Mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie wygodnej, wydajnej i wysokoprzepustowej mikrofluidycznej technologii oczyszczania, służącej do oddzielania wolnych nanocząstek od komórek po przeprowadzeniu inżynierii komórkowej z użyciem nanocząstek. Głównym założeniem tej technologii jest umożliwienie szybkiego i efektywnego usuwania niezwiązanych nanocząstek po zakończeniu procedury modyfikacji komórek. Ta mikrofluidyczna technologia oczyszczania komórek zapewnia wydajną separację opartą na rozmiarze dzięki różnicowym efektom ogniskowania inercyjnego komórek i nanocząstek w spiralnym urządzeniu mikrofluidycznym.

Urządzenie pozwala na przetwarzanie do 10 milionów komórek na ml stężenia, co jest bardzo użyteczne w medycynie regeneracyjnej, jak również przy przetwarzaniu dużych objętości komórek. Technologia ta jest wysoce pożądana w dziedzinie inżynierii komórkowej, w której często wykorzystuje się nanocząsteczki do znakowania komórek w celu obrazowania lub kontroli funkcji. Procedurę zademonstrują Hui Min Tay, asystent naukowy z mojego laboratorium, oraz doktor David Yeo, postdoktorant z laboratorium profesora Xi.

Hoduj mezenchymalne komórki macierzyste do stopnia konfluencji przekraczającego 80% na płytce sześciodołkowej przed znakowaniem komórek nanocząsteczkami. Podobnie hoduj komórki THP-1 do gęstości jednego miliona komórek na mililitr. Następnie rozpuść jeden miligram nanocząsteczek krzemionki w jednym mililitrze roztworu barwnika wapniowego o stężeniu dwustu mikromoli.

Mieszać cząsteczki przez noc. Następnie przygotować nanocząsteczki PLGA z calcium AM, stosując metody opisane w wskazanej tutaj referencji. Wymieszać 1 mg nanocząsteczek PLGA z calcium AM lub 150 µg nanocząsteczek krzemianu wapnia w 0,1% roztworze poli-L-lizyny w wodzie, pipetując roztwór w górę i w dół przez jedną minutę.

Następnie inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut. W kolejnym kroku odwiruj nanocząstki w wirówce. Usuń nadmiar nadsączu zawierającego poli-L-lizynę i resuspenderuj nanocząstki w jednym mililitrze odpowiedniej pożywki hodowlanej dla typu komórek przeznaczonych do znakowania.

Dodaj 1 mg znakowanych nanocząstek do jednego mililitra pożywki na każdy milion komórek w hodowli. Dokładnie pipetuj mieszaninę komórek, nanocząstek i pożywki przez jedną minutę. Następnie inkubuj mieszaninę przez około 24 godziny.

Po oznakowaniu zdysocjować i zebrać komórki macierzyste, a następnie resuspender je do stężenia od 100 000 do 1 000 000 komórek na mililitr w celu przetworzenia mikrofluidycznego. Użyć oznakowanych komórek THP-1 o tym samym stężeniu. Aby wykonać mikrofluidyczne urządzenie spiralne, najpierw przygotować matrycę z wafla silikonowego przy użyciu standardowych technik mikrofabrykacji.

Następnie w naczyniu wagi dokładnie zmieszaj 30 g prepolimeru PDMS oraz trzy gramy utwardzacza. Odgazuj mieszaninę w próżni przez 60 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Ostrożnie wlej mieszaninę PDMS na matrycę z wzorem kanału spiralnego, aż do osiągnięcia wysokości od pięciu do 10 mm.

Następnie odgazuj mieszaninę przez 60 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Powtarzaj ten proces do czasu całkowitego usunięcia pęcherzyków. Następnie umieść wafer w piekarniku, upewniając się, że wafer nie jest przechylony podczas utwardzania, aby zapewnić stałą wysokość urządzenia.

Utwardzaj PDMS w temperaturze 80 °C przez dwie godziny. Po ostygnięciu wytnij urządzenie w kształcie spirali z PDMS za pomocą skalpela i ostrożnie oddziel płytkę PDMS od formy matrycy. Następnie użyj skalpela, aby wyrównać krawędzie urządzenia, zapewniając gładką powierzchnię do wiązania.

Następnie za pomocą trepanu biopsyjnego o średnicy 1,5 mm wykonaj dwa otwory dla wlotów oraz dwa otwory dla wylotów. Przemyj urządzenie izopropanolem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Następnie wysusz urządzenie w piekarniku w temperaturze 80 °C przez pięć minut.

Następnie, używając taśmy maskującej, oczyść dolną powierzchnię urządzenia PDMS oraz jedną stronę szkiełka przedmiotowego. Ostrożnie umieść szkiełko przedmiotowe i urządzenie PDMS w komorze plazmowej, tak aby ich czyste powierzchnie były odsłonięte. Ustaw moc plazmy na maksimum, obniż ciśnienie w komorze, aż przybierze ona różowy kolor, i naświetlaj elementy przez 60 sekund.

Następnie należy wyjąć preparat i urządzenie PDMS z komory. Połącz je ze sobą, mocno dociskając do siebie powierzchnie poddane działaniu plazmy. Upewnij się, że między obiema powierzchniami nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza.

Ogrzewaj złączone urządzenie na płycie grzejnej ustawionej na 80 °C przez dwie godziny, aby wzmocnić wiązanie. Odetnij dwa odcinki rurek o długości od 15 do 20 cm na wloty i przymocuj igłę 23G do jednego końca każdej rurki. Następnie odetnij dwa odcinki tej samej rurki o długości od 5 do 10 cm na wyloty i przymocuj je do otworów wylotowych urządzenia.

Przed analizą próbki należy ręcznie przepłukać urządzenie za pomocą strzykawki zawierającej 70% etanol, aż zacznie on wypływać z rurki wylotowej. Pozostawić etanol w urządzeniu przez co najmniej 30 sekund w celu jego sterylizacji. Następnie do strzykawki o pojemności 60 ml należy nalać 30 ml przefiltrowanego PBS z 1% BSA.

Następnie wprowadź 3 mL oznakowanych komórek do strzykawki o objętości 3 mL i upewnij się, że w żadnej ze strzykawek nie ma pęcherzyków powietrza. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, delikatnie wypychając kilka kropel cieczy przez końcówkę. Podłącz końcówki wlotowe i przewody do strzykawek, a następnie zamocuj strzykawki w pompach strzykawkowych.

Włóż probówki do odpowiednich wlotów urządzenia i upewnij się, że w przewodach nie ma pęcherzyków powietrza. Po przygotowaniu układu płynowego zamocuj urządzenie na odwróconym mikroskopie fazowo-kontrastowym w celu obrazowania w czasie rzeczywistym podczas procesu sortowania komórek. Umieść mały zlewki na odpady oraz dwie probówki o pojemności 15 ml blisko urządzenia na stoliku mikroskopu.

Umieść rurki odpływowe z obu wylotów urządzenia w zlewce na odpady. Następnie ustaw stosunek przepływu próbki do buforu osłonowego na 1:10, ustawiając szybkość przepływu strzykawki z próbką na 120 µL/min, a strzykawki z buforem osłonowym na 1 200 µL/min. Uruchom urządzenie na półtorej minuty, aby umożliwić stabilizację szybkości przepływu.

Użyj kamery o wysokiej szybkości, aby potwierdzić obecność komórek skupionych inercyjnie w pobliżu wewnętrznej ścianki kanału w jasnym polu z kontrastem fazowym. Po osiągnięciu stanu stacjonarnego przepływu i upewnieniu się, że urządzenie działa prawidłowo, umieść rurki wylotowe w oddzielnych probówkach, aby zebrać osobne eluaty z wylotu komórek oraz wylotu odpadów. Urządzenie to pozwala na prawidłowe sortowanie znakowanej zawiesiny monocytów THP-1 od fluorescencyjnych nanocząsteczek krzemionki.

Uzyskano wysoką wydajność separacji, co potwierdzono zarówno za pomocą obrazowania z dużą prędkością, jak i analizy cytometrycznej. Jednoetapowa strategia oczyszczania umożliwia ciągłe odzyskiwanie znakowanej zawiesiny oraz komórek adherentnych zawieszonych w świeżym roztworze buforowym bez konieczności wirowania. Urządzenie pozwala na wysoce wydajną separację zarówno nanocząsteczek krzemionkowych, jak i PLGA, a także może oddzielać do 10 milionów komórek na mililitr z zachowaniem tej samej wysokiej wydajności.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak znakować komórki za pomocą nanocząsteczek oraz jak oczyszczać znakowane komórki poprzez usuwanie nadmiaru niezwiązanych cząsteczek przy użyciu naszego specjalistycznego urządzenia mikroprzepływowego.