Name: Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj prostą metodę współkultury in vitro do naśladowania mikrośrodowiska guza, wzbogacania populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej. Technika ta umożliwia generowanie wzbogaconych populacji bez stresującego znakowania fluorescencyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), National Institutes of Health (CA049062) oraz National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).

1. Przygotowanie pożywek i komórek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml minimalnej pożywki Eagle's Essential uzupełnionej 12,5% (vol/vol) inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-alanylo-L-glutaminy oraz 100 jednostek penicyliny i 100 μg streptomycyny na ml. 
	UWAGA: Pożywkę wzrostową i suplement(y) można łatwo wymienić na wymagania dotyczące wzrostu innych szczepów komórkowych lub linii komórkowych.</li>
	<li>Przygotować 70 μl pożywki do hodowli komórkowych na każdą wkładkę (wkładka w formacie 6-dołkowym): Minimalna niezbędna pożywka Eagle'a uzupełniona 50% (obj./obj.) inaktywowanego termicznie FBS, 2 mM L-alanylo-L-glutaminy i 100 jednostek penicyliny i 100 μg streptomycyny na ml. 
	UWAGA: Pożywka jest uzupełniona 50% FBS, aby ułatwić mocowanie ogniw do dolnej strony (tj. Spodu) wkładki. Pożywkę wzrostową i suplement(y) można łatwo wymienić na wymagania dotyczące wzrostu innych szczepów komórkowych lub linii komórkowych.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek przeznaczonych do posiewu na spodniej stronie wkładki. 
	UWAGA: W tym przypadku wyniki uzyskano przy użyciu normalnych ludzkich fibroblastów AG1522 hodowanych w kolbach do hodowli komórkowych o średnicy 75cm2, a zatem komórki te będą przedmiotem opisu preparatu zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Aby zebrać komórki, usuń pożywkę wzrostową i przemyj monowarstwę komórek 2x 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Usuń PBS i rozprowadź 1 ml trypsyny o stężeniu 0,25% (obj./obj.) z 2,21 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), wstępnie podgrzanego do temperatury pokojowej (RT) na komórkach przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Stłumić aktywność trypsyny za pomocą 9 ml kompletnej pożywki wzrostowej (przygotowanej w kroku 1.1) i zebrać komórki, delikatnie pipetując zawiesinę komórek po powierzchni kolby 10x.</li>
	<li>Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub elektronicznego licznika i odpipetuj objętość zawiesiny komórek, która zapewni 250 000 komórek na wkładkę do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Zawiesinę komórek zagnieździć przez odwirowanie (800 x g, 2 min). Zawiesić osad komórkowy z pożywką wzrostową (przygotowaną w kroku 1.2), aby uzyskać stężenie 250 000 komórek na 70 μl. 
	UWAGA: Ponieważ hodowla komórkowa w przepuszczalnych mikroporowatych wkładkach membranowych opiera się na podłożach 2D, wysiewanie komórek odbywa się podobnie, z wyjątkiem tego, że komórki powinny być początkowo zawieszone w pożywce zawierającej 50% (vol/vol) FBS, aby ułatwić przyczepienie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wkładek
UWAGA: Aby zapewnić sterylne warunki, pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym przeznaczonej do hodowli komórkowych.
<ol>
	<li>Wybierz wkładki o wielkości porów błony 0,4 μm, 1 μm lub 3 μm (określonej na podstawie zainteresowań eksperymentalnych, ponieważ wielkość porów można wykorzystać do zbadania roli różnych sposobów komunikacji międzykomórkowej). 
	UWAGA: Por 0,4 μm jest wystarczająco mały, aby ograniczyć tworzenie funkcjonalnych połączeń szczelinowych między komórkami po obu stronach błony wstawienia i może być wykorzystany do badania komunikacji międzykomórkowej przez wydzielane czynniki. Natomiast pory 1 μm i 3 μm są wystarczająco duże, aby umożliwić tworzenie funkcjonalnych połączeń szczelinowych i mogą być wykorzystywane do badania komunikacji międzykomórkowej zarówno przez połączenia szczelinowe, jak i wydzielane czynniki.</li>
	<li>Wyjmij pojedyncze wkładki z opakowania i umieść w naczyniu wielofunkcyjnym o równej wielkości. 
	UWAGA: Wkładki są dostępne z różnymi powierzchniami membrany, aby dopasować je do konkretnych potrzeb aplikacji (np. wkładki 6-dołkowe, 12-dołkowe i 24-dołkowe). W tym przypadku wyniki uzyskano przy użyciu wkładki 6-dołkowej i dlatego będą one przedmiotem opisu modelu.</li>
	<li>Przykryj naczynie, w którym znajdują się wkładki, pokrywką naczynia. Trzymając naczynie wielodołkowe obiema rękami, delikatnie odwróć naczynie tak, aby dna wkładek (tj. spód) były teraz skierowane do góry.</li>
	<li>Zdejmij dno naczynia wielostudzienkowego, odsłaniając dolną stronę wkładek. Pracując z jedną wkładką na raz, użyj sterylnej pary kleszczyków i delikatnie przytrzymaj wkładkę na miejscu. Wolną ręką za pomocą pipety z końcówką z szerokim otworem pobrać 70 μl zawiesiny komórek (przygotowanej w krokach 1.3-1.8), zawierającej 250 000 komórek.</li>
	<li>Aby pokryć komórki płytkami, delikatnie umieść końcówkę pipety na środku membrany wkładki i powoli odpipetuj 70 μl zawiesiny komórek, powoli przesuwając końcówkę pipety po powierzchni membrany. Należy uważać, aby nie wysunąć końcówki pipety i zawiesiny kuwety do krawędzi wkładki. 
	UWAGA: Dotknięcie krawędzi wkładki może spowodować utratę napięcia kapilarnego zawiesiny komórek, co prowadzi do wysychania komórek podczas przyczepiania.</li>
	<li>Powtórzyć tę czynność dla pozostałych wkładek, zwracając uwagę, aby nie pracować bezpośrednio nad odsłoniętymi wkładkami, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia mikrobiologicznego.</li>
	<li>Delikatnie odwróć dno naczynia wielodołkowego, aby przykryć wkładki. Trzymając naczynie z wkładkami odwróconymi, inkubować w wilgotnej atmosferze powietrza 5% (obj./obj.) CO2 w temperaturze 37 °C przez 30-45 min. 
	UWAGA: Jeśli zawiesina komórek na wkładce styka się z dnem studzienki, ostrożnie podnieś dno naczynia i oprzyj je na krawędzi górnej części naczynia, tak aby tworzyło niewielki kąt i tworzyło większą separację między powierzchnią naczynia a dolną stroną wkładek (gdzie komórki są wysiane). Zapobiegnie to przyczepianiu się komórek do powierzchni studzienek zamiast wkładki.</li>
	<li>Po upływie 30-45 minut inkubacji delikatnie wyjmij naczynie zawierające wkładki i umieść je w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Obiema rękami i mocno trzymając pokrywkę naczynia, delikatnie odwróć naczynie tak, aby dolna strona wkładek zawierających przyczepione komórki była teraz skierowana w dół.</li>
	<li>Powoli i ostrożnie dodać 2 ml (1 ml na wkładki z porami 3 μm, aby uniknąć migracji komórek przez pory wkładki) wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża (patrz krok 1.1) do każdej studzienki, tak aby dno wkładki było zanurzone.</li>
	<li>Po dodaniu pożywki wzrostowej do wszystkich studzienek zawierających wkładki, umieść naczynie z powrotem w nawilżonym inkubatorze.</li>
	<li>Pozostawić wkładki w inkubatorze w nienaruszonym stanie przez 48 godzin. Po 48 godzinach nakarmić komórki, odsysając 2 ml pożywki z dna studzienki i dodając 2 ml świeżej pożywki.</li>
	<li>Po dodaniu świeżej pożywki na dno studzienki, nasiona 1 ml zawiesiny drugiej populacji komórek (~ 250 000 komórek/ml) na górnej stronie wkładki, która ma już pierwszą populację komórek rosnącą na dolnej stronie (dla tych eksperymentów, komórki AG1522 (kontrolne) lub komórki rakowe (eksperymentalne) są siane na górze wkładek, które mają już komórki AG1522, przeznaczone do przekształcenia się w CAF, rosnące na spodniej stronie wkładek). Umieść naczynie z powrotem w nawilżonym inkubatorze. 
	UWAGA: W przypadku pracy z komórkami, które nie przylegają dobrze do dolnej części wkładki, komórki te można alternatywnie hodować na górnej stronie wkładki.</li>
	<li>Zmień pożywkę po 24, 72 i 96 godzinach po wysianiu drugiej populacji komórek na górnej stronie wkładki, zasysając pożywkę od góry wkładki i od dołu studzienki. Delikatnie dodaj 1 ml świeżej pożywki na górną stronę wkładki i 2 ml na dno studzienki. Pozwól dwóm populacjom komórek pozostać we wspólnej hodowli po obu stronach przepuszczalnej mikroporowatej membrany wstawczej przez 120 godzin.</li>
</ol>
3. Zbieranie komórek z wkładki przez trypsynizację
UWAGA: Oprócz łatwości uzyskania wzbogaconych populacji komórek, model TME insertu pozwala również na podobne zabiegi eksperymentalne (np. inkubacja z chemikaliami, ekspozycja na warunki tlenowe, które są powyżej lub poniżej atmosfery otoczenia, promieniowanie jonizujące, itp.) jak inne metody in vitro Modele kokultur TME. Co więcej, przepuszczalny substrat do kohodowli może być analizowany za pomocą procedur już opracowanych dla standardowych modeli kultur tkankowych 2D. Na przykład, komórki mogą być zbierane z obu stron błony wstawczej w celu uzyskania wysoce wzbogaconych populacji, które można następnie wykorzystać do analizy punktów końcowych (np. immunodetekcja in situ, Western blot) lub rozmnażać do kolejnych eksperymentów36.
<ol>
	<li>Aby zebrać komórki, należy wyjąć wkładkę z pożywki wzrostowej i umieścić ją w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm zawierającym 1 ml PBS. Umyj dolną i górną stronę wkładu 1x 1 ml PBS.</li>
	<li>Usuń PBS i dodaj 200 μl trypsyny 0,25% (vol/vol) z 2,21 mM EDTA, wstępnie podgrzanej do RT.
	<ol>
		<li>W przypadku zbierania komórek wyhodowanych na dolnej stronie wkładki, umieść roztwór trypsyny w naczyniu o średnicy 35 mm i delikatnie umieść spód wkładki w roztworze trypsyny na 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W przypadku zbierania komórek wyhodowanych na górnej stronie wkładki, umieść wkładkę w naczyniu o średnicy 35 mm i dodaj roztwór trypsyny do górnej części wkładki i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ugasić aktywność trypsyny, dodając 800 μl kompletnej pożywki wzrostowej.
	<ol>
		<li>W przypadku zbierania komórek wyhodowanych na dnie wkładki, dodać pożywkę wzrostową do szalki o średnicy 35 mm i zebrać komórki, delikatnie pipetując 1 ml zawiesiny komórek na powierzchnię wkładki 10 razy, przy czym wkładka jest trzymana pod niewielkim kątem, tak aby zawiesina komórek zebrała się w naczyniu.</li>
		<li>W przypadku pobierania komórek z górnej strony wkładki, dodaj pożywkę wzrostową do górnej strony i delikatnie odpipetuj 1 ml zawiesiny komórek na powierzchni wkładki 10x.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Charakterystyka czystości komórek za pomocą cytometrii przepływowej
UWAGA: Aby scharakteryzować zdolność przepuszczalnych mikroporowatych wkładek membranowych do utrzymania czystości dwóch populacji komórek (tj. górnej i dolnej) przez okres do 120 godzin, przeprowadzono sekcje 1-3, z komórkami MDA-MB-231 oznaczonymi zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) na górnej stronie wkładki i komórkami AG1522 bez znacznika GFP na dolnej stronie 0,4 μm-, Wkładki porowe 1 μm lub 3 μm.
<ol>
	<li>Po zebraniu komórek z dolnej strony wkładki (procedura opisana w sekcji 3) zawiesinę komórek należy zatopić przez odwirowanie (500 g, 30 sekund).</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w 400 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) uzupełnionego 1% (obj./obj.) FBS.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę cytometryczną na cytometrze przepływowym wyposażonym w laser o długości fali 488 nm do wzbudzenia GFP i filtr pasmowoprzepustowy 530/30 do wykrywania emisji fotonów GFP37.</li>
	<li>Do celów identyfikacji komórek należy użyć populacji komórek kontrolnych AG1522 do regulacji napięć rozproszenia przedniego i bocznego na cytometrze przepływowym. Dostosuj napięcie kanału GFP, aby ustawić wartość autofluorescencji komórkowej jako dolny próg wykrywania sygnału GFP.</li>
	<li>Określ próg bramkowania za pomocą komórek kontrolnych. Oceń czystość każdej populacji komórek na podstawie obecności komórek GFP-dodatnich w porównaniu z kontrolą. 
	UWAGA: Czysta populacja odzwierciedlałaby brak wykrytych komórek GPF-dodatnich.</li>
</ol>
5. Charakterystyka komórek za pomocą immunofluorescencji in situ
<ol>
	<li>Po trypsynizacji komórek z wkładki (patrz sekcja 3) zebrać komórki, rozmieścić na płytce 5 x 104 komórki w pożywce o objętości 250 μl (patrz krok 1.1) na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych i pozostawić na 1 godzinę w wilgotnej atmosferze powietrza o stężeniu 5% (obj. / obj.) CO2 w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pod koniec inkubacji delikatnie wyjąć naczynie zawierające szkiełko nakrywkowe i umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 2 ml wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża (patrz krok 1.1) do każdego naczynia, tak aby szkiełko nakrywkowe było zanurzone.</li>
	<li>Po dodaniu pożywki wzrostowej do wszystkich szalek zawierających szkiełka nakrywkowe, należy umieścić szalki w atmosferze nawilżonego powietrza o stężeniu 5% (obj./obj.) CO2 w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 48 godzin.</li>
	<li>Po 48-godzinnej inkubacji przemyć próbkę 3x PBS i utrwalić 4% (wag./obj.) formaldehydem w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać 5x buforowaną solą fizjologiczną Tris (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl), a następnie przepuszczać 0,25% (vol/vol) saponiną Triton X-100, 0,1% (wt/vol) przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Blokować niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 2% (obj./obj.) normalnej surowicy koziej (NGS), 1% (wag./obj.) albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,1% (obj./obj.) Triton X-100 w TBS (roztwór blokujący) przez 1 godzinę w RT.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-kaweolina 1 (CAV1), 1:1 000) w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe zmyć (3x, 5 min/pranie) 0,2% NGS (obj./obj.), 1% (m.j./obj.) BSA, 0,1% (obj./obj.) Triton X-100 w TBS (roztwór do płukania).</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w roztworze blokującym (patrz punkt 5.4).</li>
	<li>Niezwiązane przeciwciało drugorzędowe zmyć (3x, 5 min/płukanie) roztworem płuczącym (patrz krok 5.6).</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) i uszczelnij lakierem do paznokci.</li>
	<li>Obserwuj komórki za pomocą obiektywu z 63-krotnym powiększeniem oleju na odwróconym mikroskopie wyposażonym w zewnętrzne źródło światła do wzbudzenia fluorescencji i rejestruj obrazy za pomocą dołączonej kamery cyfrowej do późniejszej analizy.</li>
</ol>
6. Charakterystyka komórek za pomocą Western Blot
UWAGA: Procedura Western blot jest opisana gdzieindziej 38. Krótki zarys jest opisany tutaj:
<ol>
	<li>Po odłączeniu komórek od wkładki przez trypsynizację (patrz sekcja 3), zawiesinę komórek osadzać przez odwirowanie (500 g, 30 sekund).</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy 2x za pomocą 100 μl PBS.</li>
	<li>Usunąć supernatant i komórki lizy w 50 μl zmodyfikowanego buforu do testów radioimmunoprecypitacji (RIPA) (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 1% (obj./obj.), deoksycholan sodu jednowodny (DOC) 0,5% (obj./obj.), dodecylosiarczan sodu (SDS) 0,1% (obj./obj.)), zawierający koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut na lodzie i odwirowywać przy 19 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białek w supernatancie za pomocą testu gęstości optycznej białka, zgodnego z detergentami w buforze RIPA.</li>
	<li>Oddzielić białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i elektroblot na membranie nitrocelulozowej o grubości 0,2 μm.</li>
	<li>Inkubować błony w TBS zawierającym 0,1% (obj./obj.) mleko odtłuszczone Tween-20 (TBST) i 4% (wt/obj.) (roztwór blokujący) przez 60 min i reagować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C przez noc (anty-CAV1, 1:1,000).</li>
	<li>Umyć membranę 3x TBST w temperaturze RT (5 min/pranie).</li>
	<li>Inkubować błony przez 30 minut w roztworze blokującym zawierającym drugorzędowe przeciwciało przeciw myszom sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (1:5 000).</li>
	<li>Umyć membranę 3x TBST w temperaturze RT (5 min/pranie).</li>
	<li>Wizualizacja produktów reakcji za pomocą chemiluminescencji przy użyciu systemu wykrywania Western blot.</li>
</ol>
7. Charakterystyka komunikacji międzykomórkowej za pomocą cytometrii przepływowej
UWAGA: Aby scharakteryzować zdolność adaptacyjną przepuszczalnych mikroporowatych wkładek membranowych, aby zbadać różne sposoby komunikacji międzykomórkowej (np. wydzielane czynniki, połączenia szczelinowe). Sekcje 1-2.12 wykonano z niefluorescencyjnymi komórkami AG1522 posiewanymi na spodniej stronie wkładek o porach 0,4 μm, 1 μm lub 3 μm.
<ol>
	<li>Hodować nieznakowane komórki AG1522 w naczyniu o średnicy 35 mm do 90% zbiegu przy użyciu pożywki opisanej w sekcji 1.1.</li>
	<li>Wypłucz komórki 1x 1 ml HBSS.</li>
	<li>Załaduj komórki za pomocą Calcein AM poprzez inkubację komórek w HBSS zawierających 30 μM Calcein AM.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w wilgotnej atmosferze powietrza o stężeniu 5% (obj./obj.) CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj komórki 2x 1 ml HBSS.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki, dodając 200 μl roztworu 0,25% (vol/vol) trypsyny z 2,21 mM EDTA przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Stłumić aktywność trypsyny, dodając 800 μl kompletnej pożywki zawierającej 12,5% (obj./obj.) FBS.</li>
	<li>Doprowadzić komórki do zawiesiny przez wielokrotne pipetowanie.</li>
	<li>Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub licznika elektronicznego i umieść 250 000 komórek załadowanych Calcein AM na górnej stronie wkładek, które mają już komórki AG1522 rosnące na dolnej stronie.</li>
	<li>Inkubować wkładki w wilgotnej atmosferze powietrza o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.</li>
	<li>Po 6 godzinach zebrać komórki z dolnej strony wkładek, jak opisano w punkcie 3.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową osadzać przez odwirowanie (500 g, 30 sekund).</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w 400 μl HBSS uzupełnionym 1% (vol/vol) FBS.</li>
	<li>Przeanalizuj komórki na cytometrze wyposażonym w laser i filtr zdolny do wzbudzania i wykrywania emisji kalceiny (odpowiednio 496 nm i 516 nm), zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Do celów identyfikacji komórek należy użyć niebarwionej populacji komórek kontrolnych AG1522, aby dostosować napięcia rozproszenia do przodu i boków na cytometrze przepływowym. Dostosuj napięcie kanału Calcein, aby ustawić wartość autofluorescencji komórkowej jako dolny próg wykrywania sygnału Calcein.</li>
	<li>Określ górną granicę progową za pomocą komórek kontrolnych obciążonych kalceiną. Oceń komunikację dla każdej wstawki komórkowej na podstawie obecności komórek dodatnich w porównaniu z kontrolą.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych lub sprzecznych interesów.

Opisany tutaj protokół jest prostą, adaptowalną procedurą in vitro (ryc. 1), która wykorzystuje przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do generowania wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek ze wspólnej hodowli komórek heterotypowych. Co istotne, model ten nadaje się do badania różnych sposobów komunikacji międzykomórkowej. Krytyczne kroki obejmują wybór odpowiedniej wkładki o wielkości porów dla określonych zainteresowań eksperymentalnych, wysiew pierwszej populacji komórek n...

Mikrośrodowisko nowotworu (TME) to bardzo złożony system składający się z komórek rakowych, które współistnieją i ewoluują wraz ze zrębem gospodarza. Ten składnik zrębu zazwyczaj składa się z fibroblastów, miofibroblastów, komórek śródbłonka, różnych składników odpornościowych, a także macierzy zewnątrzkomórkowej1. Istotnym składnikiem, często przeważającym elementem tego zrębu, są aktywowane fibroblasty, często określane jako fibroblasty związane z rakiem lub fibroblasty związane z rakiem (CAF)2,3. W przeciwieństwie do normalnych, nieaktywowanych fibroblastów, CAF przyczyniają się do inicjacji guza, progresji, angiogenezy, inwazji, przerzutów i nawrotów4-11 w wielu różnych nowotworach, w tym piersi, prostaty, płuc, trzustki, skóry, okrężnicy, przełyku i jajnika5,6,12-17. Jednak dokładny charakter udziału CAF w patogenezie raka pozostaje słabo zdefiniowany. Ponadto dowody kliniczne wykazały wartość prognostyczną, jaką mają CAF, korelując ich obecność z nowotworami złośliwymi o wysokim stopniu złośliwości, niepowodzeniem terapii i ogólnym złym rokowaniem10,18,19.
Oczywiście, poszerzenie naszego zrozumienia zdarzeń inicjujących rozwój CAF, jak również komunikacji międzykomórkowej pośredniczącej w ich roli w TME, może dostarczyć ekscytujących nowych celów terapeutycznych i ulepszonych strategii, które mogą poprawić wyniki leczenia pacjentów. W tym celu opracowano kilka modeli in vivo i in vitro. Chociaż podejścia in vivo bardziej odzwierciedlają TME pacjentów, mają ograniczenia, w tym ogromną złożoność i niejednorodność zarówno w obrębie guzów, jak i między nimi. Co więcej, próbki guzów od ludzi często reprezentują wysoko rozwinięte TME i nie pozwalają na zrozumienie zdarzeń inicjujących TME. Eksperymentalne badania na zwierzętach oferują pewne korzyści, jednak uogólnianie danych na zwierzętach na ludzi powinno być dokonywane z ostrożnością ze względu na różnice w fizjologii między ludźmi a zwierzętami, takimi jak gryzonie (np. chemia tiolu20, tempo metabolizmu21, tolerancja na stres 22 itp.). Co więcej, w przeciwieństwie do populacji ludzkiej, która jest genetycznie niejednorodna z natury, zwierzęta laboratoryjne są zazwyczaj hodowane w celu uzyskania jednorodności. Ponadto często trudno jest zbadać przejściowe zmiany fizjologiczne i zmiany fenotypu komórek, a także kontrolować określone parametry eksperymentalne przy użyciu zwierząt, takich jak gryzonie. W związku z tym 2- i 3-wymiarowe (2D i 3D) modele hodowli tkankowych in vitro są często wykorzystywane do pogłębiania podstawowej wiedzy na temat rozwoju TME. Pomimo braku dokładnego odwzorowania złożoności systemów in vivo, modele te oferują zalety, które znacznie ułatwiają badania mechanistyczne. Modele in vitro pozwalają na bardziej uproszczoną, ukierunkowaną i opłacalną analizę TME, dzięki czemu można uzyskać statystycznie istotne dane w komórkach wolnych od zmian ogólnoustrojowych występujących u zwierząt.
Istnieje kilka odmian systemów in vitro. Dwa najczęściej stosowane modele TME in vitro składają się z mieszanych kultur komórek jednowarstwowych lub sferoidalnych. Obie metody hodowli są korzystne w podstawowych badaniach interakcji międzykomórkowych (np. normalne komórki z komórkami nowotworowymi) oraz w analizie różnych zmian fenotypu komórek specyficznych dla TME (np. pojawienie się fibroblastów związanych z rakiem z normalnych fibroblastów). Dodatkowo, sferoidy są w stanie stworzyć bardziej refleksyjną strukturę przypominającą tkankę TME i mogą być reprezentatywne dla heterogeniczności guza23. Jednak sferoidy często wytwarzają bardzo zróżnicowane gradienty napięcia tlenu w różnych warstwach, co może komplikować wnioski eksperymentalne24. Niestety, oba modele mają bardzo ograniczoną zdolność do izolowania czystych populacji komórek w celu dalszej charakterystyki i badań po wspólnej hodowli. Aby to zrobić, co najmniej jeden typ komórek musiałby zostać fluorescencyjnie oznakowany lub oznaczony za pomocą producenta identyfikującego, a następnie poddać mieszaną kokulturę intensywnemu przetwarzaniu i sortowaniu komórek w celu oddzielenia populacji komórek. Podczas gdy sortownik komórek jest w stanie wyizolować raczej czystą populację komórek, należy być świadomym stresu komórkowego i potencjalnego ryzyka zanieczyszczenia mikrobiologicznego25.
Aby ułatwić zrozumienie komunikacji międzykomórkowej, włożono wiele wysiłku w rozwój i optymalizację systemów in vitro, które ściśle naśladują środowisko in vivo, jednocześnie pozwalając na uproszczone podejście. Jednym z takich narzędzi jest przepuszczalna wkładka mikroporowata, podłoże membranowe, które zostało po raz pierwszy opracowane w 1953 r.26, a następnie dostosowane do różnych zastosowań i badań (np. polaryzacja komórek27, endocytoza28, transport leków29, modelowanie tkanek30, zapłodnienie31, efekt osoby postronnej32,33 itp.). System ten umożliwia wzrost komórek z anatomicznym i funkcjonalnym różnicowaniem podobnym do in vivo, a także ekspresję wielu markerów in vivo 34,35, których nie obserwuje się podczas hodowli na nieprzepuszczalnych naczyniach z tworzyw sztucznych. Co więcej, niezwykle cienka porowata membrana (o grubości 10 μm) umożliwia szybką dyfuzję cząsteczek i czasy równowagi, co symuluje środowisko in vivo i umożliwia niezależne funkcjonowanie komórkowe zarówno w domenie komórek wierzchołkowych, jak i podstawno-bocznych. Dodatkową zaletą użyteczności wkładu jako systemu TME jest jego fizyczne oddzielenie dwóch heterotypowych populacji komórek wyhodowanych po obu stronach błony w tych samych warunkach środowiskowych, przy zachowaniu różnych trybów komunikacji międzykomórkowej poprzez pory błony. Chociaż fizycznie oddzielone, obie populacje komórek są metabolicznie sprzężone za pomocą wydzielanych pierwiastków i, jak opisano tutaj, również przez kanały szczelinowo-połączeniowe. Dodatkowo, utrzymując wkładki na poziomie częściowego napięcia tlenu in vivo (PO2), model zmniejsza powikłania związane z gradientami tlenu i chemicznymi obserwowanymi w innych układach. Przeciwnie, zwiększa zrozumienie naturalnych mechanizmów kontrolujących TME. Warto zauważyć, że obie populacje komórek można łatwo wyizolować z wysoką czystością, bez znakowania fluorescencyjnego i/lub sortowania komórek po dłuższych okresach wspólnej hodowli.
Tutaj opisujemy protokół TME in vitro składający się z komórek ludzkiego raka piersi i ludzkich fibroblastów hodowanych, odpowiednio, po obu stronach przepuszczalnej mikroporowatej wkładki membranowej, ale jednak w ciągłej, dwukierunkowej komunikacji przez pory błony. Pokazujemy, że stosując błony o różnej wielkości porów, można badać udział określonego rodzaju komunikacji międzykomórkowej (np. czynników wydzielanych w porównaniu z połączeniami szczelinowymi) w rozwoju TME.

<table><tbody><tr><td>For Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AG01522 (<>, AG1522) ludzki diploidalny fibroblast</td><td>Coriell</td><td>107661</td><td>Passage 8-13</td></tr><tr><td>MDA-MB-231-luc-D3H1 linia komórkowa gruczolakoraka piersi</td><td>PerkinElmer</td><td>119261</td><td>Linia rodzicielska: ATCC (#HTB-26)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231/GFP linia komórkowa gruczolakoraka piersi</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-201</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna niezbędna pożywka Eagle's (MEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowany</td> suplement <td>Sigma</td><td>F6178-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Glutagro (200 mM L-alanylo-L-glutamina)</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Roztwór streptomycyny, 100x</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Wkład Transwell (i.e., przepuszczalna mikroporowata wkładka membranowa) (0,4 &mu; m pore)</td> <td>Costar</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Insert (i.e., przepuszczalna mikroporowata wkładka membranowa) (1 &mu; m pore)</td> <td>Greiner bio-one</td><td>657610</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Insert (i.e., przepuszczalna mikroporowata wkładka membranowa) (3 &mu; m pore)</td><td>Costar</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Greiner Bio-One Cellstar</td><td>657160-01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kolba do hodowli komórkowych</td><td>CellStar</td><td>658 170</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>0,25% (vol/vol) Trypsyna, 2,21 mM EDTA, 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka wirówkowa</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Greiner bio-one</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Do mikroskopii immunofluorescencyjnej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>mysie <td>przeciwciało transdukcyjne</td> <td>anty-kaweoliny 1</td> BD <td>610406</td><td>In situ Immunofluorescencja - 1:5 000</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) Drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>In situ Immunofluorescencja - 1:2,000</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej - frakcja V</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td>Bez immunoglobulin i proteaz</td></tr><tr><td>16% (wag./obj.) roztwór formaldehydu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Rozcieńczyć do 4% z 1x PBS</td></tr><tr><td>Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm nr 1)</td><td>Fisher</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcie SlowFade Gold z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Do analizy cytometrycznej przepływowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calceina,</td><td>sondy molekularne</td> AM <td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Do analizy Western Blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anty-kaweolina 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>Western Blot - 1:1,000</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa (0,2 &mu; m)</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>BioRad DC Test białkowy</td><td>BioRad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu jednowodny (DOC)</td><td>Sigma</td><td>D5670</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>30% roztwór akrylamidu/bis, 37,5:1</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td></td></tr></tbody></table>

naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Zrozumienie wczesnych heterotypowych interakcji między komórkami rakowymi a otaczającym je nienowotworowym zrębem jest ważne dla wyjaśnienia wydarzeń prowadzących do aktywacji zrębu i powstania mikrośrodowiska guza (TME). Opracowano kilka modeli TME in vitro i in vivo; Jednak ogólnie rzecz biorąc, modele te nie pozwalają na izolację pojedynczych populacji komórek, w warunkach niezakłócających, w celu dalszych badań. Aby obejść tę trudność, zastosowaliśmy model TME in vitro przy użyciu substratu do wzrostu komórek składającego się z przepuszczalnej mikroporowatej wkładki membranowej, która umożliwia proste generowanie wysoce wzbogaconych populacji komórek hodowanych intymnie, ale oddzielnie, po obu stronach błony wkładki w celu wydłużenia czasu kohodowli. Dzięki zastosowaniu tego modelu jesteśmy w stanie wygenerować znacznie wzbogacone populacje fibroblastów związanych z rakiem (CAF) z normalnych diploidalnych ludzkich fibroblastów po wspólnej hodowli (120 godzin) z wysoce przerzutowymi ludzkimi komórkami raka piersi, bez użycia znakowania fluorescencyjnego i / lub sortowania komórek. Dodatkowo, modulując wielkość porów wkładki, możemy kontrolować tryb komunikacji międzykomórkowej (np. komunikacja szczelina-połączenie, wydzielane czynniki) między dwiema heterotypowymi populacjami komórek, co pozwala na zbadanie mechanizmów leżących u podstaw rozwoju TME, w tym roli przepuszczalności złącza szczelinowego. Model ten służy jako cenne narzędzie w pogłębianiu naszego zrozumienia początkowych zdarzeń prowadzących do inicjacji zrębu nowotworowego, wczesnej ewolucji TME oraz modulującego wpływu zrębu na odpowiedzi komórek nowotworowych na środki terapeutyczne.

W niniejszej pracy wykorzystano wstawki z przepuszczalną, mikroporowatą membraną do opracowania in vitro heterotypowego systemu hodowli komórek w warunkach współkultury, który naśladuje in vivo mikrośrodowisko guza (Rycina 1). System ten umożliwia długotrwałą hodowlę dwóch różnych populacji komórek po przeciwnych stronach porowatej membrany wstawki (do 120 godzin w naszym przypadku). Co istotne, system ten potrafi zachować czystość populacji komórkowych,...

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Ogólnym celem tego prostego modelu kokultury in vitro jest naśladowanie charakterystyki mikrośrodowiska guza in vivo, wzbogacanie poszczególnych populacji komórek oraz badanie różnych sposobów komunikacji międzykomórkowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii i radiobiologii, w szczególności dotyczące czynników leżących u podstaw powstawania fibroblastów towarzyszących nowotworom oraz odpowiedzi na środki terapeutyczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na uzyskanie poszczególnych populacji komórek z mieszanej kultury komórkowej bez konieczności stosowania indukującego stres znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek.Zacznij od dwukrotnego przemycia badanej hodowli komórkowej pięcioma mililitrami PBS. Po drugim przemyciu ododerwij komórki, dodając jeden mililitr trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej i inkubując przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie przerwij reakcję, dodając dziewięć mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej i delikatnie pipetując ją po powierzchni kolby 10 razy w celu dysocjacji komórek.Po policzeniu rozcieńcz komórki w świeżej pożywce do stężenia 2,5 × 10⁵ komórek/ml i przenieś je do

a-mimic-tumor-microenvironment-simple-method-for-generating-enriched

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.

Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Interakcje komórkowe parakrynne i juktakrynowe odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w progresji guza, odpowiedziach immunologicznych, angiogenezie i rozwoju. W tym przypadku stosuje się metodę hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej, w której utrzymywane są zlokalizowane stężenia wydzielanych czynników, jednocześnie zapobiegając bezpośredniemu kontaktowi komórkowemu.

Metoda hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami

Celem przedstawionej tutaj metody jest pokazanie, jak mikromacierze mikrośrodowiskowe (MEMA) mogą być wytwarzane i wykorzystywane do badania wpływu tysięcy prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych na fenotyp hodowanych komórek.

Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Tutaj szczegółowo opisujemy prosty, szybki i niezawodny protokół wspomagany wieloparametryczną cytometrią przepływową i nowotworem na chipie, aby monitorować i charakteryzować etapy składające się na cykl rak-odporność. Rzeczywiście, dogłębne zrozumienie wzajemnych zależności między rakiem a komórkami odpornościowymi dostarcza kluczowych informacji, które pozwalają przechytrzyć nowotwory i kierować opieką kliniczną.

Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj prostą metodę współkultury in vitro do naśladowania mikrośrodowiska guza, wzbogacania populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej. Technika ta umożliwia generowanie wzbogaconych populacji bez stresującego znakowania fluorescencyjnego.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej (Wideo) | JoVE Journal

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Przeglądaj więcej filmów