Elektrofizjologiczne metody rejestracji potencjałów synaptycznych z NMJ larw Drosophila
February 6th, 2009
Tutaj opisujemy elektrofizjologiczne metody pomiaru transmisji synaptycznej w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwolnienie wywołane jest inicjowane sztucznie przez stymulację aksonów neuronu ruchowego, a transmisję przez NMJ można zmierzyć za pomocą odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.
Do tworzenia stabilnych zapisów elektrofizjologicznych z połączeń nerwowo-mięśniowych larw Joofa. Najpierw wypreparuj larwę, aby odsłonić ścianę ciała, mięśnie i układ nerwowy przed nagraniem. Aksony u podstawy OUN są przecięte z tyłu zwoju brzusznego.
Następnie elektroda rejestrująca jest umieszczana na interesującym nas mięśniu, a elektroda stymulująca jest umieszczana w pobliżu unerwiających neuronów ruchowych. Odcięte aksony neuronów ruchowych są zasysane do pipety stymulującej. Następnie można rejestrować pobudzające potencjały połączeniowe.
Cześć, nazywam się Wendy MLA i pracuję w McCabe Lab na Wydziale Fizjologii i Biofizyki Komórkowej Uniwersytetu Columbia. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę pomiaru przekaźnictwa tików w połączeniu nerwowo-mięśniowym lawy GE. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania fizjologii synaptycznej i przekaźnictwa nerwowego.
Więc zacznijmy. Aby rozpocząć eksperyment, należy przeanalizować wędrujące larwy trzecie i gwiaździste, aby odsłonić ścianę ciała. Protokół ten jest modyfikowany do eksperymentów elektrofizjologicznych przy użyciu krótkich szpilek preparacyjnych.
Mają one około dwóch do czterech milimetrów długości i są mniej podatne na uderzenie w obiektyw mikroskopu w elektrodach podczas eksperymentu. Po odsłonięciu ściany ciała użyj kleszczy, aby przytrzymać OUN i lekko go podnieść. Następnie przetnij aksony motoryczne nerwów obwodowych i usuń mózg.
Po usunięciu mózgu przemyć wypreparowany preparat dwukrotnie buforem HL 3.1 z jednym milimolowym wapniem. Teraz, gdy sekcja jest zakończona, można wykonać zapisy wewnątrzkomórkowe z larwalnych komórek mięśniowych. Umieścić płytkę separacyjną na mikroskopie elektrofizjologicznym i zanurzyć preparat w buforze HL 3.1 plus wapń.
Następnie zamocuj elektrodę do kąpieli tak, aby stykała się z roztworem. Elektroda ssąca służy do stymulacji nerwów obwodowych, które unerwiają mięsień. Najpierw umieść elektrodę ssącą w naczyniu, aby uniknąć wibracji, gdy elektroda wewnątrzkomórkowa jest umieszczona na mięśniu.
Gdy elektroda znajdzie się w naczyniu, umieść ją blisko neuronu ruchowego, który unerwia mięsień szósty. W trzecim segmencie brzusznym zastosuj delikatne ssanie, aż przecięty nerw znajdzie się wewnątrz szklanej pipety. Uważaj, aby nie rozciągać nerwów podczas ssania.
Lekko podnieś pipetę, aby nie dotykała mięśnia. A następnie ustaw go tak, aby nie ciągnął za przecięte włókna nerwowe. Gdy elektroda ssąca znajdzie się na miejscu, ustaw elektrodę rejestrującą dla nagrań wewnątrzkomórkowych.
Użyj ostrej mikroelektrody wypełnionej trzema molowymi chlorkami potasu. Umieść elektrodę rejestrującą powyżej środka mięśnia szóstego. Dostosuj przesunięcie wejściowe tak, aby wskazywało zero dla roztworu do kąpieli.
Powoli opuść elektrodę i zbliż się do mięśnia pod dużym powiększeniem optycznym, aż dotknie powierzchni mięśnia. Aby potwierdzić, że mięsień został przeniknięty, obserwuj oscyloskop. Spoczynkowy potencjał błony powinien wynosić co najmniej minus 60 miliwoltów.
Sporadyczny potencjał miniaturowych płytek powinien być teraz widoczny. Gdy elektroda rejestrująca znajdzie się na miejscu, pozwól ogniwom ustabilizować się przez jedną minutę. Przed rozpoczęciem nagrań należy użyć aksonu HS dwa, stopnia czołowego w zacisku osiowym dwa wzmacniacza B, aby wykryć zmiany potencjału membrany.
Zacisk osi dwa B jest interfejsem do komputera, który uruchamia oprogramowanie zacisku P przez dane cyfrowe. 1322 A, który digitalizuje sygnał. Zapisz potencjał membrany na komputerze. Za pomocą oprogramowania clamp X zastosuj bodźce do aksonu motorycznego, aby wygenerować pobudzające potencjały błonowe lub ejs.
Po wygenerowaniu ejs nagrywaj miniaturowe ejs przez okres trzech minut bez synapsy bodźców. Oprogramowanie do miękkiej mini analizy może być używane do analizy ścieżek i określania amplitudy i częstotliwości mini EJP. Aby wygenerować ejs.
Użyj głównego generatora ośmiu impulsów, aby stymulować do odciętego końca programu neuronu ruchowego. Generator dostarczający program impulsów napięcia kwadratowego o długości 0,3 milisekundy. Pięciosekundowy odstęp czasu między bodźcami, aby umożliwić regenerację synapsów.
W NMJ rejestruje co najmniej 10 potencjałów wywołanych z każdego mięśnia i uśrednia amplitudy. Ten rysunek pokazuje typowy ślad zarejestrowany z mięśnia szóstego larwy sal typu dzikiego z wywołanymi reakcjami EJP i spontanicznymi mini EJ.PS Właśnie pokazaliśmy, jak rejestrować potencjały cy z połączenia nerwowo-mięśniowego lawy drosophila. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby zakończyć sekcję w ciągu trzech do 10 minut i rozpocząć zapisy elektrofizjologiczne natychmiast, gdy komórki są jeszcze zdrowe i reagują.
Jeśli rozwarstwienie trwa zbyt długo, spoczynkowy potencjał błonowy komórek mięśniowych będzie mniejszy niż minus 60 miliwoltów, co jest zbyt niskie, aby je zarejestrować. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metody elektrofizjologiczne do pomiaru transmisji synaptycznej w złączu neuromiotycznym (NMJ) larw Drosophila. Proces obejmuje sekcję larw w celu ekspozycji ściany ciała i układu nerwowego, po czym umieszczenie elektrod rejestrujących i stymulujących w celu zmierzenia potencjałów złącza wzbudzających.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Elektrofizjologia
- Neuronauki
- Transmisja synaptyczna
Tło
- Zrozumienie transmisji synaptycznej jest kluczowe dla wnikliwych informacji na temat komunikacji neuronowej.
- Larwy Drosophila służą jako organizm modelowy do badania NMJ.
- Techniki elektrofizjologiczne pozwalają na precyzyjne pomiary aktywności synaptycznej.
- Wzbudzone uwalnianie w złączu neuromiotycznym można sztucznie stymulować w celu analizy.
Cel badania
- Aby zademonstrować metody rejestracji transmisji synaptycznej w złączu neuromiotycznym.
- Aby zapewnić protokół dla badaczy zainteresowanych badaniami elektrofizjologicznymi.
- Aby zwiększyć zrozumienie mechanizmów sygnalizacji neuromiotycznej.
Zastosowanie metod
- Sekcja larw Drosophila w celu ekspozycji mięśni i układu nerwowego.
- Umieszczenie elektrod rejestrujących na mięśniu o zainteresowaniu.
- Użycie elektrod stymulujących w pobliżu neuronów ruchowych.
- Rejestrowanie potencjałów złącza wzbudzających po stymulacji.
Główne wyniki
- Sukces w pomiarze transmisji synaptycznej w złączu neuromiotycznym.
- Demonstracja wzbudzonych potencjałów złącza wzbudzających.
- Walidacja podejścia elektrofizjologicznego do badania NMJ.
- Wgląd w dynamikę sygnalizacji synaptycznej u Drosophila.
Wnioski
- Opisane metody zapewniają niezawodne podejście do badania transmisji NMJ.
- Rejestracji elektrofizjologiczne mogą ujawnić ważne aspekty funkcji synaptycznej.
- To badanie przyczynia się do szerszej wiedzy na temat interakcji neuromiotycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Electrophysiological recording at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ) provides a genetically tractable, quantitative platform for interrogating synaptic function and neurotransmission. This model enables high-confidence target validation and mechanistic de-risking in early discovery, supporting predictive assessment of synaptic modulation and genetic perturbations. The approach is directly relevant for portfolio teams seeking robust, reproducible systems for neurobiology-driven drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of synaptic transmission and quantal content for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating genetic or pharmacological effects on neurotransmission.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of synaptic pathways in a defined, manipulable system.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible assay for quantifying excitatory junction potentials (EJPs) and miniature EJPs (mEJPs).
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across genetic backgrounds or compound treatments.
- Enables preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant synaptic mechanisms for translational continuity in neurobiology programs.
- Supports risk-adjusted advancement by providing predictive data on synaptic function and modulation.
- Offers a bridge from genetic discovery to preclinical validation in neuromuscular and synaptic disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This electrophysiological method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, enabling iterative hypothesis testing and mechanistic evaluation.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification by quantifying synaptic responses to defined manipulations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of EJP amplitude and frequency for robust assay development.
- Analytics: Provides digitized, statistically analyzable data for cross-condition and cross-genotype comparisons.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant synaptic endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, genetically flexible platform for ongoing neurobiology and synaptic function studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic target validation.
- Operational Value: Standardizes electrophysiological workflows for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage based on quantitative synaptic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology-focused assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology and Drosophila genetics for optimal execution.
- Demands specialized instrumentation, including microelectrodes, amplifiers, and digitization hardware.
- Necessitates cross-team standardization of dissection and recording protocols for reproducibility.
- Adaptable to various genetic backgrounds and experimental manipulations within the Drosophila system.
- Limited to model organism context; translational extrapolation requires careful validation.
