Opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka

W organizmach wielokomórkowych wydzielane rozpuszczalne czynniki wywołują reakcje różnych typów komórek w wyniku sygnalizacji parakrynnej. Systemy kohodowli typu insert oferują prosty sposób oceny zmian, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka.

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie systemu kohodowli komórkowej dwóch typów komórek za pomocą wkładek z przepuszczalną błoną, umożliwiając w ten sposób dyfuzję wydzielanych czynników rozpuszczalnych. Osiąga się to za pomocą serii kroków, które precyzyjnie umieszczają wkładki zawierające jeden typ komórek na wielodołkowej płytce do hodowli tkankowej zawierającej drugi typ komórek. Rozpoczynamy wysiewanie komórek typu numer jeden we wkładkach, a wysiewanie typu komórki numer dwa na wielodołkowej płytce do hodowli tkankowej.

Drugim krokiem jest przeniesienie wkładek do dołków płytki zawierającej ogniwo typu numer dwa. Ostatecznie daje to możliwość zebrania dwóch typów komórek, a także odpowiednich supernatantów. W związku z tym możliwa jest ocena wpływu wydzielanych czynników rozpuszczalnych na typ komórki będącej przedmiotem zainteresowania.

W organizmach wielokomórkowych wydzielane czynniki rozpuszczalne wywołują odpowiedzi z różnych typów komórek w wyniku sygnalizacji parakrynnej. W związku z tym wartość systemu kohodowli inkubacyjnej polega na jego zdolności do zaoferowania oryginalnego sposobu oceny zmian parametrów komórkowych, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka. Systemy kohodowli wtykowej mają różne zalety w porównaniu z innymi technikami współhodowli, takimi jak:jedna poprzez sygnalizację kierunkową; dwie zachowane polaryzacje komórek; i trzy specyficzne dla populacji wykrywanie zmian komórkowych.

Szczegółowy protokół pomiaru toksycznego wpływu cytokin wydzielanych przez mikroglej N9 aktywowany lipopolisacharydem na neuronalne komórki PC12 zostanie szczegółowo opisany w dalszej części, zapewniając w ten sposób konkretne zrozumienie metodologii kohodowli indukcyjnej. Aby rozpocząć, odwiń 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i 0,4 mikrona wkładki z politetrafluoroetylenu por z opakowania. Następnie umieść wkładki w pustych dołkach płytki do hodowli tkankowej, chwytając za najwyższą krawędź wkładki za pomocą sterylnej pęsety.

Następnie napełnij wkładki rutynowym podłożem N9, aż membrana zostanie całkowicie pokryta. Inkubuj wkładki przez co najmniej godzinę lub noc, aby poprawić zdolność komórek do przyczepiania się. Gdy wstawki są gotowe, podziel mikroglej N9 przy 80 do 90% zbiegu za pomocą rutynowej pożywki N9, aby uzyskać zawiesinę komórkową, która zostanie użyta do zasiewu wkładek.

Następnie usuń rutynową pożywkę z wkładek, uważając, aby nie przebić membrany końcówką mikropipety. Następnie wysiewaj każdą wkładkę w ilości 60 000 komórek na centymetr kwadratowy z 50 mikrolitrami zawiesiny komórek lub zgodnie z protokołem producenta wkładki. Podczas rozprowadzania zawiesiny komórek należy upewnić się, że pozostaje ona jednorodna, od czasu do czasu odwracając rurkę.

Gdy wszystkie wkładki zostaną wysiane, delikatnie kołysz płytką w przód iw tył, a następnie od lewej do prawej, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Unikaj wykonywania ruchów okrężnych, ponieważ spowoduje to gromadzenie się komórek w środku wkładki. Następnie należy inkubować płytkę zawierającą wstawki przez 24 godziny, a następnie przeprowadzić aktywację mikrogleju N9.

Zacznij od zważenia 10 miligramów lipopolisacharydu i przechowuj go w 1,5-mililitrowej probówce Eppendorfa do późniejszego wykorzystania. Ponieważ lipopolisacharyd jest silną endotoksyną prozapalną i wymaga szczególnych środków ostrożności, zdecydowanie zaleca się noszenie okularów, rękawic i respiratora cząstek stałych. Następnie utwórz zestaw seryjnych rozcieńczeń lipopolisacharydu za pomocą ciepłego podłoża zabiegowego N9, aby uzyskać roztwory robocze czterech, dwóch i jednego mikrograma na mililitr.

Na koniec wyjmij połowę pożywki hodowlanej z wkładek, uważając, aby nie naruszyć komórek. Następnie delikatnie dodaj 25 mikrolitrów roztworów roboczych lipopolisacharydów do wkładek, aby uzyskać końcowe rozcieńczenia dwóch, jednego lub 0,5 mikrograma na mililitr. Inkubuj płytkę przez kolejne 24 godziny przed przystąpieniem do eksperymentów z kokulturą.

Ten etap wymaga komórek PC12 posianych z 30 000 komórek na centymetr kwadratowy zróżnicowanych interneuronów i mikrogleju N9 aktywowanego lipopolisacharydem przez 24 godziny, jak opisano w poprzedniej sekcji. Zacznij od delikatnego usunięcia całej pożywki z wkładek i zastąpienia jej 50 mikrolitrami świeżej, ciepłej pożywki zabiegowej N9. Jest to konieczne, aby usunąć wszelkie ślady lipopolisacharydu, pozostawiając tylko aktywowany mikroglej N9.

Należy pamiętać, że wkładki są luźne w dołkach płytki do hodowli tkankowej i mogą się poruszać, jeśli końcówka zostanie zbyt mocno dociśnięta do ściany. Ten krok należy wykonywać pojedynczo, aby zapobiec wysychaniu komórek z powodu długotrwałego kontaktu z powietrzem. Następnie całkowicie usuń neuronalną pożywkę komórkową PC12 i zastąp ją 0,6 mililitra świeżej, ciepłej pożywki PC12

Rób to dobrze na raz, aby upewnić się, że komórki nie wyschną. Za pomocą pęsety chwyć górną krawędź wkładki i delikatnie umieść ją w studzience zawierającej neuronalne komórki PC12. Po przeniesieniu wszystkich wkładek sprawdź, czy pod membranami wkładek nie ma pęcherzyków powietrza.

Pęcherzyki powietrza zapobiegną jakiejkolwiek wymianie w poprzek membrany wkładki i mogą zagrozić całemu eksperymentowi. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, bardzo delikatnie podnosząc wkładkę ze studzienki za pomocą pęsety i umieszczając ją z powrotem w pożywce do hodowli komórkowych, to działanie powinno pozbyć się większości pęcherzyków. Jednak w przypadku uporczywych pęcherzyków spróbuj delikatnie zanurzyć wkładkę z powrotem w pożywce do hodowli komórkowej pod kątem.

Nie stukaj ani nie mieszaj wkładek, ponieważ ma to tendencję do powodowania dysocjacji przylegających komórek. Następnie sprawdź objętość mediów zarówno we wkładkach, jak i studzienkach, ciecz w obu komorach powinna być mniej więcej na tym samym poziomie. Gdy wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte, a objętość pożywki będzie odpowiednia, należy przeprowadzić inkubację płytki.

Komórki, pożywkę hodowlaną lub oba te elementy można następnie pobrać w celu zmierzenia wpływu sygnalizacji parakrynnej między mikroglejem N9 a neuronalnymi komórkami PC12. Testy immunoenzymatyczne przeprowadzono na pożywce do hodowli komórkowej dolnego przedziału w celu ilościowego określenia cytokin prozapalnych. Wyniki pokazują, że 24 godziny po okresie aktywacji mikroglej N9 leczony dwoma mikrogramami na mililitr lipopolisacharydu wydzielał znacznie więcej cytokin prozapalnych, takich jak interluken-6, czynnik martwicy nowotworu alfa i interferon gamma, w porównaniu z mikroglejem, który nie był leczony.

Ponadto mikroglej N9 traktowany jednym mikrogramem na mililitr lipopolisacharydu wydzielał wyraźnie więcej interferonu gamma po 24 godzinach, podczas gdy potrzeba było 48 godzin, aby zaobserwować znaczny wzrost średniego poziomu interlukenu-6 i czynnika martwicy nowotworu alfa. W przeciwieństwie do tego, warunek 0,5 mikrograma na mililitr nie zwiększył ekspresji cytokin w mikrogleju N9 zarówno po 24, jak i 48 godzinach po okresie aktywacji. Co więcej, dane po 24 godzinach w grupie dwóch mikrogramów na mililitr sugerują, że wystąpił mikroglej, czyli wzrost populacji mikrogleju.

Jednak dopiero po 48 godzinach liczba komórek znacznie wzrosła. Wreszcie, aby ocenić konsekwencje aktywacji mikrogleju prowadzącej do zwiększonego wydzielania cytokin i mikrogleju, oceniono cytotoksyczność w współhodowanych neuronalnych komórkach PC12. Mierząc poziomy zewnątrzkomórkowej dehydrogenazy mleczanowej, która jest uwalniana przez uszkodzone komórki, stwierdzono, że neuronalne komórki PC12 wykazują większą śmierć komórkową wraz ze wzrostem stężenia lipopolisacharydu na komórkach N9.

W związku z tym wyniki te pokazują, że wydzielane rozpuszczalne czynniki są w stanie przenikać przez błonę wkładek kokulturowych i mogą powodować cytotoksyczne uszkodzenia neuronalnych komórek PC12 przy braku kontaktu komórka-komórka. Chociaż przedstawiono tu tylko jeden scenariusz kokultury wstawionej, jest to bardzo elastyczna technika. W tym protokole jeden typ komórki został wstępnie potraktowany cząsteczką odpowiedzialną za zmniejszenie wydzielania rozpuszczalnych czynników, które po przeniesieniu wkładki do studzienki wpływają na zachowanie drugiego typu komórki.

Możliwe jest jednak inkubowanie obu typów komórek razem w systemie kohodowli w celu wykrycia zwiększonego osłabienia lub oporności jednej lub obu populacji komórek na późniejsze leczenie. Technika ta może po prostu wykorzystać dwie populacje komórek inkubowane razem bez żadnego leczenia, na przykład w celu oceny podstawowej wzajemnej sygnalizacji parakrynnej. Oprócz tego, że są cenione w dziedzinie zapalenia nerwów, jak wykazano tutaj, systemy kohodowli inkubacyjnej mogą być wykorzystywane do udzielania odpowiedzi na szeroki zakres pytań dotyczących regenezy guza, neurolathyrismy, sygnalizacji apoptozy lub dowolnego innego tematu ze składnikiem sygnalizacji parakrynnej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś teraz dobrze zrozumieć, w jaki sposób systemy kohodowli indukcyjnej mogą zaoferować prosty sposób oceny zmian, w których pośredniczy wydzielany czynnik rozpuszczalny. Mamy nadzieję, że udało nam się przekonać Państwa o wysokim potencjale tych systemów kohodowli w badaniach nad wielokomórkową sygnalizacją parakrynną przy braku kontaktu komórka-komórka.