Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

Ogólnym celem tej konfiguracji jest zbadanie zachowań węchowych much w czterokwadrantowym olfaktometrze przy użyciu dostarczonego skryptu oprogramowania do automatycznego śledzenia much. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób węchowe systemy neuronowe wykrywają świat zewnętrzny oraz jak mózg dekoduje i kieruje decyzjami behawioralnymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona wszechstronna i wytrzymała oraz pozwala na wielokrotne testowanie reakcji węchowych populacji much na dużej arenie eksperymentalnej.

Do tego protokołu przygotuj pięć komór nawaniających, które składają się z plastikowego pojemnika zewnętrznego, szklanego pojemnika wewnętrznego i wykonanej na zamówienie wkładki z PTFE. Wkładka jest oryginalną pokrywą pojemnika ze zdjętą częścią środkową i dwoma dołączonymi zaworami jednokierunkowymi. Użyj czterech komór nawaniania do kontroli rozpuszczalnika i jednej komory do testowego środka zapachowego.

Upewnij się, że każda komora jest czysta, a następnie załaduj pojemnik na nawaniacz jednym mililitrem rozpuszczalnika lub rozcieńczenia środka zapachowego. Następnie sprawdź położenie pojemnika w plastikowej komorze i upewnij się, że nie został rozlany płyn. Zabezpiecz pokrywę za pomocą zakrętki i O-ringu na wkładce PTFE, aby zapobiec wyciekom.

Hoduj muchy na standardowym podłożu z mąki kukurydzianej. W standardowej butelce umieść 30 samców i 30 samic i pozwól na składanie jaj przez pięć dni w temperaturze pokojowej. Z takich butelek zbieraj nowo zamknięte muchy.

Dla każdej kohorty eksperymentalnej zbierz 25 samców i 25 samic much w krótkim znieczuleniu dwutlenkiem węgla i pozwól kohorcie starzeć się na standardowym podłożu muchowym przez dwa do czterech dni. 40 do 42 godzin przed eksperymentem przenieś kohortę do fiolki z około 10 mililitrami jednoprocentowego żelu agarozowego dla wilgotności bez jedzenia. Głód pomaga zwiększyć cały ruch, a ponad 90% much powinno przetrwać proces głodu.

Jeśli więcej niż 10% umrze, co może się zdarzyć w przypadku słabego genotypu, spróbuj zastosować jednodniowy głód dla wszystkich much w eksperymencie. Co najmniej pięć minut wcześniej włącz regulator temperatury i ustaw go na 25 stopni Celsjusza. Następnie podłącz komory nawaniania do areny za pomocą plastikowej rurki.

Sprawdź natężenie przepływu powietrza w każdym kwadrancie areny za pomocą elektronicznego przepływomierza. Upewnij się, że strumienie powietrza sterującego i nawaniającego działają z prędkością 100 mililitrów na minutę. Muchy są bardzo wrażliwe na przepływ powietrza i bardzo ważne jest, aby przepływ powietrza dla każdej ćwiartki był weryfikowany przed każdym eksperymentem.

Teraz wyczyść arenę i szklane płyty za pomocą 70% etanolu. Wytrzyj wszystkie części dwa do trzech razy i pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu przed kontynuowaniem. Następnie przymocuj szklane płyty do areny.

Następnie przenieś muchy na arenę bez znieczulenia. Za pomocą grawitacji pozwól im wejść przez otwór w jednej ze szklanych płytek, a następnie przykryj otwór okrągłą siatką. Teraz umieść arenę załadowaną muchami w szczelnej komorze.

Następnie podłącz cztery sterujące strumienie powietrza do każdego rogu areny. Zamknij drzwi komory i pozwól muchom zaaklimatyzować się w nowym środowisku przez 10 do 15 minut. Po okresie aklimatyzacji przeprowadź pięcio- do 10-minutowego eksperymentu kontrolnego, w którym muchy są wystawione na działanie czterech kontrolnych strumieni powietrza.

Niezbędne jest teraz natychmiastowe przeanalizowanie danych. Jeśli muchy nie są równomiernie rozmieszczone na arenie, arena musi zostać zresetowana. Bardzo ważne jest, aby przetestować zachowanie much kontrolnych, aby po prostu oczyścić powietrze.

Pozwoli to szybko sprawdzić, czy wszystkie warunki tła są normalne. Przeciekające światło, nierównowaga temperatury, pochylona arena lub zanieczyszczenie zapachowe mogą powodować problemy. W razie potrzeby wyrzuć muchy i ponownie wyczyść arenę.

W przypadku podejrzenia zanieczyszczenia odorantem wymień wszystkie rurki. Kontynuuj powtarzanie testu kontrolnego z nowymi kohortami, aż zwierzęta nie wykażą preferencji dla żadnej z czterech ćwiartek. Następnie podłącz testową komorę nawaniacza do zestawu za pomocą zaworu trójdrogowego lub ponownie podłącz rurkę i przeprowadź eksperyment testowy przez pięć do 10 minut.

W przypadku dłuższych nagrań eksperymentalnych należy szybko zatrzymywać i ponownie uruchamiać program śledzący co 20 minut, w przeciwnym razie pliki danych będą zbyt duże. Pomiędzy testami wyrzuć muchy, wyczyść arenę i szklane płytki 70% etanolem i wymień rurki łączące. Utrzymuj przepływ suchego powietrza, aby stale przepłukiwać system.

Aby zwiększyć wydajność, dobrze jest mieć dwie areny, aby można było sprzątać podczas biegów. Jeśli kilka eksperymentów nie powiedzie się tego samego dnia, należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że w systemie nie pozostał żaden zapach z poprzedniego przebiegu. Zwykle nie stanowi to problemu w przypadku niskich stężeń nawaniacza lub CO2, ale w przypadku wysoce skoncentrowanych bodźców może być potrzebna nawet 24-godzinna przerwa między seriami eksperymentów.

Do analizy danych użyj dostarczonej niestandardowej procedury Matlab, aby przekonwertować dane na format Matlab. Załaduj plik z surowymi danymi utworzonymi w czasie rzeczywistym przez oprogramowanie śledzące i utwórz maskę przestrzenną, która podąża za konturami areny. Zastosuj maskę do nieprzetworzonych danych, aby usunąć wszystkie punkty danych, które znajdują się poza areną, ponieważ reprezentują szum.

Następnie usuń wszystkie punkty danych, które poruszają się z prędkością mniejszą niż 0,163 centymetra na sekundę przez dłużej niż trzy sekundy. Dane te mogą być szumem lub nieruchomymi muchami. Teraz zwizualizuj pozostałe punkty danych, kreśląc je wszystkie w okresach nagrywania.

Dane mogą być również przeglądane jako pojedyncze trajektorie. Granice zapachu można szybko oszacować na podstawie danych behawioralnych muchy. Następnie oblicz wskaźnik przyciągania i wykonaj testy statystyczne zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

W aparacie behawioralnym przebadano 25 samców i 25 samic much. W odpowiedzi na suche powietrze muchy eksplorowały całą arenę, nie preferując żadnej ćwiartki. Linia pokazuje śledzoną trajektorię jednej muchy.

Kiedy ocet jabłkowy został wprowadzony do strumienia powietrza w lewym górnym kwadrancie, większość much została przyciągnięta do tego kwadrantu zapachu. Kiedy w lewym górnym kwadrancie wprowadzono odstraszający środek zapachowy, 10% propionian etylu, unikano tego kwadrantu. Atrakcyjny indeks tego kwadrantu uzyskał wynik 0,68.

Atrakcyjny indeks jest najczęściej stosowanym wskaźnikiem w pomiarze odpowiedzi węchowej. Wartość wyższa lub niższa od zera oznacza przyciąganie lub odpychanie. Scenariusz zrekompensował niewielkie różnice w pozycji areny między próbami.

Usunięto punkty danych, które mogły być szumem lub nieporuszającymi się muchami. Chociaż test można przeprowadzać przez dowolny czas, interesujące jest obserwowanie zmian w ruchach kohorty w 10-sekundowych przedziałach, aby docenić przyzwyczajenie do zapachu i inne zjawiska. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie uruchamiać i analizować zachowania węchowe w teście czteropolowym.

Po opanowaniu, każdy eksperyment węchowy można ukończyć w około godzinę, a my rutynowo przeprowadzamy od czterech do sześciu eksperymentów w ciągu jednego dnia.