Opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie komórkowego systemu kokultury dwóch typów komórek przy użyciu insertów z przepuszczalną membraną, co umożliwia dyfuzję wydzielanych czynników rozpuszczalnych. Jest to realizowane poprzez serię kroków polegających na precyzyjnym umieszczeniu insertów zawierających jeden typ komórek w wieloodtworowej płytce do hodowli tkanek zawierającej drugi typ komórek. Proces rozpoczynamy od wysiania pierwszego typu komórek do insertów oraz wysiania drugiego typu komórek do wieloodtworowej płytki do hodowli tkanek.

Drugim krokiem jest przeniesienie wkładów do dołków płytki zawierającej drugi typ komórek. Ostatecznie umożliwia to odzyskanie obu typów komórek, a także odpowiadających im supernatantów. Dzięki temu możliwe jest ocenienie wpływu wydzielanych czynników rozpuszczalnych na badany typ komórek.

W organizmach wielokomórkowych wydzielane czynniki rozpuszczalne wywołują odpowiedzi różnych typów komórek w wyniku sygnalizacji parakrynnej. W związku z tym wartość systemu kokultury z wkładką polega na możliwości oryginalnej oceny zmian parametrów komórkowych pośredniczonych przez wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu międzykomórkowego. Systemy kokultury z wkładką oferują szereg zalet w porównaniu z innymi technikami kokultury, takimi jak: po pierwsze, sygnalizacja kierunkowa; po drugie, zachowanie polaryzacji komórek; oraz po trzecie, specyficzna dla danej populacji detekcja zmian komórkowych.

Poniżej szczegółowo opisano konkretny protokół pomiaru toksycznych skutków działania cytokin wydzielanych przez aktywowane lipopolisacharydem mikrogleje N9 na neurony PC12, co pozwoli na praktyczne zrozumienie metodologii współhodowli z wykorzystaniem wkładek. W pierwszej kolejności wyjmij z opakowań 24-dołkową płytkę do hodowli tkanek oraz wkładki z politetrafluoroetylenu o porach o wielkości 0,4 mikrona. Następnie, chwytając górną krawędź wkładki za pomocą sterylnej pęsety, umieść wkładki w pustych dołkach płytki do hodowli tkanek.

Następnie wypełnij inserty rutynową pożywką N9, aż błona zostanie całkowicie zakryta. Inkubuj inserty przez co najmniej jedną godzinę lub przez noc, aby poprawić zdolność komórek do adhezji. Po przygotowaniu insertów, pasażuj mikroglej N9 przy 80 do 90% konfluencji, używając rutynowej pożywki N9, aby uzyskać zawiesinę komórkową, która zostanie wykorzystana do wysiania na inserty.

Następnie usunąć medium rutynowe z insertów, uważając, aby nie przebić membrany końcówką mikropipety. Dalej, zasiać w każdym insercie 60 000 komórek na centymetr kwadratowy, używając 50 µL zawiesiny komórkowej lub zgodnie z protokołem producenta insertów. Podczas rozdzielania zawiesiny komórkowej należy upewnić się, że pozostaje ona jednorodna, okazjonalnie odwracając probówkę.

Po zasianiu wszystkich wkładów delikatnie kołysz płytkę przód-tył, a następnie lewo-prawo, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Unikaj ruchów okrężnych, ponieważ spowoduje to gromadzenie się komórek w centrum wkładu. Następnie inkubuj płytkę z wkładami przez 24 godziny przed przystąpieniem do aktywacji mikrogleju N9.

Należy rozpocząć od odważenia 10 mg lipopolisacharydu i przechowywania go w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml do późniejszego użycia. Ponieważ lipopolisacharyd jest silną endotoksyną prozapalną i wymaga szczególnych środków ostrożności, zdecydowanie zaleca się stosowanie okularów ochronnych, rękawiczek oraz maski z filtrem przeciwpyłowym. Następnie należy przygotować zestaw rozcieńczeń seryjnych lipopolisacharydu, wykorzystując ciepłe medium do hodowli N9, aby uzyskać roztwory robocze o stężeniach czterech, dwóch i jednego µg/ml.

Na koniec usuń połowę pożywki z insertów, uważając, aby nie zakłócić stanu komórek. Następnie ostrożnie dodaj do insertów 25 µL roztworów roboczych lipopolisacharydu, aby uzyskać końcowe stężenia wynoszące 2, 1 lub 0,5 µg/mL. Inkubuj płytkę przez kolejne 24 godziny przed przystąpieniem do eksperymentów z kokulturą.

Ten etap wymaga zróżnicowanych interneuronów z komórek PC12 wysianych w gęstości 30 000 komórek na centymetr kwadratowy oraz mikrogleju N9 aktywowanego lipopolisarydem przez 24 godziny, zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Należy rozpocząć od delikatnego usunięcia całego medium z insertów i zastąpienia go 50 µl świeżego, ciepłego medium do hodowli N9. Jest to konieczne w celu usunięcia wszelkich śladów lipopolisarydu, tak aby pozostał jedynie aktywowany mikroglej N9.

Należy pamiętać, że wkłady są luźno osadzone w dołkach płytki do hodowli tkankowej i mogą się przemieszczać, jeśli końcówka zostanie zbyt mocno przyciśnięta do ścianki. Krok ten należy wykonywać kolejno dla każdego wkładu, aby zapobiec wysychaniu komórek w wyniku przedłużonego kontaktu z powietrzem. Następnie należy całkowicie usunąć pożywkę komórek neuronalnych PC12 i zastąpić ją 0,6 ml świeżej, ciepłej pożywki do traktowania komórek PC12.

Wykonuj tę czynność pojedynczo dla każdego dołka, aby zapobiec wysychaniu komórek. Za pomocą pęsety chwyć górną krawędź wkładu i delikatnie umieść go w dołku zawierającym neuronalne komórki PC12. Po przeniesieniu wszystkich wkładów sprawdź, czy pod membranami wkładów nie znajdują się pęcherzyki powietrza.

Pęcherzyki powietrza zapobiegną wymianie substancji przez membranę wkładu i mogą doprowadzić do niepowodzenia całego eksperymentu. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, bardzo delikatnie podnosząc wkład z dołka za pomocą pęsety i umieszczając go ponownie w medium do hodowli komórkowej; czynność ta powinna usunąć większość pęcherzyków. W przypadku pęcherzyków uporczywych spróbuj delikatnie zanurzyć wkład w medium do hodowli komórkowej pod kątem.

Nie należy uderzać ani mieszać wkładów, ponieważ może to prowadzić do dysocjacji komórek przylegających. Następnie należy sprawdzić objętości pożywki zarówno we wkładach, jak i w dołkach; poziom cieczy w obu przedziałach powinien być zbliżony. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza i upewnieniu się, że objętości pożywki są odpowiednie, należy inkubować płytkę.

Następnie można zebrać komórki, pożywkę hodowlaną lub obie te frakcje, aby zmierzyć efekty sygnalizacji parakrynowej między mikroglejem N9 a neuronowymi komórkami PC12. W celu ilościowego oznaczenia cytokin prozapalnych w pożywce hodowlanej z dolnej komory wykonano testy immunoenzymatyczne (ELISA). Wyniki wskazują, że 24 godziny po okresie aktywacji mikroglej N9 traktowany lipopolisarydem w stężeniu 2 µg/mL wydzielał znacznie więcej cytokin prozapalnych, takich jak interleukina-6, czynnik martwicy nowotworów alfa oraz interferon gamma, w porównaniu do mikrogleju niepoddanego działaniu tego związku.

Dodatkowo, mikroglej N9 traktowany lipopolisarydem w stężeniu 1 µg/ml wydzielał wyraźnie więcej interferonu gamma po 24 godzinach, podczas gdy wzrost poziomu interleukiny-6 i czynnika martwiczego nowotworów alfa w medium komórkowym stał się istotny po 48 godzinach. Z kolei w warunkach zastosowania stężenia 0,5 µg/ml nie odnotowano zwiększenia ekspresji cytokin w mikrogleju N9 zarówno 24, jak i 48 godzin po okresie aktywacji. Co więcej, dane uzyskane po 24 godzinach w grupie 2 µg/ml sugerują wystąpienie mikrogliozy, czyli wzrostu populacji mikrogleju.

Jednak dopiero po 48 godzinach odnotowano znaczący wzrost liczby komórek. W końcu, aby ocenić skutki aktywacji mikrogleju prowadzące do zwiększonego wydzielania cytokin i mikroglejozy, oceniono cytotoksyczność w kokulturze z neuronalnymi komórkami PC12. Pomiar poziomu zewnątrzkomórkowej dehydrogenazy mleczanowej, która jest uwalniana przez uszkodzone komórki, wykazał, że w neuronalnych komórkach PC12 występowało więcej zgonów komórkowych wraz ze wzrostem stężenia lipopolisacharydu na komórkach N9.

W związku z tym wyniki te wykazują, że wydzielane czynniki rozpuszczalne są w stanie przeniknąć przez membranę wkładów do kokultury i mogą powodować uszkodzenia cytotoksyczne w neuronopodobnych komórkach PC12 w przypadku braku kontaktu międzykomórkowego. Choć przedstawiono tutaj tylko jeden wariant kokultury z wykorzystaniem wkładów, jest to technika bardzo elastyczna. W niniejszym protokole jeden typ komórek został poddany wstępnej obróbce cząsteczką odpowiedzialną za zmniejszenie wydzielania czynników rozpuszczalnych, które po przeniesieniu wkładu do dołka wpływają na zachowanie drugiego typu komórek.

Można jednak inkubować oba typy komórek razem w systemie kokultury, aby wykryć zwiększoną podatność lub oporność jednej lub obu populacji komórek na późniejszą terapię. Technika ta może być wykorzystana w prosty sposób poprzez wspólną inkubację dwóch populacji komórek bez żadnej interwencji, na przykład w celu oceny podstawowego, wzajemnego sygnalizowania parakrynowego. Poza zastosowaniem w obszarze neurostanów zapalnych, co wykazano w niniejszej pracy, systemy kokultury mogą służyć do odpowiedzi na szeroki zakres pytań dotyczących regeneracji guzów, neurodegeneracji, sygnalizacji apoptozy lub każdego innego zagadnienia obejmującego komponent sygnalizacji parakrynowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, w jaki sposób systemy kokultury z wkładkami mogą stanowić prosty sposób oceny zmian pośredniczonych przez wydzielane czynniki rozpuszczalne. Mamy nadzieję, że przekonaliśmy Państwa do wysokiego potencjału tych systemów kokultury z wkładkami w badaniu wielokomórkowego sygnalizowania parakrynnego przy braku bezpośredniego kontaktu między komórkami.