Name: Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj szybką metodę magnetyczno-mikrokulkową do izolacji czystych i żywotnych neutrofilów o niskiej gęstości z krwi obwodowej. Technika ta umożliwia badanie ich roli w chorobach autoimmunologicznych i nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Césarowi Díaz-Godínezowi (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) za pomoc w mikroskopii fluorescencyjnej w wizualizacji NET-ów. Badania te zostały wsparte grantem PAPIIT IN205523 od Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Meksyk, oraz grantem CF-2023-I-610 od Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), Meksyk.

Wszystkie procedury w tym protokole są zgodne z wytycznymi Komitetu Bioetyki Badań Ludzkich w Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę.
1. Izolacja jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC) i neutrofilów z ludzkiej krwi
<ol>
	<li>Pobierz około 10 ml krwi od zdrowego dorosłego ochotnika poprzez nakłucie żył. Dodaj 10 U/mL heparyny jako środek przeciwzakrzepowy. UWAGA: Umieść igłę w pojemniku na igły niebezpieczne dla biohazardu. Strzykawki i inne materiały mające kontakt z krwią należy umieścić w worku i podłączyć do autoklawu przed utylizacją.</li>
	<li>W stożkowej wirówce o pojemności 15 mL dodaj 2 mL 6% dektranu T500 w PBS. Następnie dodaj 10 ml krwi, spuszczając ją wzdłuż rurki. Odwróć rurkę kilka razy, żeby połączyć krew z dektranem.</li>
	<li>Zostaw rurkę odpocząć przez 45 minut, podczas gdy erytrocyty się osadzą. Osocze bogate w leukocyty pojawia się powyżej warstwy erytrocytów.</li>
	<li>W kolejnej 15 mL rurce do wirówki dodaj 5 mL medium gradientowego gęstości. Ostrożnie pipetuj osocze, nie dotykając erytrocytów, i nakładaj je na ośrodek. Należy utworzyć dwie oddzielne fazy.</li>
	<li>Wiruj rurkę w 516 x g przez 20 minut w 4 °C. Ogniwa monojądrowe (PBMC) tworzą pasmo między plazmą a warstwami medium. Neutrofile tworzą pelet na dole (Rysunek 1).</li>
	<li>Izolacja PBMC<ol>
		<li>Eliminuj przez aspirację osocza na PBMC bez dotykania komórek. Zbierz komórki z pasma między osoczem a ośrodkiem. Upewnij się, że aspirujesz jak najmniej medium.</li>
		<li>Umieść ogniwa w stożkowej rurce wirówki 50 mL. Dodaj 20 ml PBS. Wiruj probówkę w 400 x g przez 5 minut w 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie zasysaj supernatant i zeskrobaj rurkę, aby oddzielić komórki. Dodaj 10 ml zimnego PBS, aby ponownie zawiesić komórki. Policz PBMC za pomocą komory Neubauera. UWAGA: Nie używaj pipety do ponownego zawieszenia komórek, ponieważ może to uszkodzić komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja neutrofilów<ol>
		<li>Usuń medium gradientu gęstości. Oddziel ogniwa, skrobując rurkę i dodając 10 ml zimnego PBS.</li>
		<li>Włóż komórki do świeżej rurki do wirówki o pojemności 50 mL i wiruj w dawce 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Aspiruj supernatant i rozdziel komórki zgodnie z krokiem 1.6.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wyeliminować pozostałości erytrocytów, dodaj 10 mL zimnego roztworu hipotonicznego (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) i delikatnie mieszaj dokładnie przez 1 minutę.</li>
	<li>Szybko dodaj 10 mL zimnego roztworu hipertonicznego (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), aby roztwór był izotoniczny.</li>
	<li>Policz neutrofile za pomocą komory Neubauera (czystość > 95%). Rozpylaj komórki przez wirowanie, jak w kroku 1.6.2. i ponownie zawiesić je w zimnym PBS. Utrzymuj rurkę na lodzie. UWAGA: Podawa się, że okres półtrwania neutrofilów in vitro wynosi 8 - 12 h 46,47,48. Z naszego doświadczenia z tym protokołem wynika, że neutrofile utrzymują swoją funkcję przez około 6 do 8 godzin.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie neutrofilów o niskiej gęstości (LDN)
<ol>
	<li>Wiruj PBMC w 400 x g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant i ponownie zawiesij komórki w 120 μL buforu do zimnego mycia (1% BSA w PBS).</li>
	<li>Dodaj 35 μL magnetycznych mikrokulek CD66b. Inkubuj mieszankę w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Mieszaj delikatnie co 10 minut, aby zapobiec gromadzeniu się komórek.</li>
	<li>Dodaj 1 ml buforu do mycia w zimno. Umieść komórki w mikrowirówce i obracaj w 400 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Usuń supernatant, oddziel pellet ogniwa przez skrobanie rurki i ponownie zawiesij komórki w 1 ml buforu do płukania.</li>
	<li>Umieść na magnesie kolumnę separacyjną magnetyczną. Dodaj 0,5 mL buforu do kolumny i pozwól mu przejść przez kolumnę.</li>
	<li>Przenieś komórki (1 mL) na kolumnę. Niech bufor przechodzi przez kolumnę kropla po kroplu.</li>
	<li>Dodaj 0,5 mL bufora do przepłynięcia do kolumny i pozwól mu przejść. Dodaj kolejne 0,5 mL buforu do płukania.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w rurce mikrowirówki. Dodaj 1 ml buforu do prania do kolumny.</li>
	<li>Włóż tłok na górę kolumny i delikatnie wywieraj nacisk, aby wyłączyć komórki. Usuń tłok i połóż kolumnę na nowej rurce mikrowirówki.</li>
	<li>Dodaj kolejne 1 ml buforu do mycia. Włóż tłok na górę kolumny i delikatnie wywieraj nacisk, aby wyłączyć komórki.</li>
	<li>Obie probówki umieść w mikrowirówce i kręć je w 800 x g przez 3 minuty. Na koniec ponownie zawiesić komórki (LDN) z obu rurek do 1 mL zimnego PBS. Trzymaj się na lodzie. UWAGA: Pierwsze 2 mL przepływu zawiera resztę PBMC. Te komórki mogą być wykorzystywane w innych badaniach.</li>
</ol>
3. Wielokolorowa cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Ponownie zawieszaj oczyszczone komórki w ilości 1 x10 6 komórek /mL w buforze znakującym (1% FBS w PBS). Dodaj 250 μL komórek do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Dodaj odpowiadające im przeciwciała przeciwko cząsteczkom błony neutrofili (szczegóły w Tabeli Materiałów). Inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem.</li>
	<li>Dodaj 1 ml PBS. Włóż probówki do mikrowirówki i obróć je w 800 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Aspiruj supernatant, rozbij granulkę komórkową przez stuknięcie w rurkę i ponownie zawiesij komórki w 0,5 mL 1% paraformaldehydu.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C chronione przed światłem do czasu analizy cytometrii przepływowej. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując 10 000 zdarzeń na próbkę. Wykonaj sortowanie komórek zgodnie z opisaniemwcześniej 22. UWAGA: Paraformaldehyd drażni skórę i drogi oddechowe. Upewnij się, że nie wdychasz pary.</li>
</ol>
4. Wykrywanie reaktywnych substancji tlenu (ROS)
<ol>
	<li>W rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL dodaj 2,5 x 10 ogniw5 ogniw. Włóż probówki do mikrowirówki i obróć w 800 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Aspiracja supernatantu, zeskrobanie rurki, aby oddzielić komórki, i ponowna zawiesina komórek w 100 μL 15 μM dihydrorodaminy 123 w PBS.</li>
	<li>Inkubuj komórki chronione przed światłem w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Dodaj 1 ml PBS.</li>
	<li>Włóż probówki do mikrowirówki i obróć w 800 x g przez 3 minuty. Aspiracja supernatantu, zeskrobanie rurki, aby oddzielić komórki, i ponowna zawiesina w 100 μL 50 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) w PBS.</li>
	<li>Inkubuj komórki chronione przed światłem w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Dodaj 1 ml PBS.</li>
	<li>Włóż probówki do mikrowirówki i obróć je w 800 x g przez 3 minuty. Aspiracja supernatantu, zeskrobanie rurki, aby oddzielić komórki, i ponowna zawieszenie w 0,5 mL 1% paradehydu w PBS.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C, chronione przed światłem do czasu analizy cytometrii przepływowej. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując 10 000 zdarzeń na próbkę.</li>
</ol>
5. Wizualizacja pułapek zewnętrznych neutrofili (NET)
<ol>
	<li>Umieść pokrywy w dołkach płyty 12-dołkowej i przykryj je poli-L-Lizyną o stężeniu 10 μg/mL. Inkubuj płytkę przez noc w 4 °C z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Usuń poli-L-Lizynę i umyj pokrywki PBS, inkubując płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Okładki wyprać PBS jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Zdejmij PBS i pozwól wyschnąć pokrywy, umieszczając płytkę w laminarnym okapie na 2 godziny.</li>
	<li>Ponownie zawiesij LDN na 1 x 106 komórek /mL w RPMI-1640 medium z 5% FBS. Weź 350 μL (3,5 x 105 ogniw) zawiesiny komórkowej i umieść je w wgłębieniu płyty 12-dołkowej zawierającej pokrywki.</li>
	<li>Utrzymuj płytkę przez 30 minut w inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Dodaj 3,5 μL 5 μM PMA rozcieńczonego w PBS do każdego dołku (końcowe stężenie PMA to 50 nM).</li>
	<li>Trzymaj talerz przez 4 godziny w inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Dodaj 350 μL paraformaldehydu 8% w PBS i przechowuj płytę przez noc w inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Na podstawce probówki należy nałożyć przezroczystą folię, jak opisanowcześniej 49, tak aby na otworach w rurkach powstały otwory.</li>
	<li>Wypełnij każdą jamkę różnymi roztworami do mycia lub bejcowania pokrywek, tworząc dużą kroplę. Zdejmij pokrywki i połóż je do góry nogami na kropli wody na 5 minut. W ten sam sposób umyj pokrywy jeszcze trzy razy wodą.</li>
	<li>Umieść pokrywki do góry nogami na kropli bufora blokującego (5% BSA w PBS) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przełóż slipy do kropli odpowiadającego mu przeciwciała pierwotnego (np. antyelastazy lub anty-cytruliny) w buforze blokującym i inkubuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pokrywa się 2x w 0,01% Tween-20 w PBS. Przenieś pokrywki do kropli odpowiadającego przeciwciała wtórnego w buforze blokującym zawierającym 150 nM DAPI i inkubuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem.</li>
	<li>Pokrywa się 2x w 0,01% Tween-20 w PBS. Połóż kroplę środka antyfade na szklanym szkiełku i połóż pokrywki do góry nogami.</li>
	<li>Zabezpiecz pokrywki wokół obwodu lakierem do paznokci. Zamki montowane w magazynie w temperaturze 4 °C, chronione przed światłem. Wizualizuj NET-y za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
6. Wykrywanie pułapek zewnętrznych neutrofili (NET)
<ol>
	<li>Ponownie zawiesz komórki 5 x 105 komórek /mL w 500 nM Sytox Green, rozcieńczonym w medium RPMI-1640 z 5% FBS.</li>
	<li>Weź 100 μL (5 x 104 komórek ) zawiesiny komórkowej i umieść je w dołku z płytą do hodowli tkankowej z 96 dołkami.</li>
	<li>Przechowywać płytkę przez 20 minut w inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Do każdego dołka dodaj 20 μL 300 nM PMA rozcieńczonego w medium RPMI-1640 (końcowe stężenie PMA to 50 nM).</li>
	<li>Przenieś płytkę do wcześniej podgrzanego czytnika mikropłytek. Inkubuj płytę w temperaturze 35 °C przez 4 godziny, wykonując pomiary fluorescencji od spodu płytki co 5 minut (przy użyciu filtrów wzbudzających 485 nm i emisji 528 nm).</li>
</ol>

Autorzy twierdzą, że badanie to zostało przeprowadzone bez żadnych powiązań handlowych czy finansowych, które mogłyby być postrzegane jako potencjalny konflikt interesów.

Ogólnie neutrofile uważano za komórki jednorodne. Jednak najnowsze dowody wykazały, że neutrofile mogą istnieć jako komórki o różnych stanach aktywacji i/lub wielu fenotypach. W związku z tym mogą istnieć różne podpopulacje neutrofili 13,14,15. Jedna z podpopulacji neutrofili, neutrofile o niskiej gęstości (LDN), zyskała duże zainteresowanie ze względu na swoje specyficzne właściwości wewnętrzne, a także ze względu na ich wzrost...

Neutrofile, dominujące leukocyty we krwi ludzkiej1, są kluczowymi uczestnikami wrodzonego układu odpornościowego. Docierają w dużych ilościach do tkanek z zapaleniem lub infekcją2. Tam neutrofile aktywują kilka funkcji efektorowych, takich jak fagocytoza 3,4, degranulacja 5,6 oraz tworzenie pułapek zewnętrznych neutrofili (NETs)7. Dodatkowo neutrofile również uczestniczą w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej8. Klasyczne podejście do neutrofilów traktuje je jako jednorodne komórki produkowane w szpiku kostnym z ustaloną odpowiedzią 9,10. Jednak najnowsze badania pokazują, że neutrofile to komórki heterogeniczne z wieloma stanami fenotypowymi i funkcjonalnymi zarówno w zdrowych, jak i chorobowychstanach 11,12,13,14,15.
Wśród kilku subpopulacji neutrofilów o niskiej gęstości (LDN) wzbudziły duże zainteresowanie ze względu na swoje właściwości wewnętrzne oraz wzrost ich liczebności w kilku chorobach 16,17,18. LDN znaleziono we krwi pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym (SLE) w 1986roku. Wykryto je po procesie separacji leukocytów w gradiencie gęstości20,21. Po wirowaniu krwi lub osocza bogatego w leukocyty w ośrodku gęstości (np. Ficoll-Paque), monocyty i limfocyty (znane jako komórki monojądrowe krwi obwodowej [PBMC]) tworzą pasmo w górnej (o niskiej gęstości) części rurki. Neutrofile osadzają się na dnie rurki. Wśród PBMC znaleziono także kilka neutrofilów; są to LDN (Rysunek 1). Niewielkie ilości LDN znajdują się we krwi zdrowych osób(22). Jednak wartości LDN znacząco wzrastają w stanach z wieloma immunosupresjami i przewlekłymi stanami zapalnymi, w tym SLE23,24, sepsa25, łuszica26, astma27, młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawówstawów 28, przeciwciała cytoplazmatyczne przeciw antyneutrofylowym (ANCA) związane z zapaleniem naczyń29, zakażenie HIV30, malarią31 oraz gruźlicą32. Chociaż liczba LDN wzrasta we wszystkich wymienionych patologiach, LDN była głównie badana w kontekście SLE17. LDN z krwi pacjentów z SLE wydaje się mieć większą zdolność do tworzenia NETs33, do wydzielania dużych ilości mediatorów prozapalnych34 oraz do aktywacji limfocytówT 24. Jednak w innych stanach, takich jak nowotwory, LDN składa się z dojrzałych i niedojrzałych neutrofilów35, z właściwościami supresyjnymilimfocytów T 36, 37, 38. Podobnie, u pacjentów z COVID-19 LDN również hamuje proliferację limfocytów T39, ale w przeciwieństwie do SLE, LDN wydaje się produkować mniej NET39. Dlatego pochodzenie, skład i właściwości funkcjonalne LDN wciąż budzą kontrowersje.
Ponieważ LDN występuje razem z PBMC, ich badanie jest technicznie skomplikowane. Aby w pełni zbadać właściwości LDN w różnych patologiach, konieczne jest ich oczyszczenie. Powszechną procedurą separacji LDN jest sortowanie fluorescencyjnymikomórkami 22,40,41,42,43,44,45. Jednak sortowanie komórek wymaga długiego czasu na separację komórek. Może to prowadzić do utraty komórek lub niskiej regeneracji, jeśli czas sortowania nie jest wystarczający. Ponadto komórki są narażone na nadmierny stres, co powoduje zmienne wyniki podczas badania ich funkcji. Długi czas sortowania zwiększa również koszty procedur eksperymentalnych i wymaga specjalistycznego personelu.
Przedstawiamy tutaj szybką i efektywną metodę uzyskania dużych ilości czystego i żywotnego ludzkiego LDN w bardzo krótkim czasie. Po wirowaniu gradientu gęstości LDN są rozdzielane przez sortowanie ogniw magnetycznych (MACS; Rysunek 1). Główną zaletą tej metody oczyszczania jest to, że LDN są rozdzielane o wysokiej czystości (ponad 90%) i żywotności (ponad 96%). Ponadto oczyszczone LDN są w pełni funkcjonalne, co potwierdza ich zdolność do wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) oraz uwalniania NET. Protokół ten można łatwo wdrożyć w każdym laboratorium zainteresowanym biologią neutrofilii, aby szybko oddzielić LDN od krwi osób z wieloma chorobami i umożliwić dalsze badania tych komórek.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Przeciwciało anty-cytrulinowe dla królika poliklonalnego</td><td>AbCam</td><td>ab100932</td><td>Rozcieńczenie 1/50</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkanek z 96 dołkami</td><td>Costar; Corning, Inc.</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 antyludzkie przeciwciało IgG1 u myszy CD11b</td><td>BioLegend</td><td>301317</td><td>0,25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 antyludzkie przeciwciało IgM CD66b</td><td>BioLegend</td><td>305109</td><td>0,05 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwmysze IgG (H+L) dla koz, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>Rozcieńczenie 1/50</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne IgG1 przeciwko elastazie antyneutrofylowej myszy</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-55549</td><td>10 & mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwkróliczego IgG (H+L) dla osła, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31572</td><td>Rozcieńczenie 1/50</td></tr><tr><td>Przeciwciało IgG1 myszy APC CD62L anty-human</td><td>BioLegend</td><td>304809</td><td>0,03 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Przeciwciało IgG1 na myszy przeciwciało APC/Cyjanina7 CD14</td><td>BioLegend</td><td>367107</td><td>0,25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Attune NxT przepływowy cytometr &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>(niebieskie/czerwone lasery)</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydła (BSA) Fraction V</td><td>MP Biomedicals</td><td>810025</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 antyludzkie przeciwciało IgG1 dla myszy CD33</td><td>BioLegend</td><td>366609</td><td>0,30 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Calbiochem/EMD Millipore</td><td>268298</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Pharmacosmos A/C</td><td>5.51005E+11</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrorodamina-123</td><td>Anaspec, Inc.</td><td>AS-85711</td><td></td></tr><tr><td>Sorter komórek FACS</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>Model FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydła płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Merck KG</td><td>GE 17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało FITC CD98 na mysie IgG1 przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>315603</td><td>0,30 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>Becton Dickinson</td><td>Wersja 10, 2019</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny odwrócony</td><td>Olympus</td><td>Model IX-70</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Inhepar - PiSA Farmaceutica</td><td>3660149</td><td>5000 UI/mL</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>MACSprep Chimerism CD66b Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-552</td><td></td></tr><tr><td>Magnes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna separacji magnetycznej</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5415C</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłyt</td><td>BioTek Instruments</td><td>Model Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PE antyludzkie na mysie CD10 – przeciwciało IgG1</td><td>BioLegend</td><td>312203</td><td>0,05 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>PE antyludzkie przeciwciało CD16b IgG2a u myszy</td><td>BD Pharmingen</td><td>550868</td><td>Rozcieńczenie 1/40</td></tr><tr><td>PE/Cyjanina5 przeciwciało IgG1 u myszy CD15</td><td>BioLegend</td><td>323013</td><td>0,25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myrystat 13-octan (PMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-Lizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2658</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka chłodzona</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5702R</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli tkanek RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>23400-021</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Molecular Probes, Inc.</td><td>S-7020</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Laboratoria Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Rapid Magnetic-microbead Method for Efficient Purification of Low-density Neutrophils

Neutrofile, ważne leukocyty wrodzonej odporności, tradycyjnie uważane są za jednorodną populację komórek. Niemniej jednak najnowsze dowody wykazały, że neutrofile występują w kilku podpopulacjach. Jedną z takich subpopulacji są neutrofile o niskiej gęstości (LDN). LDN występuje w niewielkich ilościach we krwi zdrowych osób, ale ich liczba znacznie wzrasta w chorobach takich jak toczeń rumieniowaty układowy, choroby autoimmunologiczne, nowotwory i infekcje. W takich przypadkach LDN może uczestniczyć w patogenezie choroby. Jedynym sposobem izolowania LDN jest wirowanie gęstościowo-gradientowe krwi obwodowej. Jednak po wirowaniu LDN współoczyszcza się z komórkami jednojądrowymi. Dlatego badanie tej subpopulacji neutrofili jest wyzwaniem. Nie istnieje standardowa metodologia oddzielania LDN od komórek jednojądrowych. Zazwyczaj LDN są rozdzielane przez sortowanie komórek w cytometrze przepływowym. Jednak ta metoda wymaga długich godzin sortowania, aby uzyskać wystarczającą liczbę czystych komórek do dalszych badań funkcjonalnych. To poważnie wpływa na żywotność i funkcjonowanie komórek. Proponujemy tutaj praktyczną metodę uzyskania dużych ilości czystej i żywotnej LDN w krótkim czasie. Po wirowaniu w gęstości-gradiencie frakcja komórki monojądrowej jest inkubowana z mikrokulkami magnetycznymi anty-CD66b, a następnie LDN są rozdzielane przez kolumny magnetyczne w ciągu < 30 minut. Oczyszczone LDN (komórki CD66b+ ) są oznaczane przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b i CD98 i są analizowane cytometrią przepływową w celu potwierdzenia. Oczyszczone LDN są całkowicie funkcjonalne, co potwierdza ich zdolność do produkcji reaktywnych form tlenu oraz tworzenia pułapek zewnętrznych neutrofilowych. Ta nowa metoda oczyszczania skutkuje wysoką czystością LDN (ponad 90%) i żywotnością (ponad 96%) w krótkim czasie. Metodę tę można łatwo skalować, aby uzyskać duże ilości czystego LDN i ocenić funkcje LDN w różnych chorobach za pomocą analizy biochemicznej lub innej omiki.

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) u zdrowych osobników stanowią około 5% PBMC (Rysunek 2A). Opisany tutaj protokół zazwyczaj dostarcza czysty (&gt; 90%) LDN. Komórki są również efektywnie odzyskiwane (plon około 98%) z wysoką żywotnością (&gt; 95%; Rysunek 2B). Dla porównania, LDN również zostały oczyszczone przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnym, jak opisanowcześniej 22. Krótko mówiąc, P...

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Neutrophils, important leukocytes of innate immunity, have traditionally been considered a homogeneous cell population. Nevertheless, recent evidence has ...

Badamy neutrofile o niskiej gęstości w komórkach jednojądrowych krwi obwodowej, aby scharakteryzować ich funkcje i określić ich rolę w różnych chorobach. Neutrofile o niskiej gęstości są rzadkie w zdrowej krwi, ale znacznie zwiększają ryzyko chorób takich jak toczeń rumieniowaty układowy i nowotwory. Na początek dodaj 10 jednostek heparyny na mililitr jako antykoagulant do stożkowej wirówki o pojemności 15 mililitrów.Następnie dodaj dwa mililitry 6% dekstranu T500 w PBS. Pobierz 10 mililitrów krwi od zdrowego dorosłego ochotnika poprzez nakłucie żył. Do nowej rurki wirówki o pojemności 15 mililitrów dodaj pięć mililitrów medium o gradientie gęstości.Ostrożnie pipetuj osocze bez dotykania erytrocyta i nakładaj ją na ośrodek, tworząc dwie oddzielne fazy. Wiruj probówkę w 516 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby izolować PBMC, aspiruj i odrzucaj osocze powyżej pasma PBMC bez zakłócania komórek.Zbierz pasmo komórek monojądrowych pomiędzy plazmą a ośrodkiem, minimalizując zbieranie ośrodka. Dodaj 20 mililitrów PBS do probówki zawierającej PBMC, a następnie wiruj w wirówce 400 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie opróżnij supernatant i zeskrobaj rurkę, aby oddzielić granulki.Dodaj 10 mililitrów zimnego PBS, aby ponownie zawiesować komórki. Aby odizolować neutrofile, zeskrobaj rurkę, aby oddzielić komórki po pipetowaniu medium. Następnie dodaj 10 mililitrów zimnego PBS.Teraz przenieś ogniwa do świeżej 50-mililitrowej stożkowej rurki wirówki i wirówki. Aspiruj supernatant i ponownie zeskrobaj rurkę. Teraz pipetować 10 mililitrów zimnego roztworu hipotonicznego do rurki i delikatnie wymieszać.Mieszaj delikatnie dokładnie przez minutę. Szybko dodaj 10 mililitrów zimnego roztworu hipertonicznego i hipertonicznym, aby roztwór był izotoniczny. Następnie policz neutrofile za pomocą komory Neubauera i upewnij się, że czystość przekracza 95%. Wirówkuj zawiesinę, aby uzyskać granulację komórkową.Następnie ponownie zawiesij granulki w zimnym PBS. Wiruj komórki jednojądrowe krwi obwodowej w dawce 400 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesij komórki w 120 mikrolitrach buforu do zimnego płukania.Następnie pipetować 35 mikrolitrów magnetycznych mikrogranulek CD66b do zawiesiny ogniwa. Inkubuj mieszankę w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Teraz pipetować jeden mililitr buforu do zimnego mycia do rurki.Wiruj probówkę w 400 g przez trzy minuty. Po usunięciu supernatantu zeskrobaj rurkę, aby oddzielić pellet komórkowy. I ponowne zawieszenie komórek w jednym mililitrze buforu płukania.Umieść na magnesie kolumnę separacyjną magnetyczną. Dodaj 0,5 mililitra bufora do przepłukania do kolumny, co pozwala jej całkowicie przejść. Przelej jeden mililitr komórek zawieszonych na kolumnę i pozwól buforowi przechodzić kropla po kropli.Po umyciu przelej kolumnę do rurki mikrowirówki. Następnie pipetuję jeden mililitr buforu do kolumny. Teraz włóż tłok na górę kolumny.Delikatnie wywieraj nacisk, aby wyłączyć komórki. Następnie wyjmij tłok i umieść kolumnę na nowej rurce mikrowirówki. Dodaj kolejny mililitr buforu do płukania do kolumny.Następnie ponownie włóż tłok i delikatnie naciskaj, aby wyłączyć pozostałe komórki. Wiruj obie rurki mikrowirówki w 800 g przez trzy minuty. Ponownie zawiesij pellety z obu rurek do jednego mililitra zimnego PBS.Trzymaj zawiesinę komórkową na lodzie. Ponownie zawiesić oczyszczone komórki w buforze znakującym złożonym z 1% surowicy bydła płodu w PBS. Przelej 250 mikrolitrów zawiesiny do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.Do rurki należy dodać odpowiadające mu przeciwciała przeciwko cząsteczkom błony neutrofili. Następnie inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronione przed światłem. Teraz pipetuj jeden mililitr PBS do rurki.Skręć rurkę w mikrowirówce z pojemnością 800 g przez trzy minuty. Wypompuj supernatant. Stuknij w rurkę, żeby rozbić granulkę.I ponownie zawiesić komórki w 0,5 mililitra 1% paradehydu. Następnie utrzymuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronione przed światłem aż do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując 10 000 zdarzeń na próbkę.Neutrofile o niskiej gęstości u zdrowych osób stanowiły około 5% komórek monojądrowych krwi obwodowej, podczas gdy opisany protokół izolacji magnetycznej dawał neutrofile o niskiej gęstości przy około 98% odzyskiwania. Neutrofile wyrażają markery błonowe CD10, CD11b, CD15, CD62L i CD66b. Magnetycznie oczyszczone neutrofile o niskiej gęstości wyrażały te same markery błonowe co neutrofile.Oczyszczone neutrofile o niskiej gęstości wykazywały jądro wielopłatkowe i były wielkości podobne do neutrofilów. Zarówno neutrofile, jak i neutrofile o niskiej gęstości generują reaktywne rodzaje tlenu w odpowiedzi na stymulację PMA, przy czym neutrofile o niskiej gęstości produkują wyższe poziomy niż neutrofile. Neutrofile o niskiej gęstości uwalniały pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili w odpowiedzi na stymulację PMA, co potwierdza kolokalizacja DNA z elastazą i cytruliną.Zarówno oczyszczone neutrofile, jak i neutrofile o niskiej gęstości uwalniały NET-y o podobnej kinetyce i ilościach po leczeniu PMA. Nasz protokół zapewnia szybki i powtarzalny sposób uzyskania wysoce czystych i funkcjonalnych neutrofilów o niskiej gęstości. Zajmujemy się brakiem ustandaryzowanego, efektywnego w czasie protokołu izolacji neutrofilów o niskiej gęstości od ludzkiej krwi.Protokół ten nie wymaga specjalnego szkolenia dla złożonych instrumentów, a jest też bardziej ekonomiczny i szybszy niż FACS.

rapid-magnetic-microbead-method-for-efficient-purification-low

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Neutrofile należą do pierwszych komórek docierających do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej, a ich funkcje i mechanizmy zostały szeroko zbadane in vitro. Prezentujemy standardową metodę separacji w gradiencie gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu komercyjnie dostępnych mediów separacyjnych.

Protokół izolacji neutrofili

Film wyjaśnia sposób oczyszczania limfocytów B poprzez celowanie immunomagnetyczne i separację od zawiesiny komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Metoda ta polega na znakowaniu niepożądanych typów komórek specyficznymi przeciwciałami lub ligandami (połączonymi z cząstkami magnetycznymi) skierowanymi przeciwko określonym białkom powierzchniowym komórki, które mają zostać usunięte z heterogenicznej zawiesiny komórkowej przez separację magnetyczną.

Negatywna selekcja immunomagnetyczna: metoda oczyszczania limfocytów B z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

W tym filmie opisujemy procedurę izolowania neutrofili o niskiej gęstości (LDN) z płynu z płukania otrzewnowej u pooperacyjnego pacjenta. Uzyskane w ten sposób LDN mogą być wykorzystane w dalszych eksperymentach w celu zrozumienia ich roli we wzroście i progresji guza.

Izolacja neutrofili o niskiej gęstości otrzewnej: technika uzyskiwania neutrofili o niskiej gęstości z płynu do płukania otrzewnej przy użyciu magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Opisujemy protokół izolacji i oczyszczania neutrofili ze szpiku kostnego myszy poprzez wirowanie w gradiacji gęstości oraz znakowanie neutrofili za pomocą barwników CellTracker. Jest to prosta, szybka, powtarzalna i ekonomiczna metoda uzyskiwania dużej liczby neutrofili do dalszych badań funkcjonalnych lub eksperymentów adoptywnych w zakresie transferu i śledzenia.

Izolacja, oczyszczanie i znakowanie neutrofili szpiku kostnego myszy do badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Neutrofile to najliczniejszy rodzaj białych krwinek. Opisano tutaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą separacji w gradinie gęstości i różnicowanie ludzkich komórek promielocytowych (HL60) wzdłuż szlaku granulocytarnego; w celu zbadania ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe.

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Mutacje w genie bogatej w leucynę kinazy powtórzeniowej 2 (LRRK2) powodują dziedziczną chorobę Parkinsona. Opracowaliśmy łatwą i solidną metodę oceny kontrolowanej przez LRRK2 fosforylacji Rab10 w ludzkich neutrofilach krwi obwodowej. Może to pomóc w identyfikacji osób ze zwiększoną aktywnością szlaku kinazy LRRK2.

Izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy LRRK2 związanego z chorobą Parkinsona poprzez ocenę fosforylacji Rab10

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolacji neutrofili z krwi pełnej, kożuchów lub błon leukaferezy, osiągając dobrą wydajność, wysoką czystość i minimalną aktywację komórek. Wykorzystujemy oczyszczanie gradientowe, sedymentację czerwonych krwinek (RBC) i lizę RBC, aby uzyskać wysokiej jakości / czysty preparat neutrofili.

Izolacja ludzkich neutrofili z krwi pełnej i kożuchów

To badanie przedstawia dwie techniki izolowania licznych pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) ze szpiku kostnego szczura. Jedna metoda łączy komercyjny zestaw do izolacji neutrofili z wirowaniem w gradionym przepływie gęstości, podczas gdy druga wykorzystuje tylko wirowanie w gradiencie gęstości. Oba podejścia dają funkcjonalne NET przewyższające te z neutrofili krwi obwodowej.

Unikalne podejście do izolowania neutrofili szpiku kostnego szczurów o porównywalnej pojemności

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę kompatybilną z automatyzacją o wysokiej przepustowości, polegającą na izolowaniu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do biobankowania i innych celów.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych

Tutaj oferujemy niezawodne podejście do izolacji neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej za pomocą izolacji magnetycznej (selekcja negatywna) i podłoża o nieciągłym gradinie gęstości. Zapewnia nietkniętą izolację komórek o wysokiej czystości (≥93%), ułatwiając dokładną analizę subpopulacji neutrofili, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w zdrowiu i chorobie.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

Poznaj szybką metodę magnetyczno-mikrokulkową do izolacji czystych i żywotnych neutrofilów o niskiej gęstości z krwi obwodowej. Technika ta umożliwia badanie ich roli w chorobach autoimmunologicznych i nowotworowych.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Przeglądaj więcej filmów