Osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych

Metoda ta może pomóc naukowcom zmaksymalizować produktywne wykorzystanie wysp trzustkowych do oceny wielu wyników na każdej próbce w jej natywnej architekturze tkankowej. Główną zaletą tej nowej metody osadzania jest to, że wysepki są równomiernie rozmieszczone na dobrze zdefiniowanym obszarze, umieszczając wiele wysepek w płaszczyźnie przekroju, co optymalizuje eksperymentalny plon z tego materiału o niskiej obfitości. Procedurę zademonstruje doktor Yahui Kong, pracownik naukowy w moim laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, użyj końcówki do pipety p200 o niskim poziomie wiązania i skalibrowanej siatki pod mikroskopem stereoskopowym, aby ręcznie wybrać odpowiedniki 250 wysepek. Przenoszenie ich do każdej 1,5-mililitrowej probówki z mikrofugą o niskim poziomie wiązania. Niech wysepki osiądą na dnie rurki do mikrofuge.

Następnie użyj pipety ze świeżą końcówką p200, aby ostrożnie usunąć większość supernatantu. Upewnij się, że nie usuniesz żadnych wysepek. Dodaj jeden mililitr PBS i odwiruj w wirówce z wahadłowym wiadrem, aż prędkość osiągnie 200-krotność grawitacji, a następnie zatrzymaj wirowanie.

Usunąć supernatant. Powtórz cały proces prania PBS, w sumie dwa cykle prania. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 10% roztworu formaliny lub 4% świeżo przygotowanego paraformaldehydu.

Pozwól próbce utrwalić się w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie użyj pipety z końcówką p200, aby usunąć utrwalacz. Dodaj jeden mililitr PBS i wiruj, aż prędkość osiągnie 200 razy grawitacji, a następnie zatrzymaj wirowanie.

Usunąć supernatant, a następnie powtórzyć cały proces płukania PBS jeszcze raz, w sumie dwa cykle płukania. Przygotuj żądany żel w 1,5 mililitrowych probówkach mikrowirówek, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie umieść te probówki mikrowirówkowe w bloku grzewczym o temperaturze 70 stopni Celsjusza, aby podgrzać żel.

Użyj przeciętej końcówki mikropipety, aby przenieść 10 mikrolitrów niebieskich kulek agarozy na próbkę do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj jeden mililitr PBS do kulek, a następnie odwiruj przy 800-krotności grawitacji przez jedną minutę. Wyjmij PBS i powtórz to pranie jeszcze raz.

Po drugim praniu ponownie zawieś koraliki w odpowiedniej ilości PBS. Odwiruj probówki zawierające wysepki, aż prędkość osiągnie 200-krotność grawitacji, a następnie zatrzymaj wirowanie. Usunąć większość supernatantu.

Za pomocą nożyczek odetnij koniec jednej końcówki mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów dla każdej próbki. Dodaj 10 mikrolitrów koralików do każdej rurki wysepki za pomocą czystej, odciętej końcówki dla każdej próbki. Następnie odwiruj, aż prędkość osiągnie 200-krotność grawitacji.

Następnie użyj nieoszlifowanej 200 mikrolitrów, a następnie końcówki 10 mikrolitrów, aby usunąć jak najwięcej PBS. Oznacz szkiełka mikroskopowe w celu identyfikacji próbki i umieść je na stole w pobliżu bloku grzewczego z podgrzanym żelem. Za pomocą nożyczek odetnij końce kilku słabo wiążących końcówek mikropipet na próbkę.

Za pomocą mikropipety wyposażonej w odciętą końcówkę dodaj ciepły żel do probówki zawierającej wysepki i koraliki. Wymieszaj natychmiast, unikając tworzenia się pęcherzyków. Nałóż tę mieszaninę na szkiełko, tworząc krążek w pobliżu krawędzi szkiełka, pozostawiając miejsce na zewnętrzny pierścień żelowy.

Następnie delikatnie dotknij zjeżdżalni kilka razy, aby osadzić wysepki i koraliki. Dodaj 20 mikrolitrów ciepłego żelu do probówki z próbką i wymieszaj nowy żel z pozostałymi wysepkami i kulkami. Zastosuj tę mieszaninę do tego samego slajdu otaczającego oryginalny dysk.

Powtórz w razie potrzeby, używając świeżych, wstępnie przyciętych końcówek do każdej aplikacji, aż krążek osiągnie pożądany rozmiar i grubość. Upewnij się, że przygotowujesz każdy dysk osobno i śledzisz kolejność próbek, jeśli umieszczasz wiele dysków z każdej strony. Następnie umieść szkiełka na płaskiej powierzchni mokrego lodu i przykryj je.

Pozostaw szkiełka na 10 minut lub do momentu, gdy żel zastygnie. Następnie wyjmij szkiełka, upewniając się, że wysuszyłeś tył każdego z nich. Oznacz kasetę z tkankami do przetwarzania biopsji i osadzania dla każdej próbki.

Użyj krawędzi żyletki, aby delikatnie popchnąć dysk z każdego kierunku, aby uwolnić go od szkła. Gdy dysk łatwo się przesuwa, powoli odepchnij go od szkiełka i połóż go płaską stroną do dołu bezpośrednio na papierze. Utrzymanie wyraźnych dysków w stanie nienaruszonym podczas przesuwania ich ze szklanego szkiełka na papier może być trudne.

Jeśli na dysku pojawi się zmarszczka, pozwól mu powrócić do pierwotnej pozycji, dodaj więcej żelu i ponownie żeluj szkiełko. Złóż papier wokół dysku, aby zapobiec przemieszczaniu się. Przenieś to do kasety, a następnie zamknij kasetę.

Zanurz kasetę w zlewce wypełnionej PBS. W tym badaniu zastosowano zmodyfikowaną metodę osadzania opartą na dyskach żelowych, aby skutecznie generować wysoką wydajność wysepek na sekcję. Morfologia wysepek gryzoni jest zauważalnie bardziej nienaruszona po odtworzeniu po izolacji w podłożu wysp trzustkowych, wykazując gładką, zaokrągloną powierzchnię i zwarty kulisty kształt.

Fakt, że morfologia ludzkich wysepek jest podobna, niezależnie od tego, czy są one osadzone w dniu przybycia, czy po nocnym odzyskaniu po wysyłce, może wynikać z tego, że wysepki regenerują się po stresie izolacyjnym przed wysyłką. Dla porównania, skrawki parafiny uzyskane za pomocą starej techniki mikrorurek mają mniejszy obszar przekroju poprzecznego tkanki z mniejszą liczbą wysepek na sekcję oraz z gęsto upakowanymi wysepkami i kulkami. Jak pokazano tutaj, technika ta jest w stanie wytworzyć wysokiej jakości skrawki wysp trzustkowych do barwienia histologicznego i immunofluorescencyjnego.

Barwienie insuliną i glukagonem pokazuje zróżnicowany skład i niejednorodność architektury wysp, co pokazuje znane różnice w architekturze między wysepkami ludzkimi, mysi i szczurów. Obrazy te przedstawiają również szeregowe sekcje tych samych wysepek. Wykazanie, że technika ta jest w stanie uzyskać wiele odcinków z tych samych wysepek.

Po opanowaniu technika ta oszczędza czas w porównaniu z techniką mikrowirówki. Formowanie dysku na płaskiej powierzchni, a nie w rurce, ułatwia fizyczne przeniesienie dysku do kasety w celu przetworzenia. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię wysp trzustkowych, można ją również zastosować do innych bloków komórkowych lub kruchych tkanek, które są trudne do cięcia.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby użyć żelu o małej objętości, aby skoncentrować tkankę na małym obszarze i uformować dysk na płaskiej powierzchni. Bardzo ważne jest również stosowanie probówek do mikrowirówek i końcówek do pipet o niskim poziomie wiązania w celu poprawy wydajności tkanek. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się biologią wysp trzustkowych do zbadania składu i niejednorodności typów komórek, interakcji komórka-komórka oraz regulacji genów w całych hodowanych wyspach trzustkowych w ich natywnej architekturze.

Możliwość wygenerowania 10 lub więcej sekcji zawierających wiele wysepek z jednego warunku doświadczalnego pozwala na ilościowe określenie wielu wyników na tym samym materiale, poprawiając wydajność eksperymentu. Zastosowanie tej techniki do próbek tkanek o ograniczonej obfitości może przynieść korzyści również w innych dziedzinach. Elementy tej procedury mogą wymagać modyfikacji w celu spełnienia potrzeb użytkownika.

Należy zoptymalizować intensywność fiksacji i podział. Za pomocą tej techniki można wygenerować grubszy lub większy dysk. Proste kroki przetwarzania osadzania mogą wymagać zagnieżdżenia i należy je zoptymalizować.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wygenerować wysokiej jakości blok komórek agarozowych dla odcinków parafiny całych hodowanych wysp trzustkowych.