Mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie wygodnej, wydajnej i wysokowydajnej technologii oczyszczania mikroprzepływowego, która umożliwia oddzielanie wolnych nanocząstek od komórek, zgodnie z inżynierią komórkową z nanocząstkami. Główną potrzebą tej technologii jest umożliwienie szybkiego i skutecznego usuwania niezwiązanych nanocząstek Po procedurze porodu komórkowego zbieramy wszystkie nasze ses-fa-tiony. Ta technologia mikroprzepływowego oczyszczania komórek osiąga wydajną separację opartą na wielkości dzięki różnicowym efektom inercyjnego ogniskowania komórek i nanocząstek w spiralnym mikrourządzeniu.

Może przetwarzać do 10 milionów komórek na promil, co jest bardzo przydatne w medycynie regeneracyjnej, a także w przetwarzaniu komórek objętościowych. Technologia ta jest bardzo pożądana w dziedzinie inżynierii komórkowej, która często wykorzystuje nanocząsteczki do pracy komórek, do celów obrazowania lub kontroli funkcji. Procedurę zademonstruje Hui Min Tay, asystent naukowy z mojego laboratorium, a także doktor David Yeo, doktor habilitowany z laboratorium profesora Xi.

Hoduj mezenchymalne komórki macierzyste do ponad 80% konfluencji na płytce sześciodołkowej przed znakowaniem komórek nanocząstkami. Podobnie hoduj komórki THP-1 do gęstości miliona komórek na mililitr. Następnie rozpuść jeden miligram nanocząstek krzemionki w jednym mililitrze dwustu mikromolowego roztworu barwnika wapniowego.

I mieszaj cząsteczki przez noc. Wytwarzaj również nanocząstki wapnia AM PLGA przy użyciu metod opisanych w przedstawionym tutaj odniesieniu. Wymieszać jeden miligram nanocząstek wapnia AM PLGA lub 150 mikrogramów nanocząstek krzemionki wapniowej w 01% roztworze poli-l-lizyny w wodzie, pipetując roztwór w górę iw dół przez jedną minutę.

A następnie pozwól mu inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut. Następnie odwiruj nanocząstki. Usunąć nadmiar supernatantu poli-l-lizyny i ponownie zawiesić nanocząstki w jednym mililitrze pożywki odpowiedniej dla typu komórki, która ma być znakowana.

Dodaj 1 miligram znakowanych nanocząstek do jednego mililitra pożywki na każdy milion komórek w hodowli. Dokładnie pipetować mieszaninę komórek, nanocząstek i pożywki przez jedną minutę. A następnie inkubować mieszaninę przez około 24 godziny.

Po znakowaniu należy zdysocjować i zebrać komórki macierzyste, a następnie ponownie zawiesić je do stężenia od 100 000 do 1 000 000 komórek na mililitr w celu przetwarzania mikroprzepływowego. Używaj znakowanych komórek THP-1 w tym samym stężeniu. Aby wytworzyć spiralne urządzenie mikroprzepływowe, najpierw przygotuj silikonową formę wzorcową do wafli przy użyciu standardowych technik mikrowytwarzania.

Następnie dokładnie wymieszaj 30 gramów bazowego prepolimeru PDMS i trzy gramy utwardzacza w łódce wagowej. Odgazuj mieszaninę w próżni przez 60 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Wlej mieszaninę PDMS na formę główną, ozdobioną wzorem kanału spiralnego, ostrożnie na wysokość od pięciu do 10 milimetrów.

Następnie odgazowuj mieszaninę przez 60 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie pęcherzyki zostaną wyeliminowane. Następnie umieść wafel w piekarniku i upewnij się, że wafel nie jest przechylony podczas utwardzania, aby zapewnić stałą wysokość urządzenia.

Utwardź PDMS w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po ostygnięciu wytnij spiralne urządzenie PDMS za pomocą skalpela i ostrożnie oderwij płytę PDMS od formy głównej. Następnie za pomocą skalpela przyciąć krawędzie urządzenia, aby zapewnić gładką powierzchnię do klejenia.

Następnie użyj 1,5-milimetrowego stempla do biopsji, aby utworzyć dwa otwory na wloty i dwa otwory na wyloty. Umyj urządzenie izopropanolem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. I suszyć urządzenie w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie użyj taśmy maskującej, aby wyczyścić dolną powierzchnię urządzenia PDMS i jedną stronę szkiełka podstawowego. Ostrożnie umieść szkiełko podstawowe i urządzenie PDMS w komorze plazmowej z odsłoniętymi czystymi powierzchniami. Włącz moc plazmy na maksimum, obniż ciśnienie w komorze, aż komora zmieni kolor na różowy i wystaw komponenty na 60 sekund.

Następnie należy wyjąć szkiełko i urządzenie PDMS z komory. I połącz je ze sobą, mocno dociskając do siebie powierzchnie naświetlone plazmą. Upewnij się, że między dwiema powierzchniami nie są uwięzione żadne pęcherzyki.

Podgrzej połączone urządzenie na płycie grzejnej ustawionej na 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby wzmocnić wiązanie. Wytnij dwa kawałki rurki o długości od 15 do 20 centymetrów na wloty i przymocuj igłę o rozmiarze 23 na jednym końcu każdej rurki. Następnie wytnij dwa kawałki tej samej rurki o długości od pięciu do 10 centymetrów na wyloty i przymocuj je do otworów wylotowych urządzenia.

Przed uruchomieniem próbki należy ręcznie napełnić urządzenie strzykawką zawierającą 70% etanolu, aż wypłynie on z rurki wylotowej. Pozostaw etanol w urządzeniu na co najmniej 30 sekund, aby go wysterylizować. Następnie załaduj 30 mililitrów przefiltrowanego PBS z 1% BSA do 60-mililitrowej strzykawki.

Załaduj również trzy mililitry oznakowanych komórek do trzymililitrowej strzykawki i sprawdź, czy żadne pęcherzyki powietrza nie są uwięzione w żadnej ze strzykawek. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, delikatnie wyrzucając kilka kropel płynu z dyszy. Podłączyć końcówki strzykawki wlotowej i rurkę do strzykawek i przymocować strzykawki do pomp strzykawkowych.

Włóż rurki do odpowiednich wlotów urządzenia i upewnij się, że wzdłuż rurki nie ma pęcherzyków. Po skonfigurowaniu fluidyki zamontuj urządzenie na mikroskopie z odwróconą fazą kontrastu, aby obrazować w czasie rzeczywistym podczas procesu sortowania komórek. Zabezpiecz małą zlewkę na odpady i dwie 15-mililitrowe probówki blisko urządzenia na stoliku mikroskopu.

Umieść rurkę wylotową z obu wylotów urządzenia w zlewce na odpady. Teraz ustaw stosunek przepływu próbki do bufora osłony na jeden do 10, ustawiając natężenie przepływu strzykawki z próbką na 120 mikrolitrów na minutę, a strzykawki z osłonką na 1 200 mikrolitrów na minutę. Uruchom urządzenie na półtorej minuty, aby natężenie przepływu miało szansę się ustabilizować.

Użyj szybkiej kamery, aby potwierdzić obecność komórek zogniskowanych inercyjnie w pobliżu wewnętrznej ściany kanału w jasnym polu z kontrastem fazowym. Po osiągnięciu przepływu w stanie ustalonym, a urządzenie działa prawidłowo, umieść rurki wylotowe w różnych fiolkach, aby zebrać oddzielne eluenty z wylotu ogniwa i wylotu odpadów. Urządzenie to jest w stanie poprawnie posortować znakowaną zawiesinę komórek monocytarnych THP-1 od fluorescencyjnych nanocząstek krzemionki.

Uzyskano wysoką skuteczność separacji, co zostało potwierdzone zarówno przez obrazowanie z dużą prędkością, jak i analizę cytometrii przepływowej. Jednoetapowa strategia oczyszczania umożliwia ciągłe odzyskiwanie znakowanej zawiesiny i przylegających komórek, które są zawieszone w świeżym roztworze buforowym bez konieczności wirowania. Urządzenie jest zdolne do wysokowydajnej separacji zarówno za pomocą krzemionki, jak i nanocząstek PLGA i może oddzielić do 10 milionów komórek na mililitr z taką samą wysoką wydajnością.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać komórki nanocząsteczkami. I jak oczyścić znakowane komórki, usuwając nadmiar niezwiązanych cząstek za pomocą naszego specjalistycznego urządzenia mikroprzepływowego.