Name: Projektowanie i rozwój kolorymetrycznych testów kolorymetrycznych opartych na aptamirze–złotych nanocząsteczkach do zastosowań terenowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj metodę kolorymetryczną z użyciem aptamerów i nanocząstek złota do wykrywania małych cząsteczek w warunkach terenowych. Technika zapewnia długoterminowe przechowywanie i zmniejsza ryzyko fałszywych wyników pozytywnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były częściowo finansowane przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych oraz Zastępcę Sekretarza Obrony ds. Badań i Inżynierii (Biuro Biometrii i Kryminalistyki Obrony). Udział w JES był wspierany przez National Research Council Research Associateship Award w Air Force Research Laboratory.

1. Synteza nanocząsteczek złota (AuNP) metodą redukcji cytrynianem oraz ich charakterystyka
<ol>
	<li>W dygestorium chemicznym oczyść kolbę Erlenmeyera (500 ml) oraz duży magnes w mieszadle za pomocą 5 ml stężonego kwasu azotowego i 15 ml stężonego kwasu solnego.
	<ol>
		<li>Zmocz całą powierzchnię kolby roztworem kwasowym, wypłucz kolbę wodą wolną od nukleaz i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 100 ml 1 mM chlorku złota(III); przykryj wlew oczyszczonej kwasem kolby Erlenmeyera arkuszem folii aluminiowej i podgrzewaj na płycie grzejnej przy ciągłym mieszaniu aż do wrzenia.</li>
	<li>Dodaj 10 ml 38,8 mM cytrynianu sodu. Kolor zmieni się z przeźroczystego/szarego na ciemnoniebieski/czarny, a ostatecznie na ciemnoczerwony w ciągu kilku minut. Kontynuuj mieszanie przez 10 min po wyłączeniu ogrzewania.</li>
	<li>Pozostaw zawiesinę AuNP do ostygnięcia do temperatury pokojowej i dodaj 110 µl diethylopirokarbonianu (DEPC) przy ciągłym mieszaniu.</li>
	<li>Przykryj całą kolbę folią aluminiową i pozostaw do inkubacji z DEPC przez noc. Przechowuj wszystkie AuNP w ciemności, w bursztynowych pojemnikach lub przykryte folią aluminiową.</li>
	<li>Zautoklawuj zawiesinę AuNP, ostudź do temperatury pokojowej i przefiltruj przez membranę z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,22 µm. Przefiltrowany i zautoklawowany roztwór stokowy AuNP przechowuj w ciemności w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Traktowanie DEPC, sterylizacja w autoklawie oraz przechowywanie w 4 °C przedłużą okres przydatności testu aptamer-AuNP. Przechowywanie w ten sposób pozwoli na zachowanie funkcjonalności testu przez ponad 2 miesiące.</li>
	<li>Oblicz stężenie AuNP, mierząc absorbancję w zakresie ultrafiolet-widzialnym przy 520 nm, a następnie zastosuj prawo Beera, używając współczynnika ekstynkcji (Ɛ) 2,4 x 108 L mol-1 cm-1 do obliczenia stężenia (c). Stężenie określono na 10 nM, a wielkość na 15 nm, co wyznaczono metodą dynamicznego rozpraszania światła. 
	UWAGA: Stężenia będą różnić się w zależności od partii. Rozcieńczaj roztwory stokowe AuNP wodą wolną od nukleaz w razie potrzeby, aby uzyskać pożądane stężenie zawiesiny AuNP wynoszące 10 nM.</li>
</ol>
2. Przygotowanie aptameru DNA, buforu, roztworów i testu
<ol>
	<li>Należy zakupić lub zsyntezować poniższe sekwencje aptamerów wiążących kokainę, stosując standardową chemię fosforamidytową22: 
	MN419: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3' 
	MN619: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3'</li>
	<li>Aptamery należy oczyścić za pomocą standardowego odsalania23. Oligonukleotydy należy rozpuścić w wodzie wolnej od nukleaz, przygotowując roztwory stokowe o stężeniu 100 µM lub 1 mM. Następnie należy je podzielić na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Należy zakupić lub przygotować roztwory stokowe sterylnego 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) o pH 7.4, 100 mM chlorku magnezu (MgCl2) oraz 1 M chlorku sodu (NaCl).</li>
	<li>Należy przygotować 50 ml buforu w wodzie wolnej od nukleaz o stężeniach 20 mM HEPES i 2 mM MgCl2, pH 7.4, a następnie przechowywać go w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.</li>
	<li>DNA należy inkubować z roztworem stokowym AuNP (10 nM) przez 3-4 h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Objętość AuNP można dostosować w zależności od potrzeb, aby zapewnić wystarczającą ilość próbki do planowanych testów (2.5-7.5 ml).
	<ol>
		<li>W niniejszej pracy zastosowano gęstości załadunku wynoszące odpowiednio 90, 120, 150 i 180 cząsteczek DNA/AuNP. Objętość i stężenia DNA należy dostosować odpowiednio. Stopień pokrycia DNA należy zoptymalizować, aby zredukować niezamierzone odpowiedzi kolorystyczne analitów niecelowych związane z powierzchnią AuNP. 
		UWAGA: Zwiększenie stopnia pokrycia DNA obniży czułość testu. Gęstości załadunku oblicza się na podstawie stężenia roztworu stokowego AuNP oraz całkowitej liczby AuNP obecnych w objętości przeznaczonej do eksperymentów. W celu uzyskania rzeczywistych gęstości pokrycia istnieją odpowiednie protokoły7. Stopień pokrycia DNA określono, wykorzystując kolumnę wirową z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 50 kDa w celu oddzielenia DNA związanego z AuNP od DNA wolnego. Cząsteczki AuNP są zbyt duże, aby przejść przez kolumnę wirową, podczas gdy wolne DNA przechodzi przez nią bez przeszkód. Kolejnym krokiem jest ilościowe oznaczenie zebranego wolnego DNA za pomocą pomiarów absorbancji lub fluorescencyjnego barwnika do jednoniciowego DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy dodać taką samą objętość buforu 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.4 i pozostawić próbkę w temperaturze 4 °C w ciemności przez noc. Test aptamer-AuNP przeprowadzono w buforze testowym: 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.4.</li>
</ol>
3. Miareczkowanie solą i przygotowanie testu
<ol>
	<li>Wyznaczyć początkowe stężenie soli niezbędne do wywołania odpowiedzi barwnej testu poprzez miareczkowanie solą próbki ślepej. Dodać 20 µl metanolu (próba ślepa) do 180 µl aliquotów testu aptamer-AuNP na płytce 96-dołkowej. Miareczkować próbki zwiększającymi się objętościami roztworu zakładowego NaCl (1 M lub 2 M) i wyznaczyć punkt równoważności (Rysunek 2). 
	UWAGA: Skalę testu można zmniejszyć do mniejszych objętości, zachowując ten sam stosunek metanolowej próby ślepej (lub rozpuszczonego anality) do testu aptamer-AuNP.
	<ol>
		<li>Na tym etapie wyznaczyć objętość NaCl niezbędną do wywołania najmniejszej zmiany barwy poprzez obserwację wizualną. Początkowe stężenie dla testu wynosiło odpowiednio 75 mM dla MN4 oraz 130 mM dla MN6 przy gęstości pokrycia wynoszącej 60 cząsteczek DNA/AuNP. 
		UWAGA: W przypadku ilościowego wyznaczania początkowego stężenia soli, dobrym punktem wyjścia jest punkt środkowy krzywej miareczkowania. Stosowane stężenia będą się różnić w zależności od aptameru, gęstości pokrycia DNA, wyników z poszczególnych dni oraz serii produktów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu optymalizacji odpowiedzi testu, dodać 20 µl cząsteczek anality rozpuszczonych w metanolu do 180 µl aliquotów testu aptamer-AuNP na płytce 96-dołkowej w temperaturze pokojowej. Niezwłocznie dodać stężenie NaCl wyznaczone w poprzednim kroku, aby zainicjować odpowiedź barwną testu. 
	UWAGA: Do jednoczesnego przeprowadzenia wielu eksperymentów należy użyć pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Uzyskać jak największą zmianę barwy poprzez zwiększanie lub zmniejszanie stężenia NaCl oraz porównanie odpowiedzi docelowej z odpowiedzią próby ślepej. Zastosować stężenie NaCl, które zapewnia największą różnicę w odpowiedzi.</li>
	<li>Zaobserwować lub zmierzyć odpowiedź testu po 150 s od dodania NaCl. Przeanalizować absorbancję przy 650 nm i 530 nm za pomocą spektrometru lub wykonać zdjęcie cyfrowe odpowiedzi testu (protokół analizy zdjęć znajduje się w sekcji 4). 
	UWAGA: Do uzyskania pomiarów w niniejszej pracy wykorzystano czytnik mikropłytek.</li>
	<li>Przedstawić wyniki w postaci stosunku absorbancji uzyskanej przy 650 nm i 530 nm (E650/E530) jako funkcji stężenia anality. Znormalizować odpowiedź testu względem sygnału próby ślepej, zgodnie z procedurą zastosowaną w niniejszej pracy.</li>
</ol>
4. Protokół analizy kolorystycznej zdjęć i obrazów cyfrowych
<ol>
	<li>Przygotować próbki do analizy zgodnie z opisem (sekcje 3.2-3.3). Umieścić płytkę 96-dołkową na transiluminatorze. 
	UWAGA: Standardowy laboratoryjny transiluminator jest zazwyczaj zbyt jasny, aby uzyskać użyteczne obrazy cyfrowe do tej analizy. Transiluminatory te powodują pojawienie się w obrazie cyfrowym regularnie rozmieszczonych „ciemnych linii” ze względu na intensywność źródła światła. Dobrze sprawdza się transiluminator wykonany z lightboxa opartego na diodach elektroluminescencyjnych (LED) i kawałka nieprzezroczystego plastiku.</li>
	<li>Wykonać zdjęcia płytki 96-dołkowej 150 s po dodaniu NaCl, zaimportować obrazy do oprogramowania do analizy obrazu i obliczyć średnie wartości czerwieni, zieleni i niebieskiego (RGB), stosując technikę średniej kroczącej, zgodnie z równaniem 124: 
	(1) <img alt="Wzór na średnią kroczącą, AVE_N = AVE_N-1 + (Pixel_N - AVE_N-1) / N do analizy danych." src="/files/ftp_upload/54063/54063eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
	<li>Przekształcić wartości RGB z standardowej przestrzeni barw RGB (sRGB) na przestrzeń diagramu chromatyczności (CIExyY), korzystając z następujących równań24: 
	(2) <img alt="Równanie transformacji liniowej; wzór matematyczny, treść edukacyjna dotycząca linearyzacji danych." src="/files/ftp_upload/54063/54063eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	(3) <img alt="Macierz konwersji przestrzeni barw, z XYZ na liniowe RGB, równanie macierzowe." src="/files/ftp_upload/54063/54063eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"> 
	(4) <img alt="Równania proporcjonalne; x=X/(X+Y+Z), y=Y/(X+Y+Z); równania dla rozkładów prawdopodobieństwa." src="/files/ftp_upload/54063/54063eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"></li>
	<li>Przekształcić wykładnicze wartości RGB na liniowe wartości RGB za pomocą równania 2. Macierz określona w równaniu 3 służy do obliczenia wartości X, Y i Z przestrzeni barw CIE24.</li>
	<li>Obliczyć wartości chromatyczności x i y za pomocą równania 4, reprezentujące średni kolor pikseli w obszarze wybranym do analizy24.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę w każdym dołku i wykreślić wartości chromatyczności w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej (Rysunek 4). Wyznaczyć błąd standardowy poprzez analizę koloru różnych obszarów tego samego dołka.</li>
</ol>
5. Test z zamrażaniem aptamerów-AuNP w celu długoterminowego przechowywania
<ol>
	<li>Przygotować komponenty testu aptamer-AuNP zgodnie z opisem w sekcjach 2.4 i 2.5. Przygotować oddzielne roztwory zawierające 1 g/ml trehalozy i 1 g/ml sacharozy w wodzie wolnej od nukleaz w celu przygotowania roztworu krioprotekcyjnego. 
	UWAGA: Zastosowano wysokie stężenia trehalozy i sacharozy, aby zmniejszyć czynnik rozcieńczenia podczas przygotowywania testu do zamrażania. Przed użyciem podgrzać roztwory cukrów na płycie grzejnej w zlewce z wodą, aby całkowicie rozpuścić cukry.</li>
	<li>Przygotować roztwór zawierający 19,2 mg/ml trehalozy i 4,8 mg/ml sacharozy z testem 60 MN4-DNA/AuNP do końcowej objętości 200 µl w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Końcowe stężenia roztworu krioprotekcyjnego będą się różnić w zależności od stopnia pokrycia DNA. 
	UWAGA: Objętość próbek przeznaczonych do zamrażania nie powinna przekraczać 300 µl. Większe objętości mogą nie zamarznąć prawidłowo.</li>
	<li>Próbki zamrozić gwałtownie w zamrażarce o temperaturze -146 °C lub w ciekłym azocie. Próbki przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia. Po zakończeniu gwałtownego zamrażania przechowywanie może odbywać się w temperaturze -80 °C lub -20 °C.</li>
	<li>W tej pracy próbki pozostawiono w zamrażarce -146 °C na noc, a następnie przeniesiono do zamrażarki -20 °C do długoterminowego przechowywania. 
	UWAGA: Gwałtowne zamrażanie może powodować agregację aptamer-AuNP. Sprawdzić prawidłowość procesu zamrażania poprzez monitorowanie profilu absorbancji i porównanie go z próbką niezamrożoną. W przypadku zaobserwowania agregacji zwiększyć ilość roztworu krioprotekcyjnego, aby zniwelować ten problem.</li>
	<li>Próbki rozmrozić w temperaturze pokojowej i wykorzystać tylko taką ich ilość, jaka jest niezbędna do przeprowadzenia eksperymentu. Uzyskać widma absorbancji rozmrożonych próbek i porównać je z widmami bazowymi próbki traktowanej roztworem krioprotekcyjnym, która nie była zamrażana. Absorbancję mierzyć w zakresie od 400 nm do 700 nm.</li>
	<li>Przeprowadzić miareczkowanie solą (sekcja 3.1), przetestować test (sekcja 3.2) i nanieść wyniki na wykres (sekcje 3.3 i 3.4) zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
</ol>

<ol><li>Housecroft, C., Constable, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHousecroft%2C+C+%22Chemistry%3A+an+introduction+to+organic%2C+inorganic%2C+and+physical+chemistry%22">Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry</a>. , Pearson Education. ISBN: 9780131275676 349-353 (2006).</li>
<li>Bunka, D., Stockley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age-at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age-at last.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).</li>
<li>Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticle-Based+Colorimetric+Assay+for+the+Direct+Detection+of+Cancerous+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells.</a> Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).</li>
<li>Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).</li>
<li>Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+in+bioanalytical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamer in bioanalytical applications.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).</li>
<li>Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates+coupled+to+an+android-based+color+analysis+application+for+use+in+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field.</a> Talanta. 121, 247-255 (2014).</li>
<li>Alivasatos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+nanocrustal+molecules+using+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization of nanocrustal molecules using DNA.</a> Nature. 382, 609-611 (1996).</li>
<li>Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmodified+gold+nanoparticles+as+a+colorimetric+probe+for+potassium+DNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers.</a> Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).</li>
<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+colorimetric+sensing+of+adenosine+and+cocaine+based+on+a+general+sensor+design+involving+aptamers+and+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles.</a> Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).</li>
<li>Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-functionalized+Au+nanoparticles+for+the+amplified+optical+detection+of+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).</li>
<li>Hermann, T., Patel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+recognition+by+nucleic+acid+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive recognition by nucleic acid aptamers.</a> Science. 287 (5454), 820-825 (2000).</li>
<li>Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+therapeutics+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aptamer therapeutics advance.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).</li>
<li>Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC%22%5BJournal%5D)">Aptamer-based biosensors.</a> TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).</li>
<li>Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+sensitive+aptamer-based+colorimetric+sensing+of+protein+using+unmodified+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles.</a> Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).</li>
<li>Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-based+colorimetric+biosensing+of+dopamine+using+unmodified+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%22%5BJournal%5D)">Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles.</a> Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).</li>
<li>Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates%3A+effect+of+aptamer+length+on+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response.</a> J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).</li>
<li>Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li>
<li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Colorimetric+Detection+of+Specific+Sequences+in+Genomic+DNA+Amplified+by+the+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).</li>
<li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+of+DNA+sequences+based+on+electrostatic+interactions+with+unmodified+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).</li>
<li>Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Conjugated+Nanoparticle+for+the+Collection+and+Detection+of+Multiple+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells.</a> Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).</li>
<li>Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+stringency+aptamer+selection+and+gold+nanoparticle+assay+for+detection+of+cortisol%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).</li>
<li>Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+colorimetric+detection+with+a+smartphone%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Point-of-care colorimetric detection with a smartphone.</a> Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).</li>
<li>Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+colourimetric+tests+for+trinitrotoluene+%28TNT%29+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic.+Sci.+Int%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil.</a> Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych.

W ciągu ostatniej dekady opracowano kolorymetryczne testy oparte na nanocząsteczkach do wykrywania celów takich jak małe cząsteczki, DNA, białka oraz komórki2-4. Testy wykorzystujące aptaminy DNA z nanocząstkami zyskują na znaczeniu. Zazwyczaj testy kolorymetryczne wykonuje się przez zmieszanie aptamiera DNA z cząsteczkami analitu, a następnie dodaje się AuNP9-10. Jednak te testy były wykorzystywane w demonstracjach dowodzenia koncepcji w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych oraz przy ograniczon...

Kolorymetria jest jedną z najstarszych technik stosowanych w chemii analitycznej. W tej technice jakościowe lub ilościowe określa się analit na podstawie produkcji związku kolorowego1. Zazwyczaj testy kolorowe wykorzystują odczynniki, które ulgają zmianie koloru w obecności gatunku analitu, co skutkuje obserwowalną lub wykrywalną zmianą koloru w widzialnym spektrum światła. Kolorimetria była wykorzystywana do wykrywania celów obejmujących atomy, jony i małe cząsteczki po złożone cząsteczki biologiczne, takie jak kwasy deoksyrybonukleinowe (DNA), peptydy i białka2-4. Przez ostatnie dwie dekady nanomateriały zrewolucjonizowały dziedzinę testów detekcyjnych, szczególnie w przypadku testów kolorowych5-6. Połączenie unikalnych właściwości chemicznych i fizycznych nanomateriałów z elementem selektywnego rozpoznawania celów, takimi jak przeciwciała, oligonukleotydowe aptamery czy aptamery peptydowe, doprowadziło do odrodzenia projektowania i rozwoju kolorymetrycznych testów detekcyjnych7.
Nanocząstki metalu wykazują udokumentowaną zależność od rozmiaru właściwości zmiany koloru, co zostało wykorzystane w projektowaniu licznych testów kolorymetrycznych. Nanocząstki złota (AuNP) są szczególnie interesujące ze względu na charakterystyczne przejście koloru z czerwono-niebieskiego, gdy rozproszony roztwór cząstek zostaje indukowany do agregacji8, zazwyczaj poprzez precyzyjne dodanie soli. Możliwość kontrolowania przejścia ze stanów rozproszonych (czerwonych) do zagregowanych (niebieskich) doprowadziła do powstania czujników kolorymetrycznych dla celów jonowych, małych molekularnych, peptydowych, białkowych i komórkowych2-4,9. Wiele z tych czujników wykorzystuje aptamery jako motyw rozpoznania celów.
Aptamery to cząsteczki DNA lub kwasu rybonukleinowego (RNA) wybierane z losowej puli 10,12-10,15 różnych sekwencji,10-11. Proces selekcji identyfikuje elementy rozpoznawające cele z powinowactwami wiązanymi w niskim reżimie nanomolowym, a systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) jest najczęściej znanym procesem12-13. Zalety aptamerów opartych na oligonukleotydach do zastosowań pomiarowych to łatwość syntezy, kontrolowana modyfikacja chemiczna oraz stabilność chemiczna14-15.
Jednym z podejść do tworzenia testu kolorymetrycznego łączącego nanomateriały z elementami rozpoznawczymi jest połączenie tych dwóch gatunków poprzez fizyczną adsorpcję cząsteczek aptamerów DNA na powierzchniach AuNP. Poprzez wiązanie cel-aptamer aptamer ulega zmianie strukturalnej16-18 , która zmienia interakcję aptamera z powierzchnią AuNP, prowadząc do indukowalnej odpowiedzi koloru czerwono-niebieskiego19 po dodaniu soli. Ta zdumiewająca cecha AuNP zapewnia obserwowalny mechanizm odpowiedzi kolorymetrycznej dla urządzeń opartych na aptamerze, który może być używany do projektowania kolorymetrycznych testów dla różnych analitów.
Testy kolorowe zaprojektowane z wykorzystaniem niekowalencjnych, fizycznie adsorbowanych aptamerów DNA na powierzchniach AuNP mają piętno słabej platformy sensorowej ze względu na problemy z odpornością, skłonność do awarii poza kontrolowanymi warunkami laboratoryjnymi oraz brak dostępnych informacji do praktycznego zastosowania. Jednak kolorymetryczny test oparty na aptamerze AuNP był interesujący ze względu na prostotę działania i obserwowalną reakcję kolorową. Celem tych prac jest dostarczenie protokołu do projektowania, rozwoju, działania, redukcji fałszywie pozytywnej odpowiedzi na powierzchnię oraz długoterminowego przechowywania kolorymetrycznych testów opartych na DNA-AuNP, wykorzystujących kokainę jako reprezentatywny analit. Ponadto zaproponowaliśmy podejście adsorbowanego testu aptaminowego (Rysunek 1) jako korzystne ze względu na prostotę i łatwość użycia, co skutkowało mniejszą liczbą kroków niż konwencjonalne podejście do tych testów aptamer-AuNP. Do tego testu aptamer najpierw dodano do AuNP, które mogły adsorbować powierzchnię przez dłuższy czas. Dodatkową zaletą tego podejścia było zmniejszenie odpowiedzi na niecelowe cząsteczki analitu związane z interakcjami powierzchniowymi AuNP. Jednak zmniejszenie liczby fałszywie pozytywnych wyników odbyło się kosztem wrażliwości testu. Dlatego konieczne jest zachowanie równowagi między ochroną powierzchniową a dostępnością analitu, aby utrzymać prawidłową funkcjonalność testu. Co więcej, główną wadą analizy testów kolorowych innymi metodami niż instrumentacja jest to, że wyniki są często subiektywne i otwarte na interpretację z perspektywy analityka, szczególnie przy próbie rozróżnienia subtelnych różnic kolorowych. Z kolei istnieje wiele problemów związanych z uzyskiwaniem instrumentów laboratoryjnych poza laboratorium, takich jak dostępność zasilania, praktyczność i przenośność itp. W tej pracy opracowano protokół analizy kolorów dla większej mobilności oraz wyeliminowania części domysłów typowych związanych z interpretacją testów kolorowych20-21. W porównaniu z wcześniejszymi podejściami, ten wysiłek dążył do wyciągnięcia tych testów do granic możliwości zastosowań wykraczających poza warunki laboratoryjne.

<table><tbody><tr><td>Hydrat chlorku złota(III)</td><td>Sigma</td><td>254169</td><td>Czystość 99,999% jest ważna, a rozwiązania były za każdym razem świeże</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu dwuwęglanu</td><td>Sigma</td><td>W302600-1KG-K</td><td>Zauważyliśmy, że producent ma duży wpływ na testy AuNP, a roztwory były za każdym razem przygotowywane na świeżo</td></tr><tr><td>Synergia</td><td>Bio-TEK</td><td>HT</td><td>Każdy spektrometr absorpcji będzie działał, ale czytnik płyt umożliwia analizę wielu próbek</td></tr><tr><td>4-(2-hydroksyetylo)piperazyna-1-etanolowy kwas (HEPES) Bufor, 1&nbsp; M sterylizowany</td><td>Amresco</td><td>J848</td><td>Każda sterylna marka będzie odpowiednia</td></tr><tr><td>Corning, system filtrujący 250 ml, 0,22 i nbsp; &mikro; Octan celulozy m</td><td>Rybak</td><td>430767</td><td>Inne błony zostały stwierdzone, że usuwają AuNP</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV</td><td>Varian</td><td>Cary 300&nbsp;</td><td>Każdy spektrometr absorpcji będzie działał</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu – heksahydrat</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td>&ge; 98% każdej marki się sprawdzi</td></tr><tr><td>DNA</td><td>IDT</td><td>Zwyczaj</td><td>DNA zostało oczyszczone kolumną odsolniającą, można stosować wyższe techniki oczyszczania</td></tr><tr><td>Prokaina chlorowodorek</td><td>ACROS</td><td>AC20731-1000</td><td>Przygotowano 99% zapasów 1 mg/ml metanolu</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Rybak</td><td>A144S-500</td><td>36,5-38,0% innych marek będzie działać</td></tr><tr><td>Kokainowy chlorek</td><td>Lipomed</td><td>COC-156-HC-1LM</td><td>Zauważyliśmy, że producent ma duży wpływ na testy AuNP</td></tr><tr><td>Kwas azotowy</td><td>Rybak</td><td>A509-SK212</td><td>65% innych marek będzie działać</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku sodu, o stężeniu bioreagentów 5 M</td><td>Sigma</td><td>S5150-1L</td><td>Roztwory sterylne wykonane z materiałów stałych będą skuteczne</td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu</td><td>Sigma</td><td>D5758-25 mL</td><td>&ge; W 97% każda marka się sprawdzi</td></tr><tr><td>Ekgoninoemetylester chlorowodorkowodórkowy</td><td>Lipomed</td><td>COC-205-HC-1LM</td><td>Uzyskaliśmy kontrolę EME od tego samego producenta, co cel kokainowy</td></tr><tr><td>Rurki mikrowirówkowe, Axygen Scientific, niesterylne, 1,7&nbsp; Ml</td><td>VWR</td><td>10011-722</td><td>Zauważyliśmy, że producent ma duży wpływ na testy AuNP, a probówki były autoklawowane na miejscu</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleazy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

projektowanie i rozwój kolorymetrycznych testów kolorymetrycznych opartych na aptamirze–złotych nanocząsteczkach do zastosowań terenowych

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Przeanalizowano projekt i opracowanie kolorymetrycznego testu aptamino-złoto-nanocząsteczkowego (AuNP) do wykrywania małych cząsteczek do zastosowań w terenie. Selektywne testy kolorowe oparte na AuNP zostały opracowane w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych proof-of-concept. Jednak te schematy nie zostały wykorzystane do granic porażki, aby określić ich praktyczne zastosowanie poza warunkami laboratoryjnymi. Praca ta opisuje ogólne podejście do projektowania, opracowywania i rozwiązywania problemów kolorymetrycznego testu aptamer-AuNP dla analizowanych cząsteczek oraz stosowania testu w terenowych warunkach. Test jest korzystny, ponieważ adsorbowane aptamery pasywują powierzchnie nanocząstek i umożliwiają ograniczenie oraz eliminację fałszywie pozytywnych odpowiedzi na anality niebędące celami. Przejście tego systemu do praktycznych zastosowań wymagało nie tylko określenia okresu przydatności testu aptamer-AuNP, ale także ustanowienia metod i procedur rozszerzających możliwości długoterminowego przechowywania. Jednym z rozpoznanych problemów związanych z odczytem kolorymetrycznym jest obciążenie analityków, którzy muszą dokładnie identyfikować często subtelne zmiany koloru. Aby zmniejszyć odpowiedzialność analityków w terenie, opracowano protokół analizy kolorów, który umożliwiał wykonywanie obowiązków identyfikacji kolorów bez konieczności wykonywania tego zadania na sprzęcie laboratoryjnym. Opisano metodę tworzenia i testowania protokołu analizy danych. Jednak aby zrozumieć i wpłynąć na projektowanie adsorbowanych testów aptamerowych, interakcje związane z aptamerem, celem i AuNP wymagają dalszych badań. Zdobyta wiedza może doprowadzić do dostosowania aptamerów pod kątem poprawy funkcjonalności.

Głównym celem niniejszej pracy było opracowanie oraz zbadanie stabilności i odporności kolorymetrycznych testów opartych na AuNP i aptamerach do zastosowań terenowych. Jak podkreślono w poprzedniej publikacji, zbadano dwie odrębne strategie opracowania testu7. Testy te nazwano testem z wolnym aptamerem (Free Aptamer Assay) oraz testem z zaadsorbowanym aptamerem (Adsorbed Aptamer Assay). Test z zaadsorbowanym aptamerem był bardziej odpowiedni do celów terenowego testu detekcyjne...

Analizowano projekt i opracowanie kolorymetrycznego testu nanocząsteczkowego aptamera i złota do wykrywania małych cząsteczek do zastosowań terenowych. Dodatkowo zatwierdzono aplikację kolorymetryczną (smart-device) oraz ustalono długoterminowe przechowywanie testu do użytku w terenie.

Projektowanie i rozwój kolorymetrycznych testów kolorymetrycznych opartych na aptamirze–złotych nanocząsteczkach do zastosowań terenowych

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Głównym celem jest opracowanie ogólnego podejścia do opracowania kolorymetrycznego testu kolorymetrycznego opartego na nanocząsteczkach aptamino-złota do wykrywania cząsteczek docelowych oraz opracowanie metod poprawiających długoterminowe przechowywanie i zmniejszających wskaźniki fałszywie pozytywnych odpowiedzi. Ta metoda odpowiada na kluczowe pytania w dziedzinie kolorymetrycznych testów aptaminow nanocząsteczek złota, takie jak powtarzalność testów w terenie do długotrwałego przechowywania oraz zmniejszenie wskaźnika fałszywie pozytywnych odpowiedzi. Te testy mogą być podatne na problemy z trwałością i fałszywie pozytywne odpowiedzi.W tej pracy doskonalimy się w obu tych kwestiach. Oczyść kolbę Erlenmeyera o pojemności 500 mililitrów i duży pręt mieszający pięcioma mililitrami skoncentrowanego kwasu azotowego i 15 mililitrami skoncentrowanego kwasu solnego w okapie chemicznym. Zwilż całą powierzchnię kolby kwasowym washem.Następnie przepłucz kolbę wodą wolną od nukleazy i pozwól jej wyschnąć. Dodaj 100 mililitrów 1 milimolarnego złota i trzychlorku. Użyj arkusza folii aluminiowej, aby przykryć wierzch kolby Erlenmeyera oczyszczonej kwasem i podgrzewać z ciągłym mieszaniem na gorącej płycie, aż zagotuje.Następnie dodaj 10 mililitrów cytrynianu sodu o stężeniu 38,8 milimolowego. Kolor zmienia się od klarownego lub szarego do ciemnoniebieskiego lub czarnego, a następnie do ciemnego, a potem do czerwonego przez kilka minut. Kontynuuj mieszanie z wyłączonym ogniem przez 10 minut.Pozostawić zawiesinę nanocząsteczek złota do temperatury pokojowej i dodać 110 mikrolitrów DEPC z ciągłym mieszaniem. Całą kolbę przykryj folią aluminiową i pozwól zabiegowi DEPC inkubować przez noc. Następnego dnia podkładaj do autoklawu złotą zawiesinę nanocząsteczkową.Następnie schłodzić do temperatury pokojowej i przefiltrować przez membranę celulozową o powierzchni poru 0,22 mikrona. Przechowuj filtrowany, autoklawowany roztwór nanocząsteczek złota w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oblicz stężenie nanocząsteczek złota, jak opisano w protokole tekstowym.Tutaj stężenie zostało obliczone na 10 nanomolarów o rozmiarze 15 nanometrów, co zostało określone przez dynamiczne rozpraszanie światła. Kup lub syntetyzuj sekwencje aptamerów wiążące kokainę, stosując standardową chemię fosforamidową. Po oczyszczeniu aptamerów za pomocą standardowego odsolania, odtworz oligonukleotydy w wodzie wolnej od nukleazy w roztworze zapasowym o długości 100 mikromolów lub 1 milimolu.Oczyszczone aptamery z alicytami można przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez kilka miesięcy. Połącz DNA z 10-nanomolowym roztworem nanocząsteczek złota, zmieniając objętość nanocząsteczek złota według potrzeb, aby uzyskać wystarczającą ilość próbki do przeprowadzenia testu. Inkubuj mieszankę przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej i chroń przed światłem.Dodaj równą objętość 20 milimolowych HEPES, dwumilimolowego chlorku magnezu i bufor pH 7,4, a próbkę umieść w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Początkowe stężenie soli potrzebne do wywołania odpowiedzi kolorowej testu przez miareczkowanie soli określa się za pomocą pustego materiału testowego. Dodaj 20 mikrolitrów metanolu do 180-mikrolitrowych aliquotów testu chlorku aptamera i złota w płytce z 96 dołkami.Kluczowym krokiem w wykonaniu tych testów jest określenie stężenia chlorku sodu, aby zdestabilizować nanocząstki złota po dodaniu celu. Stopniowo zwiększać ilość roztworu chlorku sodu i określić punkt równoważności. Tutaj określ objętość chlorku sodu potrzebną do wywołania najmniejszej zmiany koloru na podstawie obserwacji wzrokowej.Aby zoptymalizować odpowiedź testu, dodaj 20 mikrolitrów cząsteczek analitu rozcieńczonych w metanolu do 180-mikrolitrowych aliquotów testu nanocząsteczkowego aptamera i złota w 96-dołkowej płycie w temperaturze pokojowej. Natychmiast dodaj stężenie chlorku sodu ustalone w poprzednim kroku, aby rozpocząć reakcję kolorową testu. Uzyskaj możliwą jak największą zmianę koloru, zwiększając lub zmniejszając stężenie chlorku sodu i porównując docelową odpowiedź z odpowiedzią pustą.Użyj stężenia chlorku sodu, które daje największą różnicę w odpowiedzi. Obserwuj lub mierz odpowiedź testu 150 sekund po dodaniu chlorku sodu. Przeanalizuj absorpcję w 650 nanometrach i 530 nanometrach, używając spektrofotometru.Wyniki przedstawimy jako stosunek absorpcji uzyskany na 650 nanometrach i 530 nanometrach w funkcji stężenia analitu. Znormalizuj odpowiedź testu na sygnał pusty. Przygotuj składniki testu nanocząsteczkowego aptamieru złota, jak opisano wcześniej w filmie.Przygotuj oddzielne roztwory zawierające jeden gram trehalozy na mililitr i jeden gram na mililitr sacharozy w wodzie wolnej od nukleazy, aby uzyskać roztwór kriogenu. Dlatego kluczowym krokiem w zamrażaniu tych testów jest określenie, ile roztworów trehalozy i sacharozy należy dodać do próbek, aby zapewnić całkowite, a równe zamrożenie. Zrób roztwór zawierający 19,2 miligrama trehalozy na mililitr oraz 4,8 miligrama na mililitr sacharozy z testem nanocząsteczek 60 MN4 na nanocząstki złota w końcowej objętości 200 mikrolitrów w rurkach mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.Końcowe stężenia roztworu kriogenowego będą się różnić w zależności od pokrycia DNA. Próbki zamrażają błyskawicznie w zamrażarce o temperaturze 146 stopni Celsjusza lub w ciekłym azocie. Przechowuj próbki zamrożone do czasu użycia.Do tej pracy pozostawić próbki na noc w zamrażarce o temperaturze 146 stopni Celsjusza, a następnie przenieść je do zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Przedstawiono reprezentatywne wyniki krzywych miarkowania chlorku sodu dla nanocząstek złota nieobrobionych i APTAMEREM DNA. Początkowe stężenie chlorku sodu użyte w teście ustalono, miażdżąc go przez miareczkowanie.Reprezentatywne wyniki kolorymetrycznego testu nanocząsteczek aptamino-złota dla kokainy i cząsteczek kontrolnych przedstawiono tutaj. Wykresy pokazują wpływ zwiększenia gęstości pokrycia DNA na wskaźnik fałszywie pozytywnych odpowiedzi testu kokainowego. Poniżej przedstawiono wykresy krzywej kalibracyjnej uzyskane z analizy fotoobrazowej testu kolorymetrycznego kokainy.Zdjęcia uzyskane za pomocą smartfonów. Reprezentatywne wyniki odpowiedzi testu kolorymetrycznego nanocząsteczkowego aptameru złota na kokainę oraz cząsteczki kontrolne przedstawiono tutaj. Dane porównują próbki świeżo przygotowane z próbkami przechowywanymi do czterech tygodni.Podczas tej procedury bardzo ważne jest określenie odpowiedniego stężenia chlorku sodu, aby zdestabilizować nanocząsteczki złota i sprzyjać typowej zmianie koloru po dodaniu celu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak opracować kolorymetryczne testy aptamiserowe nanocząsteczki złota do wykrywania interesujących obiektów. Możesz skorzystać z opisanych tutaj metod, aby zmniejszyć wskaźnik fałszywie pozytywnych odpowiedzi i utrzymać testy w stanie użyteczności przez ponad miesiąc.

design-development-aptamergold-nanoparticle-based-colorimetric-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokoły SELEX obejmują wiele rund selekcji, z których każda wymaga regeneracji związanych ligandów, co z kolei wymaga stałych sekwencji starterów flankujących regiony losowej biblioteki. Te stałe sekwencje starterów mogą zakłócać proces selekcji (powodując wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne). Przedstawiamy tutaj protokół bez użycia starterów.

Selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

W tym filmie opisujemy metodę bezpośredniego testu immunologicznego opartego na spektroskopii Ramana do wykrywania określonych antygenów docelowych. Przeciwciała, które są adsorbowane na powierzchni nanocząstek złota przyczepionych do sond Ramana, oddziałują z docelowymi antygenami i wytwarzają specyficzne widmo Ramana, które jest następnie wykrywane.

Bezpośredni test immunologiczny oparty na spektroskopii Ramana w celu wykrycia określonego antygenu

Dostępny jest protokół do wyboru aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek w oparciu o przestrajalną metodę selekcji kulek magnetycznych z regulacją. Aptamery wybrane ze względu na właściwości przełączania struktur są korzystne w testach, które wymagają zmiany konformacyjnej w celu zasygnalizowania obecności celu, takich jak opisany test nanocząstek złota.

Metoda wyboru aptamerów przełączających strukturę zastosowana do kolorymetrycznego testu nanocząstek złota

Sondy optyczne oparte na nanocząstkach zostały zaprojektowane jako nośnik do wykrywania antygenów za pomocą spektroskopii Ramana i UV-Vis. W tym miejscu opisujemy protokół przygotowania takich sond do testu immunologicznego spektroskopii UV-Vis/Ramana w taki sposób, aby uwzględnić przyszłe możliwości multipleksowania.

Wytwarzanie platformy testów immunologicznych UV-VIS i spektroskopii Ramana

Przedstawiono protokół selekcji in vitro i charakterystyki aptamerów DNA wiążących estry kwasu ftalowego specyficznych dla grupy. Uwzględniono również zastosowanie wybranego aptameru w elektrochemicznym czujniku aptasensorycznym.

Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora

W tej pracy przedstawiono protokół wzmacniania sygnału biodetekcji opartej na nanosondach. Protokół opiera się na redukcji kwasu chloroaurowego na powierzchnię istniejących nanosond, które składają się z nanocząstek złota, srebra, krzemionki lub tlenku żelaza.

Szybkie wzmocnienie sygnału nanosondy poprzez syntezę nanocząstek złota in situ

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych

Obecny protokół demonstruje użycie szybkiego, 3-stopniowego, opartego na aptamie testu wykładniczego amplifikacji do wykrywania celów. Przygotowanie próbki, wzmocnienie sygnału i rozwój koloru są omówione w celu wdrożenia tego systemu do rozpoznawania obecności teofiliny w porównaniu z kofeiną.

Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex

Opracowanie nowych zastosowań terapeutycznych z wykorzystaniem mikroprzepływów

Dołączony film opisuje sposób wykorzystania systemu frakcjonowania GELFREE 8100, który rozdziela złożone próbki białek na podstawie masy cząsteczkowej i odzyskuje frakcje w fazie ciekłej. Film wyjaśnia zasadę działania tej technologii, sposób jej zastosowania oraz przedstawia uzyskane dane z analizy frakcjonowanego homogenatu wątroby bydlęcej za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.

Wykorzystanie systemu frakcjonowania GELFREE 8100 do frakcjonowania w oparciu o masę cząsteczkową z odzyskiem w fazie ciekłej

Poznaj metodę kolorymetryczną z użyciem aptamerów i nanocząstek złota do wykrywania małych cząsteczek w warunkach terenowych. Technika zapewnia długoterminowe przechowywanie i zmniejsza ryzyko fałszywych wyników pozytywnych.

Projektowanie i rozwój kolorymetrycznych testów kolorymetrycznych opartych na aptamirze–złotych nanocząsteczkach do zastosowań terenowych (Wideo) | JoVE Journal

Projektowanie i rozwój kolorymetrycznych testów kolorymetrycznych opartych na aptamirze–złotych nanocząsteczkach do zastosowań terenowych

Przeglądaj więcej filmów