Separacja kulek i komórek w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych z wykorzystaniem dielektroforezy i przepływu laminarnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest manipulacja komórkami i kuleczkami w urządzeniach mikrofluidycznych z wykorzystaniem dielektroforezy (DEP) za pomocą płytek drukowanych (PCB). Jest to realizowane poprzez zaprojektowanie i przygotowanie elektrod PCB oraz kanałów mikrofluidycznych. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie zespołu mikrofluidycznego PCB oraz roztworów kuleczek i komórek.

Trzecim krokiem procedury jest wypełnienie kanałów medium o niskiej przewodności, a następnie załadowanie kulek i komórek. Ostatnim etapem procedury jest połączenie zestawu PCB z wzmacniaczem mocy i generatorem funkcji, a następnie uruchomienie DEP. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące separację i manipulację komórkami oraz kulkami w urządzeniach mikroprzepływowych przy użyciu DEP.

Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ użytkownik musi rozumieć zasady DEP, aby opracować skutypną elektrodę współpracującą z urządzeniem mikrofluidycznym do manipulacji wybranymi komórkami lub koralikami. Z drugiej strony, zastosowanie PCB jako elektrod sprawia, że aktywacja komórek i koralików w urządzeniach mikrofluidycznych staje się dostępna dla wielu dyscyplin naukowych. Pierwszym krokiem tej procedury jest zaprojektowanie płytek drukowanych lub elektrod PCB o pożądanej geometrii, która pozwoli na wygenerowanie niejednorodnego pola elektrycznego.

Po zakończeniu projektowania należy zamówić spersonalizowane układy elektrod PCB w komercyjnym zakładzie produkcyjnym. Po otrzymaniu wykonanej na zamówienie płytki PCB, należy ją otworzyć i poddać inspekcji na potrzeby niniejszego pokazu. PCB ma długość 8,4 centymetrów i szerokość 2,1 centymetrów.

Elektrody metalowe mają szerokość pięciu milimetrów. W tym przykładzie elektrody składają się z dwóch długich metalowych pasków oraz dwóch obszarów poprzecznych o długości 4,5 milimetra, w których elektrody są rozmieszczone naprzemiennie (interdigitated). Te obszary grzebieniowe generują silne, niejednorodne pole elektryczne, aby stworzyć połączenie między stymulatorem a elektrodą na płytce PCB.

Umieść drut o przekroju 16 gauge na końcu elektrody. Używając rozgrzanej lutownicy, przymocuj drut do metalowego obszaru płytki PCB. W ten sposób drut zostanie podgrzany.

Przystaw lutnicę z cyną do rozgrzanego drutu i pozwól, aby niewielka ilość spoiwa wpłynęła w drut. Po wypełnieniu drutu lutem wyjmij lutownicę, przytrzymując drut w miejscu do czasu ostygnięcia spoiwa. Powtórz proces lutowania dla drugiego połączenia elektrycznego na płytce PCB.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie kanałów mikrofluidycznych o pożądany wzór rozgałęzień. Wykorzystując standardowe techniki mikrowytwarzania, należy stworzyć formę główną do zdefiniowania kanałów, używając płytki krzemowej oraz fotorezystu SU-8. Forma główna ta posiada jeden kanał dopływowy i trzy kanały docelowe.

Szerokość kanałów wynosi 100 micrometers, a ich wysokość to 27 micrometers. Po przygotowaniu formy matrycowej wymieszaj elastomer polimetylosiloksanowy (PDMS) z utwardzaczem w stosunku wagowym 10:1 i odczekaj pięć minut. Wlej ciekły PDMS na przygotowaną matrycę z SU-8, a następnie usuń pęcherzyki powietrza, poddając ciekły PDMS działaniu próżni przez trzy minuty.

W razie potrzeby powtórz proces próżniowy, aby całkowicie usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Do usunięcia pozostałych pęcherzyków można użyć strumienia azotu. Utwardzaj PDMS w piecu w temperaturze 70 °C przez dwie godziny.

Za pomocą żyletki oddziel warstwę P-D-M-S-S z kanałami mikroprzepływowymi od wafla. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić wafla, kierując stronę z kanałami do góry. Użyj wycinaka do biopsji, aby wykonać otwory do wprowadzania płynów i komórek do urządzenia mikroprzepływowego. Przytnij krawędzie.

Wszelkie nadmiary PDMS. Należy sprawdzić urządzenie mikrofluidyczne, aby upewnić się, że jest ono wolne od kurzu i zanieczyszczeń. Do oczyszczenia PDMS należy użyć taśmy 3M Scotch Magic.

Poddać kanały PDMS oraz czyste szkiełko nakrywkowe o grubości od 80 do 130 µm działaniu gazu plazmowego przez 1,5 minuty. Wyjąć blok PDMS oraz szkiełko nakrywkowe z urządzenia do czyszczenia plazmowego do czerpaka Petriego, przyłączyć kanały mikroprzepływowe PDMS do szkiełka nakrywkowego, a następnie podgrzewać tak przygotowany zestaw mikroprzepływowy na płycie grzewczej ustawionej na 100 °C przez minimum 15 minut. Ostatnim krokiem przygotowania urządzenia mikroprzepływowego jest ustawienie kanałów PDMS i szkiełka nakrywkowego nad elektrodami płytki PCB.

Zacznij od naniesienia około 10 µL oleju mineralnego na PCB. Aby zapewnić szczelny kontakt między PCB a szkiełkiem nakrywnym, umieść zespół kanału mikrofluidycznego ze szkiełkiem nakrywnym na zaolejonym PCB. Dociskając delikatnie zespół mikrofluidyczny ze szkiełkiem nakrywnym do oleju, zapewnij dobry kontakt i zminimalizuj liczbę pęcherzyków powietrza, które mogłyby utrudnić wizualizację komórek i kulek.

Kolejnym ważnym krokiem jest przygotowanie mieszaniny pożywki o niskiej przewodności, zawierającej 8,5% sacharozy i 0,3% glukozy (stosunek masy do objętości) w wodzie dejonizowanej. Urządzenie mikroprzepływowe jest teraz gotowe do użycia; za pomocą pipety należy napełnić każdy kanał mikroprzepływowy od 15 do 20 µL pożywki o niskiej przewodności, jeśli jest to konieczne. Aby usunąć pęcherzyki powietrza z kanałów, należy zastosować aspirację próżniową.

Kolejnym krokiem jest wprowadzenie cząstek testowych do urządzenia mikroprzepływowego. W tym pokazie zastosowano zawiesinę zawierającą 550 kulek polistyrenowych na mikrolitr medium o niskiej przewodności; ponieważ kuleczki mogą z czasem osiadać, należy je ponownie zawiesić poprzez mieszanie. Następnie, używając pipety, wprowadź 200 µL zawiesiny kulek polistyrenowych do kanału.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie elektrod oraz podłączenie wyjścia generatora funkcji do wejścia wzmacniacza mocy AC. Następnie należy podłączyć wyjście wzmacniacza do przewodów elektrod. Wszystkie przewody elektryczne i powierzchnie urządzenia należy zabezpieczyć taśmą izolacyjną, aby chronić użytkowników przed potencjalnym porażeniem prądem.

Ustaw generator funkcji tak, aby generował sygnał sinusoidalny o częstotliwości od 1 do 1,5 MHz. Uruchom DEP, aby rozpocząć sortowanie komórek i kulek w tej konfiguracji. Kanał wlotowy znajduje się po prawej stronie, a trzy kanały docelowe rozdzielają się na rozwidleniu trójdzielnym.

Elektrody PCB odpowiadają czarnym paskom bez przepływu laminarnego i bez DEP. Po uruchomieniu DEP kuleczki pozostają w zasadzie nieruchome, jednak przy braku przepływu. W przypadku włączonego przepływu laminarnego kuleczki migrują w stronę elektrod PCB i oddalają się od przestrzeni między elektrodami.

Jednak gdy DEP jest wyłączone, kule przepływające przez kanały wlotowe dzielą się pomiędzy trzy kanały docelowe. Po uruchomieniu DEP, przy zachowaniu przepływu laminarnego, kule są kierowane tak, aby przepływały wyłącznie przez kanał centralny. W kolejnych filmach urządzenie mikroprzepływowe zostało obrócone nad elektrodami PCB, co spowodowało zmianę orientacji kanałów.

W odniesieniu do elektrod PCB. Kanał wlotowy, który wcześniej był prostopadły do elektrod PCB, jest teraz niemal równoległy do elektrod przy włączonym przepływie laminarnym. Jednak przy wyłączonym DEP kulek wnikają do wszystkich trzech kanałów docelowych w równym stopniu.

Po zainicjowaniu DEP kulki zbliżają się do punktu trifurkacji, a siła DEP wciąga je do kanału bocznego znajdującego się nad elektrodą. Kolejny zestaw obrazów w filmie przedstawia mieszaninę ludzkich komórek gruczolakoraka jelita grubego (HT 29) oraz fluorescencyjnych kulek w urządzeniu mikrofluidycznym. Na tym obrazie DIC otwarta strzałka wskazuje kierunek przepływu laminarnego, a kanały zostały obrysowane liniami przerywanymi.

Odbijające światło elektrody metalowe widoczne są jako jasny prążkowany obszar w tle; do obrazowania kulek wykorzystano mikroskopię DIC. Intensywność skali. Obrazy służą zwiększeniu widoczności komórek.

Ta rycina przedstawia ten sam obraz co poprzednia, jednak w formie obrazu intensywności w skali glow, co pozwala na wizualizację zarówno komórek, jak i kulek. Odblaskowe elektrody metalowe widoczne są na tej rycinie jako żółte i zielone pasy. Przy zastosowaniu DEP kulki opuszczają prawy kanał, co widać na obrazie DIC, natomiast komórki HT 29 opuszczają kanał środkowy i lewy, co obrazuje skala glow przed uruchomieniem DEP. Mieszanina komórek i kulek przepływa z jednego kanału wlotowego do trzech oddzielnych kanałów docelowych.

Po wywołaniu DEP kulki i komórki są selektywnie kierowane do osobnych kanałów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zacząć wdrażać dielektroforezę w celu manipulacji komórkami i kulkami w urządzeniach mikroprzepływowych.