Name: Mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj mikroprzepływową technologię oczyszczania komórek inżynieryjnych z wolnych nanocząstek przy użyciu inercyjnej mikrofluidyki w spiralnym mikroukładzie. Metoda umożliwia wysokoprzepustowe przetwarzanie do 10 milionów komórek na mililitr.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Uprzejmy dar komórek THP-1 od dr Marka Chonga oraz pomoc w mikroprodukcji od dr Yuejun Kang i dr Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) zostały bardzo docenione. Projekt ten został sfinansowany przez NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. był wspierany przez stypendium podoktorskie Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine).

1. Znakowanie nanocząsteczek (NP) mezenchymalnych komórek macierzystych i monocytów
<ol>
	<li>Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami do ≥80% zbiegu przed znakowaniem. Podobnie, hodowla komórek THP-1 (ATCC) w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełniona 10% FBS do gęstości ~106 komórek/ml.</li>
	<li>Załaduj NP krzemionki (~500 μm) roztworem barwnika kalceinowego (200 μM), mieszając przez noc. Wytwarzaj PLGA-kalceinę AM (CAM) przy użyciu protokołu opisanego wcześniej. 22 Rozdział 22
	<ol>
		<li>Rozpuścić 250 μg CAM i 100 mg PLGA (50:50) w chloroformie w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wytwarzać pojedyncze nanocząsteczki emulsji za pomocą homogenizatora o dużej prędkości (13 600 x g, 60 s) w temperaturze pokojowej. Odparować chloroform w okapie chemicznym (≥3 godz.) przed pobraniem za pomocą wirowania (3 400 x g przez 5 min), mycia (woda podwójnie destylowana), liofilizacji i przechowywania w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować nanocząsteczki CAM-PLGA (1 mg) lub nanocząsteczki krzemionki kalceinowej (150 μg) w 0,01% roztworze poli-L-lizyny (PLL) w temperaturze pokojowej przez 15 - 20 min.</li>
	<li>Wirować przy 3 400 x g przez 5 minut w celu usunięcia nadmiaru supernatantu PLL przed ponownym zawieszeniem nanocząstek w 1 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Inkubować NP z komórkami (MSCs lub THP-1, ~1 - 2 x 106 komórek w sumie) przez około 24 godziny (stężenie znakowane 0,1 mg·ml−1</li>).
	<li>Oddzielić i zebrać oznakowane przylegające MSCs za pomocą 2 ml 0,25% trypsyny (5 min, 37 °C) i zalać 6 ml DMEM. Odwirować komórki w temperaturze (1 000 x g, 4 min) i ponownie zawiesić do stężenia 105 - 106 komórek/ml do przetwarzania mikroprzepływowego. Użyj znakowanych komórek THP-1 (10,5 - 10,6 komórek/ml) bezpośrednio do oczyszczania mikrofluidyki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Produkcja urządzeń
	<ol>
		<li>Wytwarzanie spiralnego urządzenia mikroprzepływowego (500 μm (w) × 115 μm (h)) z polidimetylosiloksanem (PDMS) z zestawu komercyjnego przy użyciu standardowych etapów miękkiej litografii. 23</li>
		<li>Dokładnie wymieszać 30 g prepolimeru bazowego i 3 g utwardzacza w łódce wagowej. Odgazować mieszaninę w eksykatorze przez 60 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Wlej mieszaninę PDMS na formę główną wafla krzemowego z wzorem spiralnego kanału ostrożnie na wysokość ~5 - 10 mm.</li>
		<li>Odgazować mieszaninę w próżni eksykatora przez 60 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Powtarzaj proces, aż wszystkie pęcherzyki zostaną wyeliminowane.</li>
		<li>Utwardź mieszaninę PDMS w piekarniku o temperaturze 80 °C przez 2 godziny, aż PDMS się zetnie. Upewnij się, że płytka nie jest przechylona podczas utwardzania, aby mieć stałą wysokość urządzenia.</li>
		<li>Wytnij urządzenie spiralne PDMS za pomocą skalpela i ostrożnie oderwij płytę PDMS od formy głównej.</li>
		<li>Przytnij krawędzie urządzenia skalpelem, aby zapewnić gładką powierzchnię do klejenia.</li>
		<li>Przebić dwa otwory (1.5 mm) na wloty i dwa otwory (1.5 mm) na wyloty w urządzeniu PDMS za pomocą dziurkacza do biopsji 1.5 mm.</li>
		<li>Umyj urządzenie izopropanolem (IPA) w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń i wysusz urządzenie w piekarniku o temperaturze 80 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Oczyść dolną powierzchnię urządzenia PDMS (z funkcjami kanałów) za pomocą taśmy maskującej.</li>
		<li>Wyczyść jedną stronę szkiełka szklanego (2 cale na 3") za pomocą taśmy maskującej.</li>
		<li>Ostrożnie umieść i wyeksponuj oczyszczone powierzchnie urządzenia PDMS oraz szkiełka w komorze myjki plazmowej i poddaj je działaniu odkurzenia przez 60 sekund. Następnie włącz moc plazmy na maksimum i obniż ciśnienie w komorze, aż komora zmieni kolor na różowy.
		<ol>
			<li>Wystawić powierzchnie na działanie plazmy powietrznej przez 60 sekund. Plazma tworzy reaktywne formy na odsłoniętych powierzchniach PDMS i szkła, co umożliwia ścisłe wiązanie w przypadku fizycznego kontaktu. Wyłącz zasilanie plazmy i zwolnij ciśnienie z myjki plazmowej, aby odzyskać urządzenie i szkiełko podstawowe.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Połącz ze sobą urządzenie PDMS i szkiełko szkiełkowe, mocno dociskając powierzchnie naświetlone plazmą i upewniając się, że między dwiema powierzchniami nie są uwięzione pęcherzyki.</li>
		<li>Podgrzewaj złączone urządzenie za pomocą płyty grzejnej ustawionej na 80 °C przez 2 godziny, aby wzmocnić wiązanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Działanie urządzenia
	<ol>
		<li>Wyciąć dwa kawałki rurki (1,52 mm średnicy zewnętrznej) o średnicy zewnętrznej ~15 - 20 cm na strzykawki wlotowe i przymocować końcówkę strzykawki (rys. 23) na jednym końcu każdej rurki.</li>
		<li>Wytnij dwa kawałki rurki (1.52 mm OD) o długości ~5 - 10 cm na wyloty i przymocuj do otworów wylotowych urządzenia PDMS.</li>
		<li>Przed uruchomieniem próbki należy ręcznie zalać urządzenie strzykawką zawierającą 70% etanolu, aż wypłynie on z rurki wylotowej. Pozostaw etanol na 30 sekund do 1 minuty, aby wysterylizować urządzenie.</li>
		<li>Do strzykawki o pojemności 60 ml naładować 30 ml przefiltrowanego (0,2 μm porów) buforu osłonkowego (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)) i zabezpieczyć strzykawkę na pompie strzykawkowej. Ustaw pompę na prawidłowe ustawienia (Rozmiar strzykawki: 60 ml, Objętość: 60 000 μl). 
		Uwaga: Dodanie BSA do PBS ma na celu zminimalizowanie wiązania komórka-komórka i niespecyficznego wiązania między komórkami a urządzeniem PDMS.</li>
		<li>Załadować 3 ml oznakowanych komórek do strzykawki o pojemności 3 ml i zabezpieczyć strzykawkę na oddzielnej pompie strzykawkowej. Ustaw pompę na prawidłowe ustawienia (wielkość strzykawki: 3 ml, objętość: 3 000 μl).</li>
		<li>Sprawdzić, czy w strzykawkach nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza, aby zapewnić stabilny przepływ. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, delikatnie wyrzucając kilka kropel płynu z dyszy.</li>
		<li>Podłączyć końcówki strzykawki i rurkę wlotową do strzykawek i włożyć je do odpowiednich wlotów urządzenia (osłona i wlot próbki). Upewnij się, że wzdłuż rurki nie ma pęcherzyków.</li>
		<li>Zamontuj urządzenia na mikroskopie z odwróconym kontrastem fazowym, aby obrazować w czasie rzeczywistym podczas procesu sortowania komórek.</li>
		<li>Zabezpiecz małą zlewkę na odpady i dwie probówki o pojemności 15 ml blisko urządzenia na stoliku mikroskopu za pomocą klejów.</li>
		<li>Umieścić rurki wylotowe w zlewce na odpady.</li>
		<li>Ustawić stosunek przepływu próbki do bufora osłony na 1:10 i uruchomić obie pompy strzykawkowe, aby zainicjować proces sortowania (Przykład: 120 μl/min dla strzykawki z próbką i 1 200 μl/min dla strzykawki z osłoną; prędkość przepływu w kanale ~0,38 m/s).</li>
		<li>Uruchom urządzenie na 1,5 minuty, aby natężenie przepływu się ustabilizowało. Można to potwierdzić obecnością komórek zogniskowanych inercyjnie w pobliżu wewnętrznej ścianki kanału w jasnym polu z kontrastem fazowym przy użyciu szybkiej kamery (~5 000 - 10 000 klatek na sekundę (fps), czas naświetlania: 10-50 μs).</li>
		<li>Umieść rurki wylotowe w różnych rurkach, aby zebrać eluenty z wylotu ogniwa i wylotu odpadów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wiraja, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+technology+for+tracking+cells%27+status+%26+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Ther%22%5BJournal%5D)">Aptamer technology for tracking cells' status & function.</a> Mol. Cell. Ther. 2, 33(2014).</li>
<li>Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosensors+for+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanosensors for Regenerative Medicine.</a> J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).</li>
<li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+imaging+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).</li>
<li>Soenen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+toxicity+of+inorganic+nanoparticles%3A+Common+aspects+and+guidelines+for+improved+nanotoxicity+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation.</a> Nano Today. 6, 446-465 (2011).</li>
<li>Donaldson, K., Poland, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicity%3A+challenging+the+myth+of+nano-specific+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).</li>
<li>Veiseh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-+and+shape-dependent+foreign+body+immune+response+to+materials+implanted+in+rodents+and+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates.</a> Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).</li>
<li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+clearance+is+governed+by+Th1%2FTh2+immunity+and+strain+background%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background.</a> J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).</li>
<li>Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+methods+for+the+isolation+of+murine+blood+neutrophils+with+respect+to+the+release+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+and+the+expression+of+immunological+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors.</a> Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).</li>
<li>Morton, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+metamaterials%3A+Microfabricated+arrays+to+steer%2C+refract%2C+and+focus+streams+of+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-specific+sorting+of+rare+cells+using+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).</li>
<li>Cummings, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streaming+dielectrophoresis+for+continuous-flow+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Eng.+Med.+Biol.+Mag%22%5BJournal%5D)">Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices.</a> IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).</li>
<li>Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decomplexing+biofluids+using+microchip+based+acoustophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis.</a> Lab Chip. 9, 810-818 (2009).</li>
<li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+inertial+focusing%2C+ordering%2C+and+separation+of+particles+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).</li>
<li>Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability-based+cell+classification+and+enrichment+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 11, 912-920 (2011).</li>
<li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioengin%22%5BJournal%5D)">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).</li>
<li>Gossett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+manipulation+and+transfer+of+microparticles+across+laminar+fluid+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams.</a> Small. 8, 2757-2764 (2012).</li>
<li>Amini, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+fluid+flow+using+sequenced+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering fluid flow using sequenced microstructures.</a> Nat. Commun. 4, 1826(2013).</li>
<li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidic+programming+of+microparticle-laden+flows+for+solution+transfer+around+cells+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles.</a> Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).</li>
<li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+biophysical+markers+predictive+of+mesenchymal+stromal+cell+multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).</li>
<li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Sci. Rep. 3, 1259(2013).</li>
<li>Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+and+drug-resistance+profiling+of+bacteremias+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).</li>
<li>Yeo, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference-free+Micro%2Fnanoparticle+Cell+Engineering+by+Use+of+High-Throughput+Microfluidic+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell+cycle+synchronization+using+inertial+forces+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).</li>
<li>Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics+for+continuous+particle+separation+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana w niniejszym dokumencie technologia oczyszczania komórek DFF umożliwia szybką i ciągłą separację znakowanych komórek w sposób wysokoprzepustowy. Takie podejście do separacji jest idealne do przetwarzania próbek o dużej objętości lub wysokim stężeniu komórek i jest lepsze niż konwencjonalna filtracja membranowa, która jest podatna na zatykanie się po dłuższym użytkowaniu. Podobnie, separacja magnetyczna oparta na powinowactwie wymaga dodatkowych etapów znakowania komórek, które są pracochłonne i kosztowne. Wykazan...

Inżynieria komórek za pomocą mikro/nanocząsteczek (NP) załadowanych agentem to prosta, wolna od integracji genomowej i wszechstronna metoda zwiększania możliwości obrazowania biologicznego i rozszerzania/uzupełniania jej natywnych właściwości terapeutycznych w medycynie regeneracyjnej. 1-3 Modyfikacje komórkowe uzyskuje się poprzez znakowanie błony plazmatycznej lub cytoplazmy nadmiernym stężeniem nanocząsteczek obciążonych czynnikiem w celu nasycenia miejsc wiązania. Jednak główną wadą tej metody są znaczne ilości niezwiązanych cząstek pozostających w roztworze po procesach znakowania komórek, co może potencjalnie zakłócić precyzyjną identyfikację komórek zmodyfikowanych cząsteczkami lub skomplikować wyniki terapeutyczne. 4,5 Ponadto narażenie na nanocząstki zawierające czynniki transformujące (czynniki wzrostu, kortykosteroidy itp.) w zbyt wysokim stężeniu może powodować cytotoksyczność, a niewłaściwie ukierunkowane narażenie może wywołać niezamierzone konsekwencje dla komórek niebędących przedmiotem zwalczania. Nawet nośniki cząstek stałych składające się z materiałów "biokompatybilnych" [np. poli(kwasu mlekowo-koglikolowego), PLGA] mogą również w pewnych warunkach wywoływać silne odpowiedzi komórek odpornościowych. 6 Jest to szczególnie ryzykowne u osób z upośledzoną odpornością (np. reumatoidalne zapalenie stawów), co potencjalnie opóźnia ogólnoustrojowy usuwany nanocząsteczki. 7 W związku z tym skuteczne usuwanie wolnych cząstek przed wprowadzeniem komórek modyfikowanych cząsteczkami ma ogromne znaczenie dla zminimalizowania profilu toksyczności i zmniejszenia niewłaściwie skierowanego narażenia na cząstki obciążone czynnikami in vivo.
Konwencjonalne wirowanie gradientowe jest często używane do oddzielania komórek inżynieryjnych od wolnych cząstek, ale jest pracochłonne i odbywa się w trybie wsadowym. Co więcej, naprężenia ścinające, których doświadczają komórki podczas wirowania z dużą prędkością oraz składniki ośrodka gradientu gęstości, mogą zagrozić integralności komórek i/lub wpływać na zachowanie komórek. 8 Mikrofluidyka jest atrakcyjną alternatywą dla kilku technologii separacji, w tym deterministycznego przemieszczenia bocznego (DLD)9, dieletroporezy10,11 i akustoforezy12 opracowanych do zastosowań związanych z separacją małych cząstek i wymianą. Jednak metody te mają niską przepustowość (1-10 μl·min−1) i są podatne na problemy z zatykaniem. Aktywne separacje, takie jak metody oparte na dielektroforezie, wymagają również różnic w wewnętrznych fenotypach komórek dielektroforetycznych lub dodatkowych etapów znakowania komórek w celu uzyskania separacji. Bardziej obiecującym podejściem jest mikrofluidyka inercyjna – boczna migracja cząstek lub komórek przez linie strumieni w celu skupienia się w różnych pozycjach ze względu na dominujące siły nośne (FL) przy wysokiej liczbie Reynoldsa (Re). 13 Ze względu na wysokie warunki przepływu i doskonałą rozdzielczość rozmiaru, jest on często wykorzystywany do separacji komórek w oparciu o rozmiar14,15 i zastosowań związanych z wymianą. 16-18 Jednak wydajność wymiany buforowej pozostaje niska w przypadku ∼10−30% roztworu zanieczyszczeń, ponieważ oddzielone komórki zwykle pozostają blisko granicy między oryginalnymi i nowymi roztworami buforowymi. 16-18 Co ważniejsze, rozkład wielkości komórek docelowych musi być podobny, aby uzyskać precyzyjne inercyjne ogniskowanie i separację od oryginalnego roztworu buforowego, co stanowi problem zwłaszcza w przetwarzaniu heterogenicznych typów komórek, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSC). Rozdział 19
Wcześniej opracowaliśmy nową technikę inercyjnego sortowania komórek mikrofluidycznych, zwaną Frakcjonowaniem Przepływu Deana (DFF) do izolowania krążących komórek nowotworowych (CTC)20 i bakterii21 z krwi pełnej za pomocą urządzenia mikrokanałowego z 2 wlotami i 2 wylotami. W tym protokole wideo opiszemy proces znakowania zawiesiny komórek monocytowych THP-1 (ludzka linia komórkowa ostrej białaczki monocytowej) (~15 μm) i MSCs (10-30 μm) nanocząsteczkami naładowanymi kalceiną, a następnie wytworzenia i obsługi mikrourządzenia spiralnego DFF w celu skutecznego odzyskiwania znakowanych komórek i usuwania niezwiązanych NP.22 Ta jednoetapowa strategia oczyszczania umożliwia ciągłe odzyskiwanie znakowanej zawiesiny i przylegających komórek zawieszonych w świeżym roztworze buforowym bez wirowania. Co więcej, może przetwarzać do 10 milionów komórek·ml−1, gęstość komórek nadającą się do zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

<table><tbody><tr><td><silne>Linie komórkowe i Pożywka</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mezenchymalne komórki macierzyste (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Komórki monocytowe THP-1 (THP-1)</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media</td><td>Lonza</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki i odczynniki Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,01% poli-L-lizyna (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr> 3 <tr><td>ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>302113</td><td>Strzykawka 3 ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>60 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309653</td><td>Strzykawka 60 ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Biowest</td><td>P6154-100GR</td><td></td></tr><tr><td>Calcein, AM (CAM)</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>#P/7507/17</td><td>HPLC Grade 2,5 l</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516Q/12</td><td></td></tr><tr><td>Zwykłe szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>FIS#12-550D</td><td>75 x 25 x 1 mm3</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>3M</td><td>21200702044</td><td>18 mm x 25 m</td></tr><tr><td>Krzemionka NPs (&sim; 200 &mu; m)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>748161</td><td>Wielkość porów 4 nm</td></tr><tr><td>Końcówka strzykawki</td><td>Technologia JEC</td><td>7018302</td><td>23 G 0,013 x 0,25</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Tygon</td><td>Spectra-Teknik</td><td>06419-01</td><td>0,02 x 0,06 "100</td></tr><tr><td>Poly (D,L-laktyd-ko-glikolid) (PLGA; 50:50)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji</td><td>Harris Uni-Core</td><td>69036-15</td><td>1,50 mm</td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>Scienceware</td><td>111/4 IN OD</td><td></td></tr><tr><td>Szybka kamera</td><td>Phantom&nbsp;</td><td>V9.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowym&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmowego</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Chemyx</td><td>CX Fusion 200</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Inżynieria komórek z mikro/nanocząstkami (NP) naładowanymi aktywnymi składnikami staje się coraz bardziej popularną metodą zwiększania natywnych właściwości terapeutycznych, umożliwiania obrazowania biologicznego i kontroli fenotypu komórki. Krytyczną, ale nieodpowiednio rozwiązaną kwestią jest znaczna liczba cząstek, które pozostają niezwiązane po znakowaniu komórek, a których nie można łatwo usunąć za pomocą konwencjonalnego wirowania. Prowadzi to do wzrostu szumu tła w obrazowaniu biologicznym i może nadawać efekty transformacyjne sąsiednim komórkom niedocelowym. W tym protokole przedstawiamy strategię wymiany opartą na mikrofluidyce inercyjnej, określaną jako frakcjonowanie przepływu Deana (DFF), aby skutecznie oddzielać znakowane komórki od wolnych nanocząsteczek w sposób wysokoprzepustowy. Opracowane spiralne mikrourządzenie ułatwia ciągłe gromadzenie (>90% odzysku komórek) oczyszczonych komórek (THP-1 i MSC) zawieszonych w nowym roztworze buforowym, przy jednoczesnym osiągnięciu >95% zubożenia niezwiązanego barwnika fluorescencyjnego lub nanocząsteczek obciążonych barwnikiem (krzemionki lub PLGA). Ta jednoetapowa, oparta na wielkości strategia oczyszczania komórek umożliwia wysoką przepustowość przetwarzania komórek (10-6 komórek/min) i jest bardzo przydatna do oczyszczania komórek o dużej objętości z mikro/nanocząstek w celu uzyskania wolnego od zakłóceń zastosowania klinicznego.

Po całonocnym znakowaniu komórek nanocząsteczkami (NP) obciążonymi środkiem do obrazowania biologicznego, znakowane komórki (zawierające wolne cząstki) są zbierane i oczyszczane za pomocą spiralnego mikroukładu DFF w celu usunięcia wolnych NP w procesie jednoetapowym (Rysunek 1A). Spiralny mikrokanał z dwoma wlotami i dwoma wylotami został zaprojektowany przy użyciu oprogramowania inżynieryjnego i wykonany za pomocą fotorezystu SU-8. Wzorcowy wafelek krzemowy służy następ...

Ten protokół opisuje wykorzystanie strategii wymiany opartej na inercyjnej mikroprzepływowości do oczyszczania komórek inżynierii mikro/nanocząsteczkowej z efektywnym usuwaniem niezwiązanych cząstek.

Mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie wygodnej, wydajnej i wysokoprzepustowej mikrofluidycznej technologii oczyszczania, służącej do oddzielania wolnych nanocząstek od komórek po przeprowadzeniu inżynierii komórkowej z użyciem nanocząstek. Głównym założeniem tej technologii jest umożliwienie szybkiego i efektywnego usuwania niezwiązanych nanocząstek po zakończeniu procedury modyfikacji komórek. Ta mikrofluidyczna technologia oczyszczania komórek zapewnia wydajną separację opartą na rozmiarze dzięki różnicowym efektom ogniskowania inercyjnego komórek i nanocząstek w spiralnym urządzeniu mikrofluidycznym.Urządzenie pozwala na przetwarzanie do 10 milionów komórek na ml stężenia, co jest bardzo użyteczne w medycynie regeneracyjnej, jak również przy przetwarzaniu dużych objętości komórek. Technologia ta jest wysoce pożądana w dziedzinie inżynierii komórkowej, w której często wykorzystuje się nanocząsteczki do znakowania komórek w celu obrazowania lub kontroli funkcji. Procedurę zademonstrują Hui Min Tay, asystent naukowy z mojego laboratorium, oraz doktor David Yeo, postdoktorant z laboratorium profesora Xi.Hoduj mezenchymalne komórki macierzyste do stopnia konfluencji

microfluidic-buffer-exchange-for-interference-free-micronanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje system mikroprzepływowy do testu immunologicznego opartego na magnetycznych nanocząsteczkach. System detekcji wykorzystuje urządzenie mikroprzepływowe zawierające pułapkę magnetyczną w swoich kanałach. Do kanałów wprowadzane są wstępnie uformowane immunokompleksy, składające się z pokrytych antygenem nanocząstek magnetycznych związanych z przeciwciałami pierwszorzędowymi i przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą. Immunokompleksy zostają wychwycone w...

Test immunologiczny oparty na nanocząstkach magnetycznych przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Proponujemy prostą technikę samoorganizacji koloidalnych nanocząstek krzemionki w celu stworzenia nanofluidycznego połączenia między dwoma mikrokanałami w polidimetylosiloksanie (PDMS). Korzystając z tej techniki, nanoporowatą membranę perełkową o wielkości porów do ~45 nm wbudowano w mikrokanał i zastosowano do elektrokinetycznego wstępnego zagęszczenia próbek DNA.

Tworzenie połączeń nanofluidycznych poniżej 50 nm w chipie mikroprzepływowym PDMS poprzez proces samoorganizacji cząstek koloidalnych

Opisano protokół dla nowatorskiej platformy polaryzacji stężenia jonów (ICP), która może zatrzymać rozprzestrzenianie się strefy ICP, niezależnie od warunków pracy. Ta unikalna zdolność platformy polega na wykorzystaniu łączącego się zubożenia i wzbogacania jonów, które są dwiema biegunowościami zjawiska ICP.

Łączenie polaryzacji stężenia jonów między zestawionymi membranami jonowymiennymi w celu zablokowania propagacji strefy polaryzacji

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Obecny protokół opisuje pneumatyczną platformę mikroprzepływową, która może być używana do efektywnego koncentracji mikrocząstek.

Pneumatycznie napędzana platforma mikroprzepływowa do zagęszczania mikrocząstek

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Ten protokół opisuje prosty proces, który wykorzystuje wygodne plastikowe mikro-formy do prostych operacji mikrotłoczenia w celu wytworzenia mikrokanałów na nanofibrylowanym papierze celulozowym, osiągając minimalną szerokość 200 μm.

Mikrotłoczenie: wygodny proces wytwarzania mikrokanalików na mikrofluidyce na bazie papieru nanocelulozowego

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Poznaj mikroprzepływową technologię oczyszczania komórek inżynieryjnych z wolnych nanocząstek przy użyciu inercyjnej mikrofluidyki w spiralnym mikroukładzie. Metoda umożliwia wysokoprzepustowe przetwarzanie do 10 milionów komórek na mililitr.

Mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń

Przeglądaj więcej filmów