za pomocą wszystkich procedur wielokrotnego porównania parami (test post hoc Tukeya) lub dwukierunkowej ANOVA, a następnie metody Holma-Sidak.</li>
	<li>Uznaj p <0,05 za istotne i wykonuj analizy za pomocą programu statystycznego.</li>
</ol>

<ol><li>Finucane, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National%2C+regional%2C+and+global+trends+in+body-mass+index+since+1980%3A+systematic+analysis+of+health+examination+surveys+and+epidemiological+studies+with+960+country-years+and+9.1+million+participants%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants.</a> Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).</li>
<li>James, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+obesity%3A+the+size+of+the+problem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of obesity: the size of the problem.</a> J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).</li>
<li>Stengel, A., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+peptides+and+their+regulation+of+hunger+and+satiety%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gastroenterol+Rep%22%5BJournal%5D)">Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety.</a> Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).</li>
<li>Hussain, S. S., Bloom, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+food+intake+by+the+gut-brain+axis%3A+implications+for+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity.</a> Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).</li>
<li>Hosoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+collection+and+storage+conditions+for+ghrelin+measurements%3A+octanoyl+modification+of+ghrelin+is+rapidly+hydrolyzed+to+desacyl+ghrelin+in+blood+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples).</a> Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAPID+method+for+blood+processing+yields+new+insight+in+plasma+concentrations+and+molecular+forms+of+circulating+gut+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides.</a> Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+differentially+decreases+plasma+acyl+and+desacyl+ghrelin+levels+in+rats%3A+Potential+role+of+the+circulating+ghrelin-acylating+enzyme+GOAT%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT.</a> Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+ambient+temperature+reverses+abdominal+surgery-induced+delayed+gastric+emptying+and+decreased+plasma+ghrelin+levels+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats.</a> Peptides. 31, 2229-2235 (2010).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+administration+of+pan-somatostatin+agonist+ODT8-SST+prevents+abdominal+surgery-induced+inhibition+of+circulating+ghrelin%2C+food+intake+and+gastric+emptying+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats.</a> Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+surgery+inhibits+circulating+acyl+ghrelin+and+ghrelin-O-acyltransferase+levels+in+rats%3A+role+of+the+somatostatin+receptor+subtype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+urocortin+1+induces+a+CRF2+mediated+increase+in+circulating+ghrelin+and+glucose+levels+through+distinct+mechanisms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats.</a> Peptides. 39, 164-170 (2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexigenic+response+to+tail+pinch%3A+role+of+brain+NPY%281%29+and+corticotropin+releasing+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).</li>
<li>Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+increases+plasma+levels+of+corticotropin-releasing+hormone+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats.</a> Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).</li>
<li>Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ethylenediamine+tetraacetic+acid+%28EDTA%29+as+in+vitro+anticoagulant+for+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes.</a> Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).</li>
<li>Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrally+injected+kisspeptin+reduces+food+intake+by+increasing+meal+intervals+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice.</a> Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).</li>
<li>De Bond, J. A., Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kisspeptin+and+energy+balance+in+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Kisspeptin and energy balance in reproduction.</a> Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).</li>
<li>Wren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+enhances+appetite+and+increases+food+intake+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans.</a> J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992(2001).</li>
<li>Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glucagon+on+food+intake+and+body+weight+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of glucagon on food intake and body weight in man.</a> J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).</li>
<li>Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+glucagon-like+peptide+1+or+peptide+YY+3-36+affects+food+intake+in+healthy+male+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects.</a> Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).</li>
<li>Dewan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+insulin-induced+hypoglycaemia+on+energy+intake+and+food+choice+at+a+subsequent+test+meal%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal.</a> Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).</li>
<li>Schlogl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+24-hour+ad+libitum+food+intake+is+associated+with+lower+plasma+irisin+concentrations+the+following+morning+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Appetite%22%5BJournal%5D)">Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans.</a> Appetite. 90, 154-159 (2015).</li>
<li>Heymsfield, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+leptin+for+weight+loss+in+obese+and+lean+adults%3A+a+randomized%2C+controlled%2C+dose-escalation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial.</a> JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).</li>
<li>Shimizu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+administration+of+nesfatin-1+reduces+food+intake+in+mice%3A+the+leptin-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism.</a> Endocrinology. 150, 662-671 (2009).</li>
<li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+food+intake+in+obese+subjects+by+peptide+YY3-36%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36.</a> N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).</li>
<li>Shibasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+effect+of+somatostatin+on+corticotropin-releasing+factor-induced+anorexia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat.</a> Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>Smets, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+plasma+levels+of+metastin+in+early+pregnancy+are+associated+with+small+for+gestational+age+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat+Diagn%22%5BJournal%5D)">Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates.</a> Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).</li>
<li>Kojima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+is+a+growth-hormone-releasing+acylated+peptide+from+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach.</a> Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).</li>
<li>Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((the+Gastric+X%2FA-like+Cell+as+Possible+Dual+Regulator+of+Food+Intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake.</a> J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).</li>
<li>Inhoff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desacyl+ghrelin+inhibits+the+orexigenic+effect+of+peripherally+injected+ghrelin+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats.</a> Peptides. 29, 2159-2168 (2008).</li>
<li>Hirayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+effects+of+ghrelin+and+des-acyl+ghrelin+on+the+lumbo-sacral+defecation+center+and+regulation+of+colorectal+motility+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats.</a> Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).</li>
<li>Horikoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+elevation+of+plasma+metastin+concentrations+in+human+pregnancy%3A+metastin+as+a+novel+placenta-derived+hormone+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans.</a> J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).</li>
<li>Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+of+kisspeptin+levels+in+girls+with+idiopathic+central+precocious+puberty+and+its+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance.</a> Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).</li>
<li>Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+and+des-acyl+ghrelin%3A+two+major+forms+of+rat+ghrelin+peptide+in+gastrointestinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue.</a> Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).</li>
<li>Raff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+and+active+ghrelin+in+developing+rats+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia.</a> Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+anticoagulants+and+storage+temperatures+on+stability+of+plasma+and+serum+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones.</a> Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).</li>
<li>Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+degradation+pathway+of+recombinant+human+parathyroid+hormone%3A+deamidation+of+asparaginyl+residue+and+peptide+bond+cleavage+at+aspartyl+and+asparaginyl+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues.</a> Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).</li>
<li>White, A., Handler, P., Smith, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+A+%22Principles+of+Biochemistry%22">Principles of Biochemistry</a>. , 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Informowaliśmy wcześniej, że metoda RAPID do przetwarzania krwi poprawiła odzyskiwanie peptydów 11/12 w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi u szczurów6. W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że metoda ta nadaje się również do stosowania u ludzi. Po przetworzeniu RAPID odzysk 9 z 9 125testowanych peptydów znakowanych izotopem I uległ poprawie w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi (EDTA, krew na lodzie). Zaobserwowana poprawa wahała się od 19 do 39%, co może być istotne, szczególnie ...

W obliczu rosnącej na całym świecie częstości występowania otyłości1,2, badania w dziedzinie regulacji spożycia pokarmu zyskują na znaczeniu. Choć do tej pory znany był tylko jeden peptyd produkowany obwodowo i działający centralnie w celu stymulacji spożycia pokarmu, mianowicie ghrelina3, w ciągu ostatnich dekad zidentyfikowano szeroki zakres peptydów ograniczających spożycie pokarmu, np. leptynę, peptyd YY (PYY), a także peptyd podobny do glukagonu-1 (GLP-1) i insulinę4. Dlatego w badaniach nad mechanizmami regulacji głodu i sytości często ocenia się poziomy peptydów, jednocześnie zakładając, że badany peptyd jest stabilny i odzyskiwany z wysoką wydajnością podczas przygotowania osocza. Jednakże bardzo często tak nie jest ze względu na szybki rozkład endogenny, co wykazano wcześniej np. dla ghreliny, która ulega degradacji z formy acylowanej do desacylowanej5. W związku z tym opisaliśmy niedawno metodę RAPID przetwarzania krwi u szczurów, wykorzystującą Reduced temperatures (obniżone temperatury), Acidification (zakwaszanie), Protease inhibition (hamowanie proteaz), Isotopic exogenous controls (izotopowe kontrole egzogenne) oraz Dilution (rozcieńczanie)6. Metoda ta poprawiła odzysk dla 11 z 12 testowanych peptydów i pozwoliła na oznaczenie prawidłowej krążącej formy molekularnej w porównaniu do standardowego przetwarzania krwi (krew z EDTA w lodzie)6. Metoda ta została wykorzystana w kilku kolejnych badaniach7-12 do wykrywania krążącej ghreliny, a także czynnika uwalniającego kortykotropinę13. Tym samym metoda ta okazała się użyteczna w badaniach nad peptydami u gryzoni. Ponieważ jednak wyniki badań na gryzoniach nie zawsze są możliwe do przełożenia na inne gatunki, metodę tę należy wprowadzić również do użytku w krwi ludzkiej.
Celem niniejszego badania było przetestowanie metody RAPID przetwarzania krwi u ludzi w porównaniu z standardowym przetwarzaniem krwi (krew z EDTA w lodzie), która jest szeroko zalecana14 i często stosowana zarówno w praktyce klinicznej, jak i badawczej. Przebadaliśmy odzysk wybranych peptydów znakowanych 125I zaangażowanych w regulację spożycia pokarmu, w tym uznanych peptydów, a także nowych kandydatów, o których niedawno sugerowano, że odgrywają rolę w regulacji karmienia (efekty na spożycie pokarmu przedstawiono w Tabeli 1), po przetworzeniu obiema metodami. Wybrano również hormony reprezentujące peptydy o różnej długości i ładunku (Tabela 2). Ponadto w przypadku ghreliny zbadaliśmy formę(y) molekularną po zastosowaniu metody standardowej oraz metody RAPID. Na koniec oceniliśmy endogenne poziomy ghreliny (ghreliny acylowanej i desacylowanej) oraz kisspeptyny – peptydu, o którym również niedawno sugerowano, że odgrywa rolę w regulacji spożycia pokarmu15,16 – po przetworzeniu metodą RAPID lub standardową. Dodatkowo zbadaliśmy poziomy tych peptydów w populacji osób o szerokim zakresie indeksu masy ciała (od 10,2 do 67,6 kg/m2), aby przeanalizować możliwe różnice związane z przewlekłymi zmianami masy ciała.
<img alt="Wpływ peptydów na spożycie pokarmu, tabela przedstawia rodzaje, efekty i źródła; dane z badań medycznych." src="/files/ftp_upload/53959/53959table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1">
<img alt="Wykresy hydrofobowości Kyte-Doolittle, ładunek netto peptydów przy pH 3,6 i 7,4, wykres analityczny." src="/files/ftp_upload/53959/53959table2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 2">
Diagnoza, ocena i plan: 
Uczestnicy badania 
Wszyscy uczestnicy badania byli pacjentami nowo przyjętymi do szpitala (włączenie do badania nastąpiło w ciągu dwóch dni od przyjęcia) w Oddziale Medycyny Psychosomatycznej w Charité-Universitätsmedizin Berlin i wyrazili pisemną świadomą zgodę. Aby uniknąć wpływu płci, w badaniu wzięły udział wyłącznie pacjentki. W badaniu uczestniczyło łącznie 42 osoby, które podzielono na trzy grupy: o prawidłowej masie ciała (BMI 18.5-25 kg/m2, n = 12), z jadłowstrętem psychicznym (BMI &lt;17.5 kg/m2, n = 15) oraz z otyłością (BMI &gt;30 kg/m2, n = 15). Pacjentki z jadłowstrętem psychicznym i otyłością zdiagnozowano zgodnie z Międzynarodową Klasyfikacją Chorób-10 i hospitalizowano odpowiednio w celu zwiększenia masy ciała (jadłowstręt psychiczny) lub redukcji masy ciała (otyłość). Wszystkie pacjentki o prawidłowej masie ciała były hospitalizowane wyłącznie z powodu objawów somatoformicznych bez istotnych zaburzeń somatycznych. Wykluczono pacjentki z somatoformicznymi objawami żołądkowo-jelitowymi lub w wywiadzie przebytymi operacjami układu pokarmowego. Kryteria wykluczenia obejmowały również wiek &lt;18 lat, aktualną ciążę oraz nieleczone choroby psychotyczne. Pobranie krwi przeprowadzono w 2. lub 3. dniu po przyjęciu do szpitala, przed rozpoczęciem leczenia dietetycznego ukierunkowanego odpowiednio na zwiększenie lub zmniejszenie masy ciała. Parametry antropometryczne oceniono w tym samym dniu.

<table><tbody><tr><td>Diprotin A</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IDP-4132</td><td></td></tr><tr><td>E-64-d</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IED-4321-v</td><td></td></tr><tr><td>Antipain</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IAP-4062</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>ILP-4041</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatyna</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>ICY-4063</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 wkłady</td><td>Waters Corporation, Milford, MA, USA</td><td>WAT051910</td><td>360 mg, 55-105 i mikro; m</td></tr><tr><td>Milipor acylo-greliny</td><td>, Billerica, MA, USA</td><td>9088-HK</td><td>Radioaktywny</td></tr><tr><td>GLP-1</td><td>Milipore, Billerica, MA, USA</td><td>9035-HK</td><td>Radioaktywny</td></tr><tr><td>glikagon</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9030</td><td>Radioaktywna</td></tr><tr><td>insulina</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9011S</td><td>Radioaktywna</td></tr><tr><td>leptyna</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9081-HK</td><td>Radioaktywna</td></tr><tr><td>Kisspeptin-10</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-048-56</td><td>Radioaktywna</td></tr><tr><td>Nesfatin-1</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-003-26</td><td>Radioaktywna</td></tr><tr><td>PYY3-36</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-059-02&nbsp;</td><td>radioaktywny</td></tr><tr><td>Somatostatin-28</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td>T-060-16&nbsp;</td><td>radioaktywny</td></tr><tr><td>Kolumna ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA</td><td>822700-902</td><td>2,1 mm x 50 mm, 1,8 i mikro; m</td></tr><tr><td>Agilent 1200 LC&nbsp;</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>HPLC, kilka komponentów, dlatego nie ma jednego numeru katalogowego</td></tr><tr><td>Kisspeptin&nbsp; RIA</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA</td><td># RK-048-56</td><td>Radioaktywna</td></tr><tr><td>grelina całkowita RIA</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td># GHRT-89HK&nbsp;</td><td>radioaktywny</td></tr><tr><td>Aktywna grelina RIA</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td># GHRA-88HK</td><td>Radioaktywne</td></tr><tr>oprogramowanie<td>SigmaStat 3.1</td><td>Systat, San Jose, CA, USA</td><td>do pobrania online</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka metoda przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności stężenia peptydów w osoczu we krwi ludzkiej

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Badania w dziedzinie regulacji spożycia żywności zyskują na znaczeniu. Często obejmuje to pomiar peptydów regulujących przyjmowanie pokarmu. Aby prawidłowo określić stężenie peptydu, powinien on być stabilny podczas przetwarzania krwi. Nie dotyczy to jednak kilku peptydów, które są szybko rozkładane przez endogenne peptydazy. Niedawno opracowaliśmy metodę przetwarzania krwi wykorzystującą temperatury wywołane R, cydyfikacja A, hamowanie rotazy P, kontrole egzogenne Isotopowe i rozcieńczanie D(RAPID) do stosowania u szczurów. Tutaj ustaliliśmy tę technikę do stosowania u ludzi i zbadaliśmy regenerację, formę molekularną i stężenie krążących hormonów regulujących spożycie pokarmu. Metoda RAPID znacząco poprawiła odzysk 125znakowanych I somatostatyny-28 (+39%), glukagonopodobnego peptydu-1 (+35%), acylogreliny i glukagonu (+32%), insuliny i kisspeptyny (+29%), nesfatyny-1 (+28%), leptyny (+21%) i peptydu YY3-36 (+19%) w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem (EDTA krew na lodzie, p <0,001). Wysokosprawna chromatografia cieczowa wykazała elucję endogennej greliny acylowej w oczekiwanej pozycji po przetwarzaniu RAPID, podczas gdy po standardowym przetwarzaniu 62% greliny acylowej uległo degradacji, co spowodowało wcześniejszy pik prawdopodobnie reprezentujący desacyl grelinę. Po przetwarzaniu RAPID stosunek acylo-desacylogreliny we krwi osób o prawidłowej masie ciała wynosił 1:3 w porównaniu do 1:23 po standardowym przetwarzaniu (p = 0,03). Również poziomy endogennej kisspeptyny były wyższe po badaniu RAPID w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem (+99%, p = 0,02). Metoda przetwarzania krwi RAPID może być stosowana u ludzi, daje wyższe poziomy peptydów i pozwala na ocenę prawidłowej formy molekularnej.

Szybkie przetwarzanie krwi (RAPID) zwiększa wydajność uzysku peptydów znakowanych 125I w ludzkiej krwi w porównaniu do standardowego przetwarzania krwi. 
Po standardowym przetwarzaniu krwi (krew z EDTA w lodzie), odzysk peptydów znakowanych radioizotopem wyniósł ~60% dla 9/9 peptydów (zakres od 48-68%, Rysunek 1A-K). Przetwarzanie metodą RAPID poprawiło wydajność we wszystkich peptydach znakowanych 125I, a mianowicie w somatostaty...

Metoda RAPID przetwarzania krwi może być stosowana u ludzi i daje wyższe poziomy peptydów, jak również pozwala na ocenę prawidłowej formy molekularnej. Dlatego metoda ta będzie cennym narzędziem w badaniach nad peptydami.

SZYBKA metoda przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności stężenia peptydów w osoczu we krwi ludzkiej

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Ogólnym celem metody RAPID jest zwiększenie wydajności izolacji endogennych hormonów peptydowych do pomiarów w ludzkiej krwi. Metoda RAPID została niedawno opracowana do zastosowań u szczurów i nadaje się również do stosowania w ludzkiej krwi. Metoda RAPID zwiększa wydajność oraz umożliwia wykrycie prawidłowej formy molekularnej endogennego peptydu.Metoda RAPID jest łatwa w użyciu. Jest ona jednak bardziej czasochłonna i kosztowna w porównaniu do standardowego pobierania krwi, dlatego może znaleźć szersze zastosowanie w warunkach badawczych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ terminowe rozcieńczenie próbek, jak i elucja, mają ogromne znaczenie dla zapewnienia odpowiedniego poziomu peptydów. Krew żylną należy pobrać w zestandaryzowanym czasie po nocnym poście z żyły przedramiennej. Następnie należy ją przetworzyć zgodnie ze standardowymi procedurami lub metodą RAPID.Poinstruuj badanych, aby nie ćwiczyli ani nie palili przed pobraniem krwi. W przypadku standardowego procesu, pobierz krew do schłodzonych probówek z EDTA, a następnie odwiruj w ciągu 10 minut z prędkością 3000 Gs przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsiusza. Zbierz nadsącz i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsiusza do czasu dalszej analizy metodą radioimmunologiczną.W przypadku przetwarzania metodą RAPID należy natychmiast rozcieńczyć krew w stosunku 1:10 w lodowatym buforze RAPID o pH 3,6, zawierającym 0,1 M octanu amonu, 0,5 M chlorku sodu oraz inhibitory enzymów.W ciągu 10 minut odwiruj próbkę RAPID z prędkością 3000 Gs przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie zbierz nadsącz za pomocą pipety. Następnie napełnij wkłady chromatograficzne 100% acetonitrylem z przepływem 10 mililitrów na minutę. Po czym przeprowadź równoważenie przy użyciu 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA).Załaduj supernatant próbki RAPID ze stałą prędkością 1 ml/min, używając pompy strzykawkowej. Po przemyciu kartridży 3 ml 0,1% TFA z prędkością 10 ml/min, powoli eluej próbkę RAPID za pomocą 2 ml 70% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA, przy prędkości 2 ml/min. Osuszone eluaty poddaj wirowaniu próżniowemu i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy metodą radioimmunologiczną.Należy pozyskać ludzkie peptydy znakowane radioizotopem jodu 125. Peptydy należy przechowywać w formie proszku do momentu rozpoczęcia eksperymentu. Następnie należy je świeżo rozpuścić w 0.1% kwasie octowym.W przypadku standardowego przetwarzania, bezpośrednio po pobraniu krwi do schłodzonych probówek z EDTA, przenieś 1 ml krwi do probówki zawierającej 50 µL znacznika radioaktywnego o aktywności od 3000 do 6000 CPM. W przypadku szybkiego przetwarzania (RAPID), przenieś 1 ml krwi z EDTA do probówki zawierającej 9 ml buforu RAPID oraz 500 µL znacznika radioaktywnego o aktywności od 30 000 do 60 000 CPM. Ze względu na rozcieńczenie w stosunku 1:10, w metodzie RAPID należy zastosować 10-krotnie większą objętość znacznika radioaktywnego.Bezpośrednio po wykonaniu poszczególnych etapów metody RAPID, należy ocenić odzysk radioaktywnie znakowanych peptydów za pomocą licznika gamma. Nie należy suszyć próbek w wirówce próżniowej ani przechowywać ich w temperaturze -80°C. W celu dokonania pomiaru należy przenieść naddatek do probówek dopasowanych do licznika gamma.Następnie należy ocenić liczbę zliczeń na minutę. W próbkach standardowych mierzy się cały nadsącz. W próbkach RAPID analizuje się jedną dziesiątą całkowitej objętości, aby uzyskać porównywalną ilość użytego znacznika promieniotwórczego.Jako wzorzec 100% należy wykorzystać dwie próbki zawierające 50 µL peptydu znakowanego izotopem jodu 125, które nie zostaną poddane procesowaniu. Radioaktywność wszystkich próbek należy zmierzyć w tym samym czasie. Krew pobierać do schłodzonych probówek z EDTA, a następnie przenieść 1 mL krwi do probówek zawierających 200 µL znakowanego radiologicznie acylowanego greliny o aktywności od 15 000 do 20 000 CPM w celu przeprowadzenia standardowego procesowania.W przypadku przetwarzania metodą RAPID, należy przenieść jeden mililitr krwi do probówki zawierającej dziewięć mililitrów buforu do szybkiego przetwarzania oraz 200 µL znakowanej izotopowo acylowej ghreliny o aktywności od 15 000 do 20 000 CPM. Następnie próbki należy przetwarzać w taki sam sposób jak wcześniej. W celu przeprowadzenia dalszej analizy metodą odwróconej fazy HPLC, próbki należy wprowadzić bezpośrednio na kolumnę stable bond C18 równoważoną w 17% acetonitrylu w wodzie z dodatkiem 0,1% TFA.Po pięciu minutach równoważenia zastosuj gradient acetonitrylu od 17 do 40%, aby eluować próbkę w ciągu 40 minut, przy przepływie 1 ml/min. Zbieraj frakcje o objętości 1 ml w każdej minucie i analizuj radioaktywność za pomocą licznika gamma. W oddzielnym doświadczeniu nanieś bezpośrednio na kolumnę 200 µl znakowanej radioaktywnie acylowanej ghreliny zawierającej od 15 000 do 20 000 CPM i przeprowadź analizę HPLC w ten sam sposób co wcześniej.W celu przeprowadzenia radioimmunologicznego testu przeciwciał (RIA), rozmrozić zamrożone nadsączniki oraz proszek suszony próżniowo w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed badaniem RIA, zawiesić ponownie wysuszone próbki RAPID w wodzie dwukrotnie destylowanej, zgodnie z pierwotną objętością osocza. Oznaczyć poziom kisspeptyny, całkowitej ghreliny oraz ghreliny acylowanej, wykorzystując komercyjne zestawy do radioimmunologicznego testu przeciwciał zgodnie z protokołami producenta.Należy użyć probówek borokrzemowych, które umożliwiają stabilne tworzenie się osadu. Pierwszego dnia próbki należy inkubować z buforem do analizy oraz przeciwciałem pierwotnym w rozcieńczeniu zalecanym przez producenta przez 24 godziny. Drugiego dnia należy dodać znacznik jod-125, wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez 24 godziny.W trzecim dniu należy dodać odczyn wytrącający, wymieszać w wortexie i inkubować zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie probówki należy wirować z prędkością 3 000 Gs przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu nadsączów należy zmierzyć aktywność promieniotwórczą w osadach za pomocą licznika gamma.Oblicz poziom desacyl-ghreliny jako różnicę między całkowitą ghreliną a acyl-ghreliną. Określ stosunek acyl-ghreliny do desacyl-ghreliny, dzieląc wartość acyl-ghreliny przez wartość desacyl-ghreliny dla każdej próbki. Jeśli to możliwe, przetwórz wszystkie próbki w jednej serii, aby uniknąć zmienności międzyanalitycznej.SZYBKA obróbka krwi zwiększa wydajność peptydów znakowanych radioaktywnie jodem 125 w ludzkiej krwi w porównaniu do standardowej obróbki krwi. Po standardowej obróbce krwi odzysk peptydów znakowanych radioaktywnie wynosił od 48% do 68% dla dziewięciu peptydów. Obróbka RAPID poprawiła wydajność we wszystkich peptydach znakowanych jodem 125, przy odzysku w zakresie od 71% do 98% Przedstawiono tutaj profil elucji acylowanej greliny znakowanej jodem 125 w ludzkiej krwi po standardowej lub SZYBKIEJ obróbce krwi.Po obróbce metodą RAPID grelina znakowana jodem 125 eluała w oczekiwanej pozycji. Natomiast po zastosowaniu standardowej procedury zaobserwowano wcześniejszy pik, który prawdopodobnie odpowiadał desacylgrelinie.Odpowiadało to 62% degradacji peptydu. Przetwarzanie krwi metodą RAPID poprawia stosunek greliny acylowanej do dezacylowanej w porównaniu z przetwarzaniem standardowym. Po zastosowaniu metody RAPID stosunek greliny acylowanej do dezacylowanej we krwi osób o prawidłowej masie ciała wynosił jeden do trzech.W porównaniu z wartościami od 1 do 23 uzyskanymi po standardowym przetwarzaniu krwi. Podobne wyniki zaobserwowano w warunkach anoreksji i otyłości. SZYBKIE przetwarzanie krwi skutkuje zwiększeniem endogennych poziomów kisspeptyny we krwi w porównaniu do przetwarzania standardowego.Zarówno u osób z anoreksją, jak i o prawidłowej masie ciała, poziomy krążącej endogennej kisspeptyny były znacząco wyższe po zastosowaniu metody RAPID w porównaniu do standardowego przetwarzania. Różnica ta nie osiągnęła poziomu istotności w warunkach otyłości. Po opanowaniu i prawidłowym wdrożeniu, technikę tę można przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna godzina.Metoda ta jest szczególnie istotna w przypadkach, gdy oczekiwane stężenie peptydu jest niskie lub różnice między grupami są niewielkie. Nie można sformułować ogólnej rekomendacji dla wszystkich peptydów. Potencjalne korzyści dla każdego peptydu należy przetestować jednorazowo na początku badań.Technika ta toruje drogę badaczom z różnych dziedzin do analizy wydajności, a co ważniejsze, prawidłowej formy molekularnej endogennych hormonów peptydowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat zastosowania metody RAPID w procesowaniu krwi u ludzi.

a-rapid-method-for-blood-processing-to-increase-yield-plasma-peptide

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ludzki lizat płytek krwi jest bogatym źródłem czynników wzrostu i silnym suplementem w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia proces przygotowania dużej puli ludzkiego lizatu płytek krwi, rozpoczynając od osocza bogatopłytkowego, przeprowadzając kilka cykli zamrażania i rozmrażania oraz usuwając fragmenty płytek.

Przygotowanie puli lizatu płytek krwi ludzkich (pHPL) jako wydajnego suplementu do bezzernowych hodowli ludzkich komórek macierzystych

Opisujemy nową metodę izolacji DNA genomowego z krwi pełnej pobranej do badań osocza/serologii. Po pobraniu osocza zagęszczona krew jest zazwyczaj utylizowana. Nasza nowatorska metoda stanowi znaczną poprawę w stosunku do istniejących sposobów i umożliwia uzyskanie DNA oraz osocza z jednego pobrania, bez konieczności pobierania dodatkowej krwi.

Praktyczna i nowatorska metoda izolacji genomowego DNA z zestawów do pobierania krwi służących do konserwacji białek osocza

Ten film przedstawia przygotowanie wysokiej jakości osocza bogatopłytkowego (PRP) poprzez badanie przesiewowe liczby płytek krwi, pobieranie i odwirowywanie krwi oraz izolowanie płytek krwi. Ten PRP jest stosowany w zastosowaniach terapeutycznych do regeneracji i gojenia tkanek.

Przygotowanie osocza bogatopłytkowego z ludzkiej krwi obwodowej

Przedstawiamy metodologię przetwarzania krwi pełnej w celu uzyskania różnych składników do dalszej analizy. Zoptymalizowaliśmy uproszczony protokół, który umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe jednoczesne przetwarzanie próbek krwi pełnej w warunkach nieklinicznych.

Szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę trawienia białek osocza do ilościowej analizy proteomicznej opartej na spektrometrii mas. W tym protokole etapy przenoszenia cieczy i inkubacji w celu denaturacji, redukcji, alkilowania i trawienia trypsyny są usprawnione i zautomatyzowane. Przygotowanie płytki 96-dołkowej z pożądaną precyzją zajmuje około pięciu godzin.

Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

Ten protokół przedstawia urządzenie, które wytwarza PRP, aby przyspieszyć ekspansję in vitro komórek w 100% autologicznym systemie hodowli fibroblastów.

Produkcja autologicznego osocza bogatopłytkowego w celu zwiększenia ekspansji ludzkich fibroblastów in vitro

Osocze bogatopłytkowe (PRP) jest stosowane w leczeniu schorzeń układu mięśniowo-szkieletowego koni. Różne techniki dają PRP o różnych stężeniach płytek krwi i leukocytów. W artykule opisano metodę pozyskiwania PRP z krwi koni.

Prosta metoda podwójnej probówki wirującej do uzyskiwania osocza bogatopłytkowego z krwi koni

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Aby skutecznie badać funkcje populacji komórek odpornościowych, często konieczna jest ich puryfikacja. Usuwanie dopełniacza jest szybką i niedrogą techniką izolacji populacji komórek odpornościowych o wysokiej czystości.

Deplecja specyficznych populacji komórek poprzez deplecję dopełniacza

Poznaj metodę RAPID do przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności peptydów endogennych w osoczu ludzkim. Technika ta umożliwia dokładną ocenę form molekularnych hormonów peptydowych w badaniach naukowych.

SZYBKA metoda przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności stężenia peptydów w osoczu we krwi ludzkiej

Przeglądaj więcej filmów