Name: Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę selekcji grupowo specyficznych aptamerów DNA wiążących hydrofobowe cząsteczki oraz ich zastosowanie w elektrochemicznym biosensorze. Protokół obejmuje charakterystykę wiązań i detekcję.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (21675112), kluczowego projektu planu nauki i technologii Pekińskiej Komisji Edukacyjnej (KZ201710028027) oraz Yanjing Young Scholar Program of Capital Normal University.

<ol><li>Vorkamp, K., Riget, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+new+and+current-use+contaminants+in+the+Arctic+environment%3A+Evidence+of+long-range+transport+and+indications+of+bioaccumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation.</a> Chemosphere. 111, 379-395 (2014).</li>
<li>Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence%2C+fate%2C+behavior+and+ecotoxicological+state+of+phthalates+in+different+environmental+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices.</a> Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).</li>
<li>Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+phthalate+esters+in+edible+oils+by+use+of+QuEChERS+coupled+with+ionic-liquid-based+dispersive+liquid-liquid+microextraction+before+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+BioanalChem%22%5BJournal%5D)">Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography.</a> Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).</li>
<li>Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12161-013-9770-x">Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry.</a> Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).</li>
<li>Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+phthalic+acid+esters+in+Chinese+white+spirit+using+dispersive+liquid-liquid+microextraction+coupled+with+sweeping+beta-cyclodextrin-modified+micellar+electrokinetic+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography.</a> J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).</li>
<li>Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+seven+phthalic+acid+esters+in+beverages+using+ultrasound+and+vortex-assisted+dispersive+liquid-liquid+microextraction+followed+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography.</a> J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).</li>
<li>Sun, R., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+gold+nanoparticles+improved+real-time+immuno-PCR+assay+for+detecting+diethyl+phthalate+in+foodstuff+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples.</a> Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).</li>
<li>Sun, R. Y., Zhuang, H. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ay/c4ay02088j">A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody.</a> Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).</li>
<li>Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-sensitive+monoclonal+antibody-based+enzyme-linked+immunosobent+assay+for+dibutyl+phthalate+in+human+urinary%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary.</a> Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).</li>
<li>Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+development+of+sandwich+assay+based+on+the+nanobiotechnologies+for+proteins%2C+nucleic+Acids%2C+small+Molecules%2C+and+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions.</a> Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).</li>
<li>Yin, X. -B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993612000040">Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications.</a> TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-based+environmental+biosensors+for+small+molecule+contaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants.</a> Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).</li>
<li>Groher, F., Suess, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+antibiotic-binding+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of antibiotic-binding aptamers.</a> Methods. 106, 42-50 (2016).</li>
<li>Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+and+amplification+protocols+for+isolation+of+aptameric+sensors+for+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules.</a> Methods. 106, 58-65 (2016).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).</li>
<li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+PCB-binding+DNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers.</a> Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).</li>
<li>Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+adverse+effects+of+phthalic+acid+esters+on+human+health%3A+A+review+of+recent+studies+on+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction.</a> Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).</li>
<li>Goodchild, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugates+of+oligonucleotides+and+modified+oligonucleotides%3A+a+review+of+their+synthesis+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties.</a> Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).</li>
<li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+oligonucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Oligonucleotides+and+Analogs%3A+Synthesis+and+Properties%22%5BJournal%5D)">A brief history of oligonucleotide synthesis.</a> Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).</li>
<li>Reese, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-and+poly-nucleotides%3A+50+years+of+chemical+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis.</a> Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).</li>
<li>Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/15257779508014668">An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides.</a> Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+group-specific+phthalic+acid+esters+binding+DNA+aptamers+via+rationally+designed+target+immobilization+and+applications+for+ultrasensitive+and+highly+selective+detection+of+phthalic+acid+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters.</a> Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).</li>
<li>Bartlett, J. M. S., Stirling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+protocols%22%5BJournal%5D)">A short history of the polymerase chain reaction.</a> PCR protocols. , 3-6 (2003).</li>
<li>Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2999980">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18428223">Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> JoVE. (32), e1485(2009).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).</li>
<li>Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCs+of+DNA+aptamer+and+related+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">ABCs of DNA aptamer and related assay development.</a> Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001346861530551X">Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A.</a> Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).</li>
<li>Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evolution+of+functional+DNA+using+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis.</a> J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).</li>
<li>Lou, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromagnetic+selection+of+aptamers+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).</li>
<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+selection+of+DNA+aptamers+through+microfluidic+selection+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).</li>
<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+selection+and+parallel+characterization+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative selection and parallel characterization of aptamers.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).</li>
<li>Song, K. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle-based+colorimetric+detection+of+kanamycin+using+a+DNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer.</a> Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).</li>
<li>Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517313278">Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine.</a> Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).</li>
<li>Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+DNA+monolayer+buffered+dynamic+ranges+of+mercuric+electrochemical+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor.</a> Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).</li>
<li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoprobe-enhanced%2C+split+aptamer-based+electrochemical+sandwich+assay+for+ultrasensitive+detection+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules.</a> Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).</li>
<li>Lou, X., He, L. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400507006181">Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection.</a> Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Jedną z wyjątkowych zalet aptamerów jest to, że są one identyfikowane za pomocą metody in vitro SELEX, podczas gdy przeciwciała są generowane w wyniku reakcji immunologicznych in vivo . W związku z tym aptamery mogą być wybierane z pożądaną swoistością docelową w dobrze zaprojektowanych warunkach eksperymentalnych, podczas gdy przeciwciała są ograniczone do warunków fizjologicznych.
Aby ułatwić oddzielenie sekwencji związanych od sekwencji swobodnych, ostatnio zgłoszono kilka...

Wraz z szybkim rozwojem gospodarczym, przyspieszeniem industrializacji i budownictwem miejskim, zanieczyszczenie środowiska jest większe niż kiedykolwiek. Typowe zanieczyszczenia środowiska obejmują jony metali ciężkich, toksyny, antybiotyki, pestycydy, substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego i trwałe zanieczyszczenia organiczne (TZO). Oprócz jonów metali i toksyn, inne zanieczyszczenia to małe cząsteczki, które dość często składają się z różnych kongenerów. Na przykład najbardziej toksyczne TZO obejmują polichlorowane bifenyle (PCB), wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), polibromowane etery bifenylowe (PBDE), polichlorowane dibenzo-p-dioksyny (PCDD), polichlorowane dibenzo-f-dioksyny (PCDF) i estry kwasu ftalowego (PAE)1,2, które składają się z wielu kongenerów. Wykrywanie małych cząsteczek odbywa się głównie za pomocą technik opartych na chromatografii/spektrometrii mas ze względu na ich różnorodność zastosowań3,4,5,6. Do wykrywania na miejscu opracowano ostatnio metody oparte na przeciwciałach7,8,9. Ponieważ jednak metody te są wysoce specyficzne dla określonego kongeneru, należy przeprowadzić wiele testów. Poważniejsze jest to, że nowe kongenery rosną tak szybko, że ich przeciwciała nie mogą zostać wytworzone na czas. W związku z tym opracowanie specyficznych dla danej grupy bioczujników do monitorowania całkowitych poziomów wszystkich kongenerów w jednym teście może stanowić nieoceniony wskaźnik do oceny stanu zanieczyszczenia środowiska.
Ostatnio, aptamery kwasów nukleinowych są szeroko stosowane jako elementy rozpoznające w różnych platformach biosensorycznych ze względu na ich zdolność do rozpoznawania szerokiej gamy celów, od jonów i małych molekuł po białka i komórki10,11,12. Aptamery są identyfikowane za pomocą metody in vitro zwanej systematyczną ewolucją ligandów przez wykładnicze wzbogacanie (SELEX)13,14. SELEX rozpoczyna się od losowej syntetycznej biblioteki oligonukleotydów jednoniciowych, która zawiera około 1014-10 15 sekwencji. Wielkość losowej biblioteki zapewnia różnorodność struktur kandydujących na RNA lub DNA. Typowy proces SELEX składa się z wielu rund wzbogacania, aż biblioteka zostanie wzbogacona o sekwencje o wysokim powinowactwie i swoistości do celu. Końcowa wzbogacona pula jest następnie sekwencjonowana, a stałe dysocjacji (Kd) i selektywność wobec potencjalnych substancji zakłócających są określane za pomocą różnych technik, takich jak wiązanie filtra, chromatografia powinowactwa, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) itp. 15
Ze względu na bardzo słabą rozpuszczalność w wodzie i brak grup funkcyjnych do unieruchomienia powierzchni, wybór aptamerów POP jest teoretycznie trudny. Znaczące postępy poczynione w ramach projektu SELEX przyspieszyły odkrycie aptamerów. Nie zgłoszono jednak jeszcze wyboru aptamerów specyficznych dla danej grupy dla TZO. Do tej pory zidentyfikowano tylko aptamery DNA wiążące PCB o wysokiej swoistości dla określonego kongeneru16. PAE są stosowane głównie w materiałach z polichlorku winylu, zmieniając polichlorek winylu z twardego tworzywa sztucznego w elastyczne tworzywo sztuczne, działając w ten sposób jako plastyfikator. Niektóre PAE zostały zidentyfikowane jako substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego, mogą powodować poważne uszkodzenia czynności wątroby i nerek, zmniejszać ruchliwość męskich plemników i mogą powodować nieprawidłową morfologię plemników i raka jąder17. Nie zgłoszono ani swoistych dla związku, ani dla grupy aptamerów wiążących PAE.
Celem tej pracy jest dostarczenie reprezentatywnego protokołu wyboru aptamerów DNA specyficznych dla grupy do wysoce hydrofobowych małych cząsteczek, takich jak PAE, reprezentatywna grupa POP. Demonstrujemy również zastosowanie wybranego aptameru do wykrywania zanieczyszczeń środowiska. Protokół ten zawiera wskazówki i spostrzeżenia dotyczące odkrywania aptamerów innych hydrofobowych małych cząsteczek.

<table><tbody><tr><td>UV-2550</td><td>Shimadzu, protokół japoński</td><td></td>, <td>sekcja 3.8.2</td></tr><tr><td>Termocykler DNA Engnine, PTC0200</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>sekcja 3.5.1.2 i 3.5.2</td></tr><tr><td>C1000 Touch</td><td>BIO-RAD</td><td>sekcja 5.3.6 i 6.3</td>Potencjostat wielokanałowy VMP3 Bio-Logic <td></td></tr><tr><td></td><td>Science, Claix, Francja</td><td></td><td>sekcja 7.4,7.8 i 7.11</td></tr><tr><td>Sepharoza aktywowana żywicą epoksydową 6B</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td><td>10220020</td><td>koraliki argarozowe, sekcja 2.3 i 3.3</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 kulki magnetyczne z kwasem karboksylowym</td><td>Invitrogen, USA</td><td>420420</td><td>kulki magnetyczne, sekcja 5.2. i 5.3</td></tr><tr><td>Premix Taq Hot Start Version</td><td>Takara, Dalian, Chiny</td> Polimeraza <td>R028A</td><td>, sekcja 3.5.1.1</td></tr><tr><td>Membrana uszczelniająca PARAFILM</td><td>Bemis, USA</td><td>PM-996</td><td>sekcja 3.6.5</td></tr><tr><td>Lambda Exonuclease</td><td>Invitrogen, USA</td><td>EN0561</td><td>sekcja3.7.1.2.Bufor reakcyjny 10 &times; jest dostarczany wraz z egzonukleazą &lambda; przez dostawcę.</td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Nośnik opadów</td><td>Takara, Dalian, Chiny</td><td>9094</td><td>sekcja 3.6.2 i 3.8.1</td></tr><tr><td>Zestaw do odzyskiwania DNA UNIQ-10 PAGE</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) B511135</td><td></td> <td>sekcja 4.2</td></tr><tr><td>SYBR Złoty barwnik żelowy kwasu nukleinowego</td><td>Invitrogen, USA</td><td>1811838</td><td>barwnik barwiący kwasem nucelowym, sekcja 3.5.1.5</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara, Dalian, Chiny</td><td>RR820A</td><td>mieszanina polimerazy łącząca polimerazę i dNTP, sekcja 5.3.5</td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 1132-61-2</td><td>sekcja 5.2.1</td></tr><tr><td>Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>CAS: 25952-53-8</td><td>sekcja 5.2.2</td></tr><tr><td>N-hydroksysukcynimid (NHS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>6066-82-6</td><td>sekcja 5.2.3</td></tr><tr><td>merkaptoheksanol (MCH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 1633-78-9</td><td>sekcja 7.7</td></tr><tr><td>Złota elektroda</td><td>Shanghai Chenhua</td><td>CHI101</td><td>sekcja 7.4. - 7.11</td></tr><tr><td>chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 51805-45-9</td><td>sekcja 7.5</td></tr><tr><td>O-(2-merkaptoetylo)-O'-metylo-hexa-(glikol etylenowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 651042-82-9</td><td>sekcja 7.7</td></tr><tr><td>ftalan dietyloheksylu (DEHP)</td> <td>Narodowy Instytut Metrologii, Chiny</td><td>CAS: 117-81-7</td><td>sekcja 7.11</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 9005-64-5</td><td>monolaurynian sorbaitanu polioksyetylenowego(20)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 9002-93-1</td><td>niejonowy środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>10 mM bufor fosforanowy zawierające 1 M NaCl, pH 7,4</td></tr></tbody></table>

wybór aptameru dna wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Estry kwasu ftalowego (PAE) są jedną z głównych grup trwałych zanieczyszczeń organicznych. Wykrywanie PAE w zależności od grupy jest wysoce pożądane ze względu na szybki wzrost kongenerów. Aptamery DNA są coraz częściej stosowane jako elementy rozpoznające na platformach biosensorów, ale rzadko zgłasza się wybór aptamerów w kierunku wysoce hydrofobowych celów małocząsteczkowych, takich jak PAE. W pracy opisano metodę opartą na koralikach, zaprojektowaną w celu selekcji aptamerów DNA specyficznych dla grupy do PAE. Funkcjonalizowany grupą aminową ftalan dibutylu (DBP-NH2) jako cel kotwicy został zsyntetyzowany i unieruchomiony na kulkach agarozy aktywowanych epoksydowo, co umożliwiło wyświetlenie grupy estrów ftalowych na powierzchni matrycy immobilizacyjnej, a tym samym wybór spoiw specyficznych dla grupy. Określiliśmy stałe dysocjacji kandydatów na aptamery za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimeryzacji sprzężonej z separacją magnetyczną. Względne powinowactwo i selektywność aptamerów do innych PAE określono za pomocą testów konkurencyjnych, w których kandydaci na aptamery zostali wstępnie związani z kulkami magnetycznymi dołączonymi do DBP-NH2 i uwolnieni do supernatantu po inkubacji z badanymi PAE lub innymi potencjalnymi substancjami zakłócającymi. Test konkurencyjny został zastosowany, ponieważ zapewnił łatwe porównanie powinowactwa między PAE, które nie miały grup funkcyjnych do immobilizacji powierzchniowej. Na koniec zademonstrowaliśmy wytwarzanie elektrochemicznego czujnika aptasensora i wykorzystaliśmy go do ultraczułego i selektywnego wykrywania ftalanu bis(2-etyloheksylu). Protokół ten dostarcza informacji na temat odkrywania aptamerów innych małych cząsteczek hydrofobowych.

Zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy funkcjonalizowany grupą aminową ftalan dibutylu (DBP-NH2) jako docelową kotwicę (Rysunek 1F). Następnie przeprowadziliśmy selekcję aptamerów DNA dla PAE, wykorzystując DBP-NH2 jako docelową kotwicę, zgodnie z klasyczną metodą opartą na immobilizacji celu (Rysunek 2). W każdej rundzie wykonywano pilotażową reakcję PCR z wykorzystaniem denaturującej elektroforezy w żelu po...

Przedstawiono protokół selekcji in vitro i charakterystyki aptamerów DNA wiążących estry kwasu ftalowego specyficznych dla grupy. Uwzględniono również zastosowanie wybranego aptameru w elektrochemicznym czujniku aptasensorycznym.

Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Ogólnym celem tej procedury jest selekcja aptamerów DNA specyficznych dla grupy do wysoce hydrofobowych, małych cząsteczek i wykorzystanie wybranego aptameru do opracowania czułego bioczujnika elektrochemicznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wyboru aptamerów, dotyczące sposobu selekcji i charakterystyki aptamerów specyficznych dla grupy, gdy celem są cząsteczki wysoce hydrofobowe. Chociaż najbardziej użyteczną częścią tej metody jest rozwój biosensorów elektrochemicznych do wykrywania tytułów.Te biosensory powinny również działać w naszych pomiarach powinowactwa aptamerów. Aby rozpocząć reakcję, dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od RNaz do oczyszczonego produktu APTAMER PCR. Mieszaj mieszaninę, aż osad się rozpuści.Reakcja egzonukleazy lambda jest wrażliwa na stężenie soli i jest produktem, który powinien być proliferowany przez wytrącanie etanolu, ale inny izopropanol. Umieścić w każdej z pięciu probówek do mikrowirówek pięć mikrolitrów roztworu aptameru, 11 mikrolitrów wody wolnej od Rnazy i dwa mikrolitry 10-krotnego buforu reakcyjnego. Dodaj dwa mikrolitry wody wolnej od Rnazy i roztwory dwóch, pięciu, ośmiu i 10 jednostek egzonukleazy lambda w wodzie wolnej od Rnazy do jednej probówki każdy.Dobrze wymieszać delikatnym pipetowaniem. Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 35 minut i w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie trzymaj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przygotuj 12% natywny żel na stronę.Dodaj do każdej probówki jeden mikrolitr barwnika ładującego i cztery mikrolitry wody wolnej od Rnazy. Uruchom mieszaniny w natywnym żelu na stronie pod napięciem 150 woltów przez 45 minut. Zidentyfikuj najmniejszą ilość egzonukleazy lambda potrzebną do całkowitego wytworzenia jednoniciowego DNA.Przeprowadź reakcję na dużą skalę, aby wygenerować jednoniciowe DNA. Dla każdego badanego celu wiążącego inkubować 10 mikrolitrów średnio funkcjonalizowanych kulek magnetycznych kodowanych DBP z 500 mikrolitrami jednego mikromolowego roztworu DBP-1 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej podczas obracania. Następnie odrzucić supernatant.Przemyj kulki czterokrotnie porcjami 200 mikrolitrów buforu wiążącego PAE i ponownie zawieś kulki w 10 mikrolitrach buforu wiążącego PAE. Uzyskać 10 docelowych dyspersji testowych wiązania mikromolowego w buforze wiążącym PAE. Świetnie nadaje się do dyspersji celów hydrofobowych w buforze wiążącym PAE.Aby to zapewnić, następuje wzbogacenie biblioteki, zostały wybrane w ramach testów powinowactwa. Dodaj 10 mikrolitrów kulek kodowanych DBP-1 do 110 mikrolitrów każdego docelowego roztworu testowego. Inkubować mieszaniny przez godzinę i zebrać supernatanty przez separację magnetyczną.Rozcieńczyć supernatanty 100 razy i użyć trzech mikrolitrów na każdy ilościowy PCR. Obliczyć względne powinowactwo, dzieląc liczbę DBP-1 uwalnianego w obecności badanej próbki przez liczbę DBP-1 uwalnianego w samym buforze wiążącym PAE. Przed wykonaniem pomiarów należy zsyntetyzować i oczyścić sondę sekwencyjną z tiolowanym rdzeniem na bazie DBP-1 oraz sondę sygnalizacyjną.Rozpuść tiolowaną sondę i sondę sygnalizacyjną w postaci 100 roztworów mikromolowych w wodzie wolnej od nukleaz. Następnie wypoleruj złotą elektrodę o średnicy dwóch milimetrów do powierzchni przypominającej lustro za pomocą jednego, 0,3 i 0,5 mikrona proszku tlenku glinu i ściereczki z mikrofibry przez pięć minut każda. Sonikuj elektrodę w ultra czystej wodzie przez pięć minut po każdym polerowaniu.Zanurz wypolerowaną elektrodę w 0,5 molowym roztworze kwasu siarkowego. Oczyść elektrodę za pomocą 35 kolejnych skanów woltamperometrii cyklicznej od minus 0,4 do dodatniego 1,2 V w porównaniu z kalomelem rtęciowym o napięciu 100 miliwoltów na sekundę. Następnie przygotuj w cienkościennej probówce wirówkowej mieszaninę 0,5 mikromolowej tiolowanej sondy DBP-1.I 0,5 mikromolowego FC zmodyfikowanego DBP-1 w 100 mikrolitrach PBS. Podgrzej mieszaninę w łaźni wodnej ustawionej na 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej w łaźni wodnej.Dodać jeden mikrolitr 10-milimolowego roztworu podstawowego TCEP do schłodzonej mieszaniny i utrzymywać w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie zanurz czystą złotą elektrodę w mieszaninie na 12 godzin w temperaturze pokojowej. Przepłukać elektrodę PBS, a następnie zanurzyć elektrodę w jednomilimolowym roztworze tiolowanego PEG w PBS na jedną godzinę.Dokładnie przepłukać elektrodę buforem wiążącym PAE bez celu i zanurzyć elektrodę w buforze. Następnie sonikować ogniwa elektrolityczne z platynowej przeciwelektrody i nasyconej kalomelowej elektrody referencyjnej przez dwie minuty każde w ultra czystej wodzie i buforze wiążącym PAE w sekwencji. Otwórz falę prostokątną oprogramowania przyrządu woltamperometrycznego i wprowadź parametry eksperymentu.Napełnij czyste ogniwo elektrolityczne docelowym buforem wiążącym PAE. Podłącz trzy czyste elektrody do potencjostatu i zanurz elektrody w buforze. Uzyskaj skanowanie SWV w tle.Następnie zanurzyć złotą elektrodę roboczą w 10-pikamolarnym roztworze DEHP w buforze wiążącym PAE na 30 minut w temperaturze pokojowej. Dokładnie przepłukać elektrodę buforem wiążącym PAE. Zanurz wszystkie trzy elektrody w świeżym buforze wiążącym PAE i zbierz kolejną krzywą SWV, używając tych samych parametrów, co poprzednio.Powtórzyć ten proces ze zwiększaniem stężeń DEHP, aby uzyskać krzywą miareczkowania. Stwierdzono, że minimalna ilość egzonukleazy lambda niezbędna do uzyskania tylko jednoniciowego DNA to dwie jednostki oparte na reakcjach na małą skalę. Kandydat na aptamer DBP-1 został zidentyfikowany za pomocą projektu SELEX, a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.DBP-1 wykazywał dobrą swoistość grupową w stosunku do kongenerów PAE. Elektrochemiczny czujnik aptasensor wykorzystujący DBP-1 selektywnie reagował na DEHP w porównaniu z innymi powszechnymi zanieczyszczeniami środowiska. Aptasensor był bardzo czuły na DEHP z odpowiedzią na niego przy stężeniach tak niskich, jak 10 pikamolów.Cząstki laserowe, w których selekcja i charakterystyka aptamerów dla zagrożonych hydrofobowych małych cząsteczek. Charakterystyka i ulatnianie aptamerów hydrofobowych małych cząsteczek, takich jak PAE, jest na ogół dość trudne ze względu na wyjątkowo ograniczoną rozpuszczalność w wodzie i niską masę cząsteczkową PAE. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zrobić elektrochemiczne aptasensory i jak ich używać do wykrywania tytułów.

phthalic-acid-ester-binding-dna-aptamer-selection-characterization

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Protokoły SELEX obejmują wiele rund selekcji, z których każda wymaga regeneracji związanych ligandów, co z kolei wymaga stałych sekwencji starterów flankujących regiony losowej biblioteki. Te stałe sekwencje starterów mogą zakłócać proces selekcji (powodując wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne). Przedstawiamy tutaj protokół bez użycia starterów.

Selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Dostępny jest protokół do wyboru aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek w oparciu o przestrajalną metodę selekcji kulek magnetycznych z regulacją. Aptamery wybrane ze względu na właściwości przełączania struktur są korzystne w testach, które wymagają zmiany konformacyjnej w celu zasygnalizowania obecności celu, takich jak opisany test nanocząstek złota.

Metoda wyboru aptamerów przełączających strukturę zastosowana do kolorymetrycznego testu nanocząstek złota

Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.

Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali

Przedstawiono protokół rozwoju elektrochemicznego biosensora DNA, składającego się z stabilizowanej kwasem polimlekowym, modyfikowanej nanocząstkami złota, sitodrukowanej elektrody węglowej do wykrywania Vibrio parahaemolyticus.

Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Zmieniona aktywność nukleazy jest związana z różnymi schorzeniami ludzkimi, co potwierdza jej potencjał jako biomarkera. Modułowa i łatwa do wdrożenia metodologia badań przesiewowych przedstawiona w tym artykule pozwala na wybór konkretnych sond kwasów nukleinowych do wykorzystania aktywności nukleazy jako biomarkera choroby.

Kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych

Obecny protokół opisuje użycie izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC) do analizy kinetyki asocjacji i dysocjacji wiązania między aptamerem DNA a tetracykliną, w tym przygotowania próbek, uruchamiania wzorców i próbek oraz interpretacji uzyskanych danych.

Określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru DNA i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Koniecznym krokiem w rozwoju aptameru przeciwnowotworowego jest przetestowanie jego wiązania z celem. Demonstrujemy test oparty na cytometrii przepływowej w celu zbadania tego wiązania, podkreślając znaczenie włączenia aptameru kontroli ujemnej i komórek rakowych, które są dodatnie lub ujemne dla tego konkretnego białka.

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

Obecny protokół demonstruje użycie szybkiego, 3-stopniowego, opartego na aptamie testu wykładniczego amplifikacji do wykrywania celów. Przygotowanie próbki, wzmocnienie sygnału i rozwój koloru są omówione w celu wdrożenia tego systemu do rozpoznawania obecności teofiliny w porównaniu z kofeiną.

Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex

Protokół ten przedstawia projekt podzielonych sond hybrydyzacyjnych wykorzystujących fluorescencyjny aptamer, świecący aptamer DAP-10-42 jako reporter sygnału oraz ich zastosowanie do wykrywania kwasów nukleinowych i różnicowania celów z podstawieniami pojedynczych nukleotydów.

Dzielona sonda hybrydyzacyjna wykorzystująca fluorescencyjny aptamer rozświetlający DNA jako reporter sygnału do analizy kwasów nukleinowych specyficznych dla sekwencji

Poznaj metodę selekcji grupowo specyficznych aptamerów DNA wiążących hydrofobowe cząsteczki oraz ich zastosowanie w elektrochemicznym biosensorze. Protokół obejmuje charakterystykę wiązań i detekcję.

Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora

Przeglądaj więcej filmów