Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro
16 lipca 2016
Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.
Ogólnym celem tej platformy przesiewowej do badań przesiewowych replikacji komórek beta o wysokiej zawartości jest ułatwienie badania szlaków molekularnych, które ograniczają wzrost komórek beta. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na ważne pytania w dziedzinie biologii komórek beta. Takich jak jedna z kluczowych cząsteczek sygnałowych i szlaków, które kontrolują regenerację komórek beta.
Głównymi zaletami tej techniki jest to, że umożliwia ona zwiększenie przepustowości wyściółki komórkowej do określonej oceny oraz zautomatyzowaną analizę danych pierwotnej replikacji komórek wysp trzustkowych. Zastosowanie tej techniki ma potencjał, aby rozszerzyć się w kierunku rozwoju terapii regeneracyjnej cukrzycy. Jest to choroba, która wiąże się z poważnymi kosztami zdrowotnymi i ekonomicznymi dla naszego społeczeństwa.
Zacznij od użycia roztworu trawiennego dla trzustki załadowanej 10-mililitrową strzykawką wyposażoną w igłę o rozmiarze 22, aby naśladować wspólny przewód żółciowy na lub tylko dystalnie do połączenia torbielowatych i wspólnych przewodów wątrobowych. Podpierając wspólny przewód żółciowy uchwytem skalple, powoli wstrzyknij 10 mililitrów roztworu. Po podaniu całej kolagenazy użyj zakrzywionych kleszczy i nożyczek, aby oddzielić napompowaną trzustkę od zstępującej okrężnicy, jelit, żołądka i wypustu.
Następnie umieść do dwóch trzustek w 50-mililitrowej probówce na lodzie zawierającej pięć mililitrów roztworu do trawienia trzustki. Po zebraniu całej trzustki umieść rurki wytrawiające w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut, delikatnie obracając co trzy minuty. Pod koniec trawienia energicznie potrząśnij rurkami pionowo 10 razy.
I dodaj 10 mililitrów do mycia na zimno do próbek. Energicznie potrząśnij probówkami jeszcze pięć razy i umieść je na lodzie. Następnie napełnij probówki do końcowej objętości 50 mililitrów buforem do mycia na zimno i odwróć probówki pięć razy.
Następnie odwiruj chusteczki i odlej supernatanty, uważając, aby nie usunąć granulek. Ponownie zawiesić zawiesinę tkanek w 25 mililitrach buforu do mycia, a następnie delikatnie wirować. Powtórz kroki wirowania i ponownego zawieszenia jeszcze dwa razy.
Zawiesiny tkanek przelać przez sito do tkanek o oczkach 30 do sterylnej zlewki o pojemności 250 mililitrów. Przepłucz probówki wytrawiające dodatkowymi 20 mililitrami buforu do płukania i wylej popłuczyny na siatkę, aby usunąć niestrawioną tkankę trzustkową i tłuszczową. Podziel przefiltrowany materiał na dwie nowe 50-mililitrowe probówki i osadź tkankę przez odwirowanie.
Następnie zdekantować supernatant i odwrócić probówki, aby spuścić nadmiar buforu. Aby oczyścić wyspy, dodaj 20 mililitrów gradientu gęstości na zimno do granulek tkanki trzustki i delikatnie pipetuj w górę iw dół pięć razy, aby jednorodnie ponownie zawiesić zawartość. Następnie powoli nałóż 10 mililitrów HBSS na ściankę każdej probówki gradientu, uważając, aby utrzymać ostry interfejs cieczy i oddzielić komórki trzustki przez wirowanie.
Użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby przenieść warstwę wysepek z interfejsu do nowych 50-mililitrowych stożkowych rurek. Następnie umyj wysepki w 40 do 50 mililitrach bufora do płukania trzy razy. Odwracanie ich probówek w celu ponownego zawieszenia granulek między każdym wirowaniem.
Po ostatnim umyciu umieść probówki w kapturze do hodowli tkankowych. Odessać supernatant. I ponownie zawiesić granulki w sześciu mililitrach pożywki wysepek.
Przesiać wysepki z każdej probówki do oddzielnych studzienek na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej. I zakręć talerzem, aby zebrać wysepki w środku studni. Oceń czystość wysp trzustkowych pod mikroskopem.
Aby jeszcze bardziej oczyścić wysepki, zbierz je za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i przenieś do sąsiedniej studni za pomocą sześciu mililitrów pożywki z wysepek. Powtarzać wirowanie wysepek, zbieranie, przenoszenie i ocenę mikroskopową, aż do uzyskania czystości większej niż 90 procent. Następnie przenieś wysepki do pojedynczego 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 20 mililitrów pożywki z wysp.
Po zebraniu wszystkich wysepek należy umieścić na noc szalkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnie pokryj dołki płytki 384-dołkowej 40 mikrolitrami 804G, kondycjonowaną pożywką na studzienkę i umieść płytkę w inkubatorze na noc. Następnego dnia użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie odłączyć wysepki.
Następnie przenieś wysepki do 50-mililitrowej probówki. Zebrać wysepki przez odwirowanie. Następnie umyj je 20 mililitrami ciepłych p, b, s.
Wirować przez jedną minutę. Odessać supernatant. I ponownie zawiesić osad w punkcie zerowym dwa, pięć procent trypsyny.
Inkubować wysepki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra do zasysania i dozowania wysepek 10 razy po pięciu i 10 minutach. Po drugiej triteracji policz 20 mikrolitrów próbki trypsynizowanych komórek wysp trzustkowych. Jeśli tkanki są w pełni strawione, zawiesić dysocjacyjne komórki wysp trzustkowych w stężeniu czterech komórek pięć razy dziesięć do czterech komórek na mililitr w pożywce z funkcją wysp trzustkowych.
Następnie użyj 12-dołkowego aspiratora kolektora, aby usunąć pożywkę kondycyjną 804G z wcześniej przygotowanej płytki 384-dołkowej. I przesiać 70 mikrolitrów wysepek na studzienkę w rzędach od c do n w kolumnach od czterech do 21. Pozostawić wysepki do przylegania w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 48 godzin.
Po dwóch dniach użyj 12-dołkowego aspiratora kolektora, aby ostrożnie usunąć pożywkę z wysepek i użyj 12-kanałowej pipety, aby dodać 35 mikrolitrów pożywki z funkcją wysp trzustkowych do każdej studzienki. Następnie przenieś 35 mikrolitrów świeżo przygotowanych dwóch, x roztworów złożonych będących przedmiotem zainteresowania do każdej studzienki. I zwróć wysepki do inkubatora na kolejne 48 godzin.
Po 48 godzinach utrwaź, wybarwić i przeanalizować kultury wysp trzustkowych poddanych działaniu związku za pomocą zautomatyzowanej platformy obrazowania o wysokiej zawartości. W typowym eksperymencie szybkość replikacji komórek beta DAPI, PD-1 i insulinododatnich zależy od procentu komórek beta wykazujących współekspresję Ki-67. Replikacja komórek alfa jest mierzona jako odsetek komórek z koekspresją DAPI, PD ujemnych, glukagon-dodatnich, Ki-67.
Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie zaobserwowano, że Dipryridamol promuje replikację komórek beta, ale nie alfa. Tę technikę można wykonać w ciągu siedmiu dni. Zgodnie z tą procedurą związki, które w replikacji komórek beta mogą być dalej badane, aby ujawnić mechanizmy działania.
Technika ta umożliwiła naukowcom w dziedzinie biologii komórek beta zidentyfikowanie nowych czynników sygnałowych i szlaków regulujących wzrost komórek beta. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak testować zdolność małych cząsteczek do selektywnej stymulacji regeneracji komórek beta.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę przesiewania wysokotreściowego (high-content screening), której celem jest zidentyfikowanie małych cząsteczek stymulujących replikację komórek β. Technika ta odnosi się do kluczowych wyzwań w badaniach nad cukrzycą, w szczególności w zakresie zrozumienia mechanizmów molekularnych regulujących wzrost komórek β.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad cukrzycą
- Biologia komórki
- Regeneracja komórek β
Wstęp
- Zrozumienie replikacji komórek β jest kluczowe dla leczenia cukrzycy.
- Obecne metody stymulowania regeneracji komórek β są ograniczone.
- Przesiewy wysokoprzepustowe (high-content screening) mogą usprawnić identyfikację cząsteczek promujących replikację.
- Cukrzyca stanowi istotne wyzwanie zdrowotne i ekonomiczne.
Cel badania
- Zbadanie szlaków molekularnych ograniczających wzrost komórek β.
- Opracowanie platformy do wysokoprzepustowego przesiewania małych cząsteczek.
- Ułatwienie badań nad biologią komórek β oraz terapiami regeneracyjnymi.
Zastosowane metody
- Platforma wysokoprzepustowego przesiewania (HCS) w badaniu replikacji komórek β.
- Zautomatyzowana analiza danych dotycząca replikacji pierwotnych komórek wysepek trzustkowych.
- Ocena aktywności małych cząsteczek w stymulowaniu replikacji.
- Zwiększona przepustowość w zakresie specyficznych analiz.
Główne wyniki
- Identyfikacja małych cząsteczek stymulujących replikację komórek β.
- Wgląd w kluczowe szlaki sygnalizacyjne zaangażowane w regenerację komórek β.
- Wykazanie skuteczności platformy w wysokoprzepustowym screeningu.
- Potencjalne implikacje dla opracowania terapii regeneracyjnych w cukrzycy.
Wnioski
- Metoda przesiewowa wysokoprzepustowa (high-content screening) jest cennym narzędziem w badaniach nad cukrzycą.
- Zrozumienie biologii komórek β może prowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych.
- Dalsze badanie zidentyfikowanych cząsteczek może wspomóc regenerację komórek β.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Badania nad cukrzycą na etapie odkrywania wymagają niezawodnych platform do identyfikacji modulatorów replikacji komórek β wysepek trzustkowych, które stanowią kluczowe wąskie gardło w rozwoju terapii regeneracyjnych. Ta wysokoprzepustowa platforma przesiewowa oparta na obrazowaniu wykorzystuje pierwotne komórki wysepek, aby zmaksymalizować istotność biologiczną i pewność prognostyczną podczas wczesnego etapu selekcji związków. Jej automatyzacja oraz ilościowe wyniki bezpośrednio wspierają decyzje dotyczące portfela badań na styku walidacji celu i identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków molekularnych ograniczających wzrost komórek β z wykorzystaniem fizjologicznie istotnych komórek pierwotnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez rozróżnienie efektów ograniczonych do danej linii komórkowej od ogólnych efektów mitogennych.
- Ułatwia predykcyjne ograniczanie ryzyka poprzez zachowanie ograniczeń wzrostu in vivo, które nie występują w liniach unieśmiertelnionych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowaną, zautomatyzowaną i ilościową ocenę replikacji komórek β w formacie 384-dołkowym.
- Ogranicza błąd eksperymentatora i zwiększa powtarzalność dzięki zoptymalizowanemu barwieniu immunocytochemicznemu oraz zautomatyzowanej analizie danych.
- Przygotowuje walidowane systemy komórek pierwotnych do wiarygodnej późniejszej oceny związków oraz badań mechanistycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z biologią istotną dla przebiegu choroby poprzez modelowanie endogennych ograniczeń regeneracyjnych komórek β.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, umożliwiając adaptację do badań na ludzkich wysepkach.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy szlaków mitogennych, co pozwala na podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Platforma ta łączy etap wczesnego odkrywania z identyfikacją wiodących związków, umożliwiając wysokoprzepustowe, ilościowe przesiewanie małych cząsteczek w pierwotnych komórkach wysepek trzustkowych, z wynikami nadającymi się do dalszych badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących regulacji wzrostu komórek β oraz mapowanie szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, skalowalne i ilościowe odczyty do wstępnej oceny związków.
- Analityka: Umożliwia zautomatyzowany pomiar tempa replikacji komórek β oraz specyficzności linii komórkowych.
- Badania translacyjne: Ułatwia adaptację do ludzkich wysepek w celu zapewnienia ciągłości badań przedklinicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania wysokoprzepustowego przesiewania obrazowego w ramach portfeli badań nad biologią komórek β.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów w komórkach β.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy, zwiększa powtarzalność i umożliwia umiarkowaną skalowalność z wykorzystaniem pierwotnych komórek.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez skupienie się na systemach istotnych dla danej choroby.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów do terapii regeneracyjnej z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest doświadczenie w zakresie pierwotnej izolacji wysepek trzustkowych, ich hodowli oraz immunobarwienia.
- Konieczny jest dostęp do infrastruktury obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging) oraz zautomatyzowanej analizy danych.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja przygotowania komórek i warunków analizy pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do ludzkich wysepek jest możliwa, lecz może wiązać się z ograniczeniami zasobów i przepustowości.
- Ograniczenia obejmują zaburzoną architekturę wysepek oraz kompromisy między kosztem a przepustowością, wynikające z zastosowania pierwotnych komórek.
