Name: Osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę osadzania wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych do badań nad cukrzycą. Technika ta zachowuje natywną architekturę 3D tkanek i optymalizuje uzysk z rzadkiego materiału, umożliwiając ocenę wielu parametrów z jednej próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy Grupie Biologii Komórki Beta w Centrum Doskonałości UMass Diabetes za pomocne rady i dyskusje. Ludzkie wyspy trzustkowe zostały dostarczone przez finansowany przez NIDDK Zintegrowany Program Dystrybucji Wysp Trzustkowych (IIDP) w City of Hope. Ta praca została sfinansowana przez NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) oraz przez grant American Diabetes Association #1-15-BS-003 (LCA) we współpracy z Zakonem Amarantusa.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UMass Medical School. Badania nad ludzkimi wyspami trzustkowymi zostały uznane przez UMass Institutional Review Board za niekwalifikujące się do przeglądu IRB lub zwolnienia, ponieważ nie obejmują wykorzystania ludzi.
1. Izolacja i kultura wysepek
<ol>
	<li>Odizoluj wyspy trzustkowe i oddziel je od zanieczyszczonej tkanki zewnątrzwydzielniczej i przewodowej wybraną metodą. 
	UWAGA: Ta metoda została zoptymalizowana przy użyciu wysepek wyizolowanych przez insuflację przewodową kolagenazy i separację Ficoll12 (gryzoń) lub wysepek po wysyłce ze Zintegrowanego Programu Dystrybucji Wysepek (IIDP13; człowiek). Wysepki zostały ręcznie pobrane za pomocą mikropipety P200.</li>
	<li>Aby zoptymalizować morfologię wysp trzustkowych, pozwól im zregenerować się przez noc w 10 ml kompletnej pożywki dla wysp trzustkowych (RPMI z 10% FBS, penicyliną/streptomycyną i 5,5 mmol/l glukozy) w wilgotnej komorze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Chociaż ten krok nie jest wymagany do uzyskania sekcji, wysepki są bardziej nienaruszone po okresie rekonwalescencji (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Fiksacja wysepek
<ol>
	<li>Używając końcówki P200 o niskim poziomie wiązania, ręcznie wybierz około 250 odpowiedników wysepek (IEQ)13 za pomocą skalibrowanej siatki pod mikroskopem stereoskopowym do 1,5 ml nisko wiążącej probówki mikrofuge. Słabo wiążące końcówki i rurki zmniejszają utratę wysp trzustkowych.</li>
	<li>Pozwól, aby wysepki osiadły na dnie rurki do mikrofuge. Usunąć większość supernatantu za pomocą końcówki pipety P200, uważając, aby nie usunąć żadnych wysepek.</li>
	<li>Dodaj 1 ml PBS. Odwirować probówkę w wahadłowym wiadrze, odwirować, aż prędkość osiągnie 200 x g, a następnie zatrzymać wirowanie. Usunąć supernatant. Powtórz pranie PBS, w sumie dwa prania.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 10% roztworu formaliny lub 4% świeżo przygotowanego paraformaldehydu. Ustaw w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W przypadku wyników testowanych w tej metodzie te metody fiksacji były nie do odróżnienia. Możliwe może być również krótsze mocowanie; Zaleca się optymalizację czasu fiksacji w celu uzyskania pożądanego rezultatu.</li>
	<li>Usuń utrwalacz za pomocą końcówki P200.</li>
	<li>Dodaj 1 ml PBS. Odwirować probówkę, aż prędkość osiągnie 200 x g, a następnie zatrzymać wirowanie. Usunąć supernatant. Powtórz pranie PBS, w sumie dwa prania.</li>
	<li>Przejdź od razu do następnego kroku.</li>
</ol>
3. Przygotowanie dysku wysepek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Przy pierwszym użyciu stopić żel (np. Histogel) w temperaturze 70 °C i przygotować porcje w probówkach do mikrofug o pojemności 1,5 ml do długotrwałego przechowywania. Objętość podwielokrotności nie jest krytyczna, ponieważ podwielokrotności można ponownie wykorzystać.</li>
	<li>Ogrzać żel (około 100 μl na próbkę) w temperaturze 70 °C, umieszczając probówkę z mikrofugą zawierającą podwielokrotność żelu w bloku grzewczym ustawionym na 70 °C.</li>
	<li>Przenieś niebieskie kulki agarozy (10 μl na każdą próbkę) do 1,5 ml czystej probówki do mikrofuge. Dokładnie zawiesić kulki przed pipetowaniem. 
	UWAGA: Niebieskie kulki są mieszane z wysepkami, aby pomóc w wizualnej identyfikacji materiału osadzonego w guziku agarozowym i bloku parafiny. Liczba użytych niebieskich koralików nie ma decydującego znaczenia dla wyniku, ale unikaj nadmiernej liczby koralików (>5 razy więcej wysepek), aby umożliwić optymalne rozmieszczenie wysepek w sekcjach.</li>
	<li>Umyj niebieskie koraliki dwukrotnie 1 ml PBS. Przy każdym praniu wiruj koraliki przez 1 minutę przy 800 x g. Po drugim przemyciu ponownie zawiesić kulki w (n+2) x 10 μl PBS, gdzie n jest liczbą probówek z próbką; na przykład dla 2 probówek na próbkę objętość PBS do dodania do kulek wyniesie 40 μl.</li>
	<li>Odwirować probówkę do mikrodmuchowania zawierającą wysepki (krótkie wirowanie do 200 x g) i usunąć większość supernatantu. Odciąć końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 10 μl nożyczkami lub ostrzem i dodać 10 μl kulek do każdej probówki z wysepką, używając czystej końcówki do każdej próbki. Nie mieszać (aby uniknąć zgubienia wysepek).</li>
	<li>Odwirować wysepki i kulki (krótkie wirowanie do 200 x g). Usuń jak najwięcej PBS za pomocą nieobciętej końcówki do mikropipet o pojemności 10 μl.</li>
	<li>Oznacz szkiełka mikroskopowe w celu identyfikacji próbki. Na każdym szkiełku można przygotować od dwóch do trzech próbek. Umieść szkiełko na ławce w pobliżu bloku grzewczego z podgrzanym żelem. Odetnij końcówki od trzech do pięciu końcówek mikropipet o niskim poziomie wiązania 20 μl na próbkę za pomocą żyletki lub nożyczek. Załaduj dwie mikropipety P20 z odciętymi końcówkami, aby umożliwić szybkie przełączanie z jednej na drugą.</li>
	<li>Za pomocą pierwszej mikropipety dodaj 15 - 20 μl ciepłego żelu do rurki z mikrofugami wysepek/kulek; natychmiast wymieszaj, unikając pęcherzyków; i nałóż płynną mieszaninę agaru/wysepek/kulek na szkiełko, aby utworzyć krążek o średnicy <1 cm. Umieść krążek w pobliżu krawędzi szkiełka, pozostawiając miejsce na zewnętrzny pierścień żelowy (następny krok). Stuknij delikatnie w zjeżdżalnię kilka razy, aby osadzić wysepki i koraliki.</li>
	<li>Za pomocą drugiej mikropipety dodać 20 μl ciepłego żelu do probówki z próbką. Za pomocą pierwszej mikropipety wymieszaj nowy żel z pozostałymi wysepkami/kulkami, ponownie rozgrzej w bloku grzewczym, jeśli zacznie krzepnąć, a następnie nałóż tę mieszaninę na szkiełko, otaczając oryginalny krążek. Powtarzaj w razie potrzeby, używając dodatkowych wstępnie przyciętych końcówek, aż tarcza osiągnie pożądany rozmiar i grubość. 
	UWAGA: Obsługa żelowanej tarczy jest łatwiejsza, jeśli pierścień zewnętrzny jest nieco grubszy. Zazwyczaj wystarczają 3 x 20 μL żelu. Ten krok minimalizuje utratę wysepek przez płukanie rurek i dodaje agarozę ubogą w wysepki na zewnątrz tarczy, aby ułatwić obsługę tarczy.</li>
	<li>Przygotuj każdą płytę indywidualnie i uważnie śledź kolejność próbek, jeśli umieszczasz wiele płyt na każdym slajdzie.</li>
	<li>Umieść szkiełka na płaskiej powierzchni mokrego lodu, przykrywając, na 10 minut lub do momentu, gdy żel zastygnie. Trudniej jest zsunąć dysk ze szkła, jeśli wyschnie.</li>
	<li>Oznacz kasety z tkankami do przetwarzania/osadzania biopsji ołówkiem, po jednej na próbkę. Osusz tylną część szkiełka, aby uniknąć zamoczenia niebieskiego papieru.</li>
	<li>Używając krawędzi żyletki, delikatnie popchnij krążek w każdym kierunku, aby uwolnić go od szkła. Gdy łatwo się przesuwa, powoli wepchnij krążek ze szkiełka mikroskopowego na niebieską bibułkę. Umieść dysk płaską stroną do dołu, bezpośrednio na papierze.</li>
	<li>Trzymając dysk płasko, złóż papier wokół dysku, aby zapobiec jego przesuwaniu się, umieść dysk w złożonym papierze w kasecie i zamknij kasetę. Jeśli krążek nie zsunie się czysto ze szkła, dodaj więcej żelu i/lub umieść szkiełko z lodem na kilka minut.</li>
	<li>Zanurz kasetę w PBS w zlewce. Proces zatapiania parafiny tego samego dnia w celu uzyskania optymalnej morfologii.</li>
</ol>
4. Osadzanie parafiny
UWAGA: Przetwarzaj krążki żelu z wysp trzustkowych na bloki parafinowe, używając skróconej serii odwodnień, jak opisano poniżej. Ta technika została zoptymalizowana przy użyciu automatycznego procesora, ale ręczne przetwarzanie powinno dać podobne wyniki.
<ol>
	<li>Zanurz kasety w 85% etanolu na 15 minut.</li>
	<li>Zanurz kasety w 95% etanolu na 15 minut.</li>
	<li>Zanurz kasety w 100% etanolu na 15 minut. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania.</li>
	<li>Zanurz kasety w ksylenie na 15 minut. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania.</li>
	<li>Zanurz kasety w stopionej parafinie na 10 minut.</li>
	<li>Przenieś kasety do świeżej stopionej parafiny na 10 - 30 minut.</li>
	<li>Ostrożnie otwórz kasetę i rozpakuj niebieski papier. Wyjmij krążek żelu, zwracając uwagę na płaską powierzchnię, która znajdowała się naprzeciwko papieru. Osadź tarczę w małej formie, płaską (zawierającą wysepkę) powierzchnią do dołu, równolegle do powierzchni cięcia. W przypadku wtyczki ostrożnie wyjmij ją z kasety i umieść w małej foremce z końcówką skierowaną w stronę powierzchni cięcia.</li>
</ol>
5. Cięcie i barwienie parafiny
<ol>
	<li>Etykietuj slajdy sekwencyjnie, jeśli wymagane są sekcje seryjne.</li>
	<li>Zleć wycięcie skrawków parafiny o grubości 5 μm przez doświadczonego histotechnologa. Aby zmaksymalizować wydajność, zapisz wszystkie sekcje zawierające materiał. Ogólnie rzecz biorąc, zebranie 20 sekcji pozwala na uchwycenie większości materiału.</li>
	<li>Przechowywać sekcje w temperaturze pokojowej. Skrawki są podatne na rutynowe barwienie histologiczne (np. H&E) i immunofluorescencję (np. insulina, glukagon i DAPI). W razie potrzeby zoptymalizuj wiązanie dla innych antygenów.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+architecture%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li>
<li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li>
<li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+demand+regulates+%CE%B2+cell+number+via+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li>
<li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Induces+Mouse+%CE%B2-Cell+Proliferation+via+IRS2%2C+MTOR%2C+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li>
<li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li>
<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li>
<li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%3A+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Veterinary+Laboratory+Diagnosticians%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li>
<li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li>
<li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+cell+block+processing%3A+The+Cell-Gel+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li>
<li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+infusion+in+mice%3A+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li>
<li>Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://iidp.coh.org/">http://iidp.coh.org/</a> (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Ta zmodyfikowana metoda zatapiania oparta na żelowych krążkach zapewnia prosty, niedrogi i wydajny sposób generowania wysokiej wydajności wysepek na sekcję. Konstrukcja tarczy żelowej na płaskiej powierzchni szklanej ułatwia rozprowadzanie wysepek w równomiernym rozkładzie na dobrze zdefiniowanym obszarze. Rozłożenie wysepek w płaskim dysku ma tę zaletę, że wiele wysepek znajduje się w płaszczyźnie przekroju, optymalizując wydajność i umożliwiając wykorzystanie mniejszej liczby wysepek. Grubość tarczy można dostosować do...

Wysepki trzustkowe Langerhansa, jedyne źródło krążącej insuliny, są kluczową tkanką dla badaczy zajmujących się cukrzycą. Z dowolnego organizmu, wysepki mają różną wielkość, częstotliwość typów komórek i architekturę1,2,3. Konwencjonalną strategią badania in vivo struktury i składu komórek endokrynnych wysp trzustkowych jest cięcie tkanki trzustki4,5. Ponieważ wyspy trzustkowe stanowią tylko niewielką część całkowitej zawartości komórkowej trzustki, badania molekularne przeprowadza się na izolowanych wyspach. Eksperymenty z hodowlą wysp trzustkowych ex vivo badające reakcję na składniki odżywcze, modulację genów (transfekcję, transdukcję) lub eksperymentalne zabiegi dostarczają ważnych informacji na temat mechanizmów modulujących przeżycie, proliferację i funkcję komórek endokrynnych5,6.
Eksperymenty ex vivo z wyspami trzustkowymi często są analizowane za pomocą badań molekularnych całych wysp trzustkowych lub badań histologicznych lub molekularnych rozproszonych komórek wysp trzustkowych hodowanych w monowarstwie5,6. Analiza molekularna całych wysp trzustkowych wprowadza poważne zastrzeżenie dotyczące mieszania typów komórek, które mogą dawać wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie po ekstrapolacji na dowolny pojedynczy typ komórek. Dyspersja komórek na szkiełkach nakrywkowych do mikroskopii po hodowli umożliwia pomiar wyników specyficznych dla typu komórki, ale zaburza architekturę wysp trzustkowych, co może zmienić odpowiedź na interwencję i uniemożliwia identyfikację wyników związanych z architekturą. Ponadto na ogół można zmierzyć tylko jeden wynik; Na przykład, aby zmierzyć proliferację komórek beta i śmierć komórek beta w tych samych warunkach, należy przeprowadzić dwa oddzielne eksperymenty. Podejścia te są również ślepe na zmienność między wysepkami, która jest obszarem rosnącego zainteresowania w tej dziedzinie. Sortowanie komórek wysp trzustkowych za pomocą cytometrii przepływowej w badaniach molekularnych specyficznych dla typu komórki lub badań RNA pojedynczej komórki jest eleganckie, ale kosztowne, czasochłonne, ograniczone przez obfitość tkanek, eliminujące architekturę i niezbyt dobrze nadające się do rutynowych analiz hodowli komórkowych5,7. Obrazowanie konfokalne całych wysepek wysepkowych barwionych immunologicznie dostarcza wysokiej jakości danych o nienaruszonej architekturze, ale jest pracochłonne, a dane uzyskane z każdej próbki są ograniczone do wyników możliwych do zidentyfikowania w jednym immunostainingu8.
Możliwość generowania wysokiej jakości sekcji parafiny na całych wysepkach postkulturowych rozwiązałaby wiele z tych problemów. Cenne są kosztowne tkanki wysp trzustkowych o niskiej liczebności pochodzące z unikalnych modeli genetycznych lub od dawców narządów ludzkich, a także status wysp trzustkowych po eksperymentalnych manipulacjach in vivo lub in vitro. Uzyskanie wielu skrawków parafiny z tych samych wysepek pozwoliłoby na przeprowadzenie wielu analiz specyficznych dla typu komórki i nienaruszonej architektury w tym samym eksperymencie.
Istniejące techniki generowania granulek wysepek do podziału są niedoskonałe. Zoptymalizowana histologicznie agaroza to wodny żel o niskiej temperaturze topnienia, który jest szeroko stosowany w przetwarzaniu próbek histologicznych i cytologicznych, w tym małych lub rozdrobnionych próbek tkanek, które są trudne do przetworzenia9. Jednym ze sposobów osadzania wysepek jest zawieszenie wysepek w agarozie w probówce mikrowirówkowej, odwirowanie w celu osadzenia materiału, pobranie korka agarowego, a następnie przetworzenie i osadzenie w celu podziału10,11. Ekstrakcja zestalonej próbki z dna probówki jest czasochłonna i trudna, co prowadzi do sporadycznego rozdrobnienia próbki i ryzyka obrażeń ciała. Wysepki są skoncentrowane w końcówce korka, co prowadzi do nieodpowiedniego rozmieszczenia wysepek w odcinkach uzyskanych tą metodą. Okrągłe dno wtyczki komplikuje osadzanie w taki sposób, że do przekrojenia może zostać przedstawiony obszar ubogi w wysepki. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta prowadzi do niskiego plonu i rozmieszczenia zbitych wysepek w powstałych sekcjach.
Ta nowa metoda jest uproszczonym i ulepszonym podejściem do przygotowania odcinków wysepek. Wysepki są skoncentrowane w małej objętości, a następnie umieszczane na gładkiej powierzchni szkiełka mikroskopowego, tworząc mały dysk, z wysepkami w jednej płaszczyźnie. Krążek Histogel-wyspa trzustkowa jest następnie przetwarzany w celu zatopienia parafiny w skróconym protokole odwadniania i infiltracji ksylenu. Poprzednie podejście, które koncentruje wysepki na dnie rurki do mikrofuge, jest również przeprowadzane jako porównanie. Ta nowa technika poprawia wydajność wysepek na sekcję, rozmieszczenie wysepek w każdej sekcji i zajmuje mniej czasu na przeniesienie bloków wysepek do kaset. Technika ta jest przydatna dla biologów wysp trzustkowych lub innych naukowców badających małe fragmenty tkanki, którzy chcą zmaksymalizować produktywne wykorzystanie tkanki o niskiej liczebności poprzez pomiar wielu wyników na jednej próbce w jej natywnej architekturze tkankowej.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówka Eppendorf</td><td>Norgen Bioteck Corp</td><td>P/N 10113&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw startowy Ranin Classic</td><td>ShopRanin</td><td>17008708</td><td></td></tr><tr><td>Ranin ClassicPipette PR-2</td><td>ShopRanin</td><td>17008648</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do wiązania niskiego (1000 &mu; L)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka o niskim wiązaniu (200 &mu; L)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka o niskim wiązaniu (20 &mu; L)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka o niskim wiązaniu (10 &mu; L)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór formaliny</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>VWR</td><td>949312</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Niebieskie koraliki agarozowe - Affi-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta do przetwarzania tkanek</td><td>Simport</td><td>M492-10</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Wraps</td><td>Procesor tkanek Leica-Surgipath</td><td>3801090</td><td></td></tr><tr><td>Citadel 2000</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>McCormick Scientific</td><td>39503002</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td>Finezja ME+</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało insulinowe</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało glukagonowe</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield z DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 594 przeciwciała drugorzędowe</td><td>Technologie życia</td><td>A11076</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 488 przeciwciała drugorzędowe</td><td>Technologie życia</td><td>A11001</td><td></td></tr></tbody></table>

osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Eksperymenty z użyciem izolowanych wysp trzustkowych są ważne dla badań nad cukrzycą, ale wyspy trzustkowe są drogie i mają ograniczoną obfitość. Wysepki zawierają mieszaną populację komórek w ustrukturyzowanej architekturze, która wpływa na funkcję, a ludzkie wyspy trzustkowe są bardzo zróżnicowane pod względem składu typu komórki. Obecnie często stosowane metody badania hodowanych wysp trzustkowych obejmują badania molekularne wykonywane na całych wyspach, wrzucanie do jednego worka różnych typów komórek wysp trzustkowych lub badania mikroskopowe lub badania molekularne na rozproszonych komórkach wysp trzustkowych, zaburzające architekturę wysp trzustkowych. W przypadku badań wysp trzustkowych in vivo cięcie trzustki zatopionej w parafinie jest potężną techniką oceny wyników specyficznych dla komórek w natywnym środowisku trzustki. Badanie wysepek po hodowli przez cięcie parafiny przyniosłoby kilka korzyści: wykrywanie wielu wyników na tych samych wysepkach (potencjalnie nawet na dokładnie tych samych wysepkach, przy użyciu odcinków seryjnych), pomiary specyficzne dla typu komórki oraz utrzymanie natywnych interakcji komórka-komórka wyspa trzustkowa i komórka-podłoże zarówno podczas ekspozycji eksperymentalnej, jak i do analizy. Jednak istniejące techniki osadzania izolowanych wysepek po kulturze są nieefektywne, czasochłonne, podatne na straty materiału i na ogół wytwarzają sekcje z nieodpowiednią liczbą wysepek, aby były przydatne do ilościowego określania wyników. Laboratoria patologii klinicznej są niedostępne i niepraktyczne dla laboratoriów badań podstawowych. Opracowaliśmy ulepszoną, uproszczoną metodę laboratoryjną, która generuje sekcje o solidnym plonie i rozmieszczeniu wysepek. Stałe wysepki są ponownie zawieszane w ciepłym histologicznym żelu agarozowym i pipetowane do płaskiego krążka na standardowym szkiełku podstawowym, tak aby wysepki były rozmieszczone w płaszczyźnie. Po standardowym odwodnieniu i zatopieniu, z tego samego bloku wysepki można wyciąć wiele (10+) odcinków 4 - 5 μm. Za pomocą tej metody można przeprowadzić analizy histologiczne i immunofluorescencyjne na wyspach trzustkowych myszy, szczurów i ludzi. Jest to skuteczne, niedrogie i oszczędzające czas podejście do oceny wyników specyficznych dla typu komórki i nienaruszonej architektury z hodowanych wysepek.

Ilustracyjny schemat etapów przygotowania krążka żelowego przedstawiono na Rysunku 1. Metoda krążka żelowego pozwala na uzyskanie skrawków parafinowych zawierających wystarczającą liczbę wysepek rozmieszczonych w jednej płaszczyźnie, co umożliwia rzetelną kwantyfikację wyników. Rysunek 2 przedstawia obrazy uzyskanych skrawków przy małym powiększeniu, aby zobrazować liczbę wysepek uchwyconych w jednym skrawku. Zazwyczaj w każdym s...

Badania ex vivo wysp trzustkowych są ważne dla badań nad cukrzycą. Istniejące techniki badania hodowanych wysepek w ich natywnej architekturze trójwymiarowej są czasochłonne, nieefektywne i rzadko stosowane. W pracy opisano nową, prostą i wydajną metodę generowania wysokiej jakości skrawków parafinowych całych hodowanych wysepek.

Osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Metoda ta może pomóc naukowcom zmaksymalizować produktywne wykorzystanie wysp trzustkowych do oceny wielu wyników na każdej próbce w jej natywnej architekturze tkankowej. Główną zaletą tej nowej metody osadzania jest to, że wysepki są równomiernie rozmieszczone na dobrze zdefiniowanym obszarze, umieszczając wiele wysepek w płaszczyźnie przekroju, co optymalizuje eksperymentalny plon z tego materiału o niskiej obfitości. Procedurę zademonstruje doktor Yahui Kong, pracownik naukowy w moim laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, użyj końcówki do pipety p200 o niskim poziomie wiązania i skalibrowanej siatki pod mikroskopem stereoskopowym, aby ręcznie wybrać odpowiedniki 250 wysepek. Przenoszenie ich do każdej 1,5-mililitrowej probówki z mikrofugą o niskim poziomie wiązania. Niech wysepki osiądą na dnie rurki do mikrofuge.Następnie użyj pipety ze świeżą końcówką p200, aby ostrożnie usunąć większość supernatantu. Upewnij się, że nie usuniesz żadnych wysepek. Dodaj jeden mililitr PBS i odwiruj w wirówce z wahadłowym wiadrem, aż prędkość osiągnie 200-krotność grawitacji, a następnie zatrzymaj wirowanie.Usunąć supernatant. Powtórz cały proces prania PBS, w sumie dwa cykle prania. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 10% roztworu formaliny lub 4% świeżo przygotowanego paraformaldehydu.Pozwól próbce utrwalić się w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie użyj pipety z końcówką p200, aby usunąć utrwalacz. Dodaj jeden mililitr PBS i wiruj, aż prędkość osiągnie 200 razy grawitacji, a następnie zatrzymaj wirowanie.Usunąć supernatant, a następnie powtórzyć cały proces płukania PBS jeszcze raz, w sumie dwa cykle płukania. Przygotuj żądany żel w 1,5 mililitrowych probówkach mikrowirówek, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie umieść te probówki mikrowirówkowe w bloku grzewczym o temperaturze 70 stopni Celsjusza, aby podgrzać żel.Użyj przeciętej końcówki mikropipety, aby przenieść 10 mikrolitrów niebieskich kulek agarozy na próbkę do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj jeden mililitr PBS do kulek, a następnie odwiruj przy 800-krotności grawitacji przez jedną minutę. Wyjmij PBS i powtórz to pranie jeszcze raz.Po drugim praniu ponownie zawieś koraliki w odpowiedniej ilości PBS. Odwiruj probówki zawierające wysepki, aż prędkość osiągnie 200-krotność grawitacji, a następnie zatrzymaj wirowanie. Usunąć większość supernatantu.Za pomocą nożyczek odetnij koniec jednej końcówki mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów dla każdej próbki. Dodaj 10 mikrolitrów koralików do każdej rurki wysepki za pomocą czystej, odciętej końcówki dla każdej próbki. Następnie odwiruj, aż prędkość osiągnie 200-krotność grawitacji.Następnie użyj nieoszlifowanej 200 mikrolitrów, a następnie końcówki 10 mikrolitrów, aby usunąć jak najwięcej PBS. Oznacz szkiełka mikroskopowe w celu identyfikacji próbki i umieść je na stole w pobliżu bloku grzewczego z podgrzanym żelem. Za pomocą nożyczek odetnij końce kilku słabo wiążących końcówek mikropipet na próbkę.Za pomocą mikropipety wyposażonej w odciętą końcówkę dodaj ciepły żel do probówki zawierającej wysepki i koraliki. Wymieszaj natychmiast, unikając tworzenia się pęcherzyków. Nałóż tę mieszaninę na szkiełko, tworząc krążek w pobliżu krawędzi szkiełka, pozostawiając miejsce na zewnętrzny pierścień żelowy.Następnie delikatnie dotknij zjeżdżalni kilka razy, aby osadzić wysepki i koraliki. Dodaj 20 mikrolitrów ciepłego żelu do probówki z próbką i wymieszaj nowy żel z pozostałymi wysepkami i kulkami. Zastosuj tę mieszaninę do tego samego slajdu otaczającego oryginalny dysk.Powtórz w razie potrzeby, używając świeżych, wstępnie przyciętych końcówek do każdej aplikacji, aż krążek osiągnie pożądany rozmiar i grubość. Upewnij się, że przygotowujesz każdy dysk osobno i śledzisz kolejność próbek, jeśli umieszczasz wiele dysków z każdej strony. Następnie umieść szkiełka na płaskiej powierzchni mokrego lodu i przykryj je.Pozostaw szkiełka na 10 minut lub do momentu, gdy żel zastygnie. Następnie wyjmij szkiełka, upewniając się, że wysuszyłeś tył każdego z nich. Oznacz kasetę z tkankami do przetwarzania biopsji i osadzania dla każdej próbki.Użyj krawędzi żyletki, aby delikatnie popchnąć dysk z każdego kierunku, aby uwolnić go od szkła. Gdy dysk łatwo się przesuwa, powoli odepchnij go od szkiełka i połóż go płaską stroną do dołu bezpośrednio na papierze. Utrzymanie wyraźnych dysków w stanie nienaruszonym podczas przesuwania ich ze szklanego szkiełka na papier może być trudne.Jeśli na dysku pojawi się zmarszczka, pozwól mu powrócić do pierwotnej pozycji, dodaj więcej żelu i ponownie żeluj szkiełko. Złóż papier wokół dysku, aby zapobiec przemieszczaniu się. Przenieś to do kasety, a następnie zamknij kasetę.Zanurz kasetę w zlewce wypełnionej PBS. W tym badaniu zastosowano zmodyfikowaną metodę osadzania opartą na dyskach żelowych, aby skutecznie generować wysoką wydajność wysepek na sekcję. Morfologia wysepek gryzoni jest zauważalnie bardziej nienaruszona po odtworzeniu po izolacji w podłożu wysp trzustkowych, wykazując gładką, zaokrągloną powierzchnię i zwarty kulisty kształt.Fakt, że morfologia ludzkich wysepek jest podobna, niezależnie od tego, czy są one osadzone w dniu przybycia, czy po nocnym odzyskaniu po wysyłce, może wynikać z tego, że wysepki regenerują się po stresie izolacyjnym przed wysyłką. Dla porównania, skrawki parafiny uzyskane za pomocą starej techniki mikrorurek mają mniejszy obszar przekroju poprzecznego tkanki z mniejszą liczbą wysepek na sekcję oraz z gęsto upakowanymi wysepkami i kulkami. Jak pokazano tutaj, technika ta jest w stanie wytworzyć wysokiej jakości skrawki wysp trzustkowych do barwienia histologicznego i immunofluorescencyjnego.Barwienie insuliną i glukagonem pokazuje zróżnicowany skład i niejednorodność architektury wysp, co pokazuje znane różnice w architekturze między wysepkami ludzkimi, mysi i szczurów. Obrazy te przedstawiają również szeregowe sekcje tych samych wysepek. Wykazanie, że technika ta jest w stanie uzyskać wiele odcinków z tych samych wysepek.Po opanowaniu technika ta oszczędza czas w porównaniu z techniką mikrowirówki. Formowanie dysku na płaskiej powierzchni, a nie w rurce, ułatwia fizyczne przeniesienie dysku do kasety w celu przetworzenia. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię wysp trzustkowych, można ją również zastosować do innych bloków komórkowych lub kruchych tkanek, które są trudne do cięcia.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby użyć żelu o małej objętości, aby skoncentrować tkankę na małym obszarze i uformować dysk na płaskiej powierzchni. Bardzo ważne jest również stosowanie probówek do mikrowirówek i końcówek do pipet o niskim poziomie wiązania w celu poprawy wydajności tkanek. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się biologią wysp trzustkowych do zbadania składu i niejednorodności typów komórek, interakcji komórka-komórka oraz regulacji genów w całych hodowanych wyspach trzustkowych w ich natywnej architekturze.Możliwość wygenerowania 10 lub więcej sekcji zawierających wiele wysepek z jednego warunku doświadczalnego pozwala na ilościowe określenie wielu wyników na tym samym materiale, poprawiając wydajność eksperymentu. Zastosowanie tej techniki do próbek tkanek o ograniczonej obfitości może przynieść korzyści również w innych dziedzinach. Elementy tej procedury mogą wymagać modyfikacji w celu spełnienia potrzeb użytkownika.Należy zoptymalizować intensywność fiksacji i podział. Za pomocą tej techniki można wygenerować grubszy lub większy dysk. Proste kroki przetwarzania osadzania mogą wymagać zagnieżdżenia i należy je zoptymalizować.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wygenerować wysokiej jakości blok komórek agarozowych dla odcinków parafiny całych hodowanych wysp trzustkowych.

pancreatic-islet-embedding-for-paraffin-sections

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę sekcji służącą do przetwarzania ludzkiej trzustki w celu uzyskania wielu formatów przechowywania. Orientacja anatomiczna jest zachowana we wszystkich obszarach trzustki, aby umożliwić określenie regionalnego składu i gęstości wysepek.

Protokół pobierania trzustki ludzkiej

W niniejszym filmie zaprezentowano procedury charakterystyki ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) oraz immunohistochemii (IHC). Przekroje trzustki z obszarów głowy, trzonu i ogona poddaje się barwieniu H&amp;E oraz IHC w celu określenia składu endokrynnego wysepek (insulina, glukagon i polipeptyd trzustkowy), replikacji komórek (Ki67) oraz nacieków zapalnych (H&amp;E, CD3). Obszar haczykowaty jest lokalizowany za pomocą IHC w kierunku...

Protokoły barwienia dla ludzkich wysepek trzustkowych

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Mikrodysekcja laserowa to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek z niewielkich ilości miąższu. W tym miejscu opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych do wykorzystania w badaniach transkryptomicznych. Nasz protokół poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich pobieranie.

Ulepszony protokół mikrodysekcji laserowej ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania sekcji ludzkiej trzustki w trzech wymiarach (3D) przy użyciu zoptymalizowanych metod pasywnego oczyszczania. Niniejszy manuskrypt demonstruje te procedury pasywnego oczyszczania optycznego, a następnie wielokrotnego barwienia immunofluorescencyjnego w celu zidentyfikowania kluczowych elementów autonomicznych i czuciowych sieci neuronowych unerwiających ludzkie wyspy trzustkowe.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości sieci neurowyspiowej ludzkiej trzustki

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Tutaj prezentujemy protokół mający na celu poprawę podziału parafiny. Metoda ta łączy cięcie i pływanie za pomocą prostej studzienki termostatycznej, aby uniknąć procesu przenoszenia wymaganego przez metodę konwencjonalną. W rezultacie znacznie poprawiła się wydajność i liczba nienaruszonych skrawków parafiny.

Metoda cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie do cięcia

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

To badanie przedstawia zastosowanie żywych wycinków tkanki trzustki do badania fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami odpornościowymi wysp trzustkowych.

Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej

Dootrzewnowe podawanie leków jest bezpiecznym i skutecznym nieinwazyjnym sposobem na wywołanie uszkodzenia trzustki. W badaniu tym porównano pięć różnych protokołów wstrzyknięć dootrzewnowych na myszach w celu wywołania różnego stopnia uszkodzenia trzustki i ustanowiono model ciężkiego uszkodzenia trzustki w celu zbadania zmian patologicznych i strategii leczenia ciężkiego ostrego zapalenia trzustki (SAP).

Przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj metodę osadzania wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych do badań nad cukrzycą. Technika ta zachowuje natywną architekturę 3D tkanek i optymalizuje uzysk z rzadkiego materiału, umożliwiając ocenę wielu parametrów z jednej próbki.

Osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych

Przeglądaj więcej filmów