Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo
19 czerwca 2016
Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.
Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja wewnątrzkomórkowych odpowiedzi elektrycznych fotoreceptorów Drosophila i interneuronów wzrokowych na kontrolowane bodźce świetlne. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurokodowania, takie jak to, w jaki sposób bodźce świetlne kodują je w jednej z jego odpowiedzi lub w jaki sposób informacje wizualne oraz fotoreceptory i interneurony wyodrębniają się z bodźców świetlnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia długotrwałe, wysokiej jakości nagrania z badania przy niewielkim uszkodzeniu środowiska wewnątrzkomórkowego i próbkowaniu informacji.
Cecha demonstracji, że może to mieć wpływ, jest krytyczna, ponieważ trudno jest nauczyć się poprawnie wykonywać różne kroki, nie widząc ich. Wyciągnij mikroelektrodę referencyjną z włókna borokrzemianowego lub z rurki ze szkła kwarcowego za pomocą standardowego ściągacza do pipet. Staraj się uzyskać krótkie, stopniowe zwężanie się.
Dokładne ustawienia różnią się w zależności od instrumentu. Wielkość porów na końcówce nie jest kluczowa, ponieważ zostanie ona złamana na potrzeby eksperymentów. Następnie wyciągnij elektrodę nagrywającą z tej samej szklanej rurki i spróbuj uzyskać drobny stopniowy stożek o długości od 10 do 15 milimetrów.
W mikroskopie świetlnym zamontuj elektrodę na szklanej stronie za pomocą wielu klejów i użyj obiektywu pneumatycznego 40x, aby sprawdzić jej końcówkę. Dobra elektroda zwęża się płynnie do niewidocznie małej końcówki, wokół której można zobaczyć ciągłe, równoległe, ciemniejsze i jaśniejsze wzory interferencyjne. Tuż przed eksperymentem wypełnij elektrodę referencyjną dzwonkami muchowymi, używając pięciomililitrowej strzykawki podłączonej do filtra cząstek stałych, z cienką plastikową końcówką.
W przypadku eksperymentów z fotoreceptorami należy obciążyć elektrodę rejestrującą 3 molowym chlorkiem potasu, aż na jej dużym końcu utworzy się kropla. Zminimalizuje to szumy ze złącza cieczy podczas nagrywania. Aby pracować z histaminergicznymi LMC, wypełnij elektrody rejestrujące 3 molowym octanem potasu, 0,5 milimolowym chlorkiem potasu, aby zminimalizować wpływ na baterię chlorków ogniwa.
Zacznij od załadowania świeżej fiolki muchowej z pięcioma do 10 jednodniowymi muchami. Młodsze muchy są bardziej kruche, ale można je rejestrować. Wybierz pierwszą muchę do elektrofizjologii.
Z dużymi samicami najłatwiej się pracuje. Znajdując się w rurce wychwytującej, wykorzystaj ich wrodzoną tendencję do wspinania się w górę do końcówki pipety i zakręcania mniejszej końcówki. Następnie podłącz 100-mililitrową strzykawkę z elastycznym plastikowym wężem do końcówki pipety, która jest powiększona tylko po to, aby przepuścić Drosophila i podłącz drugi koniec do dużej końcówki pipety przymocowanej do uchwytu na muchy.
Następnie wyciśnij niewielką objętość powietrza ze strzykawki, aby wyrzucić muchę do uchwytu na muchy. Spójrz przez mikroskop stereoskopowy i delikatnie podawaj więcej powietrza, aż głowa muchy będzie wystawać ze stożkowego końca uchwytu na muchy. Upewnij się, że mucha jest mocno uwięziona w klatce piersiowej.
Następnie zabezpiecz muchę woskiem pszczelim. Użyj najniższej temperatury podgrzewacza do wosku, aby czysto stopić wosk, który będzie wyglądał na przezroczysty. Jeśli jest zbyt gorący, wosk się wypali.
Unieruchom głowę muchy, nakładając niewielką ilość wosku pszczelego na trąbkę i kącik prawego oka, omijając rogówkę. Przymocuj te dwa punkty do uchwytu na muchy. Zakończ ten krok szybko, aby uniknąć poparzenia muchy.
Następnie załóż gogle i wyprodukuj mikronóż. Zaciśnij żyletkę ze stali nierdzewnej z dwoma płaskimi uchwytami ostrza i rozbij mały pasek jej ostrej krawędzi. Najlepiej wyprodukować ostrą jak brzytwa krawędź, która przypomina iglicę.
Teraz, ostrożnie i z wielką dbałością o szczegóły, użyj mikronoża, aby otworzyć kilka ommatidia lewego oka muchy, na przykład na cztery do pięciu ommatidia od naskórka grzbietowego tuż nad równikiem oka. Zapewni to przejście dla mikroelektrody rejestrującej. Jest to dość trudne, wymaga dobrze wykonanego noża i trzeba się tego nauczyć wraz z praktyką.
Następnie delikatnie wyjmij mały kawałek rogówki z otworu, odsłaniając siatkówkę pod spodem. Teraz używając cienkich włosków aplikatora wazeliny, szybko przykryj otwór maleńką kroplą wazeliny. Galaretka ma dodatkową zaletę polegającą na zmniejszeniu pojemności wewnętrznej pipety.
Unikaj rozmazywania oka, ponieważ powoduje to rozmywanie optyki. Podczas obsługi mikroelektrody amplifier, zawsze bądź uziemiony, dotykając metalowej powierzchni klatki Faradaya lub stołu antywibracyjnego, aby zapobiec ładunkom elektrostatycznym. Przymocuj zamontowaną muchę do słupa platformy do przygotowania much.
Obróć uchwyt na muchy tak, aby lewe oko muchy było skierowane bezpośrednio w stronę badacza. Następnie użyj małego mikromanipulatora, aby delikatnie wprowadzić elektrodę referencyjną przez oczka muchy do torebki głowy. Upewnij się, że mucha nadal wydaje się zdrowa i porusza czułkami.
Przygotowanie musi być doskonałe, aby zasługiwało na nagranie. Teraz wbij ostrą mikroelektrodę rejestrującą do lewego oka przez otwór pokryty galaretką. Gdy wnika do tkanki, położenie końcówki elektrody powinno być widoczne dzięki jej wzorowi odbicia.
Delikatna końcówka elektrody musi być idealnie prowadzona, w przeciwnym razie pęknie, co jest bardzo trudne. W zależności od typu komórki, z której odbywa się nagranie, głowa muchy powinna być zorientowana nieco inaczej. Po umieszczeniu elektrod na miejscu włącz wzmacniacz mikroelektrodowy.
Następnie wyłącz zimne źródło światła, odłącz je od sieci i podłącz do centralnego uziemienia, aby zminimalizować szumy elektryczne wywołane pętlą uziemienia. Następnie wyreguluj światłowody na gęsiej szyi, aby system ramienia Carden mógł być swobodnie przesuwany wokół rozporka. Następnie wyłącz światła w pomieszczeniu, aby umieścić preparat na muchy we względnej ciemności.
Teraz zmierz rezystancję elektrody rejestrującej w oku. Musi wynosić od 100 do 260 megaomów. Czasami końcówka jest zablokowana i można ją usunąć za pomocą pojemnościowych funkcji brzęczenia i impulsu prądowego wzmacniacza.
Jeśli to nie pomoże, użyj nowej elektrody. Następnie ustaw wzmacniacz na cęgi prądowe lub mostek i wyzeruj napięcie między elektrodami. Po tym, jak mucha zostanie przystosowana do ciemności przez kilka minut, wbij końcówkę elektrody rejestrującej w oko w krokach co 0,1 do jednego mikrona za pomocą steppera piezoelektrycznego lub delikatnie obracając pokrętłem precyzyjnej rozdzielczości.
Na każdym kroku stymuluj oko błyskiem światła o długości od jednej do 10 milisekund. Każdy błysk światła spowoduje krótki spadek napięcia lub ERG. Gdy końcówka elektrody wchodzi w blaszkę, zamykając się na LMC, ERG odwraca się.
Następnie przystąp do wykonywania pomiarów. Ze względu na nieinwazyjność, wydajność sygnałową poszczególnych komórek można badać w ich stanie zbliżonym do naturalnego. Odpowiedź napięciowa fotoreceptora R1-R6 na przyćmione i jasne światło mierzono w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Następnie fotoreceptor R1-R6 porównano z LMC w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Każdy z nich został zmierzony na innej muchy, ponieważ wewnątrzkomórkowe zapisy za pomocą dwóch ostrych mikroelektrod w tej samej muszce są zbyt trudne, aby były żywotne. Powtarzalność odpowiedzi staje się oczywista, gdy nałożymy na siebie dane.
Stosunek sygnału do szumu w dziedzinie częstotliwości uzyskano w ciągu czterech lat, przekształcając fragmenty danych o sygnale i szumie w widmo mocy, a następnie dzieląc średnie widmo mocy sygnału przez odpowiednie średnie widmo mocy szumu. Wynik może być niezwykle wrażliwy na sygnały w najlepszych preparatach. Technika ta może być używana do nagrywania wielu gatunków.
Muchy Coenocia były poddawane tej samej naturalistycznej, powtarzalnej stymulacji świetlnej w temperaturze 19 stopni Celsjusza. Dane zostały pobrane przed i po synaptycznym pobraniu od tej samej muchy poprzez przesuwanie elektrody rejestrującej. Szybsza dynamika nagrania jest spójna z drapieżnym charakterem tego gatunku.
Po opanowaniu technika ta umożliwia uzyskanie zawsze długich, wysokiej jakości nagrań, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że to jak nauka gry na pianinie. Im więcej ćwiczysz, tym lepsze wyniki uzyskasz.
Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak interwencje farmakologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak rola neuromodulatorów w kształtowaniu odpowiedzi. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiofizyki do zbadania sposobów optymalizacji informacji o świetle, wychwytywania i transferu, a także reakcji biochemicznych w maszynerii fototransdukcji i w następujących naukach biologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować Drosophila do eksperymentów wewnątrzkomórkowych i jak obudzić odpowiedzi neurologiczne z jej fotoreceptorów i interneuronów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi elektrycznych fotoreceptorów i interneuronów wzrokowych Drosophila na kontrolowane bodźce świetlne. Technika ta umożliwia wysokiej jakości pomiary napięcia przy minimalnym uszkodzeniu komórek, co czyni ją odpowiednią do badania przetwarzania informacji neuronalnych w złożonych oczach owadów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Fizjologia owadów
Wprowadzenie
- Zrozumienie kodowania neuronalnego w odpowiedzi na bodźce wzrokowe jest kluczowe w neuronauce.
- Muszka owocówka (Drosophila) służy jako organizm modelowy do badania przetwarzania bodźców wzrokowych.
- Ostre mikroelektrody są niezbędne do uzyskania dokładnych zapisów.
- Poprzednie metody mogły powodować znaczne uszkodzenia komórkowe, wpływając na wyniki.
Cel badania
- Zaprezentowanie techniki rejestracji sygnałów z fotoreceptorów i neuronów pośredniczących u Drosophila.
- Zbadanie sposobu kodowania informacji wzrokowej przez te komórki.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu, który umożliwi badaczom replikację tej metody.
Zastosowane metody
- Przygotowanie ostrych mikroelektrod z borokrzemowego lub kwarcowego szkła.
- Napełnianie elektrod odpowiednimi roztworami w celu zminimalizowania szumów.
- Unieruchomienie Drosophila w celu stabilnego rejestrowania sygnałów.
- Wprowadzenie elektrod do oka w celu rejestracji odpowiedzi napięciowych.
Główne wyniki
- Pomyślne rejestracje odpowiedzi napięciowych z pojedynczych fotoreceptorów.
- Wykazanie skuteczności metody w minimalizowaniu uszkodzeń komórkowych.
- Wgląd w mechanizmy kodowania bodźców wzrokowych przez neurony Drosophila.
- Opracowanie wiarygodnego protokołu do przyszłych badań.
Wnioski
- Metoda ta stanowi solidne podejście do badania odpowiedzi neuronalnych u Drosophila.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie przetwarzania informacji wizualnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej technice, aby zgłębić inne aspekty kodowania neuronalnego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda elektrofizjologiczna umożliwia wysokiej wierności rejestrację wewnątrzkomórkową z fotoreceptorów i interneuronów Drosophila, zapewniając wgląd mechanistyczny w transdukcję sygnałów wzrokowych. Poprzez rejestrację długotrwałych, niskoszumowych odpowiedzi napięciowych in vivo, technika ta wspiera ograniczanie ryzyka w fazie wczesnego odkrywania leków, łącząc perturbacje genetyczne lub farmakologiczne z funkcjonalnym wynikiem neuronalnym. Jej powtarzalność i rygor ilościowy zwiększają pewność prognostyczną w walidacji szlaków oraz gotowości testów do przesiewowych badań neuroterapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar odpowiedzi napięciowych jako funkcjonalnych wskaźników nienaruszenia szlaku fototransdukcji.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią, ilościową ocenę pobudliwości neuronalnej i wierności sygnału w natywnym kontekście tkankowym.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji celu poprzez korelację fenotypów elektrofizjologicznych ze zmianami indukowanymi genetycznie lub związkami chemicznymi.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie wysokorozdzielczych, rozdzielonych w czasie zapisów napięcia, które służą jako ilościowe zmienne zależne w profilowaniu kinetycznym lub badaniu zależności dawka-odpowiedź.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację analizy dzięki stabilnym pomiarom wewnątrzkomórkowym z określonymi parametrami wejściowymi (bodziec świetlny) i wyjściowymi (odpowiedź napięciowa).
- Wartość strategiczna: Wspiera skalowalne platformy przesiewowe, zapewniając powtarzalny odczyt elektrofizjologiczny, który nadaje się do automatyzacji i porównań międzylaboratoryjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych w kontekście chorób wglądów systemowych poprzez modelowanie konserwatywnych mechanizmów fototransdukcji, które można zastosować do walidacji celów w neuronauce sensorycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po prace przedkliniczne dzięki zachowaniu relewantności fizjologicznej w nienaruszonych preparatach zaadaptowanych do światła.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka, umożliwiając mechanistyczne zmniejszenie ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w neuronalne kaskady sygnałowe.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta jest integrowana z wczesnymi procesami badawczymi jako narzędzie do walidacji funkcjonalnej po identyfikacji celu i przed optymalizacją wiodących związków, gdzie neuronalne odpowiedzi napięciowe służą jako mechanistyczne biomarkery aktywacji szlaku.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez określenie, w jaki sposób manipulacje genetyczne lub farmakologiczne zmieniają wewnątrzkomórkową dynamikę napięcia w fotoreceptorach i interneuronach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki spójnym, wysokiej wierności rejestracjom, które umożliwiają niezawodną ocenę związków w odniesieniu do odpowiedzi napięciowych wywołanych światłem.
- Analityka: Dostarcza pomiarów ilościowych, takich jak stosunek sygnału do szumu i kinetyka odpowiedzi, umożliwiając obiektywne porównanie warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez zachowanie fizjologii komórkowej bliskiej naturalnej, co wspiera ekstrapolację na ssacze systemy sensoryczne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma elektrofizjologiczna do iteracyjnej walidacji celów w wielu projektach z zakresu neuronauki wzroku.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach przetwarzania wizualnego dzięki bezpośredniemu pomiarowi napięcia.
- Wartość operacyjna: zwiększa powtarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym protokołom przygotowania elektrod, immobilizacji i stymulacji.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, dostarczając obiektywnych danych ilościowych na temat zaangażowania celu i funkcji neuronalnej.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację celów z silną walidacją elektrofizjologiczną i niskim szumem funkcjonalnym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii, mikrochirurgii oraz pracy z Drosophila w celu uzyskania stabilnych zapisów wewnątrzkomórkowych.
- Zależy od specjalistycznego instrumentarium, w tym od wyciągaczy mikroelektrod, wzmacniaczy, stymulatorów piezoelektrycznych i stanowisk z kontrolą oświetlenia.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w zakresie docelowej rezystancji elektrod (100–260 MΩ), czasu stymulacji oraz protokołów adaptacji do ciemności.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzaniu badań na inne gatunki owadów lub przygotowywaniu linii transgenicznych o zmienionej fototransdukcji.
- Jest ograniczona przez trudności techniczne związane z wprowadzaniem elektrod oraz utrzymaniem żywotności preparatów podczas długich sesji pomiarowych.
