Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Badamy neutrofile o niskiej gęstości w komórkach jednojądrowych krwi obwodowej, aby scharakteryzować ich funkcje i określić ich rolę w różnych chorobach. Neutrofile o niskiej gęstości są rzadkie w zdrowej krwi, ale znacznie zwiększają ryzyko chorób takich jak toczeń rumieniowaty układowy i nowotwory. Na początek dodaj 10 jednostek heparyny na mililitr jako antykoagulant do stożkowej wirówki o pojemności 15 mililitrów.

Następnie dodaj dwa mililitry 6% dekstranu T500 w PBS. Pobierz 10 mililitrów krwi od zdrowego dorosłego ochotnika poprzez nakłucie żył. Do nowej rurki wirówki o pojemności 15 mililitrów dodaj pięć mililitrów medium o gradientie gęstości.

Ostrożnie pipetuj osocze bez dotykania erytrocyta i nakładaj ją na ośrodek, tworząc dwie oddzielne fazy. Wiruj probówkę w 516 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby izolować PBMC, aspiruj i odrzucaj osocze powyżej pasma PBMC bez zakłócania komórek.

Zbierz pasmo komórek monojądrowych pomiędzy plazmą a ośrodkiem, minimalizując zbieranie ośrodka. Dodaj 20 mililitrów PBS do probówki zawierającej PBMC, a następnie wiruj w wirówce 400 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie opróżnij supernatant i zeskrobaj rurkę, aby oddzielić granulki.

Dodaj 10 mililitrów zimnego PBS, aby ponownie zawiesować komórki. Aby odizolować neutrofile, zeskrobaj rurkę, aby oddzielić komórki po pipetowaniu medium. Następnie dodaj 10 mililitrów zimnego PBS.

Teraz przenieś ogniwa do świeżej 50-mililitrowej stożkowej rurki wirówki i wirówki. Aspiruj supernatant i ponownie zeskrobaj rurkę. Teraz pipetować 10 mililitrów zimnego roztworu hipotonicznego do rurki i delikatnie wymieszać.

Mieszaj delikatnie dokładnie przez minutę. Szybko dodaj 10 mililitrów zimnego roztworu hipertonicznego i hipertonicznym, aby roztwór był izotoniczny. Następnie policz neutrofile za pomocą komory Neubauera i upewnij się, że czystość przekracza 95%. Wirówkuj zawiesinę, aby uzyskać granulację komórkową.

Następnie ponownie zawiesij granulki w zimnym PBS. Wiruj komórki jednojądrowe krwi obwodowej w dawce 400 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesij komórki w 120 mikrolitrach buforu do zimnego płukania.

Następnie pipetować 35 mikrolitrów magnetycznych mikrogranulek CD66b do zawiesiny ogniwa. Inkubuj mieszankę w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Teraz pipetować jeden mililitr buforu do zimnego mycia do rurki.

Wiruj probówkę w 400 g przez trzy minuty. Po usunięciu supernatantu zeskrobaj rurkę, aby oddzielić pellet komórkowy. I ponowne zawieszenie komórek w jednym mililitrze buforu płukania.

Umieść na magnesie kolumnę separacyjną magnetyczną. Dodaj 0,5 mililitra bufora do przepłukania do kolumny, co pozwala jej całkowicie przejść. Przelej jeden mililitr komórek zawieszonych na kolumnę i pozwól buforowi przechodzić kropla po kropli.

Po umyciu przelej kolumnę do rurki mikrowirówki. Następnie pipetuję jeden mililitr buforu do kolumny. Teraz włóż tłok na górę kolumny.

Delikatnie wywieraj nacisk, aby wyłączyć komórki. Następnie wyjmij tłok i umieść kolumnę na nowej rurce mikrowirówki. Dodaj kolejny mililitr buforu do płukania do kolumny.

Następnie ponownie włóż tłok i delikatnie naciskaj, aby wyłączyć pozostałe komórki. Wiruj obie rurki mikrowirówki w 800 g przez trzy minuty. Ponownie zawiesij pellety z obu rurek do jednego mililitra zimnego PBS.

Trzymaj zawiesinę komórkową na lodzie. Ponownie zawiesić oczyszczone komórki w buforze znakującym złożonym z 1% surowicy bydła płodu w PBS. Przelej 250 mikrolitrów zawiesiny do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.

Do rurki należy dodać odpowiadające mu przeciwciała przeciwko cząsteczkom błony neutrofili. Następnie inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronione przed światłem. Teraz pipetuj jeden mililitr PBS do rurki.

Skręć rurkę w mikrowirówce z pojemnością 800 g przez trzy minuty. Wypompuj supernatant. Stuknij w rurkę, żeby rozbić granulkę.

I ponownie zawiesić komórki w 0,5 mililitra 1% paradehydu. Następnie utrzymuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronione przed światłem aż do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując 10 000 zdarzeń na próbkę.

Neutrofile o niskiej gęstości u zdrowych osób stanowiły około 5% komórek monojądrowych krwi obwodowej, podczas gdy opisany protokół izolacji magnetycznej dawał neutrofile o niskiej gęstości przy około 98% odzyskiwania. Neutrofile wyrażają markery błonowe CD10, CD11b, CD15, CD62L i CD66b. Magnetycznie oczyszczone neutrofile o niskiej gęstości wyrażały te same markery błonowe co neutrofile.

Oczyszczone neutrofile o niskiej gęstości wykazywały jądro wielopłatkowe i były wielkości podobne do neutrofilów. Zarówno neutrofile, jak i neutrofile o niskiej gęstości generują reaktywne rodzaje tlenu w odpowiedzi na stymulację PMA, przy czym neutrofile o niskiej gęstości produkują wyższe poziomy niż neutrofile. Neutrofile o niskiej gęstości uwalniały pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili w odpowiedzi na stymulację PMA, co potwierdza kolokalizacja DNA z elastazą i cytruliną.

Zarówno oczyszczone neutrofile, jak i neutrofile o niskiej gęstości uwalniały NET-y o podobnej kinetyce i ilościach po leczeniu PMA. Nasz protokół zapewnia szybki i powtarzalny sposób uzyskania wysoce czystych i funkcjonalnych neutrofilów o niskiej gęstości. Zajmujemy się brakiem ustandaryzowanego, efektywnego w czasie protokołu izolacji neutrofilów o niskiej gęstości od ludzkiej krwi.

Protokół ten nie wymaga specjalnego szkolenia dla złożonych instrumentów, a jest też bardziej ekonomiczny i szybszy niż FACS.