Name: Opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj metodę kohodowli dwóch typów komórek z wykorzystaniem wstawek z przepuszczalną membraną. System ten umożliwia badanie wpływu rozpuszczalnych czynników sekretowanych bez bezpośredniego kontaktu komórka-komórka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana z grantu Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada dla MGM. JR jest stypendystą NSERC-Vanier.

Uwaga: Każdy z poniższych kroków powinien być wykonywany w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym, tak jak jest to wymagane do hodowli komórek ssaków. Ponadto obowiązują ogólne wytyczne dotyczące optymalnej hodowli komórek sterylnych, np. wyrzucanie końcówek za każdym razem, gdy mogą prowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego, skrócenie czasu wystawiania komórek na działanie powietrza podczas wykonywania całkowitej wymiany pożywki, prawidłowe, ale delikatne mieszanie wszystkich zawiesin komórek w celu zapewnienia ich jednorodnego pipetowania itp. Co więcej, wkładki są rodzajem wyrobów z tworzyw sztucznych, które wymagają specjalnego obchodzenia się. Po pierwsze, za każdym razem, gdy manipuluje się wkładkami, unikaj dotykania delikatnej membrany, która łatwo się rozrywa i może w ten sposób zagrozić eksperymentowi. Nie nadaje się również do zasysania próżniowego pożywki do hodowli komórkowych, ponieważ istnieje ryzyko perforacji błony lub dysocjacji przylegających komórek. Następnie wkładki zwisają luźno na wielodołkowej płytce do hodowli tkankowej, dlatego należy zachować ostrożność podczas przenoszenia plastiku lub pipetowania, aby uniknąć dysocjacji przylegających komórek. Ponadto, w przypadku stosowania wkładek o dużych rozmiarach porów, istnieje możliwość, że pożywka do hodowli komórkowych przesiąka przez membranę, dlatego ważne jest częste monitorowanie poziomu cieczy. Na koniec należy zauważyć, że poniższy protokół jest przeznaczony dla komórek przylegających i wymaga niewielkich modyfikacji, aby był odpowiedni dla komórek zawiesinowych.
1. Ogólne wytyczne dotyczące przeprowadzania eksperymentów z kokulturą wstawiania
<ol>
	<li>Komora wysiewająca typu #1 we wkładkach
	<ol>
		<li>Rozpakuj wkładki z opakowania.</li>
		<li>Umieścić wkładki na pustej wielodołkowej płytce do hodowli tkankowej o odpowiednim wymiarze. W tym celu chwyć za pomocą pęsety górną krawędź wkładki.</li>
		<li>Aby poprawić przyczepianie i rozprzestrzenianie się przylegających komórek, przed wysiewem należy kondycjonować wkładki pożywką do hodowli komórkowych. W tym celu należy pokryć całą powierzchnię membrany pożywką do hodowli komórkowych za pomocą mikropipety. 
		UWAGA: Zrób to dla tylu wkładek, ile jest to wymagane.</li>
		<li>Założyć pokrywkę na płytkę i inkubować przez co najmniej 1 godzinę lub O/N w tych samych warunkach (zwykle 37°C, 5-10% CO2 ).</li>
		<li>Po kondycjonowaniu wkładek należy usunąć całą pożywkę z hodowli komórkowych za pomocą mikropipety. Wyrzuć zużyte podłoże.</li>
		<li>Komórka nasienna typu #1 w pożywce do hodowli świeżych komórek w taki sam sposób, jak na płytce wielodołkowej. W tym celu należy pobrać odpowiednią objętość zawiesiny komórek za pomocą mikropipety i dozować płyn do wkładu. 
		UWAGA: Przygotuj tyle wkładek, ile potrzeba.</li>
		<li>Po wysianiu wszystkich wkładek delikatnie kołysz płytką w lewo i w prawo, a następnie w przód i w tył, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Unikaj wykonywania ruchów okrężnych, ponieważ spowoduje to gromadzenie się komórek w środku wkładek.</li>
		<li>Umieść pokrywkę na płytce i inkubuj zgodnie z wymaganiami komórkowymi (zwykle 37°C, 5-10% CO2 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórka wysiewająca typu #2 w wielodołkowych płytkach do kultur tkankowych
	<ol>
		<li>Komórka nasienna typu #2 w pożywce do hodowli świeżych komórek zgodnie z sekcją 1.</li>
		<li>Przygotuj tyle dołków, ile jest wymagane dla liczby wkładek. Kołysz płytką jak w kroku 1.1.7), aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzienkach.</li>
		<li>Umieść pokrywkę na szalce i inkubuj w tych samych warunkach (zwykle 37°C, 5-10% CO2 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odświeżający medium we wkładkach
	<ol>
		<li>Za pomocą mikropipety usunąć część lub całość pożywki do hodowli komórkowych z wkładek zawierających komórki typu #1. Wyrzuć zużyte podłoże.</li>
		<li>Pobrać odpowiednią objętość świeżej pożywki do hodowli komórkowych. Delikatnie oprzyj końcówkę na wewnętrznej ściance wkładu i powoli dozuj pożywkę do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Umieścić pokrywkę na płytce i inkubować zgodnie z krokiem 1.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka odświeżająca na wielodołkowych płytkach do hodowli tkankowych
	<ol>
		<li>Za pomocą mikropipety usuń część lub całość pożywki do hodowli komórkowych z dołków zawierających komórki typu #2. Wyrzuć zużyte podłoże.</li>
		<li>Pobrać odpowiednią objętość świeżej pożywki do hodowli komórkowych. Oprzyj końcówkę na wewnętrznej ścianie studzienki i powoli dozuj pożywkę do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Umieścić pokrywkę na płytce i inkubować zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami hodowli komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenoszenie wkładek zawierających typ komórki #1 na wielodołkowe płytki do hodowli tkankowych zawierające typ komórki #2. 
	UWAGA: Wykonaj ten krok, gdy oba typy komórek osiągną odpowiedni etap wzrostu.
	<ol>
		<li>Przed przeniesieniem wkładek do studzienek należy dokonać wszelkich niezbędnych zmian podłoża, jak opisano wcześniej w krokach 1.3) i 1.4). 
		UWAGA: W tym momencie ważne jest, aby dozować odpowiednie objętości nośnika w obu komorach, zgodnie z instrukcjami producenta wkładu.</li>
		<li>Za pomocą pęsety chwyć za górną krawędź wkładki zawierającej komórkę typu #1 i delikatnie umieść ją w odpowiednim dołku zawierającym komórkę typu #2.</li>
		<li>Po przeniesieniu wszystkich wkładek sprawdź, czy pod membraną wkładek nie ma pęcherzyków powietrza. 
		UWAGA: Pęcherzyki powietrza zapobiegają jakiejkolwiek wymianie w poprzek membrany wkładki i mogą zagrozić całemu eksperymentowi.</li>
		<li>Jeśli obecne są pęcherzyki powietrza, bardzo delikatnie wyjmij wkładkę ze studzienki za pomocą pęsety i zanurz ją z powrotem w pożywce do hodowli komórkowych. Bąbelki znikną. Jeśli są nadal obecne, spróbuj delikatnie zanurzyć wkładki z powrotem w pożywce do hodowli komórkowej pod kątem. 
		UWAGA: Nie uderzaj ani nie mieszaj wkładek, aby uniknąć dysocjacji przylegających komórek.</li>
		<li>Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza i sprawdzeniu, czy objętość pożywki w obu komorach, przykryj pokrywką płytkę i rozpocznij inkubację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywki odświeżające w systemie kohodowli 
	UWAGA: Chociaż membrana z łatwością umożliwia wymianę mediów między wkładką a studnią, odświeżanie pożywki odbywa się w obu komorach, ponieważ czas wymagany do osiągnięcia równowagi w górnej i dolnej komorze przez samą dyfuzję może być dość długi.
	<ol>
		<li>Odświeżanie podłoża we wstawkach zawierających typ komórki #1 odbywa się w taki sam sposób, jak w kroku 1.3).</li>
		<li>Aby odświeżyć pożywkę w studzienkach zawierających komórkę typu #2, delikatnie przesuń wkładkę na bok, aby utworzyć przestrzeń wystarczająco szeroką, aby pomieścić końcówkę pipety. Odśwież nośnik jak w kroku 1.4).</li>
		<li>Sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza i sprawdź objętości zgodnie z krokami od 1.5.3) do 1.5.5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przykład: pomiar wpływu cytokin wydzielanych przez aktywowany przez LPS mikroglej N9 na neuronalne komórki PC12
UWAGA: Poniższe kroki są przeznaczone dla określonych rozmiarów kolb, studzienek i naczyń. Protokół można jednak dostosować do dowolnych wymiarów wyrobów z tworzyw sztucznych. Aby zapoznać się z mediami i kompozycją, patrz tabela materiałów.
<ol>
	<li>Wysiew i różnicowanie komórek PC12 na wielodołkowych płytkach do hodowli tkankowych
	<ol>
		<li>Ciepła, rutynowa pożywka do hodowli komórkowych PC12, pożywka różnicująca PC12 i trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.</li>
		<li>Użyj komórek PC12 przy 60-80% zbiegu z kolby o średnicy 75cm2.</li>
		<li>Za pomocą pipety Pasteura o średnicy 15 mm przeprowadzić aspirację próżniową całej pożywki do hodowli komórkowych w kolbie.</li>
		<li>Delikatnie przepłukać monowarstwę komórek 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym i usunąć płyn pipetą Pasteura. Uważaj, aby na tym etapie nie dysocjować komórek.</li>
		<li>Przykryj monowarstwę komórek 3 ml trypsyny-EDTA i inkubuj przez 2-3 minuty w temperaturze 37°C.</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie komórki są odłączone pod mikroskopem. Jeśli na wodzie unosi się bardzo mało komórek, inkubuj przez dłuższy czas, maksymalnie 5 minut.</li>
		<li>Dodać 10 ml rutynowej pożywki do hodowli komórek PC12 w celu inaktywacji trypsyny-EDTA.</li>
		<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml delikatnie rozcierać, upewniając się, że większość komórek jest oddzielona od dna kolby. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza w zawiesinie komórek.</li>
		<li>Za pomocą tej samej pipety o pojemności 10 ml przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować przez 1 minutę przy 3 200 x g</li>
		<li>Odrzucić supernatant za pomocą pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć osadu.</li>
		<li>Dodać 10 ml rutynowej pożywki do hodowli komórkowych PC12 za pomocą pipety o pojemności 10 ml. 
		UWAGA: Objętość tę można regulować, jeśli granulka jest niezwykle mała lub duża.</li>
		<li>Rozetrzeć tą samą pipetą o pojemności 10 ml w celu homogenizacji osadu. Komórki PC12 często zlepiają się ze sobą, więc konieczne jest co najmniej 20 pipetowania w górę i w dół. 
		UWAGA: Chociaż konieczne jest energiczne rozcieranie, należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza w zawiesinie komórek.</li>
		<li>W probówce o pojemności 1,5 ml przygotować odpowiednie rozcieńczenie zawiesiny komórek w błękicie trypanowym. Policz komórki za pomocą hemocytometru zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami74.</li>
		<li>W oddzielnej probówce o pojemności 50 ml podzielić zawiesinę komórek za pomocą pożywki różnicującej PC12, aby uzyskać rozcieńczoną zawiesinę komórkową odpowiednią do wysiewu ze studzienek z płytki 24-dołkowej (30 000 ¢/cm2, 0,6 ml na studzienkę zgodnie z protokołem producenta). 
		UWAGA: Płytka 24-dołkowa musi być wcześniej pokryta kolagenem, zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami75.</li>
		<li>Rozprowadzić 0,6 ml zawiesiny komórek w każdym dołku za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Gdy wszystkie dołki zostaną wysiane, kołysz płytą, jak w kroku 1.1.7).</li>
		<li>Aby umożliwić prawidłowe różnicowanie komórek PC12, przed przeprowadzeniem eksperymentów z hodowlą należy inkubować płytki 24-dołkowe przez 7-9 dni w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w pożywce różnicującej PC1215,16.</li>
		<li>Zmiany podłoża należy wykonywać co drugi dzień, usuwając połowę płynu i zastępując go równą objętością świeżej pożywki różnicującej PC12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew mikrogleju N9 we wkładkach i zaprawianie LPS
	<ol>
		<li>Na jeden dzień przed przeprowadzeniem eksperymentów z jednoczesną hodowlą, należy wstępnie potraktować wkładki PTFE o porach 0,4 μm rutynową pożywką do hodowli komórkowych N9, aby zoptymalizować przyleganie komórek, wykonując kroki od 1.1.1) do 1.1.4)</li>
		<li>Ciepła pożywka do hodowli komórkowych N9 i trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.</li>
		<li>W międzyczasie odważyć około 10 mg LPS w probówce o pojemności 1,5 ml do późniejszego wykorzystania. 
		UWAGA: Ponieważ LPS jest silną endotoksyną prozapalną i wymaga szczególnych środków ostrożności, zdecydowanie zaleca się noszenie okularów, rękawic i respiratora cząstek stałych.</li>
		<li>Użyj komórek N9 przy 80-90% zbiegu z kolby o średnicy75 cm2.</li>
		<li>Wykonaj kroki od 2.1.3) do 2.1.14). Zawsze używaj rutynowej pożywki do hodowli komórkowych N9 zamiast rutynowej pożywki do hodowli komórkowych PC12. Należy również zauważyć, że mikroglej N9 nie zlepia się ze sobą tak bardzo jak komórki PC12, więc na kroku 2.1.13 może być konieczne mniej pipetowania w górę i w dół).</li>
		<li>W oddzielnej probówce o pojemności 50 ml podzielić zawiesinę komórek za pomocą pożywki do hodowli komórkowych N9, aby uzyskać rozcieńczoną zawiesinę komórkową odpowiednią do wkładek wysiewających przeznaczonych do przechowywania w płytkach 24-dołkowych (60 000 ¢/cm2, 0,05 ml na wkładkę zgodnie z protokołem producenta, dla powierzchni membrany patrz informacje producenta). 
		UWAGA: Wkładki te są już pokryte kolagenem przez producenta i są zoptymalizowane pod kątem adhezji komórek.</li>
		<li>Rozprowadzić 0,05 ml zawiesiny komórek na wkładkę za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Gdy wszystkie wkładki zostaną wysiane, kołysz płytką jak w kroku 1.1.7).</li>
		<li>Przeprowadzić seryjne rozcieńczenia LPS przy użyciu pożywki zabiegowej N9 w celu uzyskania roztworów roboczych 4 μg/ml, 2 μg/ml i 1 μg/ml.</li>
		<li>Odmierzyć pipetą 0,05 ml roztworu roboczego o stężeniu 4 μg/ml w jednym zestawie wkładek w celu uzyskania końcowego rozcieńczenia 2 μg/ml.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.2.10) dla pozostałych dwóch roztworów roboczych w różnych zestawach wkładek, uzyskując końcowe rozcieńczenia odpowiednio 1 μg/ml i 0,5 μg/ml.</li>
		<li>Inkubować płytki zawierające wstawki przez 24 godziny w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 , aby umożliwić aktywację mikrogleju N9 za pomocą LPS przed przeprowadzeniem eksperymentów z kokulturą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Współhodowla neuronalnych komórek PC12 z mikroglejem N9
	<ol>
		<li>Po 7-9 dniach różnicowania komórek PC12 aktywuj mikroglej N9 po 24 godzinach inkubacji z LPS za pomocą ciepłej pożywki zabiegowej N9 i pożywki PC12 w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.</li>
		<li>Przeprowadzić całkowitą zmianę pożywki dla mikrogleju N9, jak w kroku 1.3), zastępując całą użytą pożywkę 0,1 ml pożywki N9 poddawanej zabiegowi. Zrób to dla każdej wkładki. Jest to konieczne, aby usunąć wszelkie ślady LPS, pozostawiając we wkładkach tylko aktywowany mikroglej N9.</li>
		<li>Wykonaj całkowitą zmianę pożywki dla neuronalnych komórek PC12, jak w kroku 1.4). Przenieść wkładki do płytek 24-dołkowych, jak w kroku 1.5). Inkubować kokultury N9-PC12 przez 24 godziny lub 48 godzin w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		<li>Po 24 godzinach lub 48 godzinach należy pobrać supernatant i/lub komórki pod kątem cytotoksyczności, testu immunoenzymatycznego (ELISA), Western blot lub innych testów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytycznym krokiem każdego eksperymentu z systemem kohodowli wkładek jest wybór odpowiedniej wkładki do użycia. Należy dokładnie wziąć pod uwagę wielkość porów i materiał błony, nie zapominając o rozważeniu rodzaju komórek, które zostaną wysiane, oraz celu eksperymentu. Na przykład testy chemotaksyjne mogą wykorzystywać ten sam rodzaj błony, co kokultury komórkowe do analizy modulacji zachowania komórek indukowanych przez wydzielane rozpuszczalne czynniki przy braku kontaktu komórka-komórka. Jednak oba rodzaj...

Badanie tkanek, organów lub systemów in vitro jest próbą uproszczenia bardzo skomplikowanych relacji istniejących między kilkoma podtypami komórek, które składają się na organizmy wielokomórkowe. Rzeczywiście, badania in vitro umożliwiają szczegółowe zrozumienie populacji pojedynczych komórek. Istnieją dwie główne zalety przeprowadzania eksperymentów in vitro: 1) zmniejszone interakcje komórkowe oraz 2) możliwość łatwego manipulowania środowiskiem komórkowym. W związku z tym te dwie zalety pozwoliły naukowcom przewidzieć zachowanie określonych typów komórek in vivo, co doprowadziło do zdolności do regulowania wyników wpływów zewnętrznych w całych organizmach. W tym sensie hodowla komórkowa in vitro często działa jako pomost łączący podstawowe i stosowane nauki przyrodnicze. Niemniej jednak istnieje również kilka wad pracy in vitro, z których najważniejszą jest to, że pewne zastrzeżenie może dotyczyć fizjologicznego znaczenia obserwowanych fenotypów. Rzeczywiście, gdy pojedynczy typ komórki jest hodowany w naczyniu, kultura traci, w różnym stopniu, swoje połączenia komórka-komórka z innymi typami komórek, swój wkład w środowisko humoralne z tkanki i organizmu, z którego pochodzi, oraz kotwice w tkance, które umożliwiły jej utrzymanie określonej trójwymiarowej struktury, czasami kluczowej dla funkcjonowania komórki.
Kwestia relacji komórka-komórka została rozwiązana dzięki rozwojowi technik hodowli mieszanej. W tej metodzie dwie lub więcej populacji komórek jest hodowanych razem w tym samym naczyniu hodowlanym. Jednak te mieszane kultury niosą ze sobą poważne niedogodności. Z jednej strony niektóre podtypy komórek nie oddziałują fizycznie ze sobą w tkance pochodzenia i polegają wyłącznie na komunikacji parakrynnej podtrzymywanej przez wydzielane czynniki rozpuszczalne i pobliskie receptory. Dzieje się tak w przypadku kilku procesów zapalnych, które zależą od sygnalizacji cytokin proksymalnych. W kulturach mieszanych interakcje fizyczne są nieuniknione i uniemożliwiają badanie komunikacji parakrynnej przy braku kontaktów komórka-komórka, które mogą dawać zmienione wyniki. Z drugiej strony, uzyskanie interpretacji specyficznych dla komórek w mieszanej populacji staje się niewykonalne bez zastosowania ostrych technik separacji, które mogą znacząco wpłynąć na wyniki.
Aby rozwiązać te ważne problemy, opracowano technikę pozwalającą na dzielenie kultur na przedziały i badanie sygnalizacji parakrynnej. Metoda ta polega na przeniesieniu supernatantu jednego typu komórki, nazwanego w ten sposób pożywką kondycjonowaną, do studzienek zawierających inną populację komórek. Jednak ważną wadą jest to, że krótkotrwałe cząsteczki nie przeżywają wystarczająco długo w kondycjonowanym pożywce, aby mogły zostać przeniesione do studzienek drugiej populacji komórek. Nawet długożyciowe cząsteczki z czasem ulegną znacznemu rozcieńczeniu z powodu dyfuzji. Co więcej, obie populacje komórek uczestniczą tylko w jednokierunkowej komunikacji parakrynnej, a nie w aktywnej komunikacji dwukierunkowej. Prowadzi to do braku sygnalizacji sprzężenia zwrotnego, która jest niezbędna do odtworzenia dokładnych relacji wielokomórkowych, jakie istnieją in vivo.
W konsekwencji i kierując się potrzebą lepszego symulowania pierwotnych warunków in vivo w środowisku komórkowym in vitro, na przestrzeni lat osiągnięto kilka postępów w technikach hodowli komórkowych. Jednym z najbardziej znaczących osiągnięć było zastosowanie przepuszczalnych nośników z mikroporowatymi membranami do podziału kultur komórkowych, zastosowanych po raz pierwszy przez Grobsteina w 1953roku1. Takie przepuszczalne podpory zostały na przestrzeni lat dostosowane do wielu typów komórek i mogą być używane w kilku różnych zastosowaniach. Obecnie podpory te istnieją jako puste wkładki, które są zaprojektowane tak, aby spoczywały w studzienkach z wielodołkowej płytki do hodowli tkankowej lub w okrągłych naczyniach. W systemie kohodowli wkładka zawiera jeden typ komórek, podczas gdy studzienka lub szalka zawiera drugą populację komórkową, co pozwala na zbadanie wpływu dwóch różnych populacji komórek na ich środowisko humoralne (ryc. 1). W rezultacie zachowana jest polaryzacja komórkowa (wydzielanie podstawno-boczne i wierzchołkowe lub odbiór sygnału), co daje systemom kohodowli indukcyjnej ważną przewagę nad kulturami mieszanymi i technikami kondycjonowanych pożywek. Dostępnych jest kilka rodzajów materiałów membranowych, z których najpopularniejsze to poliester (PET), poliwęglan (PC) lub politetrafluoroetylen pokryty kolagenem (PTFE) i występują one w różnych rozmiarach porów od 0,4 μm do 12,0 μm. Te różnorodność materiałów i rozmiarów porów oferuje spektrum wkładek o zmiennych cechach związanych z właściwościami optycznymi, grubością membrany i przyleganiem komórek, co czyni je praktycznymi na różnych poziomach w następujących zastosowaniach, między innymi: 
-badanie różnicowania komórek, rozwoju embrionalnego, przerzutów nowotworowych i gojenia się ran za pomocą testów chemotaktycznych przez przepuszczalne błony; 
-ocena przenikania leków poprzez ocenę ich transportu przez monowarstwy nabłonkowe lub śródbłonkowe hodowane na przepuszczalnych nośnikach, i; 
-wykonywanie kokultur komórkowych w celu analizy modulacji zachowania komórek indukowanych przez wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka.
Celem tego artykułu jest opisanie ogólnych wytycznych metodologicznych do spełnienia trzeciej funkcji opisanej powyżej, czyli oceny zmian komórkowych, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka przy użyciu systemu kohodowli insertowej. W kilku różnych dziedzinach badań wykorzystuje się systemy kohodowli inkubacyjnych w celu uzyskania odpowiedzi na pytania dotyczące wpływu wydzielanych czynników rozpuszczalnych na populacje komórek. Rzeczywiście, sygnalizacja parakrynna, która moduluje zachowanie komórkowe na różnych poziomach, jest istotna we wszystkich tkankach i układach, co sprawia, że systemy kohodowli indukcyjnej są niezbędne do zapewnienia postępów w tych dziedzinach. I odwrotnie, zastosowanie wkładek może potwierdzić, że transdukcja sygnału odbywa się przez bezpośredni kontakt komórka-komórka, a nie przez wydzielane czynniki. Jednym z najważniejszych zastosowań insertów są badania stanu zapalnego2-14, w których ocenia się wpływ wydzielanych cytokin na różne komórkowe czynniki odporności. W szczególności badania nad stanem zapalnym w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) przyniosły ogromne korzyści z badań nad współhodowlą inkubacyjną, które pozwoliły lepiej zdefiniować odrębne role parakrynne neuronów i mikrogleju w napędzaniu zapalenia układu nerwowego15-21. Systemy te zostały również opracowane w celu zbadania potencjału przeciwzapalnego cząsteczek, który opiera się na ich zdolności do zmniejszania lub hamowania wydzielania czynników prozapalnych22-26. Badania dotyczące nowotworów27-31, w szczególności mechanizmy leżące u podstaw angiogenezy32-34 i stanu zapalnego35-42 w nowotworzenia, również korzystają z systemów kohodowli inkubowanych. Co więcej, czynniki rozpuszczalne mają pierwszorzędne znaczenie w procesach, które napędzają różnicowanie, a w kilku badaniach wykorzystano wstawki, aby odpowiedzieć na pytania w tej konkretnej dziedzinie43-50. W OUN, ponieważ tkanka nerwowa ma bardzo ograniczony potencjał odnawiania, badanie neurotrofizmu i neuroprotekcji ma fundamentalne znaczenie i zostało szeroko zapewnione dzięki zastosowaniu komórek macierzystych w systemach kohodowli51-56. Ponadto wstawki są również wykorzystywane w tak różnych dziedzinach, jak nefrologia57,58, interakcje śródbłonka i angiogeneza59-62, sygnalizacja apoptozy63-65, zapalenie w otyłości i zespole metabolicznym22,23,66-67, ochrona komórek rzęsatych ucha wewnętrznego68,69, a nawet w zjadliwości grzybów70,71 i parazytologia72,73.
Ten artykuł oferuje ogólne wytyczne metodologiczne w celu przeprowadzenia eksperymentu w celu oceny zmian komórkowych, w których pośredniczą wydzielane rozpuszczalne czynniki za pomocą systemu kohodowli insertowej. W szczególności skupimy naszą uwagę na kokulturach komórek nerwowych i ich zastosowaniach w badaniu procesu neurozapalnego. Biorąc pod uwagę bardzo szerokie spektrum eksperymentów, które umożliwiają pilotowanie za pomocą wstawek, nie do zniesienia jest objęcie każdego aspektu tej techniki hodowli komórkowej. Na przykład szczegółowo oceniony zostanie konkretny protokół pomiaru wpływu cytokin wydzielanych przez mikroglej N9 aktywowany lipopolisacharydem (LPS) na neuronalne komórki PC12, oferując konkretne zrozumienie metodologii kohodowli insercyjnej.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 średni</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Mieszanina pożywki i składników odżywczych F-12 Szynka</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem musi być uzupełniona 0,365 gm/L L-glutaminą</td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Ciepłe w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S z mysiego gruczołu podszczękowego</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Rozpuść liofilizowany proszek w roztworze buforowanej soli fizjologicznej lub pożywce do hodowli tkankowej zawierającej 0,1&ndash; 1,0% albumina surowicy bydlęcej lub 1-10%</td></tr><tr><td>roztwór trypsyny-EDTA</td> w surowicy <td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z&nbsp; Escherichia coli&nbsp; 055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórek toksycznych do stosowania z płytkami 24-dołkowymi</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0,4 i mu; m pores</td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Płaszcz z kolagenem przed użyciem</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych Routine PC12 Pożywka</td><td></td><td></td> do <td>hodowli komórkowych Routine N9</td></tr>-<tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 85% RPMI średnie</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 90% DMEM-F12 średni-</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% inaktywowana termicznie surowica</td><td></td><td></td> końska<td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% inaktywowana termicznie surowica końska</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 5% inaktywowana termicznie płodowa surowica</td><td></td><td></td><td></td>bydlęca</tr><tr><td>PC12 pożywka</td><td></td><td></td><td>różnicująca N9 pożywka</td></tr> <tr><td>zabiegowa-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% RPMI średnie</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% DMEM-F12 średni-</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% inaktywowana termicznie płodowa surowica</td><td></td><td></td> bydlęca<td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 50 ng / ml czynnik</td><td></td><td></td><td></td>wzrostu nerwów</tr><tr><td>PC12 pożywka</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>zabiegowa-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% RPMI średnie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% inaktywowana termicznie płodowa surowica</td><td></td><td></td><td></td> bydlęca</tr></tbody></table>

opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Rola wydzielanych rozpuszczalnych czynników w modyfikacji odpowiedzi komórkowych jest powtarzającym się tematem w badaniach wszystkich tkanek i układów. Próbując wyjaśnić bardzo złożone relacje między kilkoma podtypami komórkowymi, z których składają się organizmy wielokomórkowe, opracowano techniki in vitro, które pomagają naukowcom w zdobyciu szczegółowego zrozumienia populacji pojedynczych komórek. Jedna z tych technik wykorzystuje wkładki z przepuszczalną membraną, która umożliwia dyfuzję wydzielanych rozpuszczalnych czynników. W ten sposób populacja komórek hodowanych we wstawkach może być hodowana wspólnie w studzience lub naczyniu zawierającym inny typ komórki w celu oceny zmian komórkowych po sygnalizacji parakrynnej przy braku kontaktu komórka-komórka. Takie systemy kohodowli inkubacyjnej mają różne zalety w porównaniu z innymi technikami kohodowli, a mianowicie sygnalizację dwukierunkową, zachowaną polaryzację komórek i wykrywanie zmian komórkowych specyficzne dla populacji. Oprócz tego, że są wykorzystywane w dziedzinie zapalenia, raka, angiogenezy i różnicowania, te systemy kohodowli mają pierwszorzędne znaczenie w badaniu skomplikowanych relacji, które istnieją między różnymi podtypami komórkowymi obecnymi w ośrodkowym układzie nerwowym, szczególnie w kontekście zapalenia nerwów. W artykule przedstawiono ogólne wskazówki metodologiczne w celu przeprowadzenia eksperymentu w celu oceny zmian komórkowych, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne, przy użyciu systemu kohodowli insertowej. Co więcej, szczegółowo oceniony zostanie szczegółowy protokół pomiaru neurozapalnego wpływu cytokin wydzielanych przez mikroglej N9 aktywowany lipopolisacharydem na neuronalne komórki PC12, co pozwoli na konkretne zrozumienie metodologii kohodowli insertowej.

Zastosowanie systemów kokultur z wkładkami (insertami) jest szczególnie istotne w badaniu procesów neurozapalnych, które wykazują relacje parakrynne pomiędzy różnymi populacjami komórkowymi OUN. Odporność w OUN jest zapewniana głównie przez komórki rezydentne zwane mikroglejem, które monitorują środowisko w stanie spoczynku, wykazując morfologię rozgałęzioną (Rysunek 2A), i są zdolne do wykrywania zaburzeń, które mogłyby naruszyć niezwykle istotną homeostazę niezbędną do ...

W organizmach wielokomórkowych wydzielane rozpuszczalne czynniki wywołują reakcje różnych typów komórek w wyniku sygnalizacji parakrynnej. Systemy kohodowli typu insert oferują prosty sposób oceny zmian, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka.

Opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie komórkowego systemu kokultury dwóch typów komórek przy użyciu insertów z przepuszczalną membraną, co umożliwia dyfuzję wydzielanych czynników rozpuszczalnych. Jest to realizowane poprzez serię kroków polegających na precyzyjnym umieszczeniu insertów zawierających jeden typ komórek w wieloodtworowej płytce do hodowli tkanek zawierającej drugi typ komórek. Proces rozpoczynamy od wysiania pierwszego typu komórek do insertów oraz wysiania drugiego typu komórek do wieloodtworowej płytki do hodowli tkanek.Drugim krokiem jest przeniesienie wkładów do dołków płytki zawierającej drugi typ komórek. Ostatecznie umożliwia to odzyskanie obu typów komórek, a także odpowiadających im supernatantów. Dzięki temu możliwe jest ocenienie wpływu wydzielanych czynników rozpuszczalnych na badany typ komórek.W organizmach wielokomórkowych wydzielane czynniki rozpuszczalne wywołują odpowiedzi różnych typów komórek w wyniku sygnalizacji parakrynnej. W związku z tym wartość systemu kokultury z wkładką polega na możliwości oryginalnej oceny zmian parametrów komórkowych pośredniczonych przez wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu międzykomórkowe

development-an-insert-co-culture-system-two-cellular-types-absence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie rozwijamy model proksymalnej kokultury komórek raka jajnika i pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka. Ten fizjologicznie istotny model pozwala na badanie sygnalizacji parakrynnej, w której lokalne stężenia wydzielanych czynników są utrzymywane, jednocześnie zapobiegając bezpośredniemu kontaktowi komórkowemu.

System hodowli proksymalnej: technika hodowli in vitro do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami

Ten film demonstruje technikę tworzenia wspólnej kultury interneuronów z komórkami śródbłonka okołonaczyniowego. Komórki dodaje się do jednodołkowej wkładki umieszczonej w naczyniu hodowlanym. Po tym, jak komórki przylgną do naczynia, wkładka jest usuwana, umożliwiając komórkom namnażanie się i interakcję oraz tworzenie kokultury.

Ustanowienie kohodowli interneuronów z komórkami śródbłonka okołokomorowego

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

W tym artykule, nowo zaprojektowana wkładka wydrukowana w 3D jest przedstawiona jako model kokultury i zweryfikowana przez badanie parakrynnej komunikacji międzykomórkowej między komórkami śródbłonka a keratynocytami.

Innowacyjna wkładka drukowana w 3D zaprojektowana z myślą o prostych hodowlach komórkowych 2D i 3D

Protokół pokazuje nowatorski model eksperymentalny in vitro, który może podsumować biologię dwóch rodzajów przylegających linii komórkowych za pomocą trójwymiarowego (3D) wydrukowanego rusztowania. Opisano budowę tego modelu i procedury operacyjne, od przygotowania komórek i hodowli komórek po analizę i ocenę.

Model kohodowli z wykorzystaniem dwóch typów przylegających linii komórkowych

Tutaj pokazujemy, jak komórki nabłonkowe hodowane z fibroblastami w dwuwarstwowym systemie opartym na błonie nanowłóknistej mogą stabilnie przylegać do błony i rosnąć na niej.

Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół z kluczowymi krokami prowadzącymi inżynierię i wykorzystanie 3D Flipwell. Opisujemy i pokazujemy, jak składać stosy wkładek do współhodowli oraz wykorzystywać je do współhodowli warstw bakterii jelitowych, nabłonka jelitowego i makrofagów do modelowania środowiska śluzowego jelit.

3D Flipwell Engineering do opracowywania asynchronicznych systemów dla terapii toksykologicznych i immunomodulacyjnych w komórkach bakteryjnych, jelitowych i odpornościowych

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

SC1 działa poprzez podwójne hamowanie Ras-GAP oraz ERK1. Przebadaliśmy funkcję SC1 w wspieraniu samoodnawiania się mysich komórek ES w obecności braku LIF i wykazaliśmy, że SC1 jest w stanie utrzymać samoodnawianie się kultur mysich komórek ES.

Zastosowanie SC1 (Pluripotin) w celu wspierania samoodnowy mESC wobec braku LIF

Poznaj metodę kohodowli dwóch typów komórek z wykorzystaniem wstawek z przepuszczalną membraną. System ten umożliwia badanie wpływu rozpuszczalnych czynników sekretowanych bez bezpośredniego kontaktu komórka-komórka.

Opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka

Przeglądaj więcej filmów