Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości
11 listopada 2025
Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.
Badamy neutrofile o niskiej gęstości w komórkach jednojądrowych krwi obwodowej, aby scharakteryzować ich funkcje i określić ich rolę w różnych chorobach. Neutrofile o niskiej gęstości są rzadkie w zdrowej krwi, ale znacznie zwiększają ryzyko chorób takich jak toczeń rumieniowaty układowy i nowotwory. Na początek dodaj 10 jednostek heparyny na mililitr jako antykoagulant do stożkowej wirówki o pojemności 15 mililitrów.
Następnie dodaj dwa mililitry 6% dekstranu T500 w PBS. Pobierz 10 mililitrów krwi od zdrowego dorosłego ochotnika poprzez nakłucie żył. Do nowej rurki wirówki o pojemności 15 mililitrów dodaj pięć mililitrów medium o gradientie gęstości.
Ostrożnie pipetuj osocze bez dotykania erytrocyta i nakładaj ją na ośrodek, tworząc dwie oddzielne fazy. Wiruj probówkę w 516 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby izolować PBMC, aspiruj i odrzucaj osocze powyżej pasma PBMC bez zakłócania komórek.
Zbierz pasmo komórek monojądrowych pomiędzy plazmą a ośrodkiem, minimalizując zbieranie ośrodka. Dodaj 20 mililitrów PBS do probówki zawierającej PBMC, a następnie wiruj w wirówce 400 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie opróżnij supernatant i zeskrobaj rurkę, aby oddzielić granulki.
Dodaj 10 mililitrów zimnego PBS, aby ponownie zawiesować komórki. Aby odizolować neutrofile, zeskrobaj rurkę, aby oddzielić komórki po pipetowaniu medium. Następnie dodaj 10 mililitrów zimnego PBS.
Teraz przenieś ogniwa do świeżej 50-mililitrowej stożkowej rurki wirówki i wirówki. Aspiruj supernatant i ponownie zeskrobaj rurkę. Teraz pipetować 10 mililitrów zimnego roztworu hipotonicznego do rurki i delikatnie wymieszać.
Mieszaj delikatnie dokładnie przez minutę. Szybko dodaj 10 mililitrów zimnego roztworu hipertonicznego i hipertonicznym, aby roztwór był izotoniczny. Następnie policz neutrofile za pomocą komory Neubauera i upewnij się, że czystość przekracza 95%. Wirówkuj zawiesinę, aby uzyskać granulację komórkową.
Następnie ponownie zawiesij granulki w zimnym PBS. Wiruj komórki jednojądrowe krwi obwodowej w dawce 400 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesij komórki w 120 mikrolitrach buforu do zimnego płukania.
Następnie pipetować 35 mikrolitrów magnetycznych mikrogranulek CD66b do zawiesiny ogniwa. Inkubuj mieszankę w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Teraz pipetować jeden mililitr buforu do zimnego mycia do rurki.
Wiruj probówkę w 400 g przez trzy minuty. Po usunięciu supernatantu zeskrobaj rurkę, aby oddzielić pellet komórkowy. I ponowne zawieszenie komórek w jednym mililitrze buforu płukania.
Umieść na magnesie kolumnę separacyjną magnetyczną. Dodaj 0,5 mililitra bufora do przepłukania do kolumny, co pozwala jej całkowicie przejść. Przelej jeden mililitr komórek zawieszonych na kolumnę i pozwól buforowi przechodzić kropla po kropli.
Po umyciu przelej kolumnę do rurki mikrowirówki. Następnie pipetuję jeden mililitr buforu do kolumny. Teraz włóż tłok na górę kolumny.
Delikatnie wywieraj nacisk, aby wyłączyć komórki. Następnie wyjmij tłok i umieść kolumnę na nowej rurce mikrowirówki. Dodaj kolejny mililitr buforu do płukania do kolumny.
Następnie ponownie włóż tłok i delikatnie naciskaj, aby wyłączyć pozostałe komórki. Wiruj obie rurki mikrowirówki w 800 g przez trzy minuty. Ponownie zawiesij pellety z obu rurek do jednego mililitra zimnego PBS.
Trzymaj zawiesinę komórkową na lodzie. Ponownie zawiesić oczyszczone komórki w buforze znakującym złożonym z 1% surowicy bydła płodu w PBS. Przelej 250 mikrolitrów zawiesiny do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.
Do rurki należy dodać odpowiadające mu przeciwciała przeciwko cząsteczkom błony neutrofili. Następnie inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronione przed światłem. Teraz pipetuj jeden mililitr PBS do rurki.
Skręć rurkę w mikrowirówce z pojemnością 800 g przez trzy minuty. Wypompuj supernatant. Stuknij w rurkę, żeby rozbić granulkę.
I ponownie zawiesić komórki w 0,5 mililitra 1% paradehydu. Następnie utrzymuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronione przed światłem aż do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując 10 000 zdarzeń na próbkę.
Neutrofile o niskiej gęstości u zdrowych osób stanowiły około 5% komórek monojądrowych krwi obwodowej, podczas gdy opisany protokół izolacji magnetycznej dawał neutrofile o niskiej gęstości przy około 98% odzyskiwania. Neutrofile wyrażają markery błonowe CD10, CD11b, CD15, CD62L i CD66b. Magnetycznie oczyszczone neutrofile o niskiej gęstości wyrażały te same markery błonowe co neutrofile.
Oczyszczone neutrofile o niskiej gęstości wykazywały jądro wielopłatkowe i były wielkości podobne do neutrofilów. Zarówno neutrofile, jak i neutrofile o niskiej gęstości generują reaktywne rodzaje tlenu w odpowiedzi na stymulację PMA, przy czym neutrofile o niskiej gęstości produkują wyższe poziomy niż neutrofile. Neutrofile o niskiej gęstości uwalniały pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili w odpowiedzi na stymulację PMA, co potwierdza kolokalizacja DNA z elastazą i cytruliną.
Zarówno oczyszczone neutrofile, jak i neutrofile o niskiej gęstości uwalniały NET-y o podobnej kinetyce i ilościach po leczeniu PMA. Nasz protokół zapewnia szybki i powtarzalny sposób uzyskania wysoce czystych i funkcjonalnych neutrofilów o niskiej gęstości. Zajmujemy się brakiem ustandaryzowanego, efektywnego w czasie protokołu izolacji neutrofilów o niskiej gęstości od ludzkiej krwi.
Protokół ten nie wymaga specjalnego szkolenia dla złożonych instrumentów, a jest też bardziej ekonomiczny i szybszy niż FACS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie koncentruje się na neutrofilach o niskiej gęstości (LDN) znajdujących się w jednojądrzastym komórkach krwi obwodowej, które są rzadkie u osób zdrowych, ale znacznie wzrastają w różnych chorobach. Artykuł przedstawia praktyczną metodę izolowania czystych i żywotnych LDN za pomocą technik izolowania gradientem gęstości i separacji magnetycznej.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Neutrofile o niskiej gęstości są związane z chorobami takimi jak toczeń rumieniowaty układowy i rakiem.
- Zrozumienie LDN może dostarczyć wglądu w ich role w mechanizmach chorobowych.
- Izolacja LDN jest kluczowa dla badania ich funkcji i potencjału terapeutycznego.
- Obecne metody izolacji LDN mogą nie dać czystych i żywotnych komórek.
Cel badania
- Zcharakteryzowanie funkcji neutrofili o niskiej gęstości.
- Określenie roli LDN w różnych chorobach.
- Przedstawienie efektywnej metody izolowania LDN z krwi obwodowej.
Stosowane metody
- Zastosowanie hepariny jako antykoagulantu przy pobieranie krwi.
- Zastosowanie dektranu T500 do izolowania gradientem gęstości.
- Inkubacja z magnetycznymi mikrokulkami do sortowania komórek.
- Izolacja LDN za pomocą magnetycznych kolumn.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie izolowuje czyste i żywotne neutrofile o niskiej gęstości.
- LDN można scharakteryzować pod kątem ich funkcyjnych ról w chorobach.
- Lepsze zrozumienie LDN może prowadzić do lepszych strategii terapeutycznych.
- Technika izolacji może być zastosowana w różnych ustawieniach badawczych.
Wnioski
- Izolowanie LDN jest istotne dla badania ich wpływu na zdrowie i choroby.
- Przedstawiona metoda poprawia czystość i żywotność izolowanych komórek.
- Dalsze badania nad LDN mogą przyczynić się do postępów w dziedzinie immunologii i podejściach terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of low-density neutrophils (LDN) addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery, enabling robust functional studies of disease-associated neutrophil subpopulations. This rapid magnetic-microbead method delivers high-purity, viable LDN, supporting mechanistic de-risking and target validation in autoimmune, oncology, and infectious disease pipelines. Scalable, reproducible LDN purification enhances predictive confidence for translational biomarker and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LDN-mediated disease mechanisms and immune pathway clarification.
- Supports biological de-risking by isolating functionally intact LDN for hypothesis testing.
- Facilitates target validation by providing pure cell populations for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated LDN samples for quantitative flow cytometry and functional assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through high-purity cell isolation.
- Accelerates screening readiness by reducing isolation time and preserving cell viability.
Translational & Preclinical Research
- Enables disease-relevant functional studies of LDN in autoimmune, cancer, and infection models.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing scalable LDN yields.
- Facilitates omics and biomarker analyses aligned with translational research objectives.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, reproducible LDN isolation for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and immune pathway analysis using purified LDN.
- Screening: Delivers standardized, viable LDN for quantitative flow cytometry and functional readouts.
- Analytics: Supports robust measurement of LDN marker expression and functional outputs such as ROS and NET formation.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease model development by enabling scalable LDN purification.
- Enterprise Reuse: Offers a reproducible, time-efficient protocol adaptable across disease areas and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes LDN isolation, improving reproducibility and scalability for high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and translational biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires basic cell biology expertise and standard laboratory instrumentation.
- Utilizes magnetic separation columns and flow cytometry for validation.
- Enables cross-team standardization due to protocol simplicity and reproducibility.
- Adaptable to various disease models and sample volumes for scalable studies.
- Limited by the need for specific antibodies and magnetic bead reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Neutrophils from Human Blood
2:55
Purification of Low-Density Neutrophils (LDNs) Using Magnetic Microbeads
4:59
Multicolor Flow Cytometry Staining and Analysis of Purified Neutrophils
6:13
Results
7:43
Conclusion
