Projektowanie i rozwój kolorymetrycznych testów kolorymetrycznych opartych na aptamirze–złotych nanocząsteczkach do zastosowań terenowych
23 czerwca 2016
Analizowano projekt i opracowanie kolorymetrycznego testu nanocząsteczkowego aptamera i złota do wykrywania małych cząsteczek do zastosowań terenowych. Dodatkowo zatwierdzono aplikację kolorymetryczną (smart-device) oraz ustalono długoterminowe przechowywanie testu do użytku w terenie.
Głównym celem jest opracowanie ogólnego podejścia do opracowania kolorymetrycznego testu kolorymetrycznego opartego na nanocząsteczkach aptamino-złota do wykrywania cząsteczek docelowych oraz opracowanie metod poprawiających długoterminowe przechowywanie i zmniejszających wskaźniki fałszywie pozytywnych odpowiedzi. Ta metoda odpowiada na kluczowe pytania w dziedzinie kolorymetrycznych testów aptaminow nanocząsteczek złota, takie jak powtarzalność testów w terenie do długotrwałego przechowywania oraz zmniejszenie wskaźnika fałszywie pozytywnych odpowiedzi. Te testy mogą być podatne na problemy z trwałością i fałszywie pozytywne odpowiedzi.
W tej pracy doskonalimy się w obu tych kwestiach. Oczyść kolbę Erlenmeyera o pojemności 500 mililitrów i duży pręt mieszający pięcioma mililitrami skoncentrowanego kwasu azotowego i 15 mililitrami skoncentrowanego kwasu solnego w okapie chemicznym. Zwilż całą powierzchnię kolby kwasowym washem.
Następnie przepłucz kolbę wodą wolną od nukleazy i pozwól jej wyschnąć. Dodaj 100 mililitrów 1 milimolarnego złota i trzychlorku. Użyj arkusza folii aluminiowej, aby przykryć wierzch kolby Erlenmeyera oczyszczonej kwasem i podgrzewać z ciągłym mieszaniem na gorącej płycie, aż zagotuje.
Następnie dodaj 10 mililitrów cytrynianu sodu o stężeniu 38,8 milimolowego. Kolor zmienia się od klarownego lub szarego do ciemnoniebieskiego lub czarnego, a następnie do ciemnego, a potem do czerwonego przez kilka minut. Kontynuuj mieszanie z wyłączonym ogniem przez 10 minut.
Pozostawić zawiesinę nanocząsteczek złota do temperatury pokojowej i dodać 110 mikrolitrów DEPC z ciągłym mieszaniem. Całą kolbę przykryj folią aluminiową i pozwól zabiegowi DEPC inkubować przez noc. Następnego dnia podkładaj do autoklawu złotą zawiesinę nanocząsteczkową.
Następnie schłodzić do temperatury pokojowej i przefiltrować przez membranę celulozową o powierzchni poru 0,22 mikrona. Przechowuj filtrowany, autoklawowany roztwór nanocząsteczek złota w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oblicz stężenie nanocząsteczek złota, jak opisano w protokole tekstowym.
Tutaj stężenie zostało obliczone na 10 nanomolarów o rozmiarze 15 nanometrów, co zostało określone przez dynamiczne rozpraszanie światła. Kup lub syntetyzuj sekwencje aptamerów wiążące kokainę, stosując standardową chemię fosforamidową. Po oczyszczeniu aptamerów za pomocą standardowego odsolania, odtworz oligonukleotydy w wodzie wolnej od nukleazy w roztworze zapasowym o długości 100 mikromolów lub 1 milimolu.
Oczyszczone aptamery z alicytami można przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez kilka miesięcy. Połącz DNA z 10-nanomolowym roztworem nanocząsteczek złota, zmieniając objętość nanocząsteczek złota według potrzeb, aby uzyskać wystarczającą ilość próbki do przeprowadzenia testu. Inkubuj mieszankę przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej i chroń przed światłem.
Dodaj równą objętość 20 milimolowych HEPES, dwumilimolowego chlorku magnezu i bufor pH 7,4, a próbkę umieść w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Początkowe stężenie soli potrzebne do wywołania odpowiedzi kolorowej testu przez miareczkowanie soli określa się za pomocą pustego materiału testowego. Dodaj 20 mikrolitrów metanolu do 180-mikrolitrowych aliquotów testu chlorku aptamera i złota w płytce z 96 dołkami.
Kluczowym krokiem w wykonaniu tych testów jest określenie stężenia chlorku sodu, aby zdestabilizować nanocząstki złota po dodaniu celu. Stopniowo zwiększać ilość roztworu chlorku sodu i określić punkt równoważności. Tutaj określ objętość chlorku sodu potrzebną do wywołania najmniejszej zmiany koloru na podstawie obserwacji wzrokowej.
Aby zoptymalizować odpowiedź testu, dodaj 20 mikrolitrów cząsteczek analitu rozcieńczonych w metanolu do 180-mikrolitrowych aliquotów testu nanocząsteczkowego aptamera i złota w 96-dołkowej płycie w temperaturze pokojowej. Natychmiast dodaj stężenie chlorku sodu ustalone w poprzednim kroku, aby rozpocząć reakcję kolorową testu. Uzyskaj możliwą jak największą zmianę koloru, zwiększając lub zmniejszając stężenie chlorku sodu i porównując docelową odpowiedź z odpowiedzią pustą.
Użyj stężenia chlorku sodu, które daje największą różnicę w odpowiedzi. Obserwuj lub mierz odpowiedź testu 150 sekund po dodaniu chlorku sodu. Przeanalizuj absorpcję w 650 nanometrach i 530 nanometrach, używając spektrofotometru.
Wyniki przedstawimy jako stosunek absorpcji uzyskany na 650 nanometrach i 530 nanometrach w funkcji stężenia analitu. Znormalizuj odpowiedź testu na sygnał pusty. Przygotuj składniki testu nanocząsteczkowego aptamieru złota, jak opisano wcześniej w filmie.
Przygotuj oddzielne roztwory zawierające jeden gram trehalozy na mililitr i jeden gram na mililitr sacharozy w wodzie wolnej od nukleazy, aby uzyskać roztwór kriogenu. Dlatego kluczowym krokiem w zamrażaniu tych testów jest określenie, ile roztworów trehalozy i sacharozy należy dodać do próbek, aby zapewnić całkowite, a równe zamrożenie. Zrób roztwór zawierający 19,2 miligrama trehalozy na mililitr oraz 4,8 miligrama na mililitr sacharozy z testem nanocząsteczek 60 MN4 na nanocząstki złota w końcowej objętości 200 mikrolitrów w rurkach mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.
Końcowe stężenia roztworu kriogenowego będą się różnić w zależności od pokrycia DNA. Próbki zamrażają błyskawicznie w zamrażarce o temperaturze 146 stopni Celsjusza lub w ciekłym azocie. Przechowuj próbki zamrożone do czasu użycia.
Do tej pracy pozostawić próbki na noc w zamrażarce o temperaturze 146 stopni Celsjusza, a następnie przenieść je do zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Przedstawiono reprezentatywne wyniki krzywych miarkowania chlorku sodu dla nanocząstek złota nieobrobionych i APTAMEREM DNA. Początkowe stężenie chlorku sodu użyte w teście ustalono, miażdżąc go przez miareczkowanie.
Reprezentatywne wyniki kolorymetrycznego testu nanocząsteczek aptamino-złota dla kokainy i cząsteczek kontrolnych przedstawiono tutaj. Wykresy pokazują wpływ zwiększenia gęstości pokrycia DNA na wskaźnik fałszywie pozytywnych odpowiedzi testu kokainowego. Poniżej przedstawiono wykresy krzywej kalibracyjnej uzyskane z analizy fotoobrazowej testu kolorymetrycznego kokainy.
Zdjęcia uzyskane za pomocą smartfonów. Reprezentatywne wyniki odpowiedzi testu kolorymetrycznego nanocząsteczkowego aptameru złota na kokainę oraz cząsteczki kontrolne przedstawiono tutaj. Dane porównują próbki świeżo przygotowane z próbkami przechowywanymi do czterech tygodni.
Podczas tej procedury bardzo ważne jest określenie odpowiedniego stężenia chlorku sodu, aby zdestabilizować nanocząsteczki złota i sprzyjać typowej zmianie koloru po dodaniu celu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak opracować kolorymetryczne testy aptamiserowe nanocząsteczki złota do wykrywania interesujących obiektów. Możesz skorzystać z opisanych tutaj metod, aby zmniejszyć wskaźnik fałszywie pozytywnych odpowiedzi i utrzymać testy w stanie użyteczności przez ponad miesiąc.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie koncentruje się na opracowaniu kolorymetrycznego testu opartego na aptamerach i nanocząstkach złota do wykrywania małych cząsteczek w zastosowaniach terenowych. Dotyczy również rozwiązań dotyczących długotrwałego przechowywania i ma na celu zmniejszenie wskaźników fałszywych wyników dodatnich w tych testach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Nanotechnologia
- Chemia analityczna
Tło
- Testy oparte na aptamerach i nanocząstkach złota są wykorzystywane do wykrywania docelowych cząsteczek.
- Testy te napotykają na wyzwania związane z trwałością i fałszywymi wynikami dodatnimi.
- Poprawa powtarzalności w warunkach terenowych jest zasadnicza.
- Metody długotrwałego przechowywania muszą być zweryfikowane dla praktycznych zastosowań.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego kolorymetrycznego testu z wykorzystaniem aptamerów i nanocząstek złota.
- Poprawa możliwości długotrwałego przechowywania testu.
- Zmniejszenie wskaźników fałszywych wyników dodatnich w wykrywaniu.
Stosowane metody
- Przygotowanie testu obejmuje czyszczenie sprzętu laboratoryjnego kwasem.
- Weryfikacja aplikacji na urządzenia inteligentne do analizy kolorymetrycznej.
- Testowanie wydajności testu w warunkach terenowych.
- Ustanowienie protokołów dotyczących długotrwałego przechowywania testu.
Główne wyniki
- Test wykazał poprawę powtarzalności w testach terenowych.
- Metody długotrwałego przechowywania zostały pomyślnie zweryfikowane.
- Wskaźniki fałszywych wyników dodatnich zostały znacznie zmniejszone.
- Aplikacja na urządzenia inteligentne działała skutecznie do wykrywania kolorymetrycznego.
Wnioski
- Opracowany test nadaje się do zastosowań terenowych.
- Poprawy w przechowywaniu i dokładności zwiększają jego praktyczne zastosowanie.
- To dzieło przyczynia się do rozwoju metod wykrywania opartych na nanocząstkach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Developing robust, field-deployable detection methods for small molecules remains a critical challenge in early-stage target validation and assay development. Aptamer-gold nanoparticle colorimetric assays offer a pathway to reduce mechanistic ambiguity and improve predictive confidence in screening workflows by enabling quantitative, visual readouts adaptable to resource-limited settings. Addressing shelf-life limitations and false positive rates directly supports translational biomarker efforts and preclinical model reliability by ensuring assay consistency across discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through target-specific colorimetric responses that clarify binding interactions.
- Operational Value: Reduces false positive signals via aptamer surface passivation, improving assay specificity in complex matrices.
- Predictive Value: Supports lead identification by providing normalized absorbance ratios (650nm/530nm) as quantitative readouts for concentration-dependent target detection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates calibrated response curves using smartphone-based image analysis, enabling reproducible compound evaluation without laboratory-grade equipment.
- Operational Value: Establishes cryopreservation protocols with trehalose-sucrose solutions, extending assay viability beyond one month under frozen storage.
- Scalability Value: Uses standardized 96-well plate formats and sodium chloride titration to define equivalence points, facilitating assay standardization across teams.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-stage target engagement data to preclinical continuity through stable, long-term stored reagents suitable for iterative testing.
- Risk Mitigation: Minimizes false positive rates in colorimetric readouts, reducing noise in biomarker alignment studies and improving decision confidence.
- Reproducibility Value: Demonstrates consistent performance between freshly prepared and four-week frozen samples, supporting reliable cross-functional data sharing.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where quantitative, visually interpretable outputs support go/no-go decisions based on target engagement strength and selectivity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring analyte-dependent shifts in gold nanoparticle aggregation via spectrophotometric ratios.
- Screening: Delivers assay readiness through defined sodium chloride equivalence points and normalized response metrics that enable reliable compound screening.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (A650/A530 ratios) that allow teams to compare analyte concentrations and normalize to blank signals.
- Translational Research: Ensures preclinical continuity via cryostable reagents that maintain functionality over extended storage periods.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, reagent-based platform adaptable to various small molecule targets through aptamer substitution.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity and improved signal-to-noise ratios.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via cryopreservation and smartphone-enabled color analysis.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by minimizing false advances due to non-specific interactions.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through assays with demonstrated stability and specificity over time.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oligonucleotide handling, nanoparticle synthesis, and buffer optimization.
- Depends on access to heating blocks, centrifuges, spectrophotometers or colorimetric imaging devices, and cold storage units.
- Necessitates cross-team standardization of sodium chloride titration protocols and cryoprotectant formulations.
- Involves adaptation considerations when transferring assays across different aptamer targets or sample matrices.
- Practical limitations include the need for empirical optimization of salt concentrations and aptamer:nanoparticle ratios for each new target.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Synthesis via Citrate Reduction of Gold Nanoparticles (AuNP) and Characterization
2:35
DNA-aptamer, Buffer, Solution, and Assay Preparation
3:35
Salt Titration and Assay Setup
5:21
Freezing Aptamer–AuNP Assay for Long-term Storage
6:38
Results: Assay Response with Changing DNA Coverage Density and Performance of the Assay for Long-term Storage
7:37
Conclusion
