Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Ogólnym celem tego prostego modelu kokultury in vitro jest naśladowanie cech mikrośrodowiska guza in vivo, wzbogacenie poszczególnych populacji komórek i zbadanie różnych sposobów komunikacji międzykomórkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nowotworów i radiobiologii, w szczególności dotyczące czynników leżących u podstaw wytwarzania fibroblastów związanych z rakiem i odpowiedzi na środki terapeutyczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona generowanie pojedynczych populacji komórek z mieszanej hodowli komórkowej bez indukującego stres znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek.

Zacznij od dwukrotnego przemycia interesującej nas hodowli komórkowej pięcioma mililitrami PBS. Po drugim praniu odłącz komórki jednym mililitrem trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej na dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie wygasić reakcję dziewięcioma mililitrami kompletnej pożywki wzrostowej, delikatnie pipetując pożywkę po powierzchni kolby 10 razy, aby zdysocjować komórki.

Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do stężenia 2,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr w świeżej pożywce i przenieść komórki do sterylnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce wzrostowej uzupełnionej 50% płodową surowicą bydlęcą w ilości 2,5 razy 10 do piątej komórki na 70 mikrolitrów stężenia pożywki. Następnie przenieś wkładki o odpowiedniej eksperymentalnej wielkości porów z ich opakowania do indywidualnych dołków naczynia wielodołkowego i przykryj naczynie.

Następnie trzymając naczynie obiema rękami, delikatnie odwróć naczynie, aż dna wkładki będą skierowane do góry. Zdejmij dno naczynia. Używając sterylnych kleszczyków w jednej ręce, przytrzymaj jedną wkładkę na miejscu, a drugą ręką powoli zasysaj 70 mikrolitrów komórek do końcówki mikropipety.

Następnie powoli dozuj komórki na powierzchni tego, co jest teraz górną stroną wkładki. Po wysianiu każdej z wkładek ostrożnie wymień dno naczynia i inkubuj odwrócone naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z wilgotnością przez 30 do 45 minut. Pod koniec inkubacji, w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, ostrożnie odwróć szalkę tak, aby dno wkładek było teraz skierowane w dół.

Następnie powoli i ostrożnie zanurz spód każdej wkładki w dwóch mililitrach wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża i umieść naczynie z powrotem w nawilżonym inkubatorze. Po 48 godzinach zastąp pożywkę na dnie każdej studzienki dwoma mililitrami świeżej pożywki wzrostowej. Gdy cała pożywka zostanie odświeżona, wysiewaj 2,5 razy 10 do piątych komórek drugiej populacji będącej przedmiotem zainteresowania na wierzchu wkładek w jednym mililitrze świeżej pożywki i włóż naczynie z powrotem do inkubatora.

24, 48 i 96 godzin później wymień pożywkę w górnej części każdej wkładki na jeden mililitr świeżej kompletnej pożywki. I pożywkę na dnie każdej studzienki z dwoma mililitrami świeżej, kompletnej pożywki. Po 120 godzinach kohodowli przenieś jedną wkładkę na raz do indywidualnych 35-milimetrowych szalek do hodowli komórkowych zawierających jeden mililitr PBS.

I umyj dolną i górną stronę wkładek jednym mililitrem PBS. Aby zebrać komórki wyhodowane na dnie wkładki, umieść wkładki dolną stroną do dołu w 200 mikrolitrach trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej. Po dwóch minutach w temperaturze pokojowej przerwij reakcję za pomocą 800 mikrolitrów kompletnej pożywki wzrostowej.

Następnie, trzymając wkładkę pod niewielkim kątem, delikatnie odpipetować supernatant po powierzchni komórek 10 razy, zbierając komórki w naczyniu. Gdy wszystkie wkładki zostaną usunięte, ponownie zawiesić komórki w stężeniu dwa razy 10 do piątych komórek na mililitr pożywki wzrostowej. I dodaj 250 mikrolitrów komórek do sterylnych pojedynczych szklanych szkiełek nakrywkowych.

Umieść szkiełka nakrywkowe w nawilżonym inkubatorze na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji, w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, ostrożnie dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki wzrostowej do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% procentowego dwutlenku węgla przy wilgotności przez 48 godzin. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS.

Po trzecim praniu utrwal komórki w 4% formaldehydzie w PBS przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj pięć płukań solą fizjologiczną buforowaną Tris. Po ostatnim płukaniu przepuszczaj komórki 0,25% Triton X-100 uzupełnionym 0,1 saponiną przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie oznacz próbki pierwszorzędowym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania w roztworze blokującym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego ranka usunąć niezwiązane przeciwciało, przemywając je przez trzy minuty w roztworze do mycia, a następnie przeprowadzając godzinną inkubację w temperaturze pokojowej w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym w roztworze blokującym. Pod koniec inkubacji przemyć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe, jak właśnie pokazano, i zamontować szkiełka nakrywkowe na poszczególnych szkiełkach za pomocą pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu zawierającej DAPI. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.

Następnie zobrazuj komórki pod 63-krotnym powiększeniem oleju na odwróconym mikroskopie wyposażonym w zewnętrzne źródło światła do wzbudzenia fluorescencji. System ten pozwala na hodowlę dwóch różnych populacji komórek po obu stronach porowatych błon wkładek do hodowli komórkowych przez co najmniej 120 godzin, utrzymując czystość większą niż 99% w populacjach komórek po obu stronach membrany, gdy stosowane są wkładki z porami 0,4 lub jednym mikronem. Wstawki z trzema mikronowymi porami są jednak wystarczająco duże, aby umożliwić komórkom migrację przez błonę, jak zaobserwowano w tym eksperymencie przy użyciu linii komórkowej ludzkiego raka piersi GFP-dodatniej.

Wkładki porowe o wielkości 0,4 mikrona ograniczają również tworzenie funkcjonalnych połączeń szczelinowych między kulturami komórkowymi po obu stronach wkładki, ograniczając komunikację z wydzielanymi czynnikami. Wkładki z porami jedno- i trzymikronowymi umożliwiają jednak funkcjonalne sprzężenie komórek przez połączenia szczelinowe, na co wskazuje przeniesienie znacznika fluorescencyjnego przez membranę w tych kokulturach. Co ważne, system ten może być wykorzystany do skutecznego generowania fibroblastów związanych z rakiem z normalnych ludzkich diploidalnych fibroblastów po ich wspólnej hodowli z komórkami raka piersi, o czym świadczy zmniejszona ekspresja kaweoliny-1 na fibroblastach hodowanych wspólnie z ludzkimi komórkami raka piersi.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby wybrać wkładki o wielkości porów odpowiedniej dla badanego pytania. I zobaczyć pierwszą populację komórek na spodniej stronie wkładki w podłożu, które ułatwia ich przyczepienie. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunoblotting, immunofluorescencja in-situ lub większość innych testów komórkowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian ekspresji białek, zmian w inwazji i migracji lub różnic w odpowiedziach na środki terapeutyczne.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii nowotworów i biologii radiacyjnej do zbadania czynników, które przyczyniają się do rozwoju, ewolucji mikrośrodowiska guza, a w naszym przypadku do rozprzestrzeniania się szkodliwych skutków promieniowania jonizującego z komórek docelowych z promieniowaniem do komórek postronnych w pobliżu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować mieszaną kokulturę komórkową, utrzymać kokulturę i zebrać wzbogacone populacje komórek o wysokiej czystości z kokultury w celu dalszej analizy. Nie zapominaj, że praca ze szczepami komórek ludzkich lub liniami komórkowymi może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy nosić odpowiednie, odpowiednie środki ochrony osobistej i przestrzegać odpowiednich przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.