Projektowanie i rozwój kolorymetrycznych testów kolorymetrycznych opartych na aptamirze–złotych nanocząsteczkach do zastosowań terenowych

Głównym celem jest opracowanie ogólnego podejścia do opracowania kolorymetrycznego testu kolorymetrycznego opartego na nanocząsteczkach aptamino-złota do wykrywania cząsteczek docelowych oraz opracowanie metod poprawiających długoterminowe przechowywanie i zmniejszających wskaźniki fałszywie pozytywnych odpowiedzi. Ta metoda odpowiada na kluczowe pytania w dziedzinie kolorymetrycznych testów aptaminow nanocząsteczek złota, takie jak powtarzalność testów w terenie do długotrwałego przechowywania oraz zmniejszenie wskaźnika fałszywie pozytywnych odpowiedzi. Te testy mogą być podatne na problemy z trwałością i fałszywie pozytywne odpowiedzi.

W tej pracy doskonalimy się w obu tych kwestiach. Oczyść kolbę Erlenmeyera o pojemności 500 mililitrów i duży pręt mieszający pięcioma mililitrami skoncentrowanego kwasu azotowego i 15 mililitrami skoncentrowanego kwasu solnego w okapie chemicznym. Zwilż całą powierzchnię kolby kwasowym washem.

Następnie przepłucz kolbę wodą wolną od nukleazy i pozwól jej wyschnąć. Dodaj 100 mililitrów 1 milimolarnego złota i trzychlorku. Użyj arkusza folii aluminiowej, aby przykryć wierzch kolby Erlenmeyera oczyszczonej kwasem i podgrzewać z ciągłym mieszaniem na gorącej płycie, aż zagotuje.

Następnie dodaj 10 mililitrów cytrynianu sodu o stężeniu 38,8 milimolowego. Kolor zmienia się od klarownego lub szarego do ciemnoniebieskiego lub czarnego, a następnie do ciemnego, a potem do czerwonego przez kilka minut. Kontynuuj mieszanie z wyłączonym ogniem przez 10 minut.

Pozostawić zawiesinę nanocząsteczek złota do temperatury pokojowej i dodać 110 mikrolitrów DEPC z ciągłym mieszaniem. Całą kolbę przykryj folią aluminiową i pozwól zabiegowi DEPC inkubować przez noc. Następnego dnia podkładaj do autoklawu złotą zawiesinę nanocząsteczkową.

Następnie schłodzić do temperatury pokojowej i przefiltrować przez membranę celulozową o powierzchni poru 0,22 mikrona. Przechowuj filtrowany, autoklawowany roztwór nanocząsteczek złota w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oblicz stężenie nanocząsteczek złota, jak opisano w protokole tekstowym.

Tutaj stężenie zostało obliczone na 10 nanomolarów o rozmiarze 15 nanometrów, co zostało określone przez dynamiczne rozpraszanie światła. Kup lub syntetyzuj sekwencje aptamerów wiążące kokainę, stosując standardową chemię fosforamidową. Po oczyszczeniu aptamerów za pomocą standardowego odsolania, odtworz oligonukleotydy w wodzie wolnej od nukleazy w roztworze zapasowym o długości 100 mikromolów lub 1 milimolu.

Oczyszczone aptamery z alicytami można przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez kilka miesięcy. Połącz DNA z 10-nanomolowym roztworem nanocząsteczek złota, zmieniając objętość nanocząsteczek złota według potrzeb, aby uzyskać wystarczającą ilość próbki do przeprowadzenia testu. Inkubuj mieszankę przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej i chroń przed światłem.

Dodaj równą objętość 20 milimolowych HEPES, dwumilimolowego chlorku magnezu i bufor pH 7,4, a próbkę umieść w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Początkowe stężenie soli potrzebne do wywołania odpowiedzi kolorowej testu przez miareczkowanie soli określa się za pomocą pustego materiału testowego. Dodaj 20 mikrolitrów metanolu do 180-mikrolitrowych aliquotów testu chlorku aptamera i złota w płytce z 96 dołkami.

Kluczowym krokiem w wykonaniu tych testów jest określenie stężenia chlorku sodu, aby zdestabilizować nanocząstki złota po dodaniu celu. Stopniowo zwiększać ilość roztworu chlorku sodu i określić punkt równoważności. Tutaj określ objętość chlorku sodu potrzebną do wywołania najmniejszej zmiany koloru na podstawie obserwacji wzrokowej.

Aby zoptymalizować odpowiedź testu, dodaj 20 mikrolitrów cząsteczek analitu rozcieńczonych w metanolu do 180-mikrolitrowych aliquotów testu nanocząsteczkowego aptamera i złota w 96-dołkowej płycie w temperaturze pokojowej. Natychmiast dodaj stężenie chlorku sodu ustalone w poprzednim kroku, aby rozpocząć reakcję kolorową testu. Uzyskaj możliwą jak największą zmianę koloru, zwiększając lub zmniejszając stężenie chlorku sodu i porównując docelową odpowiedź z odpowiedzią pustą.

Użyj stężenia chlorku sodu, które daje największą różnicę w odpowiedzi. Obserwuj lub mierz odpowiedź testu 150 sekund po dodaniu chlorku sodu. Przeanalizuj absorpcję w 650 nanometrach i 530 nanometrach, używając spektrofotometru.

Wyniki przedstawimy jako stosunek absorpcji uzyskany na 650 nanometrach i 530 nanometrach w funkcji stężenia analitu. Znormalizuj odpowiedź testu na sygnał pusty. Przygotuj składniki testu nanocząsteczkowego aptamieru złota, jak opisano wcześniej w filmie.

Przygotuj oddzielne roztwory zawierające jeden gram trehalozy na mililitr i jeden gram na mililitr sacharozy w wodzie wolnej od nukleazy, aby uzyskać roztwór kriogenu. Dlatego kluczowym krokiem w zamrażaniu tych testów jest określenie, ile roztworów trehalozy i sacharozy należy dodać do próbek, aby zapewnić całkowite, a równe zamrożenie. Zrób roztwór zawierający 19,2 miligrama trehalozy na mililitr oraz 4,8 miligrama na mililitr sacharozy z testem nanocząsteczek 60 MN4 na nanocząstki złota w końcowej objętości 200 mikrolitrów w rurkach mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.

Końcowe stężenia roztworu kriogenowego będą się różnić w zależności od pokrycia DNA. Próbki zamrażają błyskawicznie w zamrażarce o temperaturze 146 stopni Celsjusza lub w ciekłym azocie. Przechowuj próbki zamrożone do czasu użycia.

Do tej pracy pozostawić próbki na noc w zamrażarce o temperaturze 146 stopni Celsjusza, a następnie przenieść je do zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Przedstawiono reprezentatywne wyniki krzywych miarkowania chlorku sodu dla nanocząstek złota nieobrobionych i APTAMEREM DNA. Początkowe stężenie chlorku sodu użyte w teście ustalono, miażdżąc go przez miareczkowanie.

Reprezentatywne wyniki kolorymetrycznego testu nanocząsteczek aptamino-złota dla kokainy i cząsteczek kontrolnych przedstawiono tutaj. Wykresy pokazują wpływ zwiększenia gęstości pokrycia DNA na wskaźnik fałszywie pozytywnych odpowiedzi testu kokainowego. Poniżej przedstawiono wykresy krzywej kalibracyjnej uzyskane z analizy fotoobrazowej testu kolorymetrycznego kokainy.

Zdjęcia uzyskane za pomocą smartfonów. Reprezentatywne wyniki odpowiedzi testu kolorymetrycznego nanocząsteczkowego aptameru złota na kokainę oraz cząsteczki kontrolne przedstawiono tutaj. Dane porównują próbki świeżo przygotowane z próbkami przechowywanymi do czterech tygodni.

Podczas tej procedury bardzo ważne jest określenie odpowiedniego stężenia chlorku sodu, aby zdestabilizować nanocząsteczki złota i sprzyjać typowej zmianie koloru po dodaniu celu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak opracować kolorymetryczne testy aptamiserowe nanocząsteczki złota do wykrywania interesujących obiektów. Możesz skorzystać z opisanych tutaj metod, aby zmniejszyć wskaźnik fałszywie pozytywnych odpowiedzi i utrzymać testy w stanie użyteczności przez ponad miesiąc.