Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora

Ogólnym celem tej procedury jest selekcja aptamerów DNA specyficznych dla grupy do wysoce hydrofobowych, małych cząsteczek i wykorzystanie wybranego aptameru do opracowania czułego bioczujnika elektrochemicznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wyboru aptamerów, dotyczące sposobu selekcji i charakterystyki aptamerów specyficznych dla grupy, gdy celem są cząsteczki wysoce hydrofobowe. Chociaż najbardziej użyteczną częścią tej metody jest rozwój biosensorów elektrochemicznych do wykrywania tytułów.

Te biosensory powinny również działać w naszych pomiarach powinowactwa aptamerów. Aby rozpocząć reakcję, dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od RNaz do oczyszczonego produktu APTAMER PCR. Mieszaj mieszaninę, aż osad się rozpuści.

Reakcja egzonukleazy lambda jest wrażliwa na stężenie soli i jest produktem, który powinien być proliferowany przez wytrącanie etanolu, ale inny izopropanol. Umieścić w każdej z pięciu probówek do mikrowirówek pięć mikrolitrów roztworu aptameru, 11 mikrolitrów wody wolnej od Rnazy i dwa mikrolitry 10-krotnego buforu reakcyjnego. Dodaj dwa mikrolitry wody wolnej od Rnazy i roztwory dwóch, pięciu, ośmiu i 10 jednostek egzonukleazy lambda w wodzie wolnej od Rnazy do jednej probówki każdy.

Dobrze wymieszać delikatnym pipetowaniem. Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 35 minut i w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie trzymaj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przygotuj 12% natywny żel na stronę.

Dodaj do każdej probówki jeden mikrolitr barwnika ładującego i cztery mikrolitry wody wolnej od Rnazy. Uruchom mieszaniny w natywnym żelu na stronie pod napięciem 150 woltów przez 45 minut. Zidentyfikuj najmniejszą ilość egzonukleazy lambda potrzebną do całkowitego wytworzenia jednoniciowego DNA.

Przeprowadź reakcję na dużą skalę, aby wygenerować jednoniciowe DNA. Dla każdego badanego celu wiążącego inkubować 10 mikrolitrów średnio funkcjonalizowanych kulek magnetycznych kodowanych DBP z 500 mikrolitrami jednego mikromolowego roztworu DBP-1 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej podczas obracania. Następnie odrzucić supernatant.

Przemyj kulki czterokrotnie porcjami 200 mikrolitrów buforu wiążącego PAE i ponownie zawieś kulki w 10 mikrolitrach buforu wiążącego PAE. Uzyskać 10 docelowych dyspersji testowych wiązania mikromolowego w buforze wiążącym PAE. Świetnie nadaje się do dyspersji celów hydrofobowych w buforze wiążącym PAE.

Aby to zapewnić, następuje wzbogacenie biblioteki, zostały wybrane w ramach testów powinowactwa. Dodaj 10 mikrolitrów kulek kodowanych DBP-1 do 110 mikrolitrów każdego docelowego roztworu testowego. Inkubować mieszaniny przez godzinę i zebrać supernatanty przez separację magnetyczną.

Rozcieńczyć supernatanty 100 razy i użyć trzech mikrolitrów na każdy ilościowy PCR. Obliczyć względne powinowactwo, dzieląc liczbę DBP-1 uwalnianego w obecności badanej próbki przez liczbę DBP-1 uwalnianego w samym buforze wiążącym PAE. Przed wykonaniem pomiarów należy zsyntetyzować i oczyścić sondę sekwencyjną z tiolowanym rdzeniem na bazie DBP-1 oraz sondę sygnalizacyjną.

Rozpuść tiolowaną sondę i sondę sygnalizacyjną w postaci 100 roztworów mikromolowych w wodzie wolnej od nukleaz. Następnie wypoleruj złotą elektrodę o średnicy dwóch milimetrów do powierzchni przypominającej lustro za pomocą jednego, 0,3 i 0,5 mikrona proszku tlenku glinu i ściereczki z mikrofibry przez pięć minut każda. Sonikuj elektrodę w ultra czystej wodzie przez pięć minut po każdym polerowaniu.

Zanurz wypolerowaną elektrodę w 0,5 molowym roztworze kwasu siarkowego. Oczyść elektrodę za pomocą 35 kolejnych skanów woltamperometrii cyklicznej od minus 0,4 do dodatniego 1,2 V w porównaniu z kalomelem rtęciowym o napięciu 100 miliwoltów na sekundę. Następnie przygotuj w cienkościennej probówce wirówkowej mieszaninę 0,5 mikromolowej tiolowanej sondy DBP-1.

I 0,5 mikromolowego FC zmodyfikowanego DBP-1 w 100 mikrolitrach PBS. Podgrzej mieszaninę w łaźni wodnej ustawionej na 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej w łaźni wodnej.

Dodać jeden mikrolitr 10-milimolowego roztworu podstawowego TCEP do schłodzonej mieszaniny i utrzymywać w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie zanurz czystą złotą elektrodę w mieszaninie na 12 godzin w temperaturze pokojowej. Przepłukać elektrodę PBS, a następnie zanurzyć elektrodę w jednomilimolowym roztworze tiolowanego PEG w PBS na jedną godzinę.

Dokładnie przepłukać elektrodę buforem wiążącym PAE bez celu i zanurzyć elektrodę w buforze. Następnie sonikować ogniwa elektrolityczne z platynowej przeciwelektrody i nasyconej kalomelowej elektrody referencyjnej przez dwie minuty każde w ultra czystej wodzie i buforze wiążącym PAE w sekwencji. Otwórz falę prostokątną oprogramowania przyrządu woltamperometrycznego i wprowadź parametry eksperymentu.

Napełnij czyste ogniwo elektrolityczne docelowym buforem wiążącym PAE. Podłącz trzy czyste elektrody do potencjostatu i zanurz elektrody w buforze. Uzyskaj skanowanie SWV w tle.

Następnie zanurzyć złotą elektrodę roboczą w 10-pikamolarnym roztworze DEHP w buforze wiążącym PAE na 30 minut w temperaturze pokojowej. Dokładnie przepłukać elektrodę buforem wiążącym PAE. Zanurz wszystkie trzy elektrody w świeżym buforze wiążącym PAE i zbierz kolejną krzywą SWV, używając tych samych parametrów, co poprzednio.

Powtórzyć ten proces ze zwiększaniem stężeń DEHP, aby uzyskać krzywą miareczkowania. Stwierdzono, że minimalna ilość egzonukleazy lambda niezbędna do uzyskania tylko jednoniciowego DNA to dwie jednostki oparte na reakcjach na małą skalę. Kandydat na aptamer DBP-1 został zidentyfikowany za pomocą projektu SELEX, a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

DBP-1 wykazywał dobrą swoistość grupową w stosunku do kongenerów PAE. Elektrochemiczny czujnik aptasensor wykorzystujący DBP-1 selektywnie reagował na DEHP w porównaniu z innymi powszechnymi zanieczyszczeniami środowiska. Aptasensor był bardzo czuły na DEHP z odpowiedzią na niego przy stężeniach tak niskich, jak 10 pikamolów.

Cząstki laserowe, w których selekcja i charakterystyka aptamerów dla zagrożonych hydrofobowych małych cząsteczek. Charakterystyka i ulatnianie aptamerów hydrofobowych małych cząsteczek, takich jak PAE, jest na ogół dość trudne ze względu na wyjątkowo ograniczoną rozpuszczalność w wodzie i niską masę cząsteczkową PAE. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zrobić elektrochemiczne aptasensory i jak ich używać do wykrywania tytułów.