Name: Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki beta wydzielające insulinę. Metoda obejmuje sześć etapów i umożliwia badanie genetyki cukrzycy oraz rozwoju komórek trzustkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ines Cherkaoui otrzymała wsparcie od Diabetes UK (BDA 18/0005934) dla GAR, która również dziękuje Wellcome Trust za Nagrodę Badacza (212625/Z/18/Z), UKRI MRC za grant Programu (MR/R022259/1), Diabetes UK za grant na projekt (BDA16/0005485), CRCHUM dla funduszy start-upowych, Innovation Canada za Nagrodę Lidera Johna R. Evansa (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) w przypadku grantu na projekt oraz CIHR, JDRF w przypadku grantu zespołowego (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4--2023-1182-S-N). Camille Dion i dr Harry Leitch za pomoc w tworzeniu i hodowli hiPSC u ludzi, NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre) Organoid Facility, Londyn.

Differentiating Human Pluripotent Stem Cells into Pancreatic β-Cells

<ol><li>Kolios, G., Moodley, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+stem+cells+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration%22%5BJournal%5D)">Introduction to stem cells and regenerative medicine.</a> Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+routes+to+the+generation+of+functional+%CE%B2-cells+for+diabetes+mellitus+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Emerging routes to the generation of functional β-cells for diabetes mellitus cell therapy.</a> Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Diabetes+Association.+Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).</li>
<li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Cell+Replacement+in+mice+using+human+Type+1+diabetes+nuclear+transfer+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">β-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells.</a> Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+insulin-producing+pancreatic+%CE%B2-cells+from+multiple+human+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of insulin-producing pancreatic β-cells from multiple human stem cell lines.</a> Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+insulin-producing+islet-like+clusters+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).</li>
<li>Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+%CE%B2-cell+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pancreatic β-cell differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68(2018).</li>
<li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+fork+speed+promotes+pancreatic+endocrine+differentiation+and+controls+graft+size%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size.</a> JCI Insight. 6 (5), 141553(2021).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+%CE%B2-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li>
<li>Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+functional+specialisations+of+the+pancreatic+%CE%B2-cell%3A+gene+disallowance%2C+mitochondrial+metabolism+and+intercellular+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Metabolic and functional specialisations of the pancreatic β-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity.</a> Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).</li>
<li>Micallef, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INS%28GFP%2Fw%29+human+embryonic+stem+cells+facilitate+isolation+of+in+vitro+derived+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells.</a> Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).</li>
<li>Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+KGF+is+FGF-related+with+properties+of+a+paracrine+effector+of+epithelial+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth.</a> Science. 245 (4919), 752-755 (1989).</li>
</ol>

Pomyślne różnicowanie hPSC w komórki β trzustki zależy od optymalizacji wszystkich aspektów rutynowej hodowli i pasażu wybranych komórek hPSC. Obejmuje to zapewnienie, że linia komórkowa ma prawidłowy kariotyp, jest ujemna pod względem zakażenia mykoplazmą i jest wolna od genomów plazmidów lub wektorów wirusowych. Ponadto w przypadku korzystania z hiPSC ważne jest, aby unikać korzystania z najwcześniejszych przejść, które są jeszcze w trakcie przeprogramowywania, do eksperymentów pilotażowych. Eksperymenty te powinny być prowadzone na małą skalę w celu zidentyfikowania linii hPSC o najlepszym potencjale różnicowania i optymalnej liczbie pasaży.
Inne parametry, które mogą wpływać na efektywność różnicowania, to jakość użytej pożywki z komórek macierzystych, gęstość powłoki i liczba pasaży 10,12. Protokół ten został zoptymalizowany w celu maksymalizacji efektywności różnicowania poprzez zapewnienie, że wszystkie istotne parametry są zoptymalizowane10.
Na każdym etapie stosuje się pożywki różnicujące o określonych preparatach, aby wspomóc różnicowanie hPSC w komórki β. Aktywina A i agonista Wnt są stosowane w pożywce różnicowej w celu zainicjowania przejścia do ostatecznych komórek endodermy. Podczas prymitywnego stadium cewy jelitowej KGF jest dodawany do pożywki, aby promować dalsze różnicowanie w komórki β15, a to włączenie KGF utrzymuje się od 6 do 8 dnia, różniąc się od oryginalnego protokołu Sui, Egli i wsp.10. Na etapie progenitorowym trzustki specyficzny skład podłoża jest optymalizowany w celu zwiększenia ekspresji czynnika transkrypcyjnego Pdx1. Osiąga się to dzięki zastosowaniu wysokiego stężenia kwasu retinowego (RA), KGF i LDN193189, który hamuje szlak białka morfogenetycznego kości (BMP)8. W miarę postępu różnicowania do etapu hormonalnego pożywka hodowlana jest modyfikowana w celu obniżenia sygnalizacji Notch. Osiąga się to poprzez włączenie XXI, inhibitora γ-sekretazy, wraz z T3 (hormonem tarczycy), RZS i RepSox, inhibitorem szlaku Activin/BMP/TGF-β8. Ta specyficzna kombinacja związków jest stosowana w celu promowania różnicowania komórek progenitorowych trzustki w komórki progenitorowe endokrynne. Wreszcie, aby zoptymalizować proces bezpośredniego różnicowania, afidikolina (APH) jest wprowadzana podczas różnicowania z komórek progenitorowych trzustki do komórek progenitorowych endokrynologicznych. Ten dodatek APH ma na celu dalsze wzmocnienie różnicowania komórek β i stanowi wyraźną modyfikację w stosunku do początkowego protokołu zaproponowanego przez Sui, Egli i wsp.10,11.
Podczas procesu różnicowania kluczowe znaczenie ma monitorowanie gęstości komórek i zapobieganie nadmiernej konfluencji, ponieważ może to utrudnić prawidłowe różnicowanie. Kultury o dużej gęstości mogą utrzymywać wysoką ekspresję Oct4, hamując różnicowanie do ostatecznej endodermy. Usunięcie inhibitora ROCK na pierwszym etapie płukania jest niezbędne do zainicjowania różnicowania i umożliwienia zmiany stanu pluripotencjalnego hPSC. Zastosowanie markera fluorescencyjnego, takiego jak Mel1 INS-GFP z GFP zintegrowanym w locus insuliny, ułatwia ocenę postępu różnicowania na etapach progenitorowych trzustki i komórek β, wspomagając dalsze eksperymenty14.
Obecny protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki podobne do β trzustki wykazał zmienność skuteczności między różnymi liniami hPSC10. Dodatkowo, powstałe komórki podobne do β wykazują niedojrzałość funkcjonalną w porównaniu z ludzkimi wyspami trzustkowymi, wykazując mniejsze wydzielanie insuliny na komórkę. Aby jeszcze bardziej zaradzić temu ograniczeniu, dojrzewanie in vivo komórek podobnych do β można osiągnąć poprzez przeszczepienie organoidów wysp trzustkowych do modeli zwierzęcych w końcowych stadiach różnicowania 6,7.
Pomimo tych ograniczeń różnicowanie się hPSC w komórki β trzustki ma znaczący potencjał w stosunku do istniejących metod 8,9,10. Technika ta pozwala na wytworzenie dużej liczby komórek podobnych do komórek β, które reagują na glukozę i wyrażają markery β-komórkowe (Pdx1 i Nkx6.1, patrz ryc. 2). Odbywa się to bez ograniczeń etycznych, technicznych i źródłowych związanych z użyciem ludzkich wysp trzustkowych. Ponadto technika ta ma potencjał do zastosowania w medycynie spersonalizowanej, ponieważ można generować specyficzne dla pacjenta komórki β do testowania leków i modelowania choroby 4,6,7. Technika ta może mieć również przyszłe zastosowania w leczeniu cukrzycy, która wiąże się z utratą lub dysfunkcją komórek β trzustki 4,6,7.

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają unikalną zdolność do różnicowania się w różne typy komórek, co czyni je realną alternatywą dla ludzkich komórek β trzustki1. Te hPSC dzielą się na dwa typy: embrionalne komórki macierzyste (hESC), pochodzące z blastocysty2, oraz indukowane komórki pluripotencjalne (hiPSC), generowane przez bezpośrednie przeprogramowanie komórek somatycznych3. Opracowanie technik różnicowania hPSC w komórki β ma ważne implikacje zarówno dla badań podstawowych, jak i praktyki klinicznej1,4. Cukrzyca jest chorobą przewlekłą, która dotyka >400 milionów ludzi na całym świecie i wynika z niezdolności organizmu do regulacji glikemii z powodu nieprawidłowego działania lub utraty komórek β trzustki5. Ograniczona dostępność komórek wysp trzustkowych do przeszczepu utrudniła rozwój terapii komórkowych w leczeniu cukrzycy2,4,6,7. Zdolność do generowania komórek wydzielających insulinę reagujących na glukozę za pomocą hPSC służy jako użyteczny model komórkowy do badania rozwoju i funkcji ludzkich wysp trzustkowych. Może być również stosowany do testowania potencjalnych kandydatów terapeutycznych do leczenia cukrzycy w kontrolowanym środowisku. Co więcej, hPSC mają potencjał do wytwarzania komórek wysp trzustkowych, które są genetycznie identyczne z pacjentem, zmniejszając ryzyko odrzucenia układu immunologicznego po przeszczepie2,4,7.
W ostatnich latach nastąpił znaczący postęp w udoskonalaniu protokołów hodowli i różnicowania hPSC, co skutkuje zwiększoną wydajnością i powtarzalnością procesu różnicowania w kierunku generowania komórek β trzustki 8,9.
Poniższy protokół przedstawia podstawowe etapy ukierunkowanego różnicowania komórek β trzustki. Polega na regulacji określonych szlaków sygnalizacji komórkowej w różnych punktach czasowych. Opiera się na protokole opracowanym przez Sui L. et al.10 (2018) do generowania hPSC do komórek β trzustki. Protokół został dostosowany do ostatnich aktualizacji od Sui L. et al.11 (2021), ponieważ najnowsze badania podkreślają znaczenie stosowania leczenia afidikoliną (APH) w celu zwiększenia różnicowania komórek β. Obecny protokół obejmuje dodawanie APH do pożywki na późniejszych etapach procesu. Ponadto na wczesnych etapach różnicowania wprowadzono modyfikacje w składzie pożywki w porównaniu z początkowym protokołem. Zauważalną zmianą jest dodanie czynnika wzrostu keratynocytów (KGF) w dniu 6 i trwanie do dnia 8. Czynnik wzrostu keratynocytów (KGF) jest wprowadzany od 6 do 8 dnia, co nieznacznie różni się od początkowego protokołu10, gdzie KGF nie został włączony do pożywki etapu 4.
Pierwszym i niezbędnym krokiem w tworzeniu komórek podobnych do komórek β jest ukierunkowane różnicowanie hPSC w ostateczną endodermę (DE), prymitywną warstwę zarodkową, która powoduje powstanie nabłonkowej wyściółki różnych organów, w tym trzustki. Po utworzeniu DE komórki ulegają różnicowaniu w pierwotną rurkę jelitową, po której następuje określenie losu tylnego jelita przedniego. Tylne jelito przednie rozwija się następnie w komórki progenitorowe trzustki, które mają potencjał różnicowania się we wszystkie typy komórek trzustki, w tym komórki endokrynne i zewnątrzwydzielnicze. Kolejnym etapem procesu są komórki progenitorowe endokrynne trzustki, które dają początek komórkom wydzielającym hormony znajdującym się w wysepkach Langerhansa. W końcu proces różnicowania osiąga swój końcowy etap poprzez wytworzenie w pełni funkcjonalnych komórek przypominających β komórki trzustki9,10. Należy zauważyć, że proces ten jest złożony i często wymaga optymalizacji warunków hodowli, takich jak określone czynniki wzrostu i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, w celu poprawy wydajności i swoistości różnicowania9,10. Co więcej, generowanie funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β z hPSC in vitro nadal stanowi poważne wyzwanie. Trwające badania koncentrują się na ulepszaniu protokołów różnicowania oraz poprawie dojrzewania i funkcji powstałych β-komórek9.
W tym protokole, zastosowanie łagodnej dysocjacji komórek podczas hodowli i pasażu hPSC jest niezbędne do utrzymania żywotności komórek i pluripotencji, znacznie poprawiając efektywność różnicowania w komórki β trzustki. Dodatkowo, każda pożywka specyficzna dla danego etapu została skrupulatnie zoptymalizowana zgodnie z protokołem opracowanym przez Sui L. et al.10 w celu promowania wysokiej wydajności komórek wydzielających insulinę w klastrach, które bardzo przypominają ludzką wyspę trzustkową.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek TubeOne</td><td>Starlabs</td><td>S1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165218</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa AggreWell 400&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34425</td><td></td></tr><tr><td>Anty-glukagon&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G2654-100UL</td><td></td></tr><tr><td>Antyinsulinowy&nbsp;</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NKX6.1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-49672SS</td><td></td></tr><tr><td>Anty-PDX1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab84987</td><td></td></tr><tr><td>Suplement Aphidicolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4487</td><td></td></tr><tr><td>B-27 (50X), bez surowicy&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina, bez kwasów tłuszczowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Bez wapnia/magnezu D-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Cyklopamina-KAAD</td><td>Calbiochem</td><td>239804</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza, BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94046-100ML-DMEM</td><td></td></tr> <tr><td>plus GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10566016</td><td>Do Prania Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco F-12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka adhezyjne Epredi SuperFrost Plus Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270098</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor gamma-sekretazy XX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J64904</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Zredukowany czynnik wzrostu Basement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td>Geltrex 1:1 do zimnego podłoża DMEM/F-12, aby zapewnić końcowe rozcieńczenie 1:100.</td></tr><tr><td>Kozia świnka anty-gwinejska, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Kozia świnia anty-morska, Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150187</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie, Alexa Fluor 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21052</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-króliczą IgG, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trichlorowodorek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie FGF-7 (KGF) Rekombinowane białko</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0094</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>295426</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Bariera hydrofobowa PAP Pen</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG4582</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0559-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>Związek OCT 118 ml</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletki, sól fizjologiczna buforowana fosforanem, Fisher BioReagents</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (PS)</td><td>Thermo Fisher Scientific,15070-063</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe prostokątne, 22 razy; 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>RepSox (chlorowodorek)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, suplement GlutaMAX&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870036</td><td>Medium do prania 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.</td></tr><tr><td>Shandon Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Endoderma&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>StemFlex Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3349401</td><td>Rozmrażaj suplement StemFlex przez noc w temperaturze 4& C, przenieść pozostały płyn z butelki z suplementem do StemFlex Basal Medium.</td></tr><tr><td>Stemolecule All-Trans Reprocell kwasu retinowego</td><td></td><td>04-0021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tarczyca Tormone 3 (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Enzym ekspresowy trypL (1X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Płytka o bardzo niskiej przyczepności do hodowli zawiesiny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>38071</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (dichlorowodorek)&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Z4750</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mogą różnicować się w dowolny rodzaj komórek, co czyni je doskonałym alternatywnym źródłem ludzkich komórek β trzustki. hPSC mogą być embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESC) pochodzącymi z blastocysty lub indukowanymi komórkami pluripotencjalnymi (hiPSC) generowanymi bezpośrednio z komórek somatycznych w procesie przeprogramowywania. W tym artykule przedstawiono protokół oparty na wideo w celu nakreślenia optymalnych warunków hodowli i pasażu dla hPSC, przed ich różnicowaniem i późniejszym generowaniem komórek trzustki produkujących insulinę. Metodologia ta jest zgodna z sześcioetapowym procesem różnicowania ukierunkowanego na β komórek, w którym hPSC różnicują się w ostateczną endodermę (DE), prymitywną cewę jelitową, los tylnego jelita przedniego, komórki progenitorowe trzustki, endokrynologiczne komórki progenitorowe trzustki i ostatecznie komórki β trzustki. Warto zauważyć, że ta metodologia różnicowania potrzebuje 27 dni na wytworzenie ludzkich komórek β trzustki. Potencjał wydzielania insuliny oceniono za pomocą dwóch eksperymentów, które obejmowały barwienie immunologiczne i wydzielanie insuliny stymulowane glukozą.

Protokół opisany w niniejszej pracy oferuje wysoce wydajne podejście do różnicowania komórek podobnych do β z hPSC10. Proces ten wykorzystuje system hodowli 2D, który jest łatwo skalowalny, co umożliwia jego zastosowanie w różnych warunkach eksperymentalnych, takich jak nauka różnicowania, mniejsze projekty i laboratoria oraz testy pilotażowe w celu oceny potencjału różnicowania danej linii iPSC.
Kluczowe jest scharakteryzowanie właściwości funkcjonalnych zróżnicowanych komórek β w wysepkach, aby uzyskać wgląd w homeostazę glukozy. Zazwyczaj osiąga się to poprzez różne eksperymenty, takie jak immunobarwienie markerów komórek β i ekspresji insuliny, a także testy wydzielania insuliny stymulowanego glukozą (GSIS), które badają funkcję wysepek w odpowiedzi na niskie i wysokie stężenia glukozy12,13. Komórki β posiadają charakterystyczne geny, w tym Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 oraz Neurod1, które są krytyczne dla ustanowienia i utrzymania tożsamości komórek β9. Techniki immunobarwienia są cenne w badaniu ekspresji i lokalizacji białek w przekrojach tkankowych. Immunobarwienie markerów komórek β pozwala ocenić poziomy ekspresji kluczowych markerów linii trzustkowej, dostarczając informacji o wierności procesu różnicowania i jego optymalizacji dla konkretnych zastosowań9,12.
W niniejszym badaniu wykorzystano linię reporterową hESC Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 do różnicowania skupisk obejmujących różne typy komórek, w tym komórki β przypominające te występujące w natywnych wysepkach ludzkich. Rysunek 2 w niniejszej pracy przedstawia istotne wyniki dotyczące wydajności i dokładności procesu różnicowania. Wyniki wykazują wysoki stopień wzbogacenia komórek wykazujących ekspresję insuliny w obrębie linii trzustkowej, a komórki te przejawiają stymulowaną glukozą sekrecję insuliny. Wskazuje to na pomyślne wytworzenie funkcjonalnych komórek typu β w procesie różnicowania.
Zróżnicowane komórki stymulowano niskim i wysokim stężeniem glukozy, a wyniki GSIS wykazały, że klastry pochodzące z komórek Mel1 funkcjonowały podobnie do wysepek w odpowiedzi wydzielania insuliny na glukozę. Stwierdzono, że klastry pochodzące z Mel1 wydzielają 100-krotnie więcej insuliny w odpowiedzi na wysokie stężenia glukozy w porównaniu z niskimi stężeniami glukozy. Konkretnie, zawartość insuliny wynosiła 0,003 ± 0,002% przy niskim stężeniu glukozy 3,3 mM i 0,236 ± 0,197% przy wysokim stężeniu glukozy 16,7 mM.
Klastry pochodzące z Mel1 INS-GFP hESC poddano dalszym analizom w celu określenia ich składu i funkcjonalności, poza testem GSIS. W szczególności zbadano ekspresję genów sygnaturowych komórek β oraz obecność różnych typów komórek wewnątrz klastrów. Wyniki wykazały, że linia trzustkowa uzyskana w tym procesie jest silnie wzbogacona w komórki insulinowo-dodatnie, co wskazuje na wysoki poziom sukcesu w procesie różnicowania hESC w komórki podobne do komórek β. Ponadto zbadano ekspresję genów sygnaturowych, takich jak Nkx6.1 i Pdx1, które są istotne dla ustanowienia i utrzymania tożsamości komórek β. Analiza wykazała, że odpowiednio około 25% i 40% komórek wykazuje ekspresję Nkx6.1 oraz Pdx1, co stanowi dodatkowy dowód na to, że klastry zawierały zróżnicowane komórki β-podobne (średnia liczba komórek Nkx6.1+ na klaster 24,9% ± 6,2%, n=9 klastrów, komórki Pdx1+ 40,2% ± 6,2%, n=9, SEM, Rysunek 2). Dodatkowo klastry zawierały inne typy komórek, takie jak komórki glukagonowo-dodatnie, które stanowiły około 15% całkowitej populacji komórek. Komórki te występują zazwyczaj w komórkach alfa natywnych wysepek Langerhansa, co sugeruje, że klastry ściśle przypominają ludzkie wysepki pod względem składu komórkowego.
<img alt="Schemat różnicowania progenitorów trzustki oraz zdjęcia hodowli komórkowych w dniach 1, 11, 12 i 13." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65530/65530fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Różnicowanie hPSC w kierunku komórek β trzustki. (A) Schematyczne przedstawienie ukierunkowanego różnicowania hPSC w komórki β trzustki in vitro, obejmujące sześć kolejnych etapów: indukcję ostatecznej endodermy, formowanie pierwotnej rurki jelitowej, specyfikację losu tylnej części przedjelita, generowanie progenitorów trzustki, formowanie endokrynnych progenitorów trzustki i ostatecznie różnicowanie w komórki β trzustki. Różnicowanie komórek β trzustki wykorzystuje kluczowe etapy rozwoju ludzkich wysepek trzustkowych, z regulacją specyficznych szlaków sygnalizacji komórkowej w określonych momentach. B27: suplement B-27; Ri: inhibitor kinazy białkowej związanej z rho lub inhibitor ROCK; T3: hormon tarczycy; KGF: ludzkie białko KGF / FGF-7; RepSox: inhibitor szlaku aktywiny/Nodal/TGF-β; Inhibits ALK5: inhibitor ALK5; RA: kwas retinowy; ZS: siarczan cynku; UFH: niefrakcjonowana heparyna; XX: inhibitor gamma-sekretazy XX; APH: afidikolina; EGF: czynnik wzrostu naskórka; LDN: inhibitor BMP III, LDN-212854; Cyclo: cyklopamina- KAAD. (B) Obrazy morfologii komórkowej zarejestrowane na różnych etapach różnicowania od pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek β trzustki. Pierwszy obraz przedstawia ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste w pierwszym dniu różnicowania (monowarstwa hPSC). (C) W dniu 11 komórki znajdują się na etapie progenitorów trzustki. Pasek skali 100 µm. (D) W dniu 12 klastry formują się w mikrowydłużeniach płytki 6-dołkowej po dysocjacji komórek na etapie progenitorów trzustki. (E) W dniu 13 klastry znajdują się w płytce 6-dołkowej o niskim stopniu adhezji. Pasek skali 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/65530fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja, ekspresja insuliny w komórkach, wykresy słupkowe, wpływ glukozy na sekrecję insuliny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65530/65530fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza obecności komórek produkujących insulinę, wykazujących markery dojrzałości komórek β, w klastrach uzyskanych z zróżnicowanej linii reporterowej hESC Mel1 InsGFP/w14. (A) Obrazy immunofluorescencyjne klastrów wykonane z przekrojów w bloku kriotermicznym (5 µm) przy użyciu konfokalnej mikroskopii dyskowej wykazały przewagę komórek produkujących insulinę (około 60%) w stosunku do komórek produkujących glukagon (około 15%) (n=9 klastrów, około 18 000 komórek, SEM). (B) Obrazy immunofluorescencyjne klastrów uzyskane z przekrojów w bloku kriotermicznym (5 µm) przy użyciu konfokalnej mikroskopii dyskowej wykazały przewagę komórek produkujących insulinę, które koekspresjonowały marker komórek β trzustki Nkx6.1 (n=9 klastrów, około 18 000 komórek). (C) Do wyznaczenia odsetka komórek dodatnich pod kątem insuliny, glukagonu, markerów komórek β Nkx6.1 oraz markerów komórek β Pdx1 wykorzystano makro do liczenia komórek w programie ImageJ, zaprojektowane specjalnie do immunostainingu markerów. (D) Oceniono sekrecję insuliny stymulowaną glukozą w klastrach pochodzących z hESC Mel1 InsGFP/w, w których odnotowano 100-krotny wzrost w odpowiedzi na stymulację wysokim stężeniem glukozy (16.7mM glukozy) w zróżnicowanych klastrach (n=9, SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/65530fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Podsumowanie składu pożywek do różnicowania kierowanego.Tabela ta zawiera podsumowanie składu pożywek stosowanych każdego dnia/etapu różnicowania kierowanego na macierzy i pożywce dla komórek macierzystych, wraz z buforem do stymulowanej glukozą sekrecji insuliny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic ...

Osiągnięcie wysokiej i stałej wydajności w procesie różnicowania w celu przekształcenia pluripotencjalnych komórek macierzystych w ludzkie komórki beta jest znaczącym wyzwaniem. Na to wyzwanie ma wpływ precyzja i konsekwencja, z jaką eksperymentator postępuje zgodnie z protokołem. Co więcej, krzyki komórek beta uzyskane w każdym eksperymencie są dość zmienne, co może skutkować zmniejszeniem krzyków funkcjonalnych komórek beta w wielu eksperymentach.W kontekście badań nad wyspami trzustkowymi i komórkami beta w cukrzycy dostępność dawców wysp trzustkowych jest dość ograniczona. W związku z tym wykorzystanie komórek beta zróżnicowanych komórkami macierzystymi oferuje nieograniczoną i obfitą podaż komórek wydzielających insulinę. Różnicowanie komórek beta jest kluczowym postępem w naszej dziedzinie, oferującym wiele korzyści.Pozwala nam badać rozwój i funkcję komórek beta, prowadząc do głębszego zrozumienia przyczyn cukrzycy i dysfunkcji komórek beta. Naszym celem jest wykorzystanie tej techniki w naszych badaniach koncentrujących się na genetyce cukrzycy. Naszym głównym celem jest skupienie się na mutacji niektórych genów, które mogą wpływać na funkcję komórek beta i wysp trzustkowych.Tak więc ten protokół ułatwi dostęp do ludzkich wysp trzustkowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych z mutacjami będącymi przedmiotem zainteresowania. Przed pasażem komórkowym pokryj sześciodołkową płytkę roztworem do powlekania na zimno i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Odessać pożywkę z komórek macierzystych z sześciodołkowej płytki zawierającej ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste i dodać jeden mililitr DPBS bez wapnia i magnezu do każdej studzienki.Po drugim myciu dodaj 500 mikrolitrów roztworu dysocjacyjnego do każdej studzienki i inkubuj przez dwie do pięciu minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie odessać roztwór powlekający z płytki sześciodołkowej i dodać jeden mililitr DPBS bez wapnia i magnezu do każdej studzienki. Pod odwróconym mikroskopem obserwuj proces dysocjacji komórek.Gdy 80 do 90% komórek wydaje się być zaokrąglonych i przylegających, odessaj roztwór dysocjacyjny z dołków płytki sześciodołkowej. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki z komórkami macierzystymi zawierającej 10 mikromolowy inhibitor ROCK do sześciodołkowej płytki. Dodaj 10 mikrolitrów zdysocjowanej zawiesiny komórkowej do probówki, a następnie dodaj równą objętość błękitu trypanowego.Delikatnie wymieszaj i policz komórki za pomocą hemocytometru. Po zliczeniu komórek dodaj dwa mililitry pożywki z komórek macierzystych na studzienkę, zawierającą od 0,8 do jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr i 10 mikromolowy inhibitor ROCK. Szybko przesuń talerz do przodu i do tyłu, trzy razy z boku na bok.Umieść płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Szybko przesuń płytkę do przodu i do tyłu oraz z boku na bok 10 razy przed inkubacją przez dwie godziny. Rozmrozić zarówno podłoże podstawowe na dzień zero i czwarty, jak i suplementy na lodzie.Podgrzej dwa mililitry każdego dnia, jedno podłoże i jedno medium myjące, w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie odessać pożywkę z komórkami macierzystymi z dołków sześciodołkowej płytki i dodać dwa mililitry pożywki myjącej. Po zasysaniu pożywki myjącej należy natychmiast dodać dwa mililitry pożywki dziennej na bok studzienki.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. W 12 dniu procesu różnicowania należy potraktować sześciodołkową płytkę zawierającą mikrostudzienki o wielkości 400 mikrometrów dwoma mililitrami roztworu do płukania zapobiegającego przywieraniu. Pod odwróconym mikroskopem obserwuj płytkę pod kątem pęcherzyków.Jeśli nie zaobserwuje się żadnych pęcherzyków, odessać płyn płuczący zapobiegający przywieraniu i natychmiast dodać dwa mililitry środka myjącego dwa. Następnie odessać pożywkę progenitorową trzustki i dodać 0,5 mililitra buforu dysocjacyjnego na studzienkę. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez dwie do pięciu minut.Gdy większość komórek jest zaokrąglona i nadal przylega, odessać bufor dysocjacyjny i natychmiast dodać jeden mililitr ciepłej pożywki klastrowej do każdej studzienki. Używając końcówki do pipety P1000, delikatnie rozdziel komórki, pipetując w górę i w dół, naprzemiennie wykonując ruchy okrężne i przesuwając się od góry do dołu studzienki, aby równomiernie oddzielić komórki w całym dołku. Przenieś zdysocjowaną mieszaninę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki.Dodaj jeden mililitr pożywki zbiorczej do płytki sześciodołkowej, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki. Następnie odessać pożywkę myjącą nr dwa z sześciodołkowej płytki mikrodołkowej i dodać zdysocjowaną zawiesinę komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Następnego dnia, używając końcówki do pipety P1000, powoli zbierz klastry z sześciodołkowej płytki mikrodołkowej do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj jeden mililitr pożywki dnia 13, aby zebrać pozostałe grona i przenieść grona do probówki. Pozwól komórkom naturalnie ustawić się pod wpływem grawitacji na dnie rurki przez pięć minut.Ostrożnie odessać supernatant z probówki, nie naruszając skupisk komórek. Następnie dodaj do probówki dwa mililitry pożywki z dnia 13. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół, unikając aspiracji klastrów.Przenieść zawiesinę na płytkę sześciodołkową o bardzo niskiej przyczepności. Szybko przesuń talerz do przodu i do tyłu, sześć razy z boku na bok. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Obrazy immunofluorescencyjne klastrów wykazały przewagę komórek produkujących insulinę współwyrażających markery komórek beta trzustki. Ekspresja genów sygnatury komórek beta ujawniła około 25% komórek eksprymujących Nkx6,1 i 40% wykazujących ekspresję Pdx1. Podczas testu wydzielania insuliny stymulowanego glukozą, klastry pochodzące z MEL-1 wydzielały znacznie wyższe poziomy insuliny w odpowiedzi na wysokie stężenia glukozy w porównaniu z niskimi stężeniami glukozy.

optimized-protocol-for-generating-functional-pancreatic-insulin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy 4-etapowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ in vitro. Protokół ten może być stosowany do różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Ten protokół przedstawia porównanie dwóch różnych protokołów indukcji różnicowania ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (hDPSC) w kierunku linii trzustki in vitro: protokół integracyjny i protokół nieintegracyjny. Protokół integracyjny generuje więcej komórek produkujących insulinę (IPC).

Metody in vitro Indukcja komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej w kierunku linii trzustki

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj zoptymalizowany protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki beta wydzielające insulinę. Metoda obejmuje sześć etapów i umożliwia badanie genetyki cukrzycy oraz rozwoju komórek trzustkowych.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów