Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Osiągnięcie wysokiej i stałej wydajności w procesie różnicowania w celu przekształcenia pluripotencjalnych komórek macierzystych w ludzkie komórki beta jest znaczącym wyzwaniem. Na to wyzwanie ma wpływ precyzja i konsekwencja, z jaką eksperymentator postępuje zgodnie z protokołem. Co więcej, krzyki komórek beta uzyskane w każdym eksperymencie są dość zmienne, co może skutkować zmniejszeniem krzyków funkcjonalnych komórek beta w wielu eksperymentach.

W kontekście badań nad wyspami trzustkowymi i komórkami beta w cukrzycy dostępność dawców wysp trzustkowych jest dość ograniczona. W związku z tym wykorzystanie komórek beta zróżnicowanych komórkami macierzystymi oferuje nieograniczoną i obfitą podaż komórek wydzielających insulinę. Różnicowanie komórek beta jest kluczowym postępem w naszej dziedzinie, oferującym wiele korzyści.

Pozwala nam badać rozwój i funkcję komórek beta, prowadząc do głębszego zrozumienia przyczyn cukrzycy i dysfunkcji komórek beta. Naszym celem jest wykorzystanie tej techniki w naszych badaniach koncentrujących się na genetyce cukrzycy. Naszym głównym celem jest skupienie się na mutacji niektórych genów, które mogą wpływać na funkcję komórek beta i wysp trzustkowych.

Tak więc ten protokół ułatwi dostęp do ludzkich wysp trzustkowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych z mutacjami będącymi przedmiotem zainteresowania. Przed pasażem komórkowym pokryj sześciodołkową płytkę roztworem do powlekania na zimno i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Odessać pożywkę z komórek macierzystych z sześciodołkowej płytki zawierającej ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste i dodać jeden mililitr DPBS bez wapnia i magnezu do każdej studzienki.

Po drugim myciu dodaj 500 mikrolitrów roztworu dysocjacyjnego do każdej studzienki i inkubuj przez dwie do pięciu minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie odessać roztwór powlekający z płytki sześciodołkowej i dodać jeden mililitr DPBS bez wapnia i magnezu do każdej studzienki. Pod odwróconym mikroskopem obserwuj proces dysocjacji komórek.

Gdy 80 do 90% komórek wydaje się być zaokrąglonych i przylegających, odessaj roztwór dysocjacyjny z dołków płytki sześciodołkowej. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki z komórkami macierzystymi zawierającej 10 mikromolowy inhibitor ROCK do sześciodołkowej płytki. Dodaj 10 mikrolitrów zdysocjowanej zawiesiny komórkowej do probówki, a następnie dodaj równą objętość błękitu trypanowego.

Delikatnie wymieszaj i policz komórki za pomocą hemocytometru. Po zliczeniu komórek dodaj dwa mililitry pożywki z komórek macierzystych na studzienkę, zawierającą od 0,8 do jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr i 10 mikromolowy inhibitor ROCK. Szybko przesuń talerz do przodu i do tyłu, trzy razy z boku na bok.

Umieść płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Szybko przesuń płytkę do przodu i do tyłu oraz z boku na bok 10 razy przed inkubacją przez dwie godziny. Rozmrozić zarówno podłoże podstawowe na dzień zero i czwarty, jak i suplementy na lodzie.

Podgrzej dwa mililitry każdego dnia, jedno podłoże i jedno medium myjące, w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie odessać pożywkę z komórkami macierzystymi z dołków sześciodołkowej płytki i dodać dwa mililitry pożywki myjącej. Po zasysaniu pożywki myjącej należy natychmiast dodać dwa mililitry pożywki dziennej na bok studzienki.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. W 12 dniu procesu różnicowania należy potraktować sześciodołkową płytkę zawierającą mikrostudzienki o wielkości 400 mikrometrów dwoma mililitrami roztworu do płukania zapobiegającego przywieraniu. Pod odwróconym mikroskopem obserwuj płytkę pod kątem pęcherzyków.

Jeśli nie zaobserwuje się żadnych pęcherzyków, odessać płyn płuczący zapobiegający przywieraniu i natychmiast dodać dwa mililitry środka myjącego dwa. Następnie odessać pożywkę progenitorową trzustki i dodać 0,5 mililitra buforu dysocjacyjnego na studzienkę. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez dwie do pięciu minut.

Gdy większość komórek jest zaokrąglona i nadal przylega, odessać bufor dysocjacyjny i natychmiast dodać jeden mililitr ciepłej pożywki klastrowej do każdej studzienki. Używając końcówki do pipety P1000, delikatnie rozdziel komórki, pipetując w górę i w dół, naprzemiennie wykonując ruchy okrężne i przesuwając się od góry do dołu studzienki, aby równomiernie oddzielić komórki w całym dołku. Przenieś zdysocjowaną mieszaninę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Dodaj jeden mililitr pożywki zbiorczej do płytki sześciodołkowej, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki. Następnie odessać pożywkę myjącą nr dwa z sześciodołkowej płytki mikrodołkowej i dodać zdysocjowaną zawiesinę komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnego dnia, używając końcówki do pipety P1000, powoli zbierz klastry z sześciodołkowej płytki mikrodołkowej do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj jeden mililitr pożywki dnia 13, aby zebrać pozostałe grona i przenieść grona do probówki. Pozwól komórkom naturalnie ustawić się pod wpływem grawitacji na dnie rurki przez pięć minut.

Ostrożnie odessać supernatant z probówki, nie naruszając skupisk komórek. Następnie dodaj do probówki dwa mililitry pożywki z dnia 13. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół, unikając aspiracji klastrów.

Przenieść zawiesinę na płytkę sześciodołkową o bardzo niskiej przyczepności. Szybko przesuń talerz do przodu i do tyłu, sześć razy z boku na bok. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Obrazy immunofluorescencyjne klastrów wykazały przewagę komórek produkujących insulinę współwyrażających markery komórek beta trzustki. Ekspresja genów sygnatury komórek beta ujawniła około 25% komórek eksprymujących Nkx6,1 i 40% wykazujących ekspresję Pdx1. Podczas testu wydzielania insuliny stymulowanego glukozą, klastry pochodzące z MEL-1 wydzielały znacznie wyższe poziomy insuliny w odpowiedzi na wysokie stężenia glukozy w porównaniu z niskimi stężeniami glukozy.