Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Ogólnym celem tej platformy przesiewowej do badań przesiewowych replikacji komórek beta o wysokiej zawartości jest ułatwienie badania szlaków molekularnych, które ograniczają wzrost komórek beta. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na ważne pytania w dziedzinie biologii komórek beta. Takich jak jedna z kluczowych cząsteczek sygnałowych i szlaków, które kontrolują regenerację komórek beta.

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że umożliwia ona zwiększenie przepustowości wyściółki komórkowej do określonej oceny oraz zautomatyzowaną analizę danych pierwotnej replikacji komórek wysp trzustkowych. Zastosowanie tej techniki ma potencjał, aby rozszerzyć się w kierunku rozwoju terapii regeneracyjnej cukrzycy. Jest to choroba, która wiąże się z poważnymi kosztami zdrowotnymi i ekonomicznymi dla naszego społeczeństwa.

Zacznij od użycia roztworu trawiennego dla trzustki załadowanej 10-mililitrową strzykawką wyposażoną w igłę o rozmiarze 22, aby naśladować wspólny przewód żółciowy na lub tylko dystalnie do połączenia torbielowatych i wspólnych przewodów wątrobowych. Podpierając wspólny przewód żółciowy uchwytem skalple, powoli wstrzyknij 10 mililitrów roztworu. Po podaniu całej kolagenazy użyj zakrzywionych kleszczy i nożyczek, aby oddzielić napompowaną trzustkę od zstępującej okrężnicy, jelit, żołądka i wypustu.

Następnie umieść do dwóch trzustek w 50-mililitrowej probówce na lodzie zawierającej pięć mililitrów roztworu do trawienia trzustki. Po zebraniu całej trzustki umieść rurki wytrawiające w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut, delikatnie obracając co trzy minuty. Pod koniec trawienia energicznie potrząśnij rurkami pionowo 10 razy.

I dodaj 10 mililitrów do mycia na zimno do próbek. Energicznie potrząśnij probówkami jeszcze pięć razy i umieść je na lodzie. Następnie napełnij probówki do końcowej objętości 50 mililitrów buforem do mycia na zimno i odwróć probówki pięć razy.

Następnie odwiruj chusteczki i odlej supernatanty, uważając, aby nie usunąć granulek. Ponownie zawiesić zawiesinę tkanek w 25 mililitrach buforu do mycia, a następnie delikatnie wirować. Powtórz kroki wirowania i ponownego zawieszenia jeszcze dwa razy.

Zawiesiny tkanek przelać przez sito do tkanek o oczkach 30 do sterylnej zlewki o pojemności 250 mililitrów. Przepłucz probówki wytrawiające dodatkowymi 20 mililitrami buforu do płukania i wylej popłuczyny na siatkę, aby usunąć niestrawioną tkankę trzustkową i tłuszczową. Podziel przefiltrowany materiał na dwie nowe 50-mililitrowe probówki i osadź tkankę przez odwirowanie.

Następnie zdekantować supernatant i odwrócić probówki, aby spuścić nadmiar buforu. Aby oczyścić wyspy, dodaj 20 mililitrów gradientu gęstości na zimno do granulek tkanki trzustki i delikatnie pipetuj w górę iw dół pięć razy, aby jednorodnie ponownie zawiesić zawartość. Następnie powoli nałóż 10 mililitrów HBSS na ściankę każdej probówki gradientu, uważając, aby utrzymać ostry interfejs cieczy i oddzielić komórki trzustki przez wirowanie.

Użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby przenieść warstwę wysepek z interfejsu do nowych 50-mililitrowych stożkowych rurek. Następnie umyj wysepki w 40 do 50 mililitrach bufora do płukania trzy razy. Odwracanie ich probówek w celu ponownego zawieszenia granulek między każdym wirowaniem.

Po ostatnim umyciu umieść probówki w kapturze do hodowli tkankowych. Odessać supernatant. I ponownie zawiesić granulki w sześciu mililitrach pożywki wysepek.

Przesiać wysepki z każdej probówki do oddzielnych studzienek na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej. I zakręć talerzem, aby zebrać wysepki w środku studni. Oceń czystość wysp trzustkowych pod mikroskopem.

Aby jeszcze bardziej oczyścić wysepki, zbierz je za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i przenieś do sąsiedniej studni za pomocą sześciu mililitrów pożywki z wysepek. Powtarzać wirowanie wysepek, zbieranie, przenoszenie i ocenę mikroskopową, aż do uzyskania czystości większej niż 90 procent. Następnie przenieś wysepki do pojedynczego 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 20 mililitrów pożywki z wysp.

Po zebraniu wszystkich wysepek należy umieścić na noc szalkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnie pokryj dołki płytki 384-dołkowej 40 mikrolitrami 804G, kondycjonowaną pożywką na studzienkę i umieść płytkę w inkubatorze na noc. Następnego dnia użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie odłączyć wysepki.

Następnie przenieś wysepki do 50-mililitrowej probówki. Zebrać wysepki przez odwirowanie. Następnie umyj je 20 mililitrami ciepłych p, b, s.

Wirować przez jedną minutę. Odessać supernatant. I ponownie zawiesić osad w punkcie zerowym dwa, pięć procent trypsyny.

Inkubować wysepki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra do zasysania i dozowania wysepek 10 razy po pięciu i 10 minutach. Po drugiej triteracji policz 20 mikrolitrów próbki trypsynizowanych komórek wysp trzustkowych. Jeśli tkanki są w pełni strawione, zawiesić dysocjacyjne komórki wysp trzustkowych w stężeniu czterech komórek pięć razy dziesięć do czterech komórek na mililitr w pożywce z funkcją wysp trzustkowych.

Następnie użyj 12-dołkowego aspiratora kolektora, aby usunąć pożywkę kondycyjną 804G z wcześniej przygotowanej płytki 384-dołkowej. I przesiać 70 mikrolitrów wysepek na studzienkę w rzędach od c do n w kolumnach od czterech do 21. Pozostawić wysepki do przylegania w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 48 godzin.

Po dwóch dniach użyj 12-dołkowego aspiratora kolektora, aby ostrożnie usunąć pożywkę z wysepek i użyj 12-kanałowej pipety, aby dodać 35 mikrolitrów pożywki z funkcją wysp trzustkowych do każdej studzienki. Następnie przenieś 35 mikrolitrów świeżo przygotowanych dwóch, x roztworów złożonych będących przedmiotem zainteresowania do każdej studzienki. I zwróć wysepki do inkubatora na kolejne 48 godzin.

Po 48 godzinach utrwaź, wybarwić i przeanalizować kultury wysp trzustkowych poddanych działaniu związku za pomocą zautomatyzowanej platformy obrazowania o wysokiej zawartości. W typowym eksperymencie szybkość replikacji komórek beta DAPI, PD-1 i insulinododatnich zależy od procentu komórek beta wykazujących współekspresję Ki-67. Replikacja komórek alfa jest mierzona jako odsetek komórek z koekspresją DAPI, PD ujemnych, glukagon-dodatnich, Ki-67.

Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie zaobserwowano, że Dipryridamol promuje replikację komórek beta, ale nie alfa. Tę technikę można wykonać w ciągu siedmiu dni. Zgodnie z tą procedurą związki, które w replikacji komórek beta mogą być dalej badane, aby ujawnić mechanizmy działania.

Technika ta umożliwiła naukowcom w dziedzinie biologii komórek beta zidentyfikowanie nowych czynników sygnałowych i szlaków regulujących wzrost komórek beta. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak testować zdolność małych cząsteczek do selektywnej stymulacji regeneracji komórek beta.