Name: Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj elektrofizjologiczną metodę rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne. Technika zapewnia wysokiej jakości pomiary przy minimalnym uszkodzeniu komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Mickowi Swannowi, Chrisowi Askhamowi i Martinowi Gautreyowi za ich ważny wkład w projektowanie i budowę wielu elektrycznych i mechanicznych komponentów platform. Obecne badania MJ są wspierane przez Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (Grant BBSRC: BB/M009564/1), otwarty fundusz badawczy State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning (Chiny), High-End Foreign Expert Grant (Chiny), stypendium Fundacji Jane and Aatos Erkko (Finlandia) oraz grant Leverhulme Trust (RPG-2012-567).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Przedstawiliśmy podstawowe kluczowe kroki, jak używać ostrych konwencjonalnych mikroelektrod do rejestrowania wewnątrzkomórkowych odpowiedzi fotoreceptorów R1-R6 i LMC w nienaruszonych oczach much. Metoda ta została zoptymalizowana, wraz z dostosowanymi do potrzeb narzędziami sprzętowymi i programowymi, w ciągu ostatnich 18 lat, aby zapewnić wysokiej jakości, długotrwałe nagrania, które odpowiedzą na szeroki zakres pytań eksperymentalnych. Inwestując czas i zasoby w konstruowanie solidnych i precyzyjnych zestawów eksperymentalnych oraz w produkcję mikroelektrod o korzystnych właściwościach elektrycznych, wysokiej jakości nagrania mogą stać się normą w każdym laboratorium zajmującym się neurofizjologią wzrokową Drosophila . Podczas gdy dobrze zaprojektowane systemy rejestracji i stymulacji światłem są ważne dla szybkiego przeprowadzenia różnych paradygmatów eksperymentalnych, istnieją trzy kroki proceduralne, które są jeszcze bardziej krytyczne dla osiągnięcia udanych zapisów: (i) przygotowanie muchy przy minimalnym uszkodzeniu oka, (ii) wyciągnięcie mikroelektrod o odpowiednich właściwościach elektrycznych oraz (iii) wbicie elektrody rejestrującej do oka bez złamania jej końcówki. Ostatecznie, aby zarejestrować znaczące dane, badacz musi zrozumieć fizyczne podstawy elektrofizjologii i sposób wytwarzania odpowiednich mikroelektrod dla docelowych typów komórek.
Dlatego ograniczenia tej techniki wyznacza przede wszystkim cierpliwość, doświadczenie i zdolności techniczne badacza. Ponieważ opanowanie tej techniki w przypadku małych komórek Drosophila może zająć dużo czasu, zaleca się, aby elektrofizjolodzy stażyści najpierw ćwiczyli z większymi oczami owadów, takimi jak plujka36 lub szarańcza35, przy użyciu tego samego zestawu. Gdy wykonywanie wysokiej jakości nagrań wewnątrzkomórkowych z większych fotoreceptorów i interneuronów stanie się rutyną, nadszedł czas, aby przejść do oka Drosophila . Kolejne ograniczenie tej techniki dotyczy identyfikacji komórkowej. Przeniknięte komórki Drosophila mogą być ładowane elektroforetycznie barwnikami, w tym żółcią Lucyfera lub neurobiotyną. Jednak ze względu na mały rozmiar końcówki mikroelektrod, elektroforeza działa mniej wydajnie niż w przypadku elektrod o niższej rezystancji, takich jak elektrody krosowe. Co więcej, mikroelektrody wypełnione barwnikiem mają charakterystycznie mniej korzystne właściwości elektryczne, co znacznie utrudnia rejestrowanie wysokiej jakości odpowiedzi z nich z fotoreceptorów Drosophila i LMC.
Problemem technicznym, który czasami występuje, jest niestabilny sygnał wejściowy lub jego całkowity brak. Jest to często związane z tym, że sygnał napięciowy jest albo stale dryfowany, albo wyższy/niższy niż zakres nagrywania wzmacniacza. W większości przypadków takie zachowanie jest spowodowane zablokowaniem elektrody rejestrującej (lub jej końcówką jest zbyt cienka - o zbyt dużej rezystancji lub pojemności wewnętrznej - aby prawidłowo przeprowadzić szybkie zmiany sygnału). Chociaż można próbować odblokować końcówkę, brzęcząc pojemnością elektrody, co czasami działa, często sytuację najlepiej rozwiązać, po prostu zmieniając elektrodę nagrywającą. Może to również wymagać regulacji parametrów w przyrządzie do ściągania mikroelektrod w celu obniżenia rezystancji końcówki nowych elektrod. Końcówka elektrody może również ulec zablokowaniu w preparatach, w przypadku których pokrycie otworu rogówki wazeliną zajęło zbyt dużo czasu. Długotrwały kontakt z powietrzem może wysuszyć świeżo odsłoniętą tkankę siatkówki, zamieniając jej warstwę powierzchniową w substancję podobną do kleju. W takim przypadku badacz zazwyczaj widzi czerwoną plamę tkanki przyklejoną do elektrody rejestrującej podczas wyciągania jej z oka. Jedynym rozwiązaniem jest tutaj zrobienie nowego preparatu. Wazelina może przynieść wiele korzyści w zapisach elektrofizjologicznych: (i) zapobiega koagulacji hemolimfy, która mogłaby złamać końcówkę elektrody; (ii) powleka końcówkę elektrody, zmniejszając jej pojemność wewnętrzną, co obniża stałą czasową elektrody, a tym samym może poprawić rozdzielczość czasową rejestrowanych sygnałów nerwowych40,41; (iii) utrzymuje końcówkę elektrody w czystości, ułatwiając penetracje; A po penetracji, (iv) może nawet pomóc uszczelnić końcówkę elektrody do błony komórkowej42. 
Sygnał może być dodatkowo niestabilny lub utracony, gdy drut chlorku srebra uchwytu elektrody zostanie uszkodzony lub odchlorowany; W takim przypadku wystarczy wymienić lub ponownie nachlorować stary drut. Brakujący sygnał może również wynikać z tego, że jeden (lub oba) uchwyty elektrod nie są bezpiecznie podłączone do swoich gniazd. Jednak niezwykle rzadko zdarza się, aby jakiś element wyposażenia działał nieprawidłowo. Jeśli sygnał jest niewykrywalny, a wszystkie inne możliwości zostały wyczerpane, sprawdź, czy każda część aparatury rejestrującej, w tym scena główna, wzmacniacz, filtry dolnoprzepustowe i przetworniki AD/DA, są prawidłowo podłączone i działają normalnie. Jednym ze sposobów osiągnięcia tego celu jest zastąpienie każdego instrumentu innym z zestawu, o którym wiadomo, że działa normalnie. Alternatywnie użyj generatora sygnału, aby sprawdzić wydajność komponentów elektronicznych jeden po drugim.
Ale być może najczęstszym problemem technicznym, z którym borykają się elektrofizjolog, jest rejestrowanie hałasu. Ogólnie rzecz biorąc, rejestrowanie hałasu to obserwowana aktywność elektryczna inna niż bezpośrednia odpowiedź neuronalna na dany bodziec. Ze względu na to, że przygotowanie muchy, jeśli jest prawidłowo wykonane, jest bardzo stabilne, obserwowany szum (wykraczający poza naturalną zmienność reakcji) najczęściej wynika z pętli uziemienia w sprzęcie rejestrującym lub jest odbierany przez pobliskie urządzenia elektryczne. Taki szum to typowo szum sieciowy 50/60 Hz i jego harmoniczne; ale czasami składa się z bardziej złożonych przebiegów. Aby ustalić pochodzenie hałasu, wyjmij uchwyt na muchy z zestawu, podłącz elektrody rejestrujące i referencyjne przez kroplę muchowego Ringera (lub umieść je w małej kąpieli z roztworem Ringera; patrz krok 1.2.6) i nagraj sygnał w trybie CC lub bridge. Jeśli szum jest możliwy do zaobserwowania w nagranym sygnale, prawdopodobnie oznacza to, że szum jest zewnętrzny w stosunku do preparatu muchowego.
Innym dobrym testem do identyfikacji pochodzenia szumów jest zastąpienie uchwytów elektrod modelem ogniwa elektrycznego podłączonym do wzmacniacza. W idealnie skonfigurowanym i uziemionym układzie nagrany sygnał powinien być teraz praktycznie pozbawiony szumów, pokazując tylko stochastyczny szum bitowy z przetwornika AD (w najlepszym przypadku nawet to!). Jeśli hałas jest nadal obecny, sprawdź ponownie, czy wszystkie urządzenia platformy są prawidłowo uziemione. Wygodnym podejściem do wykrywania pętli uziemienia jest: (i) odłączenie wszystkich przewodów uziemiających od wszystkich części w platformie; (ii) zapewnić, że po wykonaniu tej czynności każda pojedyncza część jest rzeczywiście odizolowana od masy za pomocą omomierza; (iii) Połączyć części, jedna po drugiej, z centralnym podłożem bezpośrednio, a nie za pośrednictwem jakiejkolwiek innej części platformy. Spróbuj również zmienić konfiguracje sprzętu. Na przykład czasami odsunięcie komputera i monitora dalej od platformy może zmniejszyć hałas; Jeszcze w innych przypadkach przeniesienie komputera do szafy sprzętowej zmniejsza hałas. Warto również odłączyć pobliski sprzęt, aby sprawdzić, czy hałas jest zredukowany, lub osłonić dodatkowe komponenty. Ponadto spróbuj odłączyć lub wymienić różne elementy sprzętu nagrywającego, zwłaszcza kable BNC (które mogą mieć wadliwe połączenia uziemiające). Jeśli podczas korzystania z modelu komórkowego obserwuje się tylko szum bitowy, początkowym źródłem szumu są albo elektrody, albo sam preparat muchowy. Na przykład, może się zdarzyć, że elektroda referencyjna przypadkowo dotyka nerwu ruchowego lub aktywnych włókien mięśniowych wewnątrz torebki głowy (lub zakłóca mięśnie lotu w klatce piersiowej - jeśli są tam umieszczone). Zwykle najprościej jest przygotować nową muchę do nagrywania, dbając o zminimalizowanie uszkodzeń muchy. Ale jeśli szum utrzymuje się i jest szerokopasmowy, jest prawdopodobne, że elektrody są nieoptymalne dla eksperymentów; zbyt ostry/drobny (a więc zbyt głośny) lub po prostu nieodpowiedni do celu; Widzieliśmy nawet elektrody kwarcowe działające jak anteny - odbierające słabe sygnały nadawcze! Chociaż iteracja ustawień parametrów ściągacza-instrumentu w celu wygenerowania odpowiednich mikroelektrod w celu uzyskania spójnych, wysokiej jakości nagrań z określonych typów komórek może wymagać wiele wysiłku, jest tego warta. Gdy elektrody rejestrujące są dobrze dopasowane do eksperymentów, mogą zapewnić długotrwałe nagrania o wyjątkowej jakości.
Ostre techniki zapisu mikroelektrod mogą być podobnie stosowane do badania przetwarzania informacji neuronalnych w wielu preparatach, w tym w różnych warstwach przetwarzania w oczach owadów i mózgu43,44. Ponieważ końcówki mikroelektrod mogą być wykonane bardzo delikatnie, zazwyczaj uszkadzają one badane ogniwa w mniejszym stopniu niż większość zastosowań patch-clamp. Co ważne, nowoczesne wzmacniacze mikroelektrod typu sample-and-hold umożliwiają dobrą kontrolę właściwości elektrycznych końcówek40,45-47. Tak więc, przy prawidłowym zastosowaniu, technika ta może dostarczyć wiarygodnych danych zarówno z preparatów in vivo3,5,7-10,44 , jak i in vitro48 z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w rozdzielczości submilisekundowej. Taka precyzja byłaby niemożliwa przy dzisiejszych technikach obrazowania optycznego, które są głośniejsze i wolniejsze. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do scharakteryzowania właściwości błony elektrycznej małych komórek zarówno w konfiguracjach cęgów prądowych, jak i napięciowych5,29,33,36,40-42,49, dostarczając cennych danych dla podejść do modelowania biofizycznego i empirycznego7,8,11,33,49-54 , które łączą eksperymenty z teorią.

Złożone oko muszki owocówki (Drosophila melanogaster) stanowi doskonały system modelowy do badania organizacji funkcjonalnej macierzy fotoreceptorów i interneuronów w procesach próbkowania i przetwarzania obrazu neuronalnego oraz w wizji zwierząt. System ten posiada najbardziej kompletny schemat połączeń neuronalnych1,2 i jest podatny na manipulacje genetyczne oraz precyzyjne monitorowanie aktywności neuronalnej (o wysokim stosunku sygnału do szumu i wysokiej rozdzielczości czasowej)3-10.
Oko Drosophila ma budowę modularną i składa się z ok. 750 pozornie regularnych struktur zwieńczonych soczewką, zwanych ommatidiami, które wspólnie zapewniają musze panoramiczne pole widzenia obejmujące niemal każdy kierunek wokół głowy. Podstawowymi jednostkami pobierania informacji w oku są rhabdomeryczne fotoreceptory7,8,11. Każde ommatidium zawiera osiem komórek fotoreceptorowych (R1-R8), które dzielą tę samą soczewkę facetową, ale są skierowane w siedmiu różnych kierunkach. Podczas gdy zewnętrzne fotoreceptory R1-R6 są najbardziej czułe na światło niebiesko-zielone, czułości spektralne komórek wewnętrznych R7 i R8, które znajdują się jedna nad drugą i są skierowane w tym samym kierunku, wykazują trzy charakterystyczne podtypy: blady (pale), żółty (yellow) oraz obszaru krawędzi grzbietowej (DRA)12-15.
<img alt="Budowa fotoreceptorów i połączenia synaptyczne Drosophila; schemat układu wkładów lamina." src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Organizacja funkcjonalna oka Drosophila. (A) Dwa pierwsze zwoje wzrokowe, siatkówka i lamina, zostały zaznaczone na szaro wewnątrz oka muchy. Fotoreceptory R1-R6 siatkówki oraz duże komórki jednobiegunowe (LMCs: L1-L3) lamina są łatwo dostępne in vivo dla konwencjonalnych rejestracji za pomocą ostrych mikroelektrod. Schematyczna elektroda pokazuje standardową ścieżkę rejestracji z R1-R6 w siatkówce. Jedną ze ścieżek rejestracji z LMCs w lamina jest równoległe przesunięcie elektrody w lewo. (B) Lamina stanowi macierz retinotopologicznie zorganizowanych wkładów, z których każdy jest wypełniony neuronami przetwarzającymi informacje z konkretnego, niewielkiego obszaru przestrzeni wizualnej. Ze względu na superpozycję neuronalną, sześć fotoreceptorów z różnych sąsiadujących ommatidiów przesyła swoje aksony (R1-R6) do tego samego wkładu lamina, tworząc histaminergiczne synapsy wyjściowe do L1-L3 oraz komórki amacrynowej (Am). (C) Przebieg informacji neuronalnej między zakończeniami aksonów R1-R6 a interneuronami wzrokowymi (w tym L4, L5, Lawf, C2, C3 i T1) wewnątrz wkładu lamina jest złożony. (D) Aksony fotoreceptorów R1-R6 otrzymują sprzężenia synaptyczne zwrotne z komórek jednobiegunowych L2 i L4. (B) i (C) zmodyfikowano na podstawie Rivera-alba et al2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Oko Drosophila jest typu neuronowego superpozycyjnego16. Oznacza to, że sygnały neuronowe z ośmiu fotoreceptorów należących do siedmiu sąsiednich ommatidiów, które patrzą w ten sam punkt w przestrzeni, są gromadzone w jednym wkładzie neuronowym w dwóch kolejnych neuropilach: laminie i meduli. Podczas gdy sześć zewnętrznych fotoreceptorów R1-R6 rzutuje końcówki swoich aksonów do kolumn neuronowych w laminie (Rysunek 1), komórki R7 i R8 omijają tę warstwę i tworzą kontakty synaptyczne z odpowiadającą im kolumną meduli17-19. Takie precyzyjne połączenia tworzą podłoże neuronowe dla mapowania retinotopowego wczesnego wzroku muchy, w wyniku czego każda kolumna laminy (Rysunki 1A-C) i meduli (wkład) reprezentuje pojedynczy punkt w przestrzeni.
Bezpośrednie sygnały z fotoreceptorów R1-R6 są odbierane przez duże komórki monopolarne (LMCs: L1, L2 i L3) oraz komórkę amacrinową (Am) w laminie1,2,20. spośród nich L1 i L2 są największymi komórkami, pośredniczącymi w głównych szlakach informacyjnych (Rycina 1D), które reagują na krawędzie poruszające się w kierunku On i Off, tworząc tym samym podstawę obliczeniową detektora ruchu21,22. Eksperymenty behawioralne sugerują, że przy umiarkowanym kontraście oba szlaki ułatwiają percepcję ruchu w przeciwnych kierunkach: od tyłu do przodu w komórkach L1 oraz od przodu do tyłu w komórkach L223,24. Połączenia wskazują ponadto, że neurony L4 mogą odgrywać kluczową rolę w komunikacji bocznej między sąsiednimi kartridżami25,26. Synapsy zwrotne stwierdzono pomiędzy komórkami L2 i L4 znajdującymi się w tym samym oraz w dwóch sąsiednich kartridżach. W dalszej części szlaku każda komórka L2 i trzy powiązane z nią komórki L4 rzutują swoje aksony do wspólnego celu – neuronu Tm2 w meduli, gdzie sygnały z sąsiednich kartridży są prawdopodobnie integrowane w celu przetwarzania ruchu od przodu do tyłu27. Chociaż neurony L1 otrzymują sygnały z komórek L2 z tego samego kartridża zarówno poprzez złącza szczelinowe, jak i synapsy, nie są one bezpośrednio połączone z komórkami L4, a tym samym z sąsiednimi kartridżami laminy.
Sprzężenia zwrotne synaptyczne do aksonów fotoreceptorów R1-R6 są zapewniane wyłącznie przez neurony należące do obwodów L2/L4, a nie przez drogę L11,2 (Rysunek 1D). Podczas gdy połączenia w obrębie tego samego wkładu (cartridge) pochodzą selektywnie z L2 do R1 i R2 oraz z L4 do R5, wszystkie fotoreceptory R1-R6 otrzymują synaptyczne sprzężenie zwrotne z L4 jednego lub obu sąsiednich wkładów. Ponadto istnieją silne połączenia synaptyczne z Am do R1, R2, R4 i R5, a komórki glei są również połączone synaptycznie z siecią, przez co mogą uczestniczyć w neuronalnym przetwarzaniu obrazu6. Wreszcie, aksonalne połączenia szczelinowe, łączące sąsiednie fotoreceptory R1-R6 oraz fotoreceptory R6 i R7/R8 w lamina, przyczyniają się do asymetrycznej reprezentacji i przetwarzania informacji w każdym wkładzie14,20,28.
Rejestracje napięcia wewnątrzkomórkowego z poszczególnych fotoreceptorów i interneuronów wzrokowych w niemal nienaruszonych owadach Drosophila dostarczają danych o wysokim stosunku sygnału do szumu przy rozdzielczości poniżej jednej milisekundy3,5,7-10,29, co jest niezbędne do zrozumienia szybkich obliczeń neuronalnych zachodzących między połączonymi neuronami. Taki poziom precyzji jest nieosiągalny przy użyciu obecnych technik obrazowania optycznego, które charakteryzują się znacznie większym poziomem szumów i zazwyczaj operują przy rozdzielczości 10 - 100 msec. Ponadto, dzięki bardzo małym i ostrym końcówkom elektrod, metoda ta nie ogranicza się do ciał komórkowych, lecz umożliwia bezpośrednie rejestracje z małych, aktywnych struktur neuronalnych, takich jak drzewa dendrytyczne LMC lub aksony fotoreceptorów, do których nie można uzyskać dostępu za pomocą znacznie większych końcówek elektrod typu patch-clamp. Co istotne, metoda ta jest również mniej inwazyjna strukturalnie i powoduje mniejsze uszkodzenia niż większość zastosowań patch-clamp, a tym samym w mniejszym stopniu wpływa na środowisko wewnątrzkomórkowe badanych komórek oraz próbkowanie informacji. W związku z tym konwencjonalne techniki z użyciem ostrych mikroelektrod przyczyniły się i nadal przyczyniają do fundamentalnych odkryć oraz oryginalnych spostrzeżeń w zakresie przetwarzania informacji neuronalnych w odpowiedniej skali czasowej, poprawiając nasze mechanistyczne rozumienie procesu widzenia3-10.
Niniejszy artykuł wyjaśnia, w jaki sposób w laboratorium Juusoli przeprowadza się wewnątrzkomórkowe rejestracje in vivo z fotoreceptorów R1-R6 oraz komórek LMC u Drosophila. Protokół ten opisuje sposób konstrukcji odpowiedniego stanowiska elektrofizjologicznego, przygotowanie muchy oraz sposób wykonywania rejestracji. Przedstawiono reprezentatywne dane oraz omówiono typowe problemy i potencjalne rozwiązania, które mogą pojawić się podczas stosowania tej metody.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy do przygotowania muchy</td><td>Okulary Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1,6x PF: WHN30x-H/22</td><td>Możliwość powiększenia ~150X przy dużej odległości roboczej; Wykonany na zamówienie ciężki stalowy stojak do montażu na stole</td></tr><tr><td>Stereomikroskop w konfiguracji wewnątrzkomórkowej</td> <td>i środkowej; &nbsp; Olympus</td><td>Olympus SZX7; okulary: WHN30x-H/22</td><td>Okulary 30X są potrzebne do dobrego widzenia odbicia końcówki elektrody podczas wprowadzania jej przez mały otwór rogówki do oka</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon SMZ645; okulary: C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny</td><td>Melles Griot</td><td>Z metrycznymi otworami M6 na płytce</td> <td>stykowejNasze zestawy na zamówienie mają duży otwór wywiercony w grubej płytce stykowej, który wpuszcza słup platformy do przygotowania much (mieści miedziany radiator z elektroniką) od spodu</td></tr><tr><td>Newport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>Narishige</td><td>Narishige NMN-21</td><td>W naszych zestawach wewnątrzkomórkowych stosuje się różne systemy mikromanipulatorów do wprowadzania elektrod rejestrujących shap do oka muchy. Wszystkie wymienione manipulatory z powodzeniem zapewniają długotrwałe, stabilne zapisy z fotoreceptorów Drosophila i LMC.</td></tr><tr><td>Huxley Bertram</td><td>Huxley Oś xyz z precyzyjnym sterowaniem</td><td></td><td></td>ręcznym</tr><tr><td>Sensapex</td><td>Potrójna oś</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sensapex M&auml; RZH&AUML; użytkownik</td><td>M&auml; RZH&AUML; użytkownik DC-3K z dodatkowym krokowym piezoelektrycznym osi X i sterownikiem</td><td></td><td></td>MS 314</tr><tr><td>Stojaki magnetyczne</td><td>Wystarczy dowolna podstawa magnetyczna z włącznikiem</td><td></td>/wyłącznikiem <td>Na przykład do zarządzania wewnątrz klatki Faradaya</td></tr><tr><td>Uchwyty elektrod</td><td>Aparat Harvarda</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>średnicy 0,3 - 0,5 mm; musi być chlorowany dla uchwytów elektrod</td></tr><tr><td>Światłowodowe źródło światła</td><td>Wiele różnych, w tym</td> wiązki światłowodowe Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Technologia</td><td></td> UltraFine <td>Aby dostarczyć bodziec świetlny LED do systemu ramienia Cardan. Używamy zarówno płynnych, jak i kwarcowych światłowodów (zakres od UV do IR)</td></tr><tr><td>Thorn Labs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Cathing Tube</td><td></td><td>P80-50P 50ml Cent. Tube PP., opakowanie 100 szt.</td><td>Odetnij stożkowe dno z plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przyklej do niej końcówkę do pipety o pojemności 1 ml.</td></tr><tr><td>Cyfrowy system akwizycji</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednoelektrodowy wzmacniacz mikroelektrod prądowo-napięciowych</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>Znakomita wydajność!</td></tr><tr><td>Stopień główny</td><td>Standard (+/- 150 nA)</td>Do źródeł światła i sterowników LED <td>npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td></td><td>2-kanałowa dioda OptoLED (Cairn Research Ltd., Wielka Brytania)</td><td></td><td>Wiele z naszych systemów stymulacyjnych jest zbudowanych we własnym zakresie&nbsp;</td></tr><tr><td>Samodzielnie zaprojektowane i skonstruowane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie do akwizycji i analiz</td><td>Wiele firm do wyboru Biosyst</td><td></td><td>; Napisany na zamówienie system oparty na Matlabie do prac eksperymentalnych i teoretycznych w laboratorium Juusola</td></tr><tr><td>Komputer osobisty lub Mac</td><td></td><td></td><td>Upewnij się, że komputer PC lub Mac jest kompatybilny z systemem akwizycji danych i oprogramowaniem</td></tr><tr><td>System ramienia Cardan&nbsp;</td><td>Samodzielnie zaprojektowany i skonstruowany</td><td></td><td>Zapewnia dokładne pozycjonowanie bodźców świetlnych x,y,z</td></tr><tr><td>System kontroli temperatury Peltiera&nbsp;</td><td>Samodzielnie zaprojektowana i skonstruowana</td><td></td><td></td></tr><tr><td>klatka Faradaya</td><td>Samodzielnie skonstruowana</td><td></td><td>osłona przed szumami elektromagnetycznymi</td></tr><tr>Kapilary <td></td> ze<td>szkła borokrzemianowego</td><td>Średnica zewnętrzna: 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Średnica wewnętrzna: 0,5 - 0,7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Kapilary <td></td> ze<td>szkła kwarcowego z włóknami</td><td>Średnica zewnętrzna: 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Średnica wewnętrzna: 0,5 - </td> Ściągacz do pipet 0,7 mm <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Model P-2000 laserowy ściągacz do mikropipet płomieniowo-brązowych</td><td>W przypadku elektrod referencyjnych borokrzemianowych użyj wstępnie ustawionego programu #11 (elektrody łatek): Ciepło = 350; Żarnik = 4; Prędkość 36; Opóźnienie = 200).1.2.1). W przypadku elektrod borokrzemianowych należy użyć wstępnie ustawionego programu #12 (zazwyczaj wyciąga on dobre konwencjonalne ostre narzędzia&nbsp; dla nagrań fotoreceptorowych): Ciepło = 355; Żarnik = 4; Prędkość 50; Opóźnienie = 225; Ciąg = 150. W przypadku nagrań LMC, które wymagają elektrod z drobniejszymi końcówkami, wartości te należy dostosować. Do wyciągania kapilar kwarcowych instrukcja P-2000 sugeruje programy dla mikroelektrod z cienką końcówką. Programy te" Wstępnie ustawione parametry służą jako użyteczne punkty wyjścia do systematycznych modyfikacji w celu wygenerowania elektrod o dobrym sukcesie penetracji i niskim poziomie szumów nagrywania.</td></tr><tr><td>Zewnątrzkomórkowy roztwór Dzwonka dla elektrody referencyjnej</td><td>Chemikalia z Fisher Scientific</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sacharoza</td><td>Zobacz przepis w sekcji protokołu</td></tr><tr><td>3 M Roztwór KCl do wypełnienia włóknistej mikroelektrody rejestrującej</td><td>Sole z Fisher Scientific</td><td>10010310, KCl</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Vaselin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td></td><td></td><td></td>ze stali nierdzewnej</tr><tr><td>Uchwyt/wyłącznik ostrza</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>Blu-tack</td><td>Bostik</td><td></td><td>Alternatywnie użyj kleszczy do formowania</td></tr><tr><td></td><td>gliny Narzędzia do nauki o nauce Przez Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (bardzo cienkie końcówki)</td></tr></tbody></table>

elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów drosophila na bodźce świetlne in vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Odpowiedzi napięciowe fotoreceptorów owadów i interneuronów wzrokowych mogą być dokładnie rejestrowane za pomocą konwencjonalnych ostrych mikroelektrod. Opisana tutaj metoda umożliwia badaczowi pomiar długotrwałych (od minut do godzin) wysokiej jakości odpowiedzi wewnątrzkomórkowych z pojedynczych fotoreceptorów Drosophila R1-R6 i dużych komórek monopolarnych (LMC) na bodźce świetlne. Ponieważ system rejestracji charakteryzuje się niskim poziomem szumów, może być używany do badania zmienności między poszczególnymi komórkami w oku muchy oraz tego, jak ich wyniki odzwierciedlają fizyczne właściwości środowiska wizualnego. Przedstawiamy wszystkie kluczowe kroki w wykonywaniu tej techniki. Opisano podstawowe etapy konstruowania odpowiedniego zestawu elektrofizjologicznego do rejestracji, takie jak projektowanie i dobór aparatury doświadczalnej. Wyjaśniamy również, jak przygotować się do nagrania, wykonując odpowiednie (ostre) elektrody rejestrujące i () elektrody referencyjne. Podano szczegółowe informacje na temat tego, jak zamocować nienaruszoną muchę w specjalnie zaprojektowanym uchwycie na muchy, przygotować małe okienko w jej oku i włożyć elektrodę rejestrującą przez ten otwór przy minimalnych uszkodzeniach. Wyjaśniamy, jak zlokalizować środek pola recepcyjnego komórki, dostosować badaną komórkę do ciemności lub światła oraz rejestrować jej reakcje napięciowe na dynamiczne bodźce świetlne. Na koniec opisujemy kryteria stabilnych normalnych zapisów, pokazujemy charakterystyczne wysokiej jakości odpowiedzi napięciowe poszczególnych komórek na różne bodźce świetlne i pokrótce określamy, jak określić ilościowo ich wydajność sygnalizacyjną. Wiele aspektów tej metody jest technicznie trudnych i wymaga praktyki i cierpliwości do opanowania. Jednak po poznaniu i zoptymalizowaniu pod kątem celów eksperymentalnych badacza, zapewnia znakomite dane neurofizjologiczne in vivo.

Metoda rejestracji za pomocą ostrych mikroelektrod, zaadaptowana tutaj dla oka Drosophila, może być wykorzystana do niezawodnego ilościowego określenia pobierania i przetwarzania informacji neuronalnych w komórkach siatkówki i lamina oraz komunikacji między nimi4,5,7,8,10,33. Dzięki zastosowaniu tej metody do badania kodowania w różnych szczepach typu dzikiego, mutantach lub genetycznie zmodyfikowanych liniach much, udowodniono jej wartość; nie tylko w ilościowym określaniu efektów mutacji, temperatury, diety lub selektywnej ekspresji3,4,6,9,10,14,30,34, ale także w ujawnianiu mechanistycznych przyczyn zmienionych zachowań wzrokowych14,34. Metoda ta jest również łatwo stosowalna w przypadku innych preparatów owadziego układu nerwowego35,36, co usprawnia neuroetologiczne badania nad wzrokiem. Poniżej przedstawiamy kilka przykładów jej udanego zastosowania.
<img alt="Schemat odpowiedzi napięciowej fotoreceptora; układ rejestracji wewnątrzkomórkowej; wpływ temperatury na potencjał." src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 muszki owocowej na impuls światła w temperaturze 20 i 25 oC. Ponieważ penetracje ostrymi mikroelektrodami są często bardzo stabilne, możliwe jest rejestrowanie odpowiedzi napięciowych tego samego fotoreceptora R1-R6 na dany bodziec świetlny w różnych temperaturach otoczenia poprzez ogrzewanie lub chłodzenie muszki. W naszych układach uchwyt do muszki jest umieszczony na systemie kontroli temperatury opartym na elemencie Peltiera z zamkniętą pętlą sprzężenia. Pozwala nam to na zmianę temperatury głowy muszki w ciągu kilku sekund. Wyższa temperatura przyspiesza odpowiedzi napięciowe i charakterystycznie obniża potencjał spoczynkowy fotoreceptorów R1-R6 (wskazane czerwonymi strzałkami). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Badanie wpływu temperatury na sygnał wyjściowy fotoreceptorów
Przy zastosowaniu odpowiednio zaprojektowanego systemu rejestracji z izolacją od wibracji, metodę tę można wykorzystać do pomiaru wpływu temperatury na sygnał neuronowy pojedynczej komórki poprzez ogrzewanie lub chłodzenie muchy. Przedstawiony przykład ukazuje odpowiedzi napięciowe na jasny impuls o długości 10 msec, zarejestrowane w tym samym fotoreceptorze R1-R6 w temperaturach 20 i 25 oC (Rycina 7). Jak określono wcześniej4,9, ogrzewanie obniża potencjał spoczynkowy fotoreceptora w ciemności i przyspiesza jego odpowiedzi napięciowe.
<img alt="Rejestracja napięcia fotoreceptora Drosophila, wykres adaptacji sygnału i stosunku szumu dla bodźców świetlnych." src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Wydajność sygnalizacji fotoreceptora R1-R6 muszki owocowej poprawia się wraz z intensywnością światła. (A) Wyjście fotoreceptora dla słabego (poniżej) i silnego (powyżej; światło 10 000 razy jaśniejsze) powtarzających się serii czasowych naturalnej intensywności światła, zarejestrowanych tą samą mikroelektrodą w tej samej komórce w temperaturze 20 oC. Reakcje na silny bodziec są większe, ponieważ integrują więcej próbek, czyli elementarnych odpowiedzi (wyboczeń) na pojedyncze fotony4,5,7,8. (B) Nałożono na siebie 20 kolejnych jednosekundowych odpowiedzi napięciowych. Pojedyncze odpowiedzi (jasnoszare) pobrano po ustąpieniu trendów adaptacyjnych (strzałka w A) (ramka kropkowana w A). Odpowiadające im średnie odpowiedzi (sygnały) to ciemniejsze ślady. Różnica między sygnałem a pojedynczymi odpowiedziami stanowi szum. (C) Wydajność sygnalizacji komórek została ilościowo określona za pomocą stosunku sygnału do szumu (SNR) pomiarów, stosując standardowe metody4,5,7,8. Wyjście fotoreceptora ma zakres niezawodnej sygnalizacji szerszy o około 64 Hz przy silnej stymulacji (SNR'Bright  ≥1, do 84 Hz) niż przy słabej (SNR'Dim  ≥1, do 20 Hz), przy czym stosunek sygnału do szumu znacząco się poprawia: od SNRDimMAX = 87 do SNRBrightMAX = 1 868. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Badanie adaptacji i kodowania neuronalnego za pomocą stymulacji powtarzalnej
Nieinwazyjność tej metody, powodującej stosunkowo niewielkie uszkodzenia struktur siatkówki i lamina, sprawia, że jest ona idealna do badania wydajności sygnalizacji poszczególnych komórek w odpowiedzi na różne bodźce świetlne w ich niemal naturalnym stanie fizjologicznym in vivo. Rysunek 8 przedstawia odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 na powtarzającą się serię czasową naturalnej intensywności światła o niskim i wysokim natężeniu w temperaturze 20 oC, natomiast Rysunek 9 pokazuje odpowiedzi innego fotoreceptora R1-R6 oraz komórki LMC na inny bodziec naturalistyczny w temperaturze 25 oC. Rejestracje presynaptyczne i postsynaptyczne przeprowadzono oddzielnie u dwóch różnych much, ponieważ jednoczesne rejestracje wewnątrzkomórkowe za pomocą dwóch ostrych mikroelektrod u jednej muchy – jednej w siatkówce, a drugiej w lamina – są zbyt trudne, aby były wykonalne30.
<img alt="Schemat analizy odpowiedzi napięciowej wewnątrzkomórkowej; stymulacja światłem; stosunek sygnału do szumu u Drosophila." src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 oraz LMC muchy owocówki na powtarzalną stymulację naturalistyczną w 25 oC. (A) Wyjścia R1-R6 (szare) i LMC (czarne) zarejestrowane za pomocą różnych mikroelektrod u różnych much. (B) W pełni zaadaptowane do światła, 20 kolejnych odpowiedzi presynaptycznych (powyżej) i postsynaptycznych (poniżej) na ten sam naturalistyczny wzór bodźca, gdzie poszczególne odpowiedzi przedstawiono w jasnoszarym kolorze, a odpowiadające im wartości średnie odpowiedzi (sygnały) jako ciemniejsze linie. Różnica między sygnałem a poszczególnymi odpowiedziami to szum. (C) Wydajność sygnalizacji komórek została ilościowo określona za pomocą stosunków sygnału do szumu (SNR) z zapisów. Wyjście LMC ma o około 10 Hz szerszy zakres niezawodnej sygnalizacji (SNR'LMC  ≥1, do 104 Hz) niż wyjście R1-R6 (SNR'R  ≥1, do 94 Hz). Oba stosunki sygnału do szumu są wysokie (SNRLMCMAX = 142, SNRRMAX = 752), a ponieważ szum rejestracji był niski, różnice te odzwierciedlają rzeczywiste różnice w kodowaniu między komórkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Po wystąpieniu bodźca w rejestracjach zazwyczaj obserwuje się trendy szybkiej adaptacji, które w dużej mierze ustępują w ciągu 5–6 s. Od tego momentu komórki generują wysoce spójne odpowiedzi na każdą prezentację bodźca trwającą 1 s (każda przerywana ramka obejmuje 20 takich odpowiedzi). Powtarzalność odpowiedzi staje się oczywista po ich nałożeniu na siebie (Rysunek 8B i Rycina 9B). Poszczególne odpowiedzi przedstawiają cienkie szare ślady, a ich średnia – grubszy, ciemniejszy ślad. Średnią odpowiedź przyjmuje się za sygnał neuronalny, podczas gdy szum neuronalny jest różnicą między średnią a każdą poszczególną odpowiedzią4,5,9,37,38Odpowiednie stosunki sygnału do szumu w dziedzinie częstotliwości (Rycina 8C i Rycina 9C) uzyskano poprzez przekształcenie Fouriera fragmentów danych sygnału i szumu w widma mocy, a następnie podzielenie średniego widma mocy sygnału przez odpowiadające mu średnie widmo mocy szumu4,5,9,37,38Charakterystyczne jest to, że maksymalne stosunki sygnału do szumu rejestrowanych odpowiedzi neuronalnych na stymulację naturalistyczną są wysokie (100–1 000) i w najbardziej stabilnych preparatach z bardzo niskim szumem rejestracji mogą osiągać wartości &gt;&gt;1,000 (np.., Rycina 8C). Zauważmy również, że ocieplenie rozszerza zakres pasma niezawodnego przesyłania sygnałów przez komórki4 (SNRJasny≥ 1); na przykład różnica względna między dwoma wartościami R1-R6 w Rycina 8 oraz 9odpowiednio, wynosi 10 Hz (84 przy 20 oC i 94 Hz przy 25 oC).
Szybkość transferu informacji dla każdej komórki można dodatkowo oszacować na podstawie stosunku sygnału do szumu, korzystając z równania Shannona32, lub poprzez obliczenie różnicy między entropią odpowiedzi a szybkością entropii szumu za pomocą metody potrójnej ekstrapolacji39. Więcej szczegółów dotyczących analiz teorii informacji oraz ich zastosowania i ograniczeń w odniesieniu konkretnie do tej metody przedstawiono w poprzednich publikacjach7,8,39.
<img alt="Rejestracja wewnątrzkomórkowej odpowiedzi napięciowej; nałożone na siebie odpowiedzi i wykres wydajności sygnalizacji." src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10. Odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 oraz LMC muchy z rodzaju Killer Fly na powtarzającą się stymulację naturalistyczną w temperaturze 19 oC. (A) Sygnały wyjściowe R1-R6 (szary) i LMC (czarny) zarejestrowane tą samą mikroelektrodą z tej samej muchy; najpierw postsynaptycznie, a później presynaptycznie, w miarę wprowadzania elektrody w głąb oka. (B) 20 kolejnych odpowiedzi presynaptycznych (powyżej) i postsynaptycznych (poniżej) (jasnoszare ślady) na ten sam naturalistyczny wzorzec bodźca, zarejestrowanych po wstępnej adaptacji (punktowana ramka w A). Ich średnie stanowią sygnały (ciemniejsze ślady na górze), natomiast różnice między nimi a poszczególnymi odpowiedziami określają szum. (C) Odpowiednie stosunki sygnału do szumu (SNR) obliczono analogicznie jak na Rysunkach 8C i 9C. Sygnał wyjściowy LMC ma o około 100 Hz szerszy zakres niezawodnej sygnalizacji (SNR'LMCMAX ≥1, do 234 Hz) niż sygnał wyjściowy R1-R6 (SNR'RMAX  ≥1, do 134 Hz). Oba stosunki sygnału do szumu są wysokie (SNRLMCMAX = 137, SNRRMAX = 627), a ponieważ do pomiarów użyto tej samej mikroelektrody, różnice te odzwierciedlają rzeczywiste różnice w presynaptycznych i postsynaptycznych sygnałach wyjściowych neuronów. Wyniki te wskazują, że system rejestracji charakteryzował się niskim poziomem szumu, a jego wpływ na analizy był marginalny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Badania neuroetologiczne nad wzrokiem
Metodę tę można również wykorzystać do rejestracji odpowiedzi napięciowych presynaptycznych i postsynaptycznych z oczu złożonych różnych gatunków owadów7,8,35,36 (Rysunek 10), co umożliwia porównawcze badania neuroetologiczne przetwarzania informacji wizualnych. W przypadku przedstawionego systemu rejestracyjnego jedyną wymaganą adaptacją są nowe uchwyty do preparatów, z których każdy posiada otwór o odpowiedniej wielkości dla badanego gatunku. Te przykładowe pomiary wykonano u samicy muchy drapieżnej (Coenosia attenuata). Przedstawiają one wewnątrzkomórkowe odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 oraz LMC na identyczną, powtarzalną stymulację świetlną, taką samą, jak w przypadku odpowiedników u Drosophila na Rysunku 9, ale w temperaturze 19 oC. W tym przypadku zarówno dane presynaptyczne, jak i postsynaptyczne zarejestrowano od tej samej muchy; jedno po drugim, przy użyciu tej samej elektrody rejestrującej (wypełnionej 3 M KCl), która najpierw przechodziła przez boczna lamina, a następnie wnikała do przedniej siatkówki. W porównaniu z danymi dla Drosophila w 25 oC, dane dla Coenosia — nawet w niższej temperaturze — wykazują odpowiedzi o szybszej dynamice, co rozszerza zakres niezawodnego przesyłania sygnałów (stosunek sygnału do szumu &gt;&gt;1) w szerszym zakresie częstotliwości. Takie funkcjonalne adaptacje w neuronalnym kodowaniu naturalnych bodźców są zgodne z drapieżnym trybem życia Coenosia36, który wymaga precyzyjnych informacji czasowo-przestrzennych w celu realizacji szybkich zachowań łowieckich w powietrzu.

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja wewnątrzkomórkowych odpowiedzi elektrycznych fotoreceptorów Drosophila i interneuronów wzrokowych na kontrolowane bodźce świetlne. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurokodowania, takie jak to, w jaki sposób bodźce świetlne kodują je w jednej z jego odpowiedzi lub w jaki sposób informacje wizualne oraz fotoreceptory i interneurony wyodrębniają się z bodźców świetlnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia długotrwałe, wysokiej jakości nagrania z badania przy niewielkim uszkodzeniu środowiska wewnątrzkomórkowego i próbkowaniu informacji.Cecha demonstracji, że może to mieć wpływ, jest krytyczna, ponieważ trudno jest nauczyć się poprawnie wykonywać różne kroki, nie widząc ich. Wyciągnij mikroelektrodę referencyjną z włókna borokrzemianowego lub z rurki ze szkła kwarcowego za pomocą standardowego ściągacza do pipet. Staraj się uzyskać krótkie, stopniowe zwężanie się.Dokładne ustawienia różnią się w zależności od instrumentu. Wielkość porów na końcówce nie jest kluczowa, ponieważ zostanie ona złamana na potrzeby eksperymentów. Następnie wyciągnij elektrodę nagrywającą z tej samej szklanej rurki i spróbuj uzyskać drobny stopniowy stożek o długości od 10 do 15 milimetrów.W mikroskopie świetlnym zamontuj elektrodę na szklanej stronie za pomocą wielu klejów i użyj obiektywu pneumatycznego 40x, aby sprawdzić jej końcówkę. Dobra elektroda zwęża się płynnie do niewidocznie małej końcówki, wokół której można zobaczyć ciągłe, równoległe, ciemniejsze i jaśniejsze wzory interferencyjne. Tuż przed eksperymentem wypełnij elektrodę referencyjną dzwonkami muchowymi, używając pięciomililitrowej strzykawki podłączonej do filtra cząstek stałych, z cienką plastikową końcówką.W przypadku eksperymentów z fotoreceptorami należy obciążyć elektrodę rejestrującą 3 molowym chlorkiem potasu, aż na jej dużym końcu utworzy się kropla. Zminimalizuje to szumy ze złącza cieczy podczas nagrywania. Aby pracować z histaminergicznymi LMC, wypełnij elektrody rejestrujące 3 molowym octanem potasu, 0,5 milimolowym chlorkiem potasu, aby zminimalizować wpływ na baterię chlorków ogniwa.Zacznij od załadowania świeżej fiolki muchowej z pięcioma do 10 jednodniowymi muchami. Młodsze muchy są bardziej kruche, ale można je rejestrować. Wybierz pierwszą muchę do elektrofizjologii.Z dużymi samicami najłatwiej się pracuje. Znajdując się w rurce wychwytującej, wykorzystaj ich wrodzoną tendencję do wspinania się w górę do końcówki pipety i zakręcania mniejszej końcówki. Następnie podłącz 100-mililitrową strzykawkę z elastycznym plastikowym wężem do końcówki pipety, która jest powiększona tylko po to, aby przepuścić Drosophila i podłącz drugi koniec do dużej końcówki pipety przymocowanej do uchwytu na muchy.Następnie wyciśnij niewielką objętość powietrza ze strzykawki, aby wyrzucić muchę do uchwytu na muchy. Spójrz przez mikroskop stereoskopowy i delikatnie podawaj więcej powietrza, aż głowa muchy będzie wystawać ze stożkowego końca uchwytu na muchy. Upewnij się, że mucha jest mocno uwięziona w klatce piersiowej.Następnie zabezpiecz muchę woskiem pszczelim. Użyj najniższej temperatury podgrzewacza do wosku, aby czysto stopić wosk, który będzie wyglądał na przezroczysty. Jeśli jest zbyt gorący, wosk się wypali.Unieruchom głowę muchy, nakładając niewielką ilość wosku pszczelego na trąbkę i kącik prawego oka, omijając rogówkę. Przymocuj te dwa punkty do uchwytu na muchy. Zakończ ten krok szybko, aby uniknąć poparzenia muchy.Następnie załóż gogle i wyprodukuj mikronóż. Zaciśnij żyletkę ze stali nierdzewnej z dwoma płaskimi uchwytami ostrza i rozbij mały pasek jej ostrej krawędzi. Najlepiej wyprodukować ostrą jak brzytwa krawędź, która przypomina iglicę.Teraz, ostrożnie i z wielką dbałością o szczegóły, użyj mikronoża, aby otworzyć kilka ommatidia lewego oka muchy, na przykład na cztery do pięciu ommatidia od naskórka grzbietowego tuż nad równikiem oka. Zapewni to przejście dla mikroelektrody rejestrującej. Jest to dość trudne, wymaga dobrze wykonanego noża i trzeba się tego nauczyć wraz z praktyką.Następnie delikatnie wyjmij mały kawałek rogówki z otworu, odsłaniając siatkówkę pod spodem. Teraz używając cienkich włosków aplikatora wazeliny, szybko przykryj otwór maleńką kroplą wazeliny. Galaretka ma dodatkową zaletę polegającą na zmniejszeniu pojemności wewnętrznej pipety.Unikaj rozmazywania oka, ponieważ powoduje to rozmywanie optyki. Podczas obsługi mikroelektrody amplifier, zawsze bądź uziemiony, dotykając metalowej powierzchni klatki Faradaya lub stołu antywibracyjnego, aby zapobiec ładunkom elektrostatycznym. Przymocuj zamontowaną muchę do słupa platformy do przygotowania much.Obróć uchwyt na muchy tak, aby lewe oko muchy było skierowane bezpośrednio w stronę badacza. Następnie użyj małego mikromanipulatora, aby delikatnie wprowadzić elektrodę referencyjną przez oczka muchy do torebki głowy. Upewnij się, że mucha nadal wydaje się zdrowa i porusza czułkami.Przygotowanie musi być doskonałe, aby zasługiwało na nagranie. Teraz wbij ostrą mikroelektrodę rejestrującą do lewego oka przez otwór pokryty galaretką. Gdy wnika do tkanki, położenie końcówki elektrody powinno być widoczne dzięki jej wzorowi odbicia.Delikatna końcówka elektrody musi być idealnie prowadzona, w przeciwnym razie pęknie, co jest bardzo trudne. W zależności od typu komórki, z której odbywa się nagranie, głowa muchy powinna być zorientowana nieco inaczej. Po umieszczeniu elektrod na miejscu włącz wzmacniacz mikroelektrodowy.Następnie wyłącz zimne źródło światła, odłącz je od sieci i podłącz do centralnego uziemienia, aby zminimalizować szumy elektryczne wywołane pętlą uziemienia. Następnie wyreguluj światłowody na gęsiej szyi, aby system ramienia Carden mógł być swobodnie przesuwany wokół rozporka. Następnie wyłącz światła w pomieszczeniu, aby umieścić preparat na muchy we względnej ciemności.Teraz zmierz rezystancję elektrody rejestrującej w oku. Musi wynosić od 100 do 260 megaomów. Czasami końcówka jest zablokowana i można ją usunąć za pomocą pojemnościowych funkcji brzęczenia i impulsu prądowego wzmacniacza.Jeśli to nie pomoże, użyj nowej elektrody. Następnie ustaw wzmacniacz na cęgi prądowe lub mostek i wyzeruj napięcie między elektrodami. Po tym, jak mucha zostanie przystosowana do ciemności przez kilka minut, wbij końcówkę elektrody rejestrującej w oko w krokach co 0,1 do jednego mikrona za pomocą steppera piezoelektrycznego lub delikatnie obracając pokrętłem precyzyjnej rozdzielczości.Na każdym kroku stymuluj oko błyskiem światła o długości od jednej do 10 milisekund. Każdy błysk światła spowoduje krótki spadek napięcia lub ERG. Gdy końcówka elektrody wchodzi w blaszkę, zamykając się na LMC, ERG odwraca się.Następnie przystąp do wykonywania pomiarów. Ze względu na nieinwazyjność, wydajność sygnałową poszczególnych komórek można badać w ich stanie zbliżonym do naturalnego. Odpowiedź napięciowa fotoreceptora R1-R6 na przyćmione i jasne światło mierzono w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Następnie fotoreceptor R1-R6 porównano z LMC w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Każdy z nich został zmierzony na innej muchy, ponieważ wewnątrzkomórkowe zapisy za pomocą dwóch ostrych mikroelektrod w tej samej muszce są zbyt trudne, aby były żywotne. Powtarzalność odpowiedzi staje się oczywista, gdy nałożymy na siebie dane.Stosunek sygnału do szumu w dziedzinie częstotliwości uzyskano w ciągu czterech lat, przekształcając fragmenty danych o sygnale i szumie w widmo mocy, a następnie dzieląc średnie widmo mocy sygnału przez odpowiednie średnie widmo mocy szumu. Wynik może być niezwykle wrażliwy na sygnały w najlepszych preparatach. Technika ta może być używana do nagrywania wielu gatunków.Muchy Coenocia były poddawane tej samej naturalistycznej, powtarzalnej stymulacji świetlnej w temperaturze 19 stopni Celsjusza. Dane zostały pobrane przed i po synaptycznym pobraniu od tej samej muchy poprzez przesuwanie elektrody rejestrującej. Szybsza dynamika nagrania jest spójna z drapieżnym charakterem tego gatunku.Po opanowaniu technika ta umożliwia uzyskanie zawsze długich, wysokiej jakości nagrań, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że to jak nauka gry na pianinie. Im więcej ćwiczysz, tym lepsze wyniki uzyskasz.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak interwencje farmakologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak rola neuromodulatorów w kształtowaniu odpowiedzi. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiofizyki do zbadania sposobów optymalizacji informacji o świetle, wychwytywania i transferu, a także reakcji biochemicznych w maszynerii fototransdukcji i w następujących naukach biologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować Drosophila do eksperymentów wewnątrzkomórkowych i jak obudzić odpowiedzi neurologiczne z jej fotoreceptorów i interneuronów.

electrophysiological-method-for-recording-intracellular-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Ten film przedstawia protokół elektrofizjologicznego zapisu aktywności fotoreceptorów w oku unieruchomionej Drosophila, umożliwiając precyzyjny pomiar zmian napięcia w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Elektrofizjologiczny zapis napięciowych odpowiedzi fotoreceptorów siatkówki Drosophila na bodźce świetlne

Film demonstruje rejestrowanie aktywności elektrycznej w neuronach fotoreceptorowych ommatidium Drosophila poprzez ustanowienie konfiguracji całej komórki. Podkreśla on aktywację przejściowych kanałów potencjału receptora przez impulsy świetlne, co skutkuje mierzalnymi wstrząsami kwantowymi.

Zapisy cęgów napięcia całej komórki z fotoreceptorów Drosophila

Elektrofizjologiczna technika zapisu wewnątrzkomórkowego jest demonstrowana i używana do określania wrażliwości spektralnej pojedynczych komórek fotoreceptorowych w złożonym oku motyla.

Wyznaczanie czułości spektralnej komórek fotoreceptorowych w modelu owadów na podstawie nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Opracowaliśmy dwie metody badania wpływu bodźców wzrokowych na zachowanie w warunkach braku bodźców dotykowych i chemicznych. Pierwsza metoda polega na filmowaniu reakcji raków na odbijające światło ścianki akwarium; druga bada wpływ bodźców wzrokowych dostarczanych przez żywego raka znajdującego się za przezroczystą przegrodą.

Rejestracja reakcji behawioralnych na odbicie u raków

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Poznaj elektrofizjologiczną metodę rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne. Technika zapewnia wysokiej jakości pomiary przy minimalnym uszkodzeniu komórek.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Przeglądaj więcej filmów